KR20010011698A

KR20010011698A - 라스 변이세포의 성장을 억제하는 티오우레아 유도체 또는 이들의 무독성염

Info

Publication number: KR20010011698A
Application number: KR1019990031188A
Authority: KR
Inventors: 이봉용; 김재규; 황순호; 이원희; 정영환; 심재영; 박유회
Original assignee: 김선진; 주식회사 유한양행
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2001-02-15
Also published as: AU6186700A; CN1376155A; CA2380371A1; AU765433B2; KR100683418B1; WO2001009128A1; EP1200430A4; KR20020030084A; EP1200430A1; JP2003506372A

Abstract

본 발명은 라스(Ras) 변이세포의 성장 억제력이 우수한 신규의 티오우레아 유도체, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 무독성염에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 함유하는 라스 변이세포 성장억제 조성물에 관한 것이다.

Description

라스 변이세포의 성장을 억제하는 티오우레아 유도체 또는 이들의 무독성염{Thiourea derivatives or non-toxic salts thereof for inhibiting RAS-transformed cell growth}

본 발명은 라스(Ras) 변이세포의 성장을 우수하게 억제하는 신규의 티오우레아 유도체, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 무독성염에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 함유하는 라스 변이세포 성장억제 조성물에 관한 것이다.

라스 단백질(Ras protein)은 파르네실트랜스퍼라제(Farnesyltransferase) 즉, 파르네실 단백질 트랜스퍼라제(Farnesyl protein transferase, 이하 "FPTase"라 한다.) 또는 제라닐제라닐 단백질 트랜스퍼라제(Geranylgeranyl protein transferase, 이하 "GPTase"라 한다.)에 의해 파르네실화(Farnesylation) 또는 제라닐제라닐화(Geranylgeranylation)되어 세포내벽으로 이동하여 GDP가 결합된 불활성화 상태 또는 GTP가 결합된 활성화 상태로 존재하게 된다. 라스단백질이 활성화 상태일 경우 하위 단계의 신호전달 체계를 단계적으로 활성화 시킴으로써 세포 외부의 신호를 핵내로 전달하게 되고, 이 정보는 전사인자(myc, jun, fos등)를 활성화시켜 세포의 성장 또는 세포의 분핵을 촉진시키게 되는데 이러한 일련의 정보전달체계를 라스신호전달체계라 한다(M. Barbacid, Annu. Rev. Biochem., 56, 779, 1987, P J. Casey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 8323, 1989).

라스유전자의 돌연변이(예를들어, H-Ras, N-Ras, K-RasA, K-RasB등)로 인해 변이성 라스단백질이 생성될 경우 즉, 이들은 GTP와 결합하여 지속적인 활성화 상태로 유지됨으로써 세포의 암화를 유발하게 된다. 다수의 인체암 중에서 특히 대장암과 췌장암의 환자에서 이러한 돌연변이성 라스유전자가 각각 50%와 90% 정도로 발견되고 있으며, 폐암(50%)이나 갑상선암(30%)등에서 높은 빈도로 돌연변이된 라스유전자가 확인되고 있다 (S. Rodenhuis, Semin. Cancer Biol. 3, 241, 1992).

따라서, 변이성 라스단백질로 인한 변이세포 억제제를 개발하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다. 이중 특히, 변이성 라스단백질이 세포내벽으로 이동하는 것을 차단할 수 있는 FPTase 저해제에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 예를들어, 라스단백질의 카르복실산 잔기(Cys-A1-A2-Met)와 유사한 구조를 갖는 Cys-Val-Phe-Met이 FPTase의 저해제로 작용한다고 개시된 바 있다(J. L. Goldstein et al., J. Biol. Chem., 266, 15575, 1991; A. M. Garcia et al., J. Biol. Chem., 268, 18415, 1993; S. L. Graham et al., J. Med. Chem., 37, 725, 1994).

또한, Cys-Ile-Phe-Met를 기본구조로 하여 다수의 유도체들이 개발중에 있으며, 대표적으로는 Phe-Met 부위를 방향족알킬아민으로 대체한 화합물이 GGPTase에 비하여 FPTase를 선택적으로 억제한다는 보고가 있고(S. J. Desolms et al., J. Med. Chem., 38, 3967, 1995), 시스테인과 트랜스-3(S)-에틸프롤린에 아미노메틸나프탈렌을 결합시킨 카보닐아미드 화합물이 FPTase에 대해 억제력을 나타낸다고 개시한 바 있으며(WO9606609, 1996), 시스테인을 이미다졸에틸기로 변환시킨 유사펩타이드 화합물들도 FPTase 저해효과를 갖는 것으로 보고되고 있다 (J. H. Hunt et al., J. Med. Chem., 39, 353, 1996; WO9610035, 1996; WO9610034, 1996; WO9609836, 1996). 이 밖에 머크사는 Cys-Ile-Phe-Met의 시스테인을 p-시아노벤질이미다졸아세테이트로, 페닐알라닌을 N-나프틸메틸로 변환한 화합물이 FPTase에 대해 억제력을 갖는다고 보고하고 있다(WO9639173, 1996).

그러나, 상기와 같은 종래의 개발중인 FPTase 저해제들은 실제로 대부분의 인체 암에서 발견되는 K-라스 변이세포내에서는 파르네실화를 효과적으로 억제하지 못한다. 그 이유는 FPTase 저해제에 의해 억제되는 K-라스단백질은 FPTase가 억제되어도 GGPTase를 이용하여 K-라스단백질의 활성을 유지하기 때문에, FPTase 저해제가 세포내에서 K-라스 단백질의 프레닐화를 억제하는데 실패한다고 보고된 바 있다(G. L. James et al., J. Biol. Chem. 270, 6221, 1995).

이에 본 발명자들은 K-라스 단백질의 프레닐화를 억제할 수 있는 라스 변이세포 성장 억제제를 개발하기 위하여 많은 연구를 거듭한 결과, K-라스 단백질의 프레닐화를 억제할 뿐만 아니라 라스 변이세포 자체의 성장을 억제하는 신규의 티오우레아 유도체를 발명하게 되었다.

본 발명은 라스변이세포 성장억제효과를 갖는 신규의 티오우레아 유도체 및 이들의 무독성염을 제공한다.

또한, 본 발명은 신규의 티오우레아 유도체 및 이들의 무독성염의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 신규의 티오우레아 유도체 및 이들의 무독성염을 유효성분으로 함유하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 라스변이세포 성장억제 조성물을 제공하는 것을 포함한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 일반식 (I)로 표시되는 티오우레아 유도체, 이들을 함유하는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

상기에서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 수소; 치환되거나 비치환된 직쇄상 또는 분지상의 C₁-C₈-알킬; C₂-C₆-알케닐; C₁-C₄-알콕시카르보닐; C₃-C₆-시클로알킬; 페닐; 1∼3개의 치환기를 갖는 페닐; 페닐-C₁-C₄-알킬; 나프틸; 디(C₁-C₄-알킬)아미노로 치환된 나프틸; 벤조일; 헤테로아릴; 1∼3개의 치환기를 갖는 피리딜; 또는 아다만틸이고, R3는 C₁-C₆-알킬; 페닐-C₁-C₄-알킬; 1∼3개의 치환기를 갖는 페닐로 치환된 C₁-C₄-알킬; 나프틸-C₁-C₄-알킬; 티오페닐-C₁-C₄-알킬; 피리딜-C₁-C₆-알킬; 옥시피리딜-C₁-C₆-알킬; C₁-C₆-알콕시-C₁-C₆-알킬; C₁-C₆-알킬티오-C₁-C₆-알킬; 또는 C₂-C₆-알키닐이고, A는 -(CH₂)n- 으로 n은 1-5이며 X는 니트로, 시아노 또는 메톡시를 나타낸다.

본 발명에 따른 티오우레아 유도체는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있으며, 그 염으로는 항암제 분야에서 통상적으로 사용가능한 무독성염, 예를들면, 비독성 무기산 또는 유기산으로부터 생성된 염의 형태일 수 있다. 이러한 통상적인 비독성 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 설폰산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로 부터 유도된 염 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 파모산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시-벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄디설폰산, 에탄디설폰산, 옥살산, 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 제조된 염등을 포함한다.

본 발명은 하기 일반식(I)로 표시되는 티오우레아 유도체 및 그의 무독성 염의 제조방법을 포함한다. 하기 일반식(I)의 화합물은 다음의 방법에 의해 제조될 수 있다.

반응식

상기 반응식에서 R1, R2, R3, A 및 X는 상기에서 정의한 것과 동일하며, Tr은 트리페닐메틸이다.

상기 반응식에 나타낸 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

단계1. 아미노기 보호반응

출발물질인 일반식(II)의 화합물을 N-에톡시카보닐 프탈이미드를 사용한 반응을 수행하여 1급아민이 보호된 일반식(III)의 화합물을 제조한다.

단계2. 이미다졸 보호반응

일반식(III)의 화합물을 트리페닐메틸 클로라이드 또는 일반적인 아미노 보호기와 적절한 유기용매를 사용하여 일반식(IV)의 화합물을 제조한다.

단계3. 부가반응

치환기를 갖는 벤질 할라이드와 일반식(IV) 화합물을 적절한 유기용매에서 반응시켜 일반식(V)의 화합물을 제조할 수 있다. 유기용매로는 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 메틸알콜, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있으며 반응을 촉진시키기 위하여 가온할 수 있다.

단계4. 탈보호기반응

아미노 보호기를 갖는 일반식(V)의 화합물을 히드라진과 반응하여 탈보호된 일반식(VI) 화합물을 제조한다.

단계5. 환원적 알킬화반응

일반식(VI)의 화합물과 나트륨 시아노보로하이드라이드 또는 다른 공지의 환원제 존재하에서 R3-알데히드를 가하여 환원적 알킬화 반응을 수행하여 일반식(VII)의 화합물을 제조한다. 이때 포타슘아세테이트 또는 초산 및 3A^o분자 체등을 가하여 반응을 촉진시킬 수 있다.

단계6. 부가반응

일반식(VII)와 R1R2-이소티오시아네이트 또는 R1R2-티오카바모일 할라이드를 디메틸포름아미드, 메틸렌클로라이드 또는, 아세토니트릴등의 용매와 반응하여 일반식(I)화합물을 제조한다.

본 발명에 따른 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 무독성 염은 염기성 잔기를 함유하는 일반식(I)의 화합물로부터 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 염은 유기 염기를 화학량론적 양 또는 과량의 목적하는 염-형성 무기산 또는 유기산과 적합한 용매 또는 용매들의 다양한 배합물중에서 반응시켜 제조할 수 있다.

본 발명은 일반식(I)로 표시되는 티오우레아 유도체를 유효성분으로 함유하고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 라스 변이세포 성장억제 조성물을 포함한다. 본 발명에 따른 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있으며, 경우에 따라 감미제 및/또는 향미제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구투여하거나, 정맥내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여를 포함한 비경구 투여를 실시할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 조성물은 정제 또는 캡슐제 형태로, 또는 수성용제 또는 현탁제로서 투여할 수 있다. 경구용 정제의 경우 통상 사용되는 담체에는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함되고, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 통상 가할 수 있다. 캡슐제 형태의 경우 유용한 희석제로서 락토즈 및 건조 옥수수 분말을 포함할 수 있다. 경구용으로 수성 현탁제가 필요할 경우 활성성분을 유화제 및 현탁제를 포함할 수 있다. 경우에 따라 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제로 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 용질의 총 농도는 제제에 등장성이 부여되도록 조절할 수 있는 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 라스변이세포의 성장을 효과적으로 억제함으로써 결장암, 직장암, 췌장암, 또는 골수성 백혈병 등의 암환자에게 투여될 수 있으며, 그 투여용량은 통상 각 환자의 연령, 체중 및 환자의 증상에 따라 일반적으로 변화시킬 수 있는 용량, 예를들어 1일 약 0.1mg/kg 내지 약 20mg/kg, 바람직하게는 1일 0.5mg/kg 내지 약 10mg/kg 으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이것이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

참조예 1

N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-2-(트리플루오로메틸)벤질아민의 제조

〈단계1〉

N-{2-(1H-이미다졸-4-일)에틸}프탈이미드의 제조

히스타민.2염산염 (21.5g, 0.12mole)을 물 (300mL)에 용해한 후 소디움카보네이트 (37.1g 0.35mol)를 가하였다. 이 반응용액에 N-에톡시카보닐프탈이미드 (25.6g, 0.12mol)을 서서히 적가한 후 실온에서 24시간동안 교반하였다. 생성된 고형물을 여과하여 모으고 물 (50mL) 와 n-헥산 (50mL)으로 수회 세척한 후, 감압하에서 건조하여 백색 고형의 목적화합물 (20.0g)을 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d₆+ TFA-d₁) δ 2.98(t, 2H), 3.85(t, 2H), 7.43(s, 1H), 7.78(m, 4H), 8.95(s, 1H)

〈단계2〉

N-{2-(1-트리페닐메틸이미다졸-4-일)에틸}프탈이미드의 제조

〈단계1〉에서 제조한 N-{2-(1H-이미다졸-4-일)에틸}프탈이미드 (20.0g, 82.90mmol)와 트리에틸아민 (23.0 mL, 165.8 mmol)을 디메틸포름아미드 (50mL)와 디클로로메탄 (200mL)의 혼합용액에 녹인 반응액을 얼음물로 냉각한 후 트리페닐메틸클로라이드 (27.7g, 99.48mmol)를 서서히 적가하였다. 이 반응액을 실온에서 24 시간동안 충분히 교반한 후 디클로로메탄 (200mL)에 희석하였다. 유기용매층을 물과 포화 소금수용액으로 수회 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 탈수한 후 감압하에서 농축하여 미황색의 반고형물질을 얻었다. 이 잔사를 n-헥산으로 재결정하여 백색 고형의 목적화합물 (40.0g)을 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 2.8(t, 2H), 3.8(t, 2H), 6.6(s, 1H), 7.0(m, 6H), 7.2(s, 1H), 7.3(m, 9H), 7.8(m, 4H)

〈단계3〉

N-[2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸]프탈이미드 브롬산염의 제조

〈단계2〉에서 제조한 N-{2-(1-트리페닐메틸이미다졸-4-일)에틸}프탈이미드 (40.0g, 82.72mmol)와 4-시아노벤질브로마이드 (19.7g, 91.19mmol)를 아세토니트릴 (250 mL)에 현탁한 후, 50~60^oC에서 24 시간동안 교반하였다. 반응액을 감압하에서 농축하여 미황색의 액상 물질을 얻고, 이를 메탄올 (200 mL)에 용해하고 3 시간동안 환류 교반하였다. 이 반응액을 감압하에서 농축 (메탄올 잔류량 약 50 mL)한 후 에틸아세테이트 (200 mL)에 희석하고 얼음물로 냉각하며 1시간동안 교반하였다. 생성된 백색 고형물을 여과하여 모으고 감압하에서 건조하여 목적화합물 (30.9 g)을 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 2.90(t, 2H), 3.75(t, 2H), 5.65(s, 2H), 7.5(d, 2H), 7.65(s, 1H), 7.8(m, 6H), 9.32(s, 1H)

〈단계4〉

1-(4-시아노벤질)-5-(2-아미노에틸)이미다졸.2염산염의 제조

〈단계3〉에서 제조한 N-[2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸]프탈이미드 브롬산염 (30.0g, 65.61mmol)을 메탄올 (100 mL)에 용해한 후 히드라진 수화물 (6.4 mL, 131.21mmol)을 가하고 1.5 시간동안 환류 교반하였다. 반응액을 얼음물로 냉각하고 염산 gas를 통과시킨 후 생성된 백색 고형물을 여과하여 제거하고, 여액을 감압농축하여 미황색의 반고형 물질을 얻었다. 이 잔사를 에틸아세테이트 (50mL)로 수회 세척한 후 감압하에서 건조하여 미황색 고체의 목적화합물 (25.0g)을 얻었다.

〈단계5〉

〈단계4〉에서 제조한 1-(4-시아노벤질)-5-(2-아미노에틸)이미다졸.2염산염 (8.5g, 28.40mmol)과 2-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드 (3.7mL, 28.40mmol)를 메탄올 (100mL)에 녹인 후, 분자 체 (3A^O, 30g)와 초산 (0.5mL)을 가하고 실온에서 30분간 교반하였다. 이 반응액을 얼음물로 냉각한 후 소디움시아노보로하이드라이드 (2.7g, 42.61mmol)를 서서히 가하고 실온에서 2시간동안 교반하였다. 반응액중의 불용성물질을 여과하여 제거하고, 여액을 감압농축하여 미황색의 액상물질을 얻었다. 잔사를 에틸아세테이트 (200mL)에 녹이고, 증류수와 포화 중탄산나트륨수용액으로 세척하고 유기층을 무수 황산마그네슘으로 탈수한 후, 용매를 감압하에서 농축하여 미황색의 액상물질을 얻었다. 이 잔사를 실리카겔 관 크로마토그라피로 정제하여 무색 액상의 목적화합물 (4.0g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ 2.60(t, 2H), 2.82(t, 2H), 3.89(s, 2H), 5.17(s, 2H), 6.92(s, 1H), 7.09(d, 2H), 7.35-7.39(m, 1H), 7.51-7.65(m, 6H)

참조예 2

N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-(2,3-디클로오로)벤질아민의 제조

참조예 1의 〈단계4〉에서 제조한 1-(4-시아노벤질)-5-(2-아미노에틸)이미다졸. 2염산염 (900mg, 3.01mmol)과 2,3-디클로오로벤즈알데히드 (526mg, 3.01mmol)를 메탄올 (20mL)에 녹인 후, 분자 체 (3A^O, 3g)와 초산 (0.5mL)을 가하고 실온에서 30분간 교반하였다. 이 반응액을 얼음물로 냉각한 후 소디움시아노보로하이드라이드 (378mg, 6.02mmol)를 서서히 가하고 실온에서 4시간동안 교반하였다. 반응액중의 불용성물질을 여과하여 제거하고, 여액을 감압농축하여 미황색의 액상물질을 얻었다. 잔사를 에틸아세테이트 (200mL)에 녹이고, 증류수와 포화 중탄산나트륨수용액으로 세척하고 유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수한 후, 용매를 감압농축하였다. 이 잔사를 실리카겔 관 크로마토그라피 (디클로로메탄/메탄올 = 40/1, v/v)로 정제하여 무색 액상의 목적화합물 (334mg, 49%)을 얻었다.

R_f=0.3 (디클로로메탄/메탄올 = 20/1, v/v)

¹H-NMR (CDCl₃) δ 2.59(t, 2H), 2.81(t, 2H), 3.84(s, 2H), 5.15(s, 2H), 6.91(s, 1H), 7.07(d, 2), 7.20-7.26(m, 2H), 7.35-7.40(m, 1H), 7.49(s, 1H), 7.60(d, 2H)

실시예 1

N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-N-(4-메톡시페닐)티오카바모일-2-(트리플루오로메틸)벤질아민의 제조

참조예1의 〈단계5〉에서 제조한 N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-2-(트리플루오로메틸)벤질아민 (120mg, 0.312mmol)을 디클로로메탄 (10mL)에 녹이고 4-메톡시페닐 이소티오시아네이트 (62mg, 0.375mmol)를 가한 후 실온에서 3시간동안 교반하였다. 반응용매를 감압 농축한 잔사를 실리카겔 관 크로마토그라피 (디클로로메탄/메탄올 = 40/1, v/v)로 정제하여 고체상의 목적화합물 (165mg, 96%)을 얻었다.

R_f=0.3 (디클로로메탄/메탄올 = 40/1, v/v)

¹H-NMR(CDCl₃) δ 2.99(t, 2H), 3.78(s, 3H), 3.98-4.02(m, 2H), 4.97(s, 2H), 5.44(s, 2H), 6.84(d, 2H), 6.92(s, 2H), 7.03(d, 2H), 7.13(d, 2H), 7.35(d, 1H), 7.48-7.52(m, 2H), 7.57-7.64(m, 3H), 7.75(d, 1H)

실시예 2

N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-N-(2-메톡시피리딘-5-일)티오카바모일-2-(트리플루오로메틸)벤질아민의 제조

참조예1의 〈단계5〉에서 제조한 N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-2-(트리플루오로메틸)벤질아민 (120mg, 0.312mmol)을 디클로로메탄 (10mL)에 녹이고 2-메톡시피리딘-5-일 이소티오시아네이트 (62.3mg, 0.375mmol)를 가한 후 실온에서 3시간동안 교반하였다. 반응용매를 감압 농축한 잔사를 실리카겔 관 크로마토그라피 (디클로로메탄/메탄올 = 40/1, v/v)로 정제하여 고체상의 목적화합물 (122mg, 71%)을 얻었다.

R_f=0.3 (디클로로메탄/메탄올 = 40/1, v/v)

¹H-NMR(CDCl₃) δ 2.98(t, 2H), 3.90(s, 3H), 4.00(t, 2H), 5.00(s, 2H), 5.41(s, 2H), 6.71(d, 2H), 6.89(s, 1H), 7.14-7.27(m, 3H), 7.35(d, 1H), 7.47-7.53(m, 2H), 7.57-7.61(m, 3H), 7.34-7.80(m, 2H)

실시예 3

N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-N-(2-메톡시피리딘-5-일)티오카바모일-2-(트리플루오로메틸)벤질아민 염산염의 제조

실시예 2에서 제조한 N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-N-(2-메톡시피리딘-5-일)티오카바모일-2-(트리플루오로메틸)벤질아민 (675mg)을 에틸아세테이트 (20mL)에 녹이고 얼음물로 냉각한 후 염산 gas를 통과시켰다. 반응액을 에테르 (50mL)로 희석한 후 생성된 고체물을 여과 수집하고 감압건조하여 흰색 고체상의 목적화합물 (592mg, 77%)을 얻었다.

¹H-NMR(CD₃OD) δ 3.10(t, 2H), 4.01(t, 2H), 4.07(s, 3H), 5.16(s, 2H), 5.68(s, 2H), 7.17-7.43(m, 4H), 7.52-7.59(m, 2H), 7.63-7.80(m, 4H), 8.10-8.18(m, 2H), 9.04(s, 1H)

실시예 4

N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-N-(4-메톡시페닐)티오카바모일-(2,3-디클로오로)벤질아민의 제조

참조예 2에서 제조한 N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-(2,3-디클로오로)벤질아민 (115mg, 298mmol)을 디클로로메탄 (10mL)에 녹이고 4-메톡시페닐 이소티오시아네이트 (58mg, 358mmol)를 가한 후 실온에서 3시간동안 교반하였다. 반응용매를 감압 농축한 잔사를 실리카겔 관 크로마토그라피 (디클로로메탄/메탄올 = 40/1, v/v)로 정제하여 고체상의 목적화합물 (164mg, 99%)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ 2.97-3.05(m, 2H), 3.81(s, 3H), 3.95-4.03(m, 2H), 4.84(s, 2H), 5.46(s, 2H), 6.84(s, 1H), 6.90(d, 2H), 7.04-7.18(m, 5H), 7.27-7.34(m, 2H), 7.50-7.53(m, 2H), 7.60(d, 2H)

실시예 5

N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-N-(2-메톡시피리딘-5-일)티오카바모일-(2,3-디클로오로)벤질아민의 제조

참조예 2에서 제조한 N-2-{1-(4-시아노벤질)-1H-이미다졸-5-일}에틸-(2,3-디클로오로)벤질아민 (115mg, 298mmol)을 디클로로메탄 (10mL)에 녹이고 2-메톡시피리딘-5-일 이소티오시아네이트 (60mg, 358mmol)를 가한 후 실온에서 1시간동안 교반하였다. 반응용매를 감압 농축한 잔사를 실리카겔 관 크로마토그라피 (디클로로메탄/메탄올 = 40/1, v/v)로 정제하여 고체상의 목적화합물 (154mg, 94%)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ 2.95-3.03(m, 2H), 3.91(s, 3H), 3.94-4.03(m, 2H), 4.85(s, 2H), 5.43(s, 2H), 6.72(d, 2H), 6.91(s, 1H), 7.06-7.26(m, 3H), 7.34(t, 1H), 7.46-7.52(m, 2H), 7.60(d, 2H), 7.83(d, 1H)

시험예 1. K-라스 형질변환 세포주에 대한 증식억제 시험

K-라스 형질변환 세포의 생존능력을 측정하기 위하여 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드]비색정량법을 이용하였으며, 이 방법은 미토콘드리아 효소에 의해 MTT가 MTT-포르마잔으로 전환되는 원리에 근거한다. 세포를 96 웰 배양 프레이트에 각 웰당 200개가 되도록 100 ㎕의 배지에 부유시켜 각각 분주하고, 37^oC, 5% CO₂하에서 24시간 동안 배양하였다. 실시예에서 제조한 화합물을 배지에 용해시켜 적절한 농도의 시료를 제조한 다음, 이들 시료를 세포가 있는 웰 (well)에 100 ㎕씩 첨가하여 37^oC, 5% CO₂하에서 96시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS (phosphate buffered saline) 용액에 5 mg/ml가 되도록 모든 웰에 가해주고 다시 4시간 동안 배양한다. MTT가 포함된 배지를 완전히 제거하고, DMSO 100 ㎕를 각 웰에 가하여 MTT-포르마잔을 용해시켰다. 마이크로프랫트 리더 (microplate reader, DL1000, Dynatech Laboratories Co.)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 근거로하여 세포성장을 50% 억제하는 농도(IC₅₀)를 구하였다. 본 발명에 따른 화합물 중에서 보다 바람직한 화합물들에 대한 결과는 표 1과 같다.

표 1. K-라스로 형질변환된 세포주에 대한 증식억제 효과

화합물	IC₅₀(nM)	화합물	IC₅₀(nM)
실시예 1	11.4	실시예 2	1.4
실시예 3	1.4	실시예 4	1.8
실시예 5	6.0

상기 표 1의 결과로부터 본 발명에 따른 일반식(I)의 화합물은 라스 변이세포에 대한 매우 우수한 증식억제효과를 가지고 있음을 확인하였다.

시험예 2. FPTase 효소에 대한 억제 시험

파르네실화 단백질 트랜스퍼라제는 소의 뇌로부터 FPLC와 gel filtration을 이용하여 부분정제하여 사용하였다. 기질로는 대장균에서 발현 및 정제된 인체 재조합 K-라스4B (His6) 단백질을 사용하였고, 프레닐 잔기 공여체로는³H로 표지된 파르네실 피로포스페이트 (FPP)를 사용하였다. 반응 용액은 50 mM N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술포닉산) (HEPES), 5 mM-MgCl₂, 10 μM ZnCl₂, 5 mM 디티오쓰레이톨 (dithiothreitol), 0.2 % n-옥틸-베타-D-글루코피라노시드 조성물로 제조하였으며, 0.6 μg의 K-라스4B (His6) 단백질과 0.15 μCi의 [³H]FPP를 혼합한 후, 실시예의 화합물을 DMSO에 용해하여 가하였다. 여기에 FPTase 1.5 μg을 첨가하고 멸균된 증류수로 50 μl의 부피가 되도록 제조하였다. 반응은 37℃에서 1시간동안 수행하고, 4 % 소디움도데실술페이트 (SDS)를 90 ㎕ 및 30 % 트리클로로아세트산 (TCA)을 90 ㎕씩 차례로 가하여 종결하였다. 반응 용액을 얼음에서 60분간 방치한 후 침전된 단백질을 여과하여 모으고 4 % SDS와 6 % TCA가 포함된 수용액으로 세척하였다. 액체섬광계수기용 혼합액을 각각 5 ml 가한 후 액체 섬광 계수기 (Beckman 5801)로 반응 생성물의 방사선량을 측정하였다. 대조군의 방사선량을 100 %로 설정한 후 화합물 처리군의 상대적 방사선량을 백분율 (%)로 환산하여 억제도를 계산하였고, 이를 Litchfield-Wilcoxon 방법으로 IC₅₀값을 구하였다. 본 발명에 따른 화합물 중에서 보다 바람직한 화합물들에 대한 결과는 표 2와 같다.

표 2. FPTase 효소에 대한 억제 효과

화합물	IC₅₀(nM)	화합물	IC₅₀(nM)
실시예 1	1.6	실시예 2	2.4
실시예 3	2.4	실시예 4	0.4
실시예 5	0.4

상기 표 2의 결과로부터 본 발명에 따른 일반식(I)의 화합물들은 FPTase 효소에 대한 억제효과가 우수함을 확인하였다.

시험예 3. 라스-가공(ras-processing) 억제 시험

인체 K-라스4B 형질 변환 세포주를 10⁵개를 6-well 배양접시에서 배양한 다음, 화합물들을 10 μM 농도가 되도록 첨가하고 48 시간 동안 계속 배양하였다. 배양된 세포는 세포용해 완충용액 [Lysis buffer, 1×PBS(phosphate buffer saline), 1% Triton X-100, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 25㎍/ml 루펩틴(leupeptin), 16㎍/ml 벤즈아미딘 염산염, 1mg/ml Sigma-104 phosphate substrate] 1 ml에 부유시키고, 4℃에서 세포를 용해하였다. Pan-라스 항체결합 아가로스 (Y13,259)를 10 ㎕ 첨가하고 다시 4℃에서 2시간 동안 회전시키면서 반응시켰다. 면역침전된 단백질을 15 % SDS-아크릴아미드 전기영동에서 분리하고, Hybond-ECL 막 (Amersham Corp.)에 고착시켰다. 단백질이 고착된 막은 일차 항체로 항-K-라스 항체를 결합시키고, ECL kit (Amersham Corp.)를 사용하여 면역적 검출 (immunodetection)을 하였다. 15% SDS-아크릴아미드 전기영동에서 비가공된 K-라스는 프레닐화된 K-라스 단백질보다 느리게 움직이므로 세포에 처리된 저해제에 의한 FPTase의 억제 정도를 관찰하였다. 본 발명에 따른 화합물에 대해 측정한 결과 K-라스4B에 대한 라스-가공 억제 효과가 80% 이상으로 우수하게 나타난 것을 확인하였다

Claims

하기 일반식 (I)로 표시되는 티오우레아 유도체, 이들을 함유하는 약제학적으로 허용가능한 염

상기에서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 수소; 치환되거나 비치환된 직쇄상 또는 분지상의 C₁-C₈-알킬; C₂-C₆-알케닐; C₁-C₄-알콕시카르보닐; C₃-C₆-시클로알킬; 페닐; 1∼3개의 치환기를 갖는 페닐; 페닐-C₁-C₄-알킬; 나프틸; 디(C₁-C₄-알킬)아미노로 치환된 나프틸; 벤조일; 헤테로아릴; 1∼3개의 치환기를 갖는 피리딜; 또는 아다만틸이고, R3는 C₁-C₆-알킬; 페닐-C₁-C₄-알킬; 1∼3개의 치환기를 갖는 페닐로 치환된 C₁-C₄-알킬; 나프틸-C₁-C₄-알킬; 티오페닐-C₁-C₄-알킬; 피리딜-C₁-C₆-알킬; 옥시피리딜-C₁-C₆-알킬; C₁-C₆-알콕시-C₁-C₆-알킬; C₁-C₆-알킬티오-C₁-C₆-알킬; 또는 C₂-C₆-알키닐이고, A는 -(CH₂)n- 으로 n은 1-5이며 X는 니트로, 시아노 또는 메톡시를 나타낸다.
하기 일반식 (VII)로 표시되는 화합물과 R1R2-이소티오시아네이트 또는 R1R2-티오카바모일 할라이드를 반응시켜 하기 일반식(I)로 표시되는 티오우레아 유도체, 또는 이들을 함유하는 약제학적으로 허용가능한 염의 제조방법.

상기에서 R1, R2, R3, A 및 X는 제 1항에서 정의한 것과 동일하다.