KR20000048759A - Ｇ 단백질 커플링된 수용체 길항제 - Google Patents

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찰스 알. 맥캐이
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Abstract

본 발명은 C-C 케모킨 수용체 3 (CKR-3) 또는 Eos L2로 명명된 포유류(예를 들어, 사람)의 수용체 단백질을 코드화시키는 단리된 및/또는 재조합 핵산, 및 단백질에 관한 것이며, 본원에서는 단리된 재조합 포유류 CKR-3 수용체로서 언급된다. 본 발명은 본 발명의 수용체 단백질 또는 이들의 일부를 코드화시키는 핵산을 포함하는 핵산 구성물; 재조합 CKR-3 수용체 또는 폴리펩티드를 생성시키기에 유용한, 상기 구성물을 포함하는 숙주 세포; 및 연구 및 진단 분야에서 유용한, 수용체와 반응하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 리간드, 억제제(예를 들어, 길항제) 또는 수용체 기능의 프로모터(작용제)를 확인하기 위해 핵산, 단백질, 및 숙주 세포를 사용하는 방법을 또한 제공한다. 수용체 기능을 억제하거나 촉진하는 화합물의 개체 투여는 백혈구 기능의 선택적인 조절에의 새로운 방법을 제시하고 있으며, 이는 다양한 염증성 및 자가면역 질환에 유용하며, 또는 감염증의 치료에 유용하다. 호산구 및 림프구와 같은 백혈구에 존재하는 주요 백혈구 케모킨 수용체로서, 상기 수용체는 약물의 스크리닝 및 디자인을 위한 핵심적인 표적을 제공한다.

Description

Ｇ 단백질 커플링된 수용체 길항제 {G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR ANTAGONISTS}
배경 기술
인테크린(intecrine)이라 언급되기도 하는 케모킨(chemokine)은 화학유인제로서 기능을 하는 사이토킨족의 저분자량 일원이다. 케모킨은 단구, 대식세포, 호산구, 호염기성 세포, 비만세포, 및 T 세포, B 세포, 다형핵 백혈구(호중구)와 같은 림프구와 같은 백혈구를 포함하는, 혈액 형성 요소(적혈구세포 이외의)의 화학주성을 선택적으로 유도할 수 있다. 화학주성을 촉진시키는 것에 추가하여, 그 밖의 변화는 백혈구의 활성화와 관련된, 세포 모양의 변화, 세포내 유리 칼슘([Ca2+]i) 농도의 일시적인 상승, 미립 엑소사이토시스, 인테크린 상향조절, 생물활성 지질(예를 들어, 류코트리엔) 및 호흡성 방출을 포함하는, 반응 세포에서의 케모킨에 의해 선택적으로 야기될 수 있다. 그리하여, 케모킨은 염증성 매개체 방출, 감염 또는 염증 부위로의 화학주성 및 넘쳐 흐르게 하는 염증성 반응을 초기에 유발시킨다.
현재까지 특징화된 케모킨은 일차 구조에 관련된다. 케모킨은 두 개의 황화물 결합을 형성하는, 4개의 보존 시스테인을 공유한다. cDNA 클로닝 및 수개의 케모킨의 생화학적 특성은 단백질이 분비시 분해되어 약 92-99개의 아미노산의 성숙 단백질을 생성시키는, 20-25 아미노산의 선두 서열을 지니고 있다는 것을 나타낸다. 보존 시스테인 모티프에 기초하여, 상기 족은 두 개의 가지로 갈라지고 C-C 케모킨(β 케모킨) 및 C-X-C 케모킨 (α 케모킨)으로서 명명되며, 첫 번째 두 개의 보존된 시스테인은 각각 개입 잔기 부근에 있거나 개입 잔기에 의해 단리된다. [참고문헌: Baggiolini, M. and C.A. Dahinden, Immunology Today, 15: 127-133 (1994)].
C-X-C 케모킨은 효능성 키모 유인제이면서 인터루킨 8과 같은 호중구의 활성제, PF4 및 호중구-활성 펩티드 2 (NAP-2)인 다수의 키모 유인제를 포함한다. C-C 케모킨은 사람의 단구 화학주성 단백질 1-3 (MCP-1, MCP-2 및 MCP-3), RANTES (Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted), 및 대식세포 염증성 단백질 1α 및 1β(MIP-1α 및 MIP-1β)와 같은, 단구 또는 림프구의 화학유인제 및 활성제를 특징으로 하는, 분자들을 포함하지만, 뉴로필에 대한 유인제로 여겨지지 않는다. 예를 들어, 재조합 RANTES는 시험관내의 메모리 T 세포와 마찬가지로 단구에 대한 화학유인제이다[참고문헌: Schall, T.J. et al., Nature, 347: 669-671 (1990)]. 더욱 최근에, 분자에서 단일 시스테인쌍을 지니는 림포택틴이라 불리는 케모킨은 림프구를 유인하는 것으로 입증되었다[참고문헌: Kelner, G.S., et al., Science, 266: 1395-1359 (1994)].
알레르기성 염증에서 C-C 케모킨의 잠재적인 역할 때문에, C-C 케모킨은 중대한 관심사항이다. 예를 들어, MCP-1은 히스타민 및 류코트리엔 C4과 같은, 염증 매개자를 고수준으로 방출하는, 사람의 호염기성 세포의 엑소사이토시스를 유도한다. 유사하게, 케모킨 결합에 응하여 이들 세포 사건을 일으키는, C-C 케모킨에 대한 수용체에 커다란 관심을 두고 있다. C-C 케모킨에 대한 수용체는 최근에 클로닝시켜졌고 MIP-1α 및 RANTES로 보고되었다. 따라서, 이러한 MIP-1α/RANTES 수용체를 C-C 케모킨 수용체 1 (CKR-1)[참고문헌:Neote, K. et al., Cell, 72: 415-425 (1993); Horuk, R. et al., WO 94/11504, published May 26, 1994; Gao, J.-I. et al., J. Exp. Med., 177: 1421-1427 (1993)]이라 칭하였다. MCP-1 수용체를 또한 클로닝시켰다[참고문헌: Charo, I.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2752 (1994)]. CKR-2라 칭하여진, 이러한 수용체는 고친화도를 갖는 MCP-1와 저친화도를 갖는 MCP-3을 결합시키는 것으로 보고 되어 있다[참고문헌: Charo, I.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2752-2756 (1994)]. CKR-2는 명확한 세포질 테일을 생성시키는 이소형 A에서 또다른 접목 부위의 이용으로부터 생성되는 두 이소형에 존재하는 것으로 입증되었다. 이러한 영역에 접목되어 있지 않은, 이소형 B는 결합 및 신호 형질 도입 검정법에서 MCP-1 및 MCP-3에 대한 작용성 수용체인 것을 입증되었다[참고문헌: Charo, I.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2752-2756 (1994); Myers, S.J., et al., J. Biol. Chem., 270: 5786-5792 (1995)]. 더욱 최근에, CKR-4라 불리는 신규한 수용체가 기술되었다; 이러한 수용체로부터의 cRNA는 X. laevis 난모 세포에 주입되는 경우에 MCP-1, MIP-1α, 및 RANTES에 응하여 Ca2+활성화된 염화물 흐름을 생성시키는 것으로 보고 되었다[참고문헌:Power, C.A., et al., J. Biol. Chem., 270: 19495-19500 (1995)].
MCP-1 수용체 (CKR-2) 및 C-C 케모킨 수용체 1은 7개의 막 스패닝 G-단백질 결합 수용체의 상과에 속하는 것으로 예견된다[참고문헌: Gerard C., and Gerard, N.P., Annu. Rev. Immunol., 12: 775-808 (1994); Gerard C., and Gerard N.P., Curr. Opin. Immunol., 6: 140-145 (1994)]. G-단백질 결합(뱀 모양의) 수용체의 이러한 족은 7개의 막-스패닝 영역을 함유하는, 거대 그룹의 인테그랄 멤브레인 단백질을 포함한다. 이들 수용체의 리간드는 에피네프린 및 노르에피네프린과 같은 소량의 생물 유지에 꼭 필요한 아민 분자, 물질 P 및 뉴로키닌과 같은 펩티드, 및 케모킨과 같은 거대 단백질을 포함하는, 다양한 그룹의 분자를 포함한다. 수용체는 G 단백질과 결합되며, 이는 GTP에 결합하고, 예를 들어, 세포내 매개체의 생성에 의해 결합된 수용체로부터 신호 형질 도입을 매개할 수 있는 헤테로트리미터 조절 단백질이다.
두 개의 IL-8 수용체 cDNAs의 클론화 및 서열화는 이들 C-X-C 수용체 단백질이 7개의 막-스패닝 G 단백질-결합 수용체 단백질과 유사한 서열을 공유한다는 것을 나타낸다[참고문헌: Murphy P.M. and H.L. Tiffany, Science, 253: 1280-1283 (1991); Murphy et al., WO 93/06299; Holmes, W.E. et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)]. 아나필라톡신 C5a 및 박테리아성 포르밀화된 트리펩티드 fMLP와 같은 화학주성 단백질에 대한 추가의 수용체는 클론화를 특징으로 하며 이들 7개의 막-스패닝 단백질에 서열 유사성을 또한 공유케 하는 수용체를 코딩시키는 것으로 밝혀졌다[참고문헌: Gerard, N.P. and C. Gerard, Nature, 349: 614-617 (1991); Boulay, F. et al., Biochemistry, 29: 11123-11133 (1990)]. 중요한 서열 유사성 및 유사한 조직을 갖는 그 밖의 다수 단백질 및 공지된 케모킨 수용체로의 백혈구 부차 집단 분포가 확인되고 클로닝시켜졌지만, 이들 수용체에 대한 리간드는 여전히 한정되지 않는다. 따라서, 이들 단백질은 고아 수용체로서 언급된다.
추가 유전자 및 코딩시켜진 수용체의 분리 및 특성화, 및 해당 리간드의 특성화는 백혈구의 화학주성 및 세포 활성을 포함하여, 이들의 표적 세포와 케모킨의 상호작용 및 이러한 상호작용으로 인해 자극되는 사건을 이해하는데 필수적이다.
발명의 요약
본 발명은 C-C 케모킨 수용체 3 (CKR-3)이라 칭하여진 포유류(예를 들어, 사람) 수용체 단백질을 코드화시키는 단리 및/또는 재조합 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 수용체 단백질 또는 상기 수용체의 일부를 코드화시키는 핵산을 함유하는, 플라스미드 또는 RNA 종양 바이러스 벡터와 같은, 재조합 핵산 구성물에 관한 것이다. 핵산 및 구성물이 재조합 수용체 단백질을 생성시키는데 사용될 수 있다. 또다른 구체예에서, 핵산은 본 발명의 수용체를 부호화하는 제 2 핵산으로 혼성시킬 수 있는 앤티센스 핵산을 부호화시키며, 이는, 세포내로 도입시키는 경우에, 수용체의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 또다른 일면은 본원에 단리된, 재조합 포유류 CKR-3 수용체로서 언급된, 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 재조합 CKR-3 수용체 또는 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같이 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 하나의 구체예에서, 수용체 단백질은 에오택신, RANTES 및/또는 MCP-3와 같은, 하나 이상의 케모킨을 결합시키는 고친화성, 및/또는 (하나 이상의) 세포 반응(예를 들어, 화학주성, 엑소사이토시스, 하나 이상의 염증 매개체의 방출)을 촉진시키는 능력을 특징으로 한다.
예를 들어, 면역원, 또는 수용체 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 세포로서 수용체 또는 이들의 일부를 사용하여, 수용체와 반응하는 항체가 생성될 수 있다. 상기 항체 또는 이들의 단편은 치료, 진단, 및 정제 및 수용체 단백질의 연구, 표면 수용체를 발현시키는 세포의 확인, 및 세포의 소팅 및 카운팅을 포함하는 연구 분야에 유용하다.
수용체의 리간드 및 수용체 기능의 억제제(예를 들어, 길항제) 또는 프로모터(작용제)를 확인하는 방법은 본 발명에 포함되어 있다. 하나의 구체예에서, 세포내로 도입시켜진 핵산에 의해 코드화된 수용체 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 처리된 적당한 숙주 세포가 수용체 기능의 리간드 효능, 억제제 또는 프로모터를 확인하고 평가하는 검정법에 사용된다. 상기 세포는 발현된 수용체 단백질 또는 폴리펩티드의 기능을 평가하는데 또한 유용하다.
본 발명에 따르면, 수용체 기능을 하는 리간드, 억제제 및 프로모터를 확인하여 치료 효과에 대해서 추가로 평가할 수 있다. 리간드 및 프로모터가, 필요하다면, 보통의 수용체 기능을 촉진시키는데 사용될 수 있지만, 수용체 기능의 억제제가 수용체 활성을 감소시키거나 억제하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 각 개체(예를 들어, 포유류)에 수용체 기능의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 다양한 염증성 및 자가면역 질환에 유용한, 소염성 치료의 새로운 전략을 제공한다. 이와 대조적으로, 개체로의 리간드 또는 프로모터 투여에 의한 수용체 기능의 촉진은, 예를 들어, 기생물 감염증을 치료하는데 유용한, 백혈구 기능의 선택적인 촉진의 새로운 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1A-1C는 Eos L2 수용체로서 또한 언급되는 사람의 CKR-3 단백질을 코드화시키는 게놈 클론으로부터 결정된 누클레오티드 서열(서열 번호: 1) 및 개방-해독 프레임(open-reading frame)에 의해 코드화되는 단백질의 예견되는 아미노산 서열(서열 번호: 2)을 도시하고 있다.
도 2A-2B는 사람의 CKR-3 수용체를 코드화시키는 cDNAs로부터 결정된 누클레오티드 서열(서열 번호: 3), 및 개방-해독 프레임에 의해 코드화되는 단백질의 예견되는 아미노산 서열(서열 번호: 4)을 도시하고 있다.
도 3은 한 형태의 내피횡단 화학주성 검정법을 도시하는 개략도이다. 배양 삽입물을 웰 내부의 제 1 및 제 2 챔버를 발생시키는, 24-웰 플레이트에서의 웰과 같은 용기내에 위치시킨다. ECV304 내피세포를 삽입물의 내측 폴리카보네이트 막상의 단층에서 성장시켰다. 물질(예를 들어, 케모킨)에 반응에 대하여 평가하고자 하는 세포를 상부 챔버내로 도입시키고 물질을 바닥 챔버로 도입시킨다. 내피층을 통과하여 바닥 챔버내로 이동하는 세포를 검출하고, 삽입물을 제거하고 적당한 방법으로 세포를 검출하거나 셈하여 화학주성을 평가할 수 있다. 예를 들어, 바닥 챔버내의 세포를 수집하여 흐름 세포계수(예를 들어, FACS 분석, 광 흩뿌림)로 평가할 수 있다.
도 4는 다양한 케모킨에 응하여 사람 호산구의 화학주성을 나타내는 막대그래프이다. 표준 프로토콜을 사용하여 사람의 호산구를 정제하고, 24웰 피부횡단 화학주성 검정법에서 다양한 케모킨에 이들의 반응에 대한 현미경 검사로 평가하였다(높은 동력장(HPF)당 세포).
도 5는 Eos L2로 트랜스펙팅된 L1-2 pre-B 세포의 다양한 클론의 FACS 분석한 결과를 도시하는 그래프이다. 200개 이상의 클론으로부터의 세포를 M2 앤티-FLAG Mab로 착색시킨 후에, 앤티-마우스 Ig-FITC로 착색시켰다. (Y-축, 세포수; X-축, 형광성). 음성적 대조군(PAUL 001)에서, 트랜스펙팅된 세포를 무관계한 항체로 착색시켰다.
도 6은 사람의 호산구에 RANTES와 MIP-1α의 결합을 도시하는 막대그래프이다. 정제된 보통의 사람 호산구를 250nM에서 여러 가지 저온 케모킨(MIP-1α, RANTES, IL-8, MCP-1, MCP-3)의 존재 또는 부재하에 0.1 nM125I-표지된 MIP-1α 또는 RANTES ("고온")로 인큐베이팅시켰다.
도 7은 여러 가지 저온 케모킨(RANTES, MIP-1α, MCP-1, MCP-3)에 의해 사람의 호산구에125I-표지된 RANTES의 결합의 억제도를 도시하는 그래프이다. 사람의 호산구를 0.1nM 방사선 표지된 RANTES로 인큐베이팅시키고, 저온 케모킨의 농도를 나타내었다. 플로팅시켜진 자료는 평균치이고 각 샘플에 대한 이중치에서 벗어나는 값이다.
도 8은 Eos L2 감염된 SF9 세포에 0.1nM125I-표지된 ("고온") RANTES 또는 0.1nM125I-표지된 ("고온") MCP-3의 결합(cpm, 분당 세포의 수)을 도시하는 막대그래프이다. (좌측부터 우측으로: 단지 고온 RANTES; 고온 RANTES + 저온 RANTES; 단지 고온 MCP-3; 고온 MCP-3 + 저온 MCP-3).
도 9A-9D는 MAb LS26-5H12 및 흐름 세포계수를 사용하여 결정된 바와 같이 백혈구상에서 CKR-3 발현을 도시하는 그래프이다. 앤티-CKR-3 MAb LS26-5H12 (고형물 라인) 또는 IgG1이소형-조화된 대조군 항체 (MOPC-21)로 백혈구 서브셋을 착색시켰다(어두운 부분). 도 9A, 호산구; 도 9B, T 세포; 도 9C, 단구; 도 9D, 호중구. 프로피디움(propidium) 요오드화물 착색에 기초하여 죽은 세포를 배제시켰다.
도 10A-10C는 CKR-3 수용체(도 10A)로 일시적으로 트랜스펙팅된 L1.2 세포, 모의-트랜스펙팅된 L1.2 대조군 세포(도 10B), 또는 앤티-CKR-3 단일 클론성 항체 (LS26-5H12, 고형물 라인)를 갖는 세포주 E5 (안정한 L1.2 CKR-3 트렌스펙턴트)(도 10C)의 세포 표면 착색도를 도시하는 그래프이다. 대조군 단일 클론성 항체 MOPC-21로의 바탕 착색이 또한 도시되어 있다(어두운 부분).
도 11A-11D는 E5 세포주(CKR-3 수용체로 트랜스펙팅된 안정한 L1-2 세포주; 도 11A)에, 또는 사람의 호산구(도 11B)에 방사선 표지된 사람의 에오택신의 경합 리간드 결합의 결과를 도시하는 그래프이다. 0.6nM125I-표지된 에오택신 및 다양한 농도의 비표지된 에오택신(0), RANTES (△), 또는 MCP-3 (□)으로 세포를 인큐베이팅시켰다. 실온에서 60분 후에, 세포 펠릿을 세척하고 셈하였다. 비표지된 에오택신 경합의 Scatchard 플롯을 자료(도 11C, E5 세포주; 도 11D, 호산구)로부터 계측하였다.
도 12은 E5 세포주에 결합하는 사람 에오택신의 여러 가지 케모킨에 의한 억제도를 도시하는 막대그래프이다. 0.6nM 방사선 표지된 에오택신 및 250nM 비표지된 케모킨 또는 주지된 바와 같은 비경합물질로 E5 세포(안정한 L1-2/CKR-3 트렌스펙턴트)를 인큐베이팅시켰다.
도 13A-13C는 L1.2 세포 및 L1.2 수용체 트렌스펙턴트의 화학주성을 도시하는 막대그래프이다. E5 세포주 (안정한 L1-2/CKR-3 트렌스펙턴트) (도 13A), 어미 L1.2 세포주 (도 13B), 또는 IL-8 RB L1.2 수용체 트렌스펙턴트 라인 LSLW-2 (도 13C)의 1×106세포를 정상 챔버에 위치시켰고 케모킨을 특정 농도에서 바닥 챔버에 위치시켰다. 4시간 동안의 이동을 허여하고 바닥 챔버로 이동하는 세포의 수를 세었다. 모든 검정법을 이중으로 수행하였고 이들 결과는 적어도 세가지 개별적인 실험을 나타내었다. 케모킨은 X-축을 따라 기입되었고, 이동하는 세포의 수는 Y-축을 따라 기입되었으며, 케모킨의 농도는 Z-축을 따라 기입되었다.
도 14A-14B는 두 개의 다른 개체로부터 호산구의 화학주성 반응을 도시하는 그래프이다. 상기 반응은 CKR-3 L1.2의 반응과 흡사하다. 호산구 대 에오택신, RANTES, MCP-3, 및 MIP-1α의 화학주성 반응의 공여체 대 공여체 변화를 관찰하였다. 호산구를 혈액으로부터 정제하고, 다양한 농도의 케모킨에 대한 이들의 화학주성 반응을 평가하였다. 두 개의 동일한 혈액 공여체를 사용하여, 수행된 적어도 4개의 대표적인 실험으로부터의 수치가 매겨진다.
도 15는 비트랜스펙팅된 293 세포(채워진 원)로부터 막에 결합하는 것과 비교하여 A31 cDNA 클론 (중심점을 갖는 정사각형)으로 293 세포를 트랜스펙팅시켜서 수득된 안정한 세포주 (A31-293-20)로부터 막에125I-표지된 RANTES의 결합을 도시하는 그래프이다.
도 16은 비트랜스펙팅된 293 세포로부터 막에 결합하는 것과 비교하여 A31 cDNA 클론으로 293 세포를 트랜스펙팅시켜서 안정한 세포주(A31-293-20)로부터 막에125I-표지된 MCP-3의 결합을 도시하는 막대그래프이다. 트랜스펙팅된 (A31-20) 또는 비트랜스펙팅된 (UT293) 세포로부터 막에 표지된 MCP-3의 결합은 저온 MCP-3의 부재 (0nM) 또는 저온 MCP-3의 존재(100nM)시에 결정된다.
도 17은 트랜스펙팅된(A31-20) 또는 비트랜스펙팅된(UT293) 세포의 막으로부터 저온 MCP-3으로 대체될 수 있는 결합된125I-표지된 MCP-3의 수량을 결저함으로써 평가되어지는, 결합의 특이도를 도시하는 막대그래프이다.
도 18A는 항-CCR3 mAb 7B11로 스테이닝된, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CXCR1 (IL-8 RA) 또는 CXCR2 (IL-8 RB) 중의 어느 하나를 발현시키는 안정한 L1.2 트랜스펙턴트(transfectant)의 형광 세기의 FACs 프로파일을 도시한 도면이다. 모든 L1.2 트랜스펙턴트에 대한 네거티브 대조 스테이닝(도시되지 않음)은 CCR1 트랜스펙턴트에 대한 7B11에 대해 도시된 스테이닝과 비슷하였다.
도 18B는 mAb 7B11로 스테이닝된 사람 호산구, 림프구, T 세포 블라스트, 단구 및 과립구의 FACs 프로파일을 도시하는 도면이다. 스테이닝 프로파일은 4회 이상의 실험을 나타내었다.
도 18C는 L1.2 CCR3 또는 CCR1에 대한 방사성표지된 사람 에오택신, RANTES, MCP-2 또는 MCP-3의 결합, 및 mAb 7B11 또는 저온 케모킨에 의한 억제를 도시하는 막대그래프이다. 세포를 0.1 nM의125I-표지된 에스택신, RANTES, 또는 MCP-3, 및 100㎍/㎖ 중의 50㎕의 무관한 mAb (MOPC 21), mAb 7B11, 또는 250 nM의 저온 케모킨 중의 어느 하나와 인큐베이팅시켰다. 실온에서 60분 후에, 세포 펠릿을 세척하고, 계수하였다.
도 19는 mAb 7B11에 의한 사람 호산구에 대한 방사성표지된 에오택신, RANTES 및 MCP-3의 결합의 억제를 도시하는 그래프이다. 사람 호산구를 0.1 nM의125I-표지된 -에오택신, -RANTES, 또는 -MCP-3, 및 다양한 농도의 mAb 7B11와 인큐베이팅시켰다. 실온에서 60분 후에, 세포 펠릿을 세척하고, 계수하였다. 데이터를 칼레이다그래프(KaleidaGraph)에 의해 분석한 결과, 에오택신의 IC50은 25.7 ng/㎖이고, RANTES는 13.7 ng/㎖이며, MCP-3은 18.8 ng/㎖ 이었다. 250 nM의 저온 케모킨을 사용하는 억제의 수준은 플롯의 왼쪽 하부에 도시되어 있다:에오택신,RANTES 및MCP-3.
도 20A는 에오택신에 대한 호산구 화학주성의 mAb 7B11의 용량 반응을 도시하는 그래프이다. 세포(케모킨 비함유)의 백그라운드 이동의 수준은 기호에 의해 도시되어 있다 (플롯의 왼쪽 하부).
도 20B는 5㎍ 또는 20 ㎍/㎖의 7B11 mAb에 의해 다양한 화학유인제에 대한 호산구 화학주성의 억제를 도시하는 막대 그래프이다. 도 20A 및 도 20B 둘 모두에 도시된 실험의 경우에, 1 x 106사람 호산구를 트랜스웰의 상부 챔버내에 넣고, 10 nM의 케모킨을 하부 챔버에 넣었다. 다양한 농도의 7B11 mAb를 상부 웰에 넣었다. 1.5 간 후에, 하부 챔버로 이동하는 세포를 흐름 세포계수기를 사용하여 계측하였다. 결과는 4회 이상의 별도의 실험을 나타낸다.
도 21은 mAb 7B11이 RANTES, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4에 대해 반응하여 사람 호산구에 의해 [Ca2+]i를 억제시킴을 도시하는 일련의 트레이싱을 도시하는 도면이다. 사람 호산구를 Fura-2에 의해 표지시키고, mAb로 순차적으로 자극시킨 후 (A), 40초 후에 표시된 케모킨으로 자극시키고 (B), 100초 후에 C5a로 자극시켰다 (C). [Ca2+]i 형광성 변화를 분광형광계를 사용하여 기록하였다. 트래이싱은 상이한 공여체로부터의 호산구로 수행된 5회의 별도의 실험을 나타낸다. 상부 패널에서는, 무관한 대조 mAb (MOPC-21)을 사용하였고, 하부 패널에서는, mAb 7B11을 사용하였다. 항체를 6.4 ㎍/㎖의 최종 농도로 사용하였고, 케모킨을 10 nM의 에오택신, 20 nM의 RANTES, 200 nM의 MCP-2, 200 nM의 MCP-3, 10 nM의 MCP-4에서 사용하였다. C5a를 400 pM에서 사용하였다.
도 22A는 건강한 개체로부터 새롭게 단리시킨 호산구 상에서의 IL-8 수용체 발현을 도시하는 FACs 프로파일을 도시하는 도면이다. 호산구를 CXCR1 (실선), CXCR2 (점선) 또는 대조 mAb (음영)에 대해 mAb로 스테이닝시키고, 흐름 세포계수기에 의해 분석하였다.
도 22B는 IL-5 처리된 호산구 상에서의 IL-8 수용체 발현을 도시하는 FACs 프로파일을 나타낸다. 5일간 IL-5로 배양시킨 호산구를 도 22A와 같이 mAb로 스테이닝시켰다.
도 22C는 호산성 개체로부터 단리되고, 도 22A 및 22B에서와 같이 스테이닝된 호산구 상에서의 IL-8 수용체 발현을 도시하는 FACs 프로파일을 나타낸다.
도 22D는 mAb 7B11에 의한 다양한 케모킨에 대한 5일째 IL-5 프라이밍된 호산구의 [Ca2+]i의 억제를 도시하는 트래이싱을 나타낸다. 방법은 도 21의 범례에 설명된 방법과 동일하였다. 사용된 mAb 및 케모킨은 하기와 같다: 1. 대조 mAb, 에오택신, C5a; 2. 7B11, 에오택신, C5a; 3. 대조 mAb, RANTES, C5a; 4. 7B11, RANTES, C5a; 5. 대조 mAb, IL-8, C5a; 6. 7B11, IL-8, C5a. 결과는 3회 이상의 별도의 실험을 나타낸다.
도 23A는 단클론성 항체 7B11에 의한 에오톡신-, RANTES- 및 MCP-3-유도된 호산구 퍼옥시다아제의 봉쇄를 도시하는 막대 그래프이다. 투명 막대는 10 nM의 에오택신, 100 nM의 에오택신, 100 nM의 RANTES 또는 100 nM의 MCP-3 중의 어느 하나에 의해 방출된 EPO의 양을 나타낸다. 검은 막대는 10 ㎍/㎖의 7B11가 호산구 탈과립 검정에 존재하는 경우에 방출된 EPO의 양을 나타낸다. "블랭크"로 표시된 막대는 케모킨 비함유 대조군, 항체(완충) 비함유 대조군에 해당된다.
도 23B는 C5a 유도된 호산구 퍼옥시다아제 방출에 대한 mAb 7B11의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 투명 막대는 1 nM의 C5a에 의해 방출된 EPO의 양을 나타낸다. 검은 막대는 10 ㎍/㎖의 7B11가 호산구 탈과립 검정에 존재하는 경우에 방출된 EPO의 양을 나타낸다.
도 24A는 호산구 퍼옥시다아제(EPO) 및 호산성 양이온 단백질(ECP)의 방출에 의해 측정된 에오택신에 의해 유도된 호산구 탈과립을 도시하는 그래프이다.
도 24B는 호산구 퍼옥시다아제(EPO) 및 호산성 양이온 단백질(ECP)의 방출에 의해 측정된 C5a에 의해 유도된 호산구 탈과립을 도시하는 그래프이다.
도 25는 에오택신에 의한 호산구로부터의 퍼옥시다아제 방출의 자극을 도시하는 그래프이다.
도 26은 에오택신에 의한 호산구로부터의 글루커로니다아제 방출의 자극을 도시하는 그래프이다.
도 27은 에토택신에 의한 사람 호산구로부터의 아릴술파타아제 B 방출의 자극을 도시하는 그래프이다.
도 28은 전혈에서의 호산구 및 호염구 상에서의 CCR3의 발현을 도시한다. 전혈을 7B11-FITC로 염색시킨 후, 실시예 12에 기재된 바와 같이 스트렙타비딘 퀀텀 레드에 의해 항-사람 IgE 비오틴으로 염색시키고, 흐름 세포계수기에 의해 분석하였다.
도 29는 케모킨에 대해 반응하여 사람 호염구에 의한 히스타민 방출을 도시하는 막대 그래프이다.
도 30A는 에오택신 및 MCP-4에 반응하는 호염구 화학주성을 도시하는 그래프이다.
도 30B는 항-CCR3 mAb 7B11을 사용하는 에오택신 및 MCP-4에 반응하는 호염구 화학주성의 봉쇄를 도시하는 막대 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본원에 기술된 바와 같이, 신규한 사람 수용체, Eos L2 또는 C-C 케모킨 수용체 3 (CKR-3)을 코드화시키는 핵산을 분리하였다. 사람의 게놈 및 cDNA 클론 둘 모두를 특성화시켰다. 과호산구증가증을 앓고 있는 환자에게서 수득한 호산구로부터 구성된 호산구 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 분리하였다. 클론의 서열 분석법은 355개의 아미노산의 예견되는 단백질을 코드화시키는 1065개의 누클레오티드의 개방 해독 프레임을 함유하는 유전자(도 1A-1C 및 2A-2B; 서열 번호: 2 및 4)를 나타내었고, 이는 그 밖의 C-C 케모킨 수용체와의 아미노산 서열 유사성을 공유하며, 이는 G 단백질-결합된 수용체이고 7개의 막 스패닝 영역의 유사한 구조를 가질것으로 믿어진다.
CKR-3 게놈 및 cDNA 클론에 의해 코드화된 예견되는 단백질은 4개의 시스테인 잔기를 함유하며, 각 세포외 도메인에서의 각 잔기는 24, 106, 183 및 273 위치에 있다(서열 번호: 2 및 4). 이들 위치에서의 시스테인은 CKR-1, CKR-2, CKR-4, IL8-RA 및 IL8-RB를 포함하는, 모든 케모킨 수용체에서 보존된다. 또한, 이러한 수용체는, C-X-C 및 C-C 케모킨 수용체 사이에서 또한 주로 보존되며 세포내일 것으로 예견되는, 아미노산 모티프, DRYLAIVHA (잔기 130-138) (서열 번호: 2 및 4)를 함유한다. 단백질 키나아제 C 인산화반응(Kishimoto, A., et al., J. Biol. Chem., 260: 12492-12499 (1985); Woodgett, J.R., Eur. J. Biochem., 161: 177-184 (1986))에 대한 두 개의 콘센서스 부위가 있으며, 하나는 231 AA 위치의 제 3 세포내 루프에 있고, 또다른 하나는 333 AA 위치의 세포질 테일에 있다. 또한, 세포질 테일에 8개의 세린/트레오닌 잔기가 있으며, 상기 잔기는 호중구로부터 단리된 것[문헌: Haribabu, B. and R. Snyderman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9398 (1993)] 또는 그 밖의 관련 족원[문헌: Benovic, J.L., and Gomez, J., J. Biol. Chem., 268: 19521-19527 (1993); Kunapuli, P., and Benovic, J.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5588-5594 (1993)]과 같은 G-단백질 결합된 수용체 키나아제에 대해서 인산화반응 부위로서 사용될 수 있다. 세린/트레오닌 부화 세포질 테일은 또한 케모킨 수용체의 공통적2인 모습이다. CKR-1, CKR-2, CKR-4, IL-8RA 및 IL-8RB 수용체와 다르게, CKR-3는 어떠한 세포외 도메인에서도 N-결합된 해당화를 위한 부위를 함유하지 않는다. CKR-3 수용체 단백질은 C-C 케모킨 수용체 1과는 구별되며, 또한 MIP-1α/RANTES 수용체로서 언급된다.
게놈으로부터 수득된 핵산 서열 및 cDNA 라이브러리는 하기의 예외를 갖는 공통-선형이었다. 초기화 코돈의 업스트림으로 (도 2A의 78 위치에서) 두 개의 서열이 분기한다. 게놈 클론은 코딩 영역으로부터 프로모터 및 대부분의 5' 비번역된 영역을 분리시키는 인트론을 갖는 것으로 보인다. 이러한 게놈 배열은 IL-8 RA 및 RB [문헌: Ahuja, S.K., et al., J. Biol. Chem., 269: 26381-89 (1994); Sprenger, H., et al., J. Biol. Chem., 269: 11065-11072 (1994); Sprenger, H., et al., J. Immunol., 153: 2524-2532 (1994)] 및 CKR-1 [문헌: Gao, J.L., et al., J. Exp. Med., 177: 1421-1427 (1993)]을 포함하는, 그 밖의 7개의 막-스패닝 화학유인제 수용체[문헌: Gerard, N.P., et al., Biochemistry, 32: 1243-1250 (1993); Murphy, P.M., et al., Gene, 133: 285-290 (1993)]에서 밝혀진 것과 유사하다. 더욱이, 분기점 주변의 게놈 서열 조사를 통해 정준 봉합 수용체 서열을 알 수 있다.
초기 서열 정보는, 염기를 삽입한 후에 삭제하던가, 염기를 제거한 후에 삽입하여 생성된, cDNA 서열이 프레임내에서 이동되는 것으로 보이는 두 개의 영역을 나타낸다. 이들 변화는 263-266 위치 및 276-279 위치에서 각각 예견되는 단백질에서의 4개의 접촉하는 아미노산 차이를 야기시킨다. 그 밖의 차이는 예견되는 단백질의 182, 196, 197, 및 315 위치에서 아미노산 차이를 유발시킨다. 서열 번호: 5에 제시된 누클레오티드 서열은 둘 모두의 클론에 배열되어 있는 영역을 포함하는 콘센서스 서열이고, 초기 핵산 서열의 단순한 일렬 배열(염기 대 염기)에 의해 구성되었다. cDNA와 게놈 클론 사이의 초기 아미노산 차이가 Xaa로 주지된, 서열 번호: 6은 서열 번호: 5의 예견되는 단백질을 나타낸다. 그러나, 또다른 서열 분석법은 개방 해독 프레임의 누클레오티드 서열이 도 2B의 918-919 누클레오티드에 해당하는 위치에서만 차이가 나는 것으로 보인다는 것을 밝혔다. 게놈 클론은 이 위치에서 CG를 갖는 반면에, cDNA 클론은 이 위치에서 GC를 갖는다. 그리하여, 276 위치에서 트레오닌에 대한 게놈 클론 코드(ACG) 및 276 위치에서 세린에 대한 cDNA 클론 코드 (AGC). 상기 차이는 서열화의 애매모호성, 또는 역전사 동안에 cDNA로 도입되는 에러에 기인될 수 있다. 또한, 보존성 치환 (세린/트레오닌)은 개체들 사이의 다형성에 기인될 수 있었다. 또다른 대안은 차이가 cDNA 라이브러리 구조화를 위해 RNA가 수득된 환자의 호산구내 수용체 유전자의 변이에 기인된다는 것이다.
수용체의 N-말단 합성 펩티드를 사용하여 사람 수점의 C-C 케모킨 수용체 3에 대해 특이적인 단일 클론성 및 다중 클론성 항체를 생성시켰다. 하나의 단일 클론성 항체를 사용하는 FACS(형광 활성화된 세포 소팅) 분석법은 사람의 호산구상의 이러한 수용체의 중요한 발현을 나타내지만, 단구, 호중구, 림프구, T 세포, T 모세포 (CD3 MAb로 활성화시킴으로 인해 생성됨)를 포함하는 백혈구상에서 이러한 수용체의 발현을 나타내지 않는다(도 13A-13D). 정제된 백혈구 서브셋으로부터 RNA로 북부 지방 사람의 분석을 통해 이러한 패턴의 발현을 확인하였다. 그러나, 몇몇의 실험에서, CKR-3 mRNA 또는 수용체가 T 림프구에서 검출되었고; 따라서, CKR-3가 서브셋의 T 림프구상에서 발현되는 것이 가능하다(실시예 5). 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 사람 기원의 C-C 케모킨 수용체 3에 특이적인 단클론성 항체를 생성시켰다 (실시예 10). 7B11로 명명되는 mAb는 사람 기원의 C-C 케모킨 수용체 및 수용체의 기능의 항체 길항물질이다. 7B11 하이브리도마 세포주를 1996년 9월 25일에 미국 20852 메릴랜드 록크빌 파크라운 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC)에 부다페스트 조약하에 루코사이트, 인코포레이티드(주소: 미국 02142 메릴랜드 캠브리지 퍼스트 스트리트 215)를 대표하여 수탁 번호 HB-12195하에 기탁하였다.
게놈 및 cDNA 클론을 다양한 시스템에서 또한 발현시켰다. 트랜스펙팅된 포유류 세포 및 바큘로바이러스-트랜스펙팅된 곤충 세포상의 항체를 사용하였다. CKR-3를 발현시키는 포유류 세포의 안정한 트렌스펙턴트를 구성하여, 코드화된 수용체는 방사선 표지된 에오택신을 호산구에서 관찰된 결합 친화도와 비교하여 특이적이고 높은 친화도로 결합시키는 것으로 입증되었다. 트랜스펙팅된 포유류 세포에 관한 연구는 수용체가 RANTES와 MCP-3를 특이적이고 높은 친화도로 또한 결합시키지만, 시험되는 그 밖의 CC 또는 CXC 케모킨은 그러하지 않다는 것을 주지시키고 있다. 본원에 드러난 바와 같이, 결합 자료를 토대로 볼 때, 수용체 트렌스펙턴트는 에오택신, RANTES, 및 MCP-3에 응하지만, 그 밖의 어떠한 시험하려는 케모킨에 응하지 않는 화학주성 검정법에서 이동되는 뮤어라인(murine) B 세포 임파선에서 발생되었다. 수 개의 이종 시스템에서 발현되는 경우, 사람의 수용체는 사용 조건하에서 MIP-1α에 현저하게 결합하지 않는다. 더욱이, 호산구 및 호산구성 세포주를 사용하는 화학주성 및 리간드 결합 검정법은 RANTES 및 MCP-3가 반응기를 통해 호산구에 결합하며, 이는 C-C 케모킨 수용체 1, MIP-1α/RANTES 수용체와 다르다는 것을 주지시키고 있다.
호산구 화학유인제로서 MIP-1α의 역할을 문제삼아왔다. 몇 명의 연구자들은 화학주성 반응을 검출[참고문헌: Rot. A., et al., J. Exp. Med., 176: 1489-1495 (1995)]한 반면, 나머지 사람들은 그러하지 못했다(참조예: 도 4, 실시예 1)[참고문헌: Ebisawa, M., et al., J. Immunol., 153: 2153-2160 (1994); and Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., (1996)(발행중)]. 흥미롭게도, MIP-1α는 마우스에서 호산구 화학유인제이고, 이것은 뮤어라인의 CKR-3 상동물을 통해서 매개되는 것으로 보이며, 이는 뮤어라인 에오택신으로 또한 결합하고 신호를 전달하며[참고문헌: Post, T.W., et al., J. Immunol., 155: 5299-5305 (1995)], 상기 문헌에 대한 설명은 완전히 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 단백질 및 항체를 사용하여, 추가의 리간드, 및 CKR-3 수용체를 발현시키는 추가의 세포 형태(예를 들어, 호염기성 세포와 같은 백혈구)를 확인하였다. 포유류 CKR-3 수용체를 결합시키는 그 밖의 케모킨의 능력은 본 발명에 따라 평가되었다.
신규한 수용체를 코딩시키는 클론의 클론화 및 특성화, 및 에오택신, RANTES 및 MCP-3와 같은 케모킨에 반응하여 화학주성을 명백히 결합시키고 매개하는 신규한 CKR-3 수용체의 분리 및 특성화는 이러한 수용체가 케모킨에 반응하여 선택적인 백혈구 화학주성 및 활성화와 관계된 다수 족의 7개의 막 스패닝 G 단백질-결합된 수용체라는 것을 제안한다. CKR-3 수용체 및 이것의 포유류 상동물은 MIP-1α/RANTES 수용체 및 MCP-1 수용체와 구별된다(즉, C-C 케모킨 수용체 1 (CKR-1) 및 MCP-1 수용체 (CKR-2) 및 이들의 상동물 이외의 수용체임).
화학유인제에 반응하여 백혈구 화학주성의 선택적인 유도 및 백혈구 활성화에서 케모킨 수용체의 역할 때문에, 케모킨 수용체는 백혈구 이동시, 특히 염증과 관련된 이동시에 중요한 역할을 한다. 염증 및 감염 부위에서 생성된 케모킨은 조직에서 염증 부위로의 순환으로부터 선택된 백혈구 서브타입을 특이적으로 재순환시킨다. 백혈구 케모킨 수용체에 결합하는 케모킨에 후속하여, 인테크린 활성화가 일어나며, 백혈구는 백혈구 인테크린 및 내피세포 부착 분자를 통해서 내피세포벽에 단단히 부착한다. 백혈구는 편평한 모양이 되며, 조직의 염증 부위를 향하여 내피를 통하여 이동한다. 조직 또는 염증 부위에 대한 백혈구의 특이성은, 많은 경우에 있어서, 인테크린 및 세포 부착 분자상이의 케모킨-수용체 상호작용의 수준에서 결정된다.
RANTES 및 MCP-3는 호산구 및 호염기성 세포에 대한 가장 효능성 있는 화학주성 케모킨중에 하나이다. 또한, RANTES는 기억 T 세포, T 림프구의 부차 집단에 대한 화학유인제인 것으로 보고 되었다. 본원에서 보여진 바와 같이, RANTES 및 MCP-3는 호산구 및 호산구-유사 세포의 화학주성을 유도할 수 있다. 본원에 기술된 CKR-3 수용체 단백질은 RNATES와 MCP-3를 높은 친화성으로 결합시킨다.
본원에 더욱 상세하게 보여진 바와 같이, CKR-3는 (호산구에서 관찰된 결합 친화성과 비교하여) 에오택신을 특이적으로 및 높은 친화성으로 결합시키며, CKR-3 수용체는 이의 발현시에 주로 제한된다. PAF, C5a, 및 IL-16[참고문헌: A.J., et al., J. Clin. Invest., 78: 1701-1706 (1986); Gerard, N.P., et al., J. Biol. Chem., 264: 1760-1765 (1989); Rand, T.H., et al., J. Exp. Med., 173: 1521-1528 (1991)] 뿐만 아니라, RNATES 및 MCP-3와 같은, 호산구에 대하여 다수의 화학유인제가 확인되었지만[참고문헌: Baggiolini, M. and Dahinden, C.A., Immunol. Today, 15:127-33 (1994); Dahinden, C.A., et al., J. Exp. Med., 179:751-756 (1994); Kameyoshi, Y, et al., J. Exp. Med., 176:587-592 (1992); Rot, A., et al., J. Exp. Med., 176: 1489-1495 (1995)], 이들 화학유인제는 그 밖의 백혈구 세포 형태의 이동을 또한 유발시킨다. 이에 반하여, 케모킨 에오택신, 기니아 피그 및 후속하여 마우스 및 사람에서 본질적으로 확인된 효능성 있는 호산구 화학유인제는 호산구에 대하여 선택적으로 화학주성적이다[참고문헌: Jose, P.J., et al., Biochem. Biochem. Biophys. Res. Commun., 205: 788-794 (1994); Jose, P.J. et al., J. Exp. Med., 179: 881-887 (1994); Rothenburg, M.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 8960-8964 (1995); Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., (1996) (발행중)]. 또한, 에오택신은 CKR-3, 또는 CKR-1과 CKR-4를 결합시키는 MIP-1α[참고문헌: Neote, K., et al., Cell, 72: 415-425 (1993); Power, C.A., et al., J. Biol. Chem., 270: 19495-19500 (1995)]에 추가하여, CKR-1와 CKR-4를 결합시키는 MCP-3[참고문헌: Ben-Baruch, A., et al., J. Biol. Chem., 270: 22123-22128 (1995)]와 같은 케모킨에 대조적으로 고성능도로 CKR-3에 결합하고 CKR-3을 통해 신호화한다. 호산구상에서 CKR-3의 제한된 발현, 및 CKR-3에 결합하는 에오택신의 성능은 조직내에서 호산구의 선택적인 회복 및 이동에 대하여 효능성 있는 메커니즘을 제공한다. 이러한 관점에서, 조직내에서의 에오택신 생성은 선택적인 호산구 회복을 유발시킬 수 있고; 붉은털원숭이의 피부내로의 에오택신 주입은 선택적으로 호산구를 이동시킨다. 또한, 에오택신은 CKR-3 트렌스펙턴트의 시험관내 화학주성과 유사한, RANTES 보다도 10배 더 낮은 용량으로 체내에서 호산구를 회복시키는 것으로 입증되었다[참고문헌: Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., 97(3):604-612 (1996)].
결합, 신호화 또는 세포 반응의 자극화와 같은, 수용체 기능의 억제 또는 촉진을 통하여, 본 발명에 따른 포유류 CKR-3 수용체 기능의 조절은 백혈구-매개 염증성 활동, 특히 호산구 및/또는 T 세포의 염증성 활동을 억제하거나 촉진시키는 효과적이고 선택적인 방법을 제공한다. 본원에서 기술된 바와 같이 확인된 리간드, 억제제 및 CKR-3 수용체 기능의 프로모터는 치료용으로 백혈구 기능을 조절하는데 사용될 수 있다.
호산구는 MIP-1α 수용체를 발현시키지 않으며, 상당량의 MCP-1 수용체를 발현시키지 않는다. 또한, 상기에서 주지된 바와 같이, 에오택신 및 RANTES는 호산구에 대하여 가장 효능성 있는 화학유인제중의 몇 가지이며, 에오택신 및 RANTES는 CKR-3에 특이적이고 높은 친화성으로 결합시킨다. 주요 호산구 및 림프구 케모킨 수용체로서, CKR-3 수용체는 호산구 및/또는 T 림프구 기능을 방해하거나 촉진시키기 위한 중요한 표적이다. 본 발명의 방법에 따라 확인된 리간드, 억제제 및 프로모터와 같은, CKR-3 수용체 기능을 억제하거나 촉진시키는 화합물은 치료적인 목적을 위해 호산구 및/또는 T 세포 기능을 조절하는데 특히 유용하다.
예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CCR3 항체 7B11은 CCR-3에 대한 에오택신의 결합에 의해 유도된 호산구 탈과립을 억제시킨다 (실시예 11). 또한 본원에 입증된 바와 같이, 7B11은 에오택신 및 MCP-4에 대한 호염구 화학주성 뿐만 아니라 케모킨에 반응하여 호염구에 의한 히스타민 방출을 억제시킨다 (실시예 13).
케모킨 수용체 기타 명칭 현재까지 밝혀진 리간드
CCR1 CC CKR1 MIP-1α, RANTES, MCP-3
CCR2a,b MCP-1Ra,b MCP-1, MCP-3, MCP-4
CCR3 CKR-3 에오택신, RANTES, MCP-2,3,4
CCR4 RANTES, MIP-1α, MCP-1
CCR5 CC CKR5 RANTES, MIP-1α, MIP-1β
CXCR1 IL-8 RA, IL-8 R1 IL-8
CXCR2 IL-8 RB, IL-8 R2 IL-8, GROα, NAP-2, ENA-78
CXCR3 없음 IP-10, Mig
CXCR4 Fusin/humstr/Lestr SDF-1
핵산, 구성물 및 벡터
본 발명은 Eos L2 또는 C-C 케모킨 수용체 3 (CKR-3)이라 명명된 포유류 (예를 들어, 사람) 수용체 단백질 및 상기 수용체의 일부를 코드화시키는 서열을 갖는 단리된 및/또는 재조합된 (예를 들어, 본질적으로 순수함을 포함함) 핵산에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 핵산 또는 이들의 일부는 결합 활성 (예를 들어, 리간드, 억제제 및/또는 프로모터 결합), 신호화활성 (예를 들어, 포유류 G 단백질의 활성화 , 시토졸 유리 칼슘 [Ca2+]i의 농도의 신속하고 일시적인 증가 유발), 및/또는 세포 반응의 자극 (예를 들어, 화학주성, 백혈구에 의한 염증성 매개체 방출 또는 엑소사이토시스, 인테크린 활성화)과 같은, 포유류 C-C 케모킨 수용체 (예를 들어, 포유류 CKR-3 수용체)의 특성적인 적어도 하나의 기능을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 코드화시킨다. 본 발명은 더욱 명확하게는 포유류 CKR-3 수용체 또는 이들의 일부를 코드화시키는 서열을 포함하는 단리된 및/또는 재조합 핵산 또는 이들의 일부에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (1) (a) 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 5를 갖는 핵산, (b) 서열 번호: 1, 3 또는 5중의 어느 하나의 보체, (c) 코딩 영역(서열 번호:1의 누클레오티드 181-1245, 서열 번호:3의 누클레오티드 92-1156, 또는 서열 번호:5의 누클레오티드 15-1079)을 포함하는 전술한 것의 일부, 또는 U가 T에 대하여 치환된 전술된 것중의 어느 하나의 RNA 상대물에 혼성화되는 이들의 능력; 또는 (2) 아미노산 서열 번호:2, 서열 번호:4 또는 서열 번호:6을 갖는 폴리펩티드 또는 이들의 기능성 등가물(즉, 세포 반응(예를 들어, 화학주성, 엑소사이토시스 또는 백혈구에 의한 염증성 매개체 방출)을 자극할 수 있도록, 수용체의 하나 이상의 자연적이거나 생리학적인 리간드 및/또는 리간드 결합에 반응하는 자극성 기능에 대해 리간드 결합 활성을 갖는 폴리펩티드)을 코드화시키는 이들의 능력; 또는 둘 모두의 특성을 특징으로 하는 단리된 및/또는 재조합 핵산에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 서열 번호:2, 4 또는 6과 이들의 기능성 등가물 사이에서 아미노산 서열 동등성의 %는 약 70% 이상(≥70%)이다. 바람직한 구체예에서는, 서열 번호: 2, 4 또는 6의 기능성 등가물은 서열 번호: 2, 4 또는 6과 각각 80% 이상의 서열 동일성을 공유한다. 더욱 바람직하게는, 서열 번호: 2, 4 또는 6과 이들의 기능성 등가물 사이의 아미노산 서열 동등성의 %는 약 90%이상이며, 더욱 더 바람직하게는, 약 95%이상이다. 이들 표준과 만나는 단리된 및/또는 재조합 핵산은 천연 포유류 CKR-3 수용체 및 이들의 일부 서열에 동등한 서열, 또는 천연 서열의 변이체를 갖는 핵산을 포함한다. 상기 변이체는 하나 이상의 잔기의 추가, 삭제 또는 치환, 하나 이상의 잔기가 변화된 변화된 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA 상동물)에 의해 다른 변이를 포함하며, 변이는 하나 이상의 개질된 잔기를 포함한다.
상기 핵산은, 예를 들어, 매우 엄격한 조건 또는 보통의 엄격한 조건하에서의 혼성화하여 검출되고 분리될 수 있다. 핵산 혼성화에 대해 "매우 엄격한 조건" 및 "보통의 엄격한 조건"은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 1, Suppl. 26, 1991]의 2.10.1-2.10.16 페이지(특히, 2.10.8-11) 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 1, Suppl. 26, 1991]의 6.3.1-6 페이지에 기술되어 있고, 이에 대한 설명은 본원에 참조로 인용된다(참조예: 실시예 2). 프로브 길이, 염기 조성물, 혼성화 서열 사이의 % 부적당한 짝, 온도 및 이온 세기와 같은 인자는 핵산 혼성 안정성에 영향을 미친다. 따라서, 높은 또는 보통의 절박한(엄격한) 조건은 그 밖의 공지된 핵산이 상동물에 대해 비교되는 부분적으로 공지된 DNA의 특성에 따라 , 실험적으로 결정될 수 있다.
서열 번호: 1, 3 또는 5 또는 서열 번호:1, 3 또는 5중의 어느 하나의 보체를 갖는 핵산을 혼성화시키는 이들의 능력을 특징으로 하는 단리된 및/또는 재조합 핵산은 결합 활성(예를 들어, 리간드, 억제제 및/또는 프로모터 결합), 신호화 활성(예를 들어, 포유류 G 단백질의 활성화, 시토졸 유리 칼슘 [Ca2+]i농도의 신속한 및 일시적인 증가 유발), 및/또는 세포 반응의 자극(예를 들어, 화학주성, 에소사이토시스 또는 백혈구에 의한 염증성 매개체 방출, 인테크린 활성화)과 같은, 포유류 C-C 케모킨 수용체(예를 들어, 포유류 CKR-3 수용체)의 특성적인 하나 이상의 기능을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 추가로 코딩시킬 수 있다.
핵산을 혼성화시킴으로써 코딩시켜진 단백질 또는 폴리펩티드의 신호화 기능은 수용체 결합에 반응하는 G 단백질 활성에 대한 효소 검정법(예를 들어, 막의 분획을 사용하여, G 단백질 α 서브유닛에서 GDP에 대해서 GTP의 교환)에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, G 단백질에 의한 자극이 보르데텔라 백일해 톡신(Bordetella pertussis toxin)과 같은, G 단백질의 특이적인 억제제로 세포 또는 적당한 세포 분획(예를 들어, 막)의 처리 또는 전처리에 의해 블로킹되는 검정법을 사용하여 G 단백질 결합을 추가로 평가할 수 있다[참고문헌: Bischoff, S.C. et al., Eur. J. Immunol. 23: 761-767 (1993); Sozzani, S. et al., J. Immunol. 147: 2215-2221 (1991)].
핵산을 혼성화시킴으로써 코드화시켜진 단백질 또는 폴리펩티드 자극의 작용성은 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 사용하여, 화학주성 또는 매개체 방출에 대한 표준 검정법(예를 들어, 화학주성, 엑소사이토시스(예를 들어, 호산구 페록시다아제, β-글루쿠로니다아제와 같은 효소) 또는 리간드에 반응하여 매개체 방출(예를 들어, 에오택신, RANTES 또는 MCP-3와 같은 케모킨 또는 프로모터를 모니터링하는 검정법)에 의해 검정될 수 있다.
핵산을 혼성화시킴으로써 코딩시켜진 단백질 또는 폴리펩티드의 결합 작용성은, 예를 들어, 수용체 또는 세포 발현 수용체를 함유하는 막의 분획을 사용하는 결합 또는 결합 억제 검정법에서 검출될 수 있다(참조예: 실시예 9)[참고문헌: Van Riper et al., J. Exp. Med., 177: 851-856 (1993); Sledziewski et al., U.S. Patent No. 5,284,746 (Feb. 8, 1994)]. 그 결과, 에오택신, RANTES 또는 MCP-3, 억제제 및/또는 프로모터와 같은. 리간드에 결합하는 코드화된 단백질 또는 폴리펩티드의 능력이 평가될 수 있다. 포유류 CKR-3 수용체의 특성을 나타내는 작용성이 그 밖의 적당한 방법에 의해 검정될 수 있다(하기 내용 참조).
단독 또는 그 밖의 적당한 방법을 조합한 이들 방법은 서열 번호: 2, 4, 6을 갖는 아미노산 서열 또는 이들의 기능성 등가물을 갖는 폴리펩티드를 코드화시키는 핵산의 확인 및/또는 분리를 위한 방법에서 또한 사용될 수 있으며, 상기 검정법으로 활성을 검출할 수 있다. 특정 기능을 갖는 서열 번호: 2, 4 또는 6의 폴리펩티드 부분을 코드화시키는 일부의 단리된 핵산은 이러한 방법으로 확인하고 분리할 수 있다.
본 발명의 핵산은 단백질 또는 폴리펩티드의 생성시에 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유류 CKR-3 수용체에 대한 모든 또는 일부의 코딩 서열을 함유하는 핵산, 또는 서열 번호: 1, 3 또는 5, 또는 서열 번호: 1, 3 또는 5중의 어느 한 보체에 혼성화시키는 DNA는 적당한 숙주세포에서 코드화된 폴리펩티드의 생성 또는 서열을 추가로 조작하기 위해 발생된 다양한 구성물 및 벡터에 혼입된다.
본원에 사용되는 용어 "단리된"으로 언급된 핵산은 게놈 DNA 또는 오리진의 이들 공급원의 세포 RNA의 핵산(예를 들어, 세포의 형태 또는 라이브러리와 같은 핵산의 혼합물의 형태로 존재함)으로부터 단리된 핵산이며, 추가의 처리과정을 수행시킨다. "단리된" 핵산은 필수적으로 순수한 핵산을 포함하는, 본원에 기술된 방법, 유사한 방법 또는 그 밖의 적당한 방법에 의해 수득된 핵산, 화학적인 합성에 의해, 생물학적인 및 화학적인 방법을 조합하여 제조된 핵산, 및 단리된 재조합 핵산을 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "재조합"으로 언급된 핵산은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 및/또는 제한 효소를 사용하여 벡터내로의 클론화와 같은, 인공적인 재조합의 방법에 의존하는 방법에 의해 발생되는 이들 핵산을 포함하는 재조합 DNA 방법론에 의해 제조된 핵산이다. "재조합" 핵산은 세포의 자연적인 메커니즘을 통해서 발생하는 재조합 사건으로부터 유발되지만, 바람직한 재조합 사건을 허여하고 가능하도록 예정된 핵산의 세포로의 도입 이후에 선택되는 핵산이다.
앤티센스 구성물
또다른 구체예에 있어서, 핵산은 센스 가닥을 포함하는 표적 분자에 전체 또는 부분적으로 보충된 앤티센스 핵산이며, 표적 분자와 혼성화시킬 수 있다. 표적은 DNA, 또는 이것의 RNA 상대물(즉, 여기서 DNA의 T 잔기가 RNA 상대물에서 U 잔기임)일 수 있다. 당해기술에 공지된 방법 또는 그 밖의 적당한 방법을 사용하여 세포내로 도입시키는 경우에, 앤티센스 핵산은 센스 가닥에 의해 코드화된 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 앤티센스 핵산은 표준 기법에 의해 생성될 수 있다.
하나의 구체예에서, 앤티센스 핵산은 표적 핵산에 전체적으로 또는 부분적으로 상보적이고 표적 핵산과 하이브리다이징 할 수 있으며, 여기에서 표적 핵산은 서열 번호: 1, 3 또는 5의 보완물의 서열을 갖는 핵산에 하이브리다이징 할 수 있다. 예를 들어, 앤티센스 핵산은 서열 번호: 5 또는 하이브리다이제이션을 허여하기에 충분한 이들의 일부를 갖는 표적 핵산에 상보적일 수 있다. 또다른 구체예에 있어서, 앤티센스 핵산은 포유류 CKR-3 수용체(예를 들어, 사람의 Eos L2 수용체)를 코드화시키는 표적 핵산에 전체적으로 또는 부분적으로 상보적이며, 표적 핵산으로 혼성화시킬 수 있다.
앤티센스 핵산은 연구 및 치료 분야를 포함하여, 많은 목적에 대해 유용하다. 예를 들어, 앤티센스 핵산을 포함하는 구성물은 적합한 세포내로 도입되어 수용체 발현을 억제시킬 수 있다. 상기 세포는, 예를 들어, 모세포 또는 그 밖의 관련 세포 타입과의 수용체-리간드 상호 작용의 특이성을 검정하는데 중요한 대조 세포를 제공한다. 또다른 일면에서, 상기 구성물은 포유류의 일부 또는 모든 세포내로 도입된다. 앤티센스 핵산은 수용체 발현을 억제하고 구성물을 함유하는 세포내의 CKR-3 수용체에 의해 매개된 염증 과정이 억제될 수 있다. 이와 같이, 염증 질환은 본 발명의 앤티센스 핵산을 사용하여 치료될 수 있다. 앤티센스 구성물을 포함하는 적합한 실험용 동물은 백혈구 기능의 결핍, 및 특히 호산구 결핍에 대해 유용한 모델을 제공할 수 있고, CKR-3 수용체 기능과 관련된 정보를 추가적으로 제공할 수 있다. 상기 동물은 숙주 방어에서 호산구 및/또는 T 림프구와 같은 백혈구의 역할을 설명하는데 유용한 염증성 질환의 중요한 모델을 제공할 수 있다.
포유류 핵산
사람의 염증성 및 자가면역 질환과 기생성 감염증의 이해 및 치료에서의 증진은 매우 중요하기 때문에, 사람의 CKR-3은 본원에 설명된 대부분의 실험적으로 연구하기 위해 선택된 종이다. 그러나, 사람의 CKR-3(Eos L2)의 게놈 및 cDNA의 단리 및 조절, 벡터 및 숙주 스트레인의 구성, 및 수용체 또는 이것의 단편의 생성 및 사용을 위해 설명된 방법은 영장류(예를 들어, 원숭이(예를 들어, 시노몰구스 원숭이)와 같이, 사람 이외의 영장류), 소과(科)(예를 들어, 암소), 양과(科)(예를 들어, 면양), 말과(科)(예를 들어, 수말), 개과(科)(예를 들어, 수캐), 고양이과(科)(예를 들어, 집고양이) 및 설치류(예를 들어, 기니아 피그, 래트, 마우스와 같은 쥐과(科)) 종을 포함하는(제한하지는 않음) 다른 포유류 종에 적용될 수 있다. 단리 및/또는 재조합 또는 합성된 것이든 간에, PCR에 의해 제조된 코드화 서열내의 단편을 포함하여, 본원에 설명된 사람 CKR-3 cDNA 및 게놈성 클론, 또는 이것의 충분한 부분은 프로브로서 사용되어 다른 포유류종으로부터 상동 CKR-3 유전자(상동체) 또는 다른 관련 수용체 유전자(예를 들어, 신규 C-C 케모킨 수용체 유전자를 검출 및/또는 회수(예를 들어, 하이브리드 형성화, PCR 또는 그 밖의 적합한 기술에 의함)할 수 있다. 이는 본원에 설명된 방법 또는 그 밖의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
단백질 및 펩티드
본 발명은 또한 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 및 폴리펩티드는 단리 및/또는 재조합될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "단리된" 단백질 또는 폴리펩티드는 이들이 포유류 세포내에 존재하는 상태 이외로 정제된 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "단리된" 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 설명된 방법, 유사 방법 또는 적합한 다른 방법에 의해 수득된 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하고, 본질적으로 정제된 단백질 또는 폴리펩티드, 화학적 합성, 또는 생물학적 및 화학적 방법의 조합에 의해 제조된 단백질 또는 폴리펩티드, 및 단리된 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 "재조합된 것"으로서 언급된 단백질 또는 폴리펩티드는 재조합 핵산의 발현에 의해 제조된 단백질 또는 폴리펩티드이다.
바람직한 구체예에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 결합 활성도(예를 들어, 리간드, 억제자 및/또는 프로모터 결합), 신호화 활성도(예를 들어, 포유류 G 단백질의 활성화, 시토졸 유리 칼슘[Ca2+]i의 농도의 빠르고 과도한 증가, 및/또는 세포 반응의 자극(예를 들어, 백혈구, 인테크린 활성화에 의한 화학주성, 엑소사이토시스 또는 염증 매개체 방출의 자극)과 같은 포유류 CKR-3 수용체의 하나 이상의 작용 특성을 갖는다. 상기와 같이, 이러한 단백질은 포유류원의 CKR-3 단백질 또는 포유류 케모킨 수용체 3 단백질로서 간주되고, 예를 들어 천연 포유류 CKR-3 수용체, 이 단백질의 변이체 및/또는 이것의 일부를 포함한다. 상기 변이체는 다형 변이체 및 천연 또는 인공 변종, 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 삭제 또는 치환에 의한 분화물, 또는 하나 이상의 잔기가 변형된 변형 폴리펩티드, 및 하나 이상의 변형 잔기를 포함하는 변종을 포함한다. 예로는 에오택신에 결합하는 포유류 CKR-3 수용체 단백질이 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 천연 포유류 CKR-3 수용체 또는 폴리펩티드와 같이, 본 발명의 포유류 CKR-3 수용체는 하나 이상의 천연 또는 생리학적 리간드에 대한 리간드 결합 작용 및/또는 리간드 결합에 반응하는 자극 작용으로, 세포 반응을 자극시킬 수 있다(예를 들어, 백혈구에 의한 화학주성, 엑소사이토시스 또는 염증 매개체 방출의 자극). 예를 들어, 사람 케모킨 수용체 3 단백질의 경우에, 단리된 사람 CKR-3 단백질은 하나 이상의 천연 또는 생리학적 리간드에 결합할 것이다. 본원에 제시된 바와 같이, 단리된 사람 CKR-3 단백질은 에오택신 및 특히 RANTE을 결합시키고 고친화성을 갖고, 특히 MCP-3을 결합을 결합시킨다. 한 구체예에서, 사람 CKR-3 수용체 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 리간드 결합의 결과로 백혈구에 의한 화학주성, 엑소사이토시스 또는 염증 매개체 방출을 일으킨다.
본 발명은 추가로 자연에서 발견되는 포유류 CKR-3 수용체에서 발생하지 않는 제 2 부분에 결합되는 제 1 부분으로서, 포유류 CKR-3 수용체 단백질 또는 폴리펩티드(상기에 설명된 것)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 이와 같이, 제 2 부분은 아미노산 또는 폴리펩티드일 수 있다. 제 1 부분은 융합 단백질에 대해 N-말단, C-말단 또는 내부에 위치할 수 있다. 한 구체예에서, 융합 단백질은 제 1 부분으로서 사람 CKR-3 수용체, 및 결합제 서열 및 친화성 리간드(예를 들어, 효소, 항원, 에피토프 표지)를 포함하는 제 2 부분을 포함한다.
융합 단백질은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예는 블루스크립트ⓡII SK +/- (스트라타진), pGEX-4T-2(파마시아) 및 pET-15b(노바겐)과 같은 적합한 발현 벡터로의 CKR-3 유전자 또는 이의 일부의 삽입에 의해 제조될 수 있다. 그리고 나서 생성된 구성물은 발현을 위해 적합한 숙주 세포내로 도입된다. 발현시에, 융합 단백질은 적합한 친화도 매트릭스에 의해 세포 용해물로부터 분리되거나 정제될 수 있다[참고 문헌: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991))]. 부가적으로, 친화도 라벨은 융합 단백질중에 존재하는 CKR-3 수용체 단백질 또는 폴리펩티드를 검출하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 항원 또는 에피토프 친화도 라벨을 포함하는 융합 단백질의 특정 세포 분율중에서의 세포 표면 발현 또는 존재는 적당한 항체에 의해 검출될 수 있다 (예를 들어, 실시예 3 참조).
본 발명은 또한 사람 CKR-3 수용체의 단편과 같은 포유류원의 CKR-3 수용체의 분리 및/또는 재조합 부분에 관한 것이다. 하기에서 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 포유류 CKR-3 수용체의 부분(예를 들어, 합성 펩티드)은 제조되어 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 선택된 포유류 CKR-3 수용체의 분리 및/또는 재조합 부분(예를 들어, 펩티드)는 하나 이상의 면역 성질을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 수용체의 일부과 관련하여, 면역 성질은 면역반응성(본 발명의 포유류 CKR-3 수용체 단백질, 및 이의 일부에 대해 증가된 항체에 의한 결합), 면역유전성(적당한 면역화 프로토콜에 사용되는 경우 그 자체에 대한 항체 반응을 유도). 및/또는 교차-반응성(선택 포유류 수용체와 반응성인 항체 유도)을 포함한다. 그러므로, 결합 활성도, 신호화 활성도, 또는 자극 작용(세포 반응의 자극)와 같은 포유류 CKR-3 수용체의 하나 이상의 작용 특성을 갖는 일부 CKR-3 수용체가 제조될 수 있다. 포유류 G 단백질-커플 수용체의 구조 및 작용에 대한 확대 연구는 포유류 CKR-3 수용체를 작용성 도메인으로 분할할 수 있는 기초를 제공한다 [참고 문헌: Lefkowitz et al., J. Biol. Chem., 263: 4993-4996 (2988); Panayotou 및 Waterfield, Curr. Opinion Cell Biol., 1: 167-176 (1989)]. 추가로, 수용제의 일부가 제조될 수 있으며, 이는 그 자체에 대해 전체 또는 부분 작용을 가지거나, 제 2 수용체의 또다른 일부와 결합하는 경우(전체, 부분, 또는 비작용성일지라도), 포유류 CKR-3 수용체의 하나 이상의 작용 특성(예를 들어, 리간드-, 억제제- 또는 프로모터-결합 작용)을 갖는 작용성 단백질을 구성한다 [참고 문헌: Sledziewski et al., U.S. Patent No. 5,284,746, 이 특허는 시험 샘플중의 리간드의 존재를 검출하는데 유용한 혼성 G 단백질-커플 수용체의 구성 및 사용에 관한 것이다].
재조합 포유류 CKR-3 수용체를 제조하는 방법
본 발명의 또다른 일면은 포유류 CKR-3 수용체 또는 이의 일부를 제조하는 방법에 관한 것이다. 포유류 CKR-3 수용체 또는이의 일부의 발현에 적합한 구성물이 또한 제조된다. 구성물은 적합한 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 재조합 포유류 CKR-3 수용체 또는 이의 일부를 발현시키는 세포는 배양중에 분리되고 유지될 수 있다. 상기 세포는 특징화, 분리 및/또는 정제를 위한 단백질의 제조와 같은 다양한 목적, 및 리간드, 또는 리간드 결합의 억제제 또는 프로모터의 검출을 위한 결합 검정에 유용하다. 적합한 숙주 세포는 원핵 세포일 수 있고, E. coli, B. subtilis 및 다른 적합한 박테리아와 같은 박테리아성 세포, 또는 균질 또는 이스트 세포(예를 들어, Pichia pastoris, Aspergillus 종, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa)와 같은 진핵 세포, 또는 다른 저급 진핵 세포, 및 곤충 세포(예를 들어, Sf9 곤충 세포) 또는 포유류 세포(예를 들어, 293 세포, 중국산 햄스터 난소 세포(CHO))와 같은 고급 진핵 생물의 세포를 포함한다 [참고 문헌: Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 및 John Wiley & Sons Inc., (1993)]. 따라서, 본 발명은 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 기능성 부분을 생성시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 수용체 또는 이것의 기능성 부분을 코딩하는 재조합 핵산을 함유하는 숙주 세포를 핵산의 발현에 안정한 조건하에 유지시킴으로써, 코드화된 단백질을 발현시키고, 상기 수용체 또는 이것의 부분을 생성시키는 것을 포함한다.
재조합 포유류 CKR-3 수용체 단백질, 이의 일부 또는 융합 단백질을 제조하는 숙주 세포는 하기와 같이 제조될 수 있다. 포유류 CKR-3 수용체 또는 융합 단백질에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 코드화하는 핵산은 발현을 위한 플라스미드, 바이러스 또는 다른 적합한 레플리콘과 같은 핵산 벡터, 예를 들어 DNA 벡터내로 삽입될 수 있다. 단일 복사체 또는 다수 복사체중에 유지되거나, 숙주 세포 염색체내로 통합되는 벡터를 포함하여, 다양한 벡터가 유용하다.
선택된 CKR-3 수용체의 전사 및/또는 번역 시그날은 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 적합한 발현 벡터가 유용하다. 포유류 CKR-3 수용체 또는 융합 단백질에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 코드화하는 핵산의 발현에 적합한 벡터는 제한하지 않고서 하기중 하나 이상을 포함하는 많은 부가 성분을 함유할 수 있다: 복제의 기원; 선택성 마커 유전자; 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 증강제, 종결제), 및/또는 하나 이상의 번역 시그날과 같은 하나 이상의 발현 조절 요소; 시그날 서열 또는 리더 서열(벡터 또는 수용체에 의해 코드화된 막 표지화용).
프로모터는 적당한 숙주 세포에서 발현을 위해 제공된다. 프로모터는 구조적이거나 유도성일 수 있다. 벡터에서, 프로모터는 수용체 단백질, 이의 일부 또는 융합 단백질을 코드화하는 핵산에 실시가능하게 결합되고, 코드화된 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있다. 원핵 숙주 세포(예를 들어, E. coli에 대한 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵 숙주 세포(예를 들어, 이스트 알코올 탈수소 효소(ADH1), SV40, CMV)에 대한 다양한 적합한 프로모터가 유용하다.
부가적으로, 복제성 발현 벡터인 경우에, 발현 벡터는 전형적으로 벡터를 운반하는 숙주 세포 및 기원 또는 복제물의 선택에 대한 선택성 마커를 포함한다. 항생 물질 또는 약제 내성을 제공하는 생성물을 코드화시키는 유전자는 통상적인 선택성 마커이고 원핵 세포(예를 들어, β-락타마아제 유전자(암피실린 내성), 테트라시클린 내성에 대한 Tet 유전자) 및 진핵 세포(예를 들어, 네오미신(G418 또는 게네티신), gpt(미코페놀산), 암피실린, 또는 히그로미신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디히드로폴레이트 환원제 마커 유전자는 많은 숙주에서 메토트렉세이트로의 선택을 가능케 한다. 숙주 세포(예를 들어, LEU2, URA3, HIS3)의 영양 요구성 마커의 유전자 생성물을 코드화시키는 유전자는 종종 이스트중의 선택성 마커로서 사용된다. 바이러스성(예를 들어 바큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 레트로바이러스성 벡터와 같은, 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 벡터의 사용이 또한 숙고된다. 본 발명은 또한 상기 발현 벡터를 운반하는 세포에 관한 것이다.
수용체 단백질 또는 폴리펩티드를 코드화시키는 핵산이 벡터내로 삽입되고, 상기 성분 중 하나 이상에 실시가능하게 결합되고, 생성된 구성물이 발현에 적합한 조건하에서 유지되는 숙주 세포내로 도입되는 경우에, 수용체 단백질 또는 폴리펩티드는 생성된다. 구성물은 선택된 숙주 세포에 적합한 방법(예를 들어, 형질 전환, 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 감염)에 의해 세포내로 도입될 수 있다. 수용체의 생성을 위해서, 구성물을 포함하는 숙주 세포는 발현에 적합한 조건하에서, 예를 들어 유도 인자(예를 들어, n-부티산염), 적당한 염으로 보충된 적합한 매질, 성장 인자, 항생 물질, 영양 보충물 등의 존재하에서 유지된다.
항체
본 발명은 추가로 CKR-3 수용체 또는 이의 일부와 반응하는 항체에 관한 것이다. 한 구체예에서, 항체는 분리 및/또는 재조합 포유류 CKR-3 단백질(이의 일부(예를 들어, 펩티드) 포함)에 대해 증가한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 CKR-3 수용체 또는 이의 일부와 특이적으로 결합한다. 포유동물 CKR-3 (CCR3)의 특징인 하나 이상의 기능, 예를 들어 결합 활성, 신호화 활성 및/또는 세포 반응의 자극을 억제시킬 수 있는 항체는 또한 본 발명에 의해 포함되며, 예를 들어 CKR-3에 대한 리간드(즉, 하나 이상의 리간드)의 결합 및/또는 리간드에 반응하여 CKR-3(CCR3)에 의해 매개되는 하나 이상의 기능을 억제할 수 있는 항체이다. 예를 들어, 단클론성 항체 7B11은 사람 CKR-3(CCR3)에 대한 에오택신, RANTES, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4의 결합을 억제할 수 있다. 또한, 7B11은 케모킨 유도된 칼슘 플럭스, 호산구 및 호염구 화학주성, 히스타민 방출 및 기타 과립 성분의 방출을 포함하는 사람 CKR-3(CCR3)에 의해 매개된 기능을 억제할 수 있다. 따라서, 수용체에 대한 리간드의 결합을 블록킹하고 수용체에 대한 리간의 결합과 관련된 기능을 억제하는, 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 대해 결합 특이성을 갖는 항체는 본 발명의 구체예이다.
특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 사람 CKR-3에 대해 특이성을 가지며, 본원에 기술된 쥐과동물 7B11 단클론성 항체의 특이성과 유사한 에피토프 특이성을 갖는다. 쥐과동물 7B11 단클론성 항체의 특이성과 유사한 에피토프 특이성을 갖는 항체는 예를 들어, 사람 CCR3에 결합하기 위해(예를 들어, 호산구, 호염구와 같은 사람 CCR3 함유 세포 또는 본 발명의 핵산으로 트랜스펙팅된 세포에 대해) 쥐과동물 7B11와 경합하는 이들의 능력에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있고(예를 들어, 실시예 5 참조), 용어 "항체"는 다클론성 및 단클론성 항체 2가지 모두를 포함한다. 본 발명의 항체는 분리 및/또는 재조합 포유류 CKR-3 수용체 단백질 또는 이의 일부와 같은 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 합성 펩티드와 같은 합성 분자를 포함하여, 적당한 면역원에 대해 증가될 수 있다. 부가적으로, 트랜스펙팅된 세포와 같은 수용체를 발현시키는 세포는 면역원으로서 사용되거나 수용체를 결합시키는 항체에 대한 스크린에서 사용될 수 있다 [참고 문헌: Chuntharapai et al., J. Immunol. 152: 1783-1789 (1994)].
면역 항원의 제조, 및 다클론성 및 단클론성 항체 생성은 모든 적합한 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 방법이 하기 문헌에 기술되어 있다: Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) 및 Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al., U.S. 특허 제 4,172,124 호; Harlow, E. 및 D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11, (1991). 일반적으로, 히브리도마는 적합한 불멸 세포 라인(예를 들어, SP2/0 과 같은 골수종 세포 라인)이 항체-생성 세포와 융합됨으로써 제조된다. 항체-생성 세포, 바람직하게는 지라 또는 림프 노드의 세포가 관심의 항원으로 면역된 동물로부터 수득된다. 융합 세포(히브리도마)는 선택 배양 조건을 사용하여 분리되고 희석을 제한함으로써 클론된다. 원하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 세포는 적합한 검정(예를 들어, ELISA)에 의해 선택된다.
단일 사슬 항체, 및 상이한 종으로부터 유도된 부분을 포함하는, 키메라성 또는 CDR-이식 단일 사슬 항체 이외에 키메라성, 인체 적용 또는 영장류성(CDR-이식) 항체도 또한 본 발명 및 용어 "항체"에 포함된다. 상기 항체의 많은 부분은 통상적인 기술에 의해 화학적으로 함께 결합될 수 있거나, 유전 공학 기술을 사용하여 근접 단백질로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라성 또는 인체 적용 사슬을 코드화하는 핵산은 발현되어 근접 단백질을 제조할 수 있다. 하기의 참고 문헌을 참조한다: Cability et al., U.S. 특허 제 4,816,567 호; Cabilly et al., 유럽 특허 0,125,023 B1; Boss et al., U.S. 특허 제 4,816,397 호; Boss et al., 유럽 특허 제 0,120,694 B1; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., 유럽 특허 0,194,276 B1; Winter, U.S. 특허 제 5,225,539 호; 및 Winter 유럽 특허 0,239,400 B1. 또한 영장류성 항체와 관련된 Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), 및 단일 사슬 항체와 관련된 Lander et al., U.S. 특허 제 4,946,778 호 및 Bird, R.E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)를 참조한다.
부가적으로, 키메라, 인간화된, 영장류화된 또는 단일 사슬 항체의 단편을 포함하는, 항체의 작용성 단편도 또한 제조될 수 있다. 상기 항체의 작용성 단편은 이들이 유도되는 온길이 항체의 하나 이상의 결합 작용 및/또는 조절 작용을 유지시킨다. 바람직한 작용성 단편은 상응하는 온길이 항체의 항원 결합 기능(예를 들어, 포유동물 CKR-3(CCR3)에 대한 특이성)을 보유한다. 특히 바람직한 작용성 단편은 포유동물 CKR-3(CCR3)의 특징인 하나 이상의 기능, 예를 들어 결합 활성, 신호화 활성 및/또는 세포 반응의 자극을 억제하는 능력을 보유한다. 예를 들어, 한 가지 구체예에 있어서, 작용성 단편은 CKR-3(CCR3)와 이것의 리간드(예를 들어, 에오택신, RANTES, MCP-2, MCP-3, MCP-4)와의 상호작용, 및/또는 하나 이상의 수용체 매개된 기능, 예를 들어 호산구 또는 호염구 화학주성 및/또는 CKR-3(CCR3)에 대한 케모킨 결합에 의해 유도된 탈과립을 억제할 수 있다. 예를 들어, 이들에 제한되지 않지만, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2를 포함하는 포유류 CKR-3 수용체에 결합할 수 있는 항체 단편은 본 발명에 포함된다. 상기 단편은 효소 분해 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 파파인 또는 펩신 분해에 의해 Fab 또는 F(ab')2가 각각 생성될 수 있다. 항체는 하나 이상의 정지 코돈이 천연 정지 부위의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단된 형태로 또한 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2중쇄 부분을 코드화하는 키메라 유전자는 중쇄의 CH1도메인 및 힌지 영역을 코드화하는 DNA 서열을 포함하도록 고안될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간화된 면역글로불린"은 상이한 기원의 면역글로불린의 부분을를 포함하며, 하나 이상의 부분이 사람 기원을 갖는 면역글로불린을 의미한다. 따라서, 본 발명은 포유동물 CCR3(예를 들어, 사람 CCR3)에 대해 결합 특이성을 갖는 인간화된 면역글로불린에 관한 것이며, 상기 면역글로불린은 비사람 기원(예를 들어, 설치류)의 항원 결합 영역 및 한 부분 이상의 사람 기원의 면역글로불린(예를 들어, 사람 프레임워크 영역, 사람 불변 영역 또는 이것의 일부)를 포함한다. 예를 들어, 인간화된 항체는 필요한 특이성을 갖는 비사람 기원, 예를 들어 마우스의 면역글로불린으로부터 유도되고, 사람 기원의 면역글로불린 서열(예를 들어, 키메라 면역글로불린)로부터 유도된 부분을 포함하며, 이들은 통상적인 기법(예를 들어, 합성)에 의해 함께 화학 결합되거나 유전 공학적 기법을 사용하여 연속 폴리펩티드로서 제조될 수 있다 (예를 들어, 키메라 항체의 단백질 부분을 코드화하는 DNA를 발현시켜 연속 폴리펩티드 사슬을 생성시킬 수 있음). 본 발명의 인간화된 면역글로불린의 또 다른 예로는 비사람 기원의 CDR(예를 들어, 비사람 기원의 항체로부터 유도된 하나 이상의 CDR) 및 사람 기원의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유도된 프레임워크 영역을 포함하는 하나 이상의 면역글로불린 사슬을 함유하는 면역글로불린(예를 들어, 프레임워크 변화가 있거나 없는 CDR 그래프팅된 항체)가 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 인간화된 항체는 사람 CCR3에 결합하기 위해 쥐과동물 7B11 단클론성 항체와 경합할 수 있다 (예를 들어, 본 발명의 핵산에 의해 트랜스펙팅된 호산구, 호염구 또는 세포에 대해). 바람직한 구체예에 있어서, 인간화된 항체의 항원 결합 영역은 7B11 단클론성 항체로부터 유도된다. 키메라 또는 CDR-그래프팅된 단일 사슬 항체는 또한 인간화된 항체에 의해 포함된다. 단일 사슬 항체에 대해서는 하기 문헌을 참조하라 [캐빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제 4,816,567호; 캐빌리 등의 유럽 특허 제 0,125,023호; 퀸(Queen) 등의 유럽 특허 제 0,451,216호; 보스(Boss) 등의 미국 특허 제 4,816,397호; 보스(Boss) 등의 유럽 특허 제 0,120,694호; 뉴버거, 엠.에스.(Neuberger, M.S.) 등의 WO 86/01533호; 윈터(Winter) 등의 미국 특허 제 5,225,539호; 윈터(Winter) 등의 유럽 특허 제 0,239,400호; 파들란, 이.에이.(Padlan, E.A.) 등의 유럽 특허 출원 제 0,519,596호; 또한, 래드너(Ladner) 등의 미국 특허 제 4,946,778호; 휴스톤(Huston)의 미국 특허 제 5,476,786호; 및 Bird, R.E., Science, 242: 423-426 (1988)].
본 발명의 항체는 조사, 진단학적 및 치료학적 적용을 포함하여, 많은 적용에서 유용하다. 예를 들어, 이들은 수용체 또는 이의 일부를 분리 및/또는 정제시키고, 수용체 구조(예를 들어, 배열) 및 작용을 연구하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 조사 및 치료 적용에서 수용체 작용을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 (a) 수용체에의 결합(예를 들어, 리간드, 제 2 억제제 또는 프로모터의 결합), (b) 수용체 신호화, 및/또는 (c) 자극 작용을 억제하기 위해 억제제로서 작용할 수 있다. 수용체 작용의 억제제로서 작용하는 항체는 직접 또는 간접적으로 결합하는 리간드 또는 프로모터를 차단할 수 있다(예를 들어, 배열 상태 변화에 의함). 예를 들어, 항체는 리간드의 결합을 억제시키거나 탈감(리간드의 결합을 억제시키거나 억제시키지 않음)시킴으로써 수용체 작용을 억제시킬 수 있다.
수용체와 결합하는 항체는 또한 수용체에 결합하는 경우 수용체의 신호화 및/또는 자극제 작용(예를 들어, 화학주성, 엑소사이토시스 또는 감염전 매개체 방출)과 같은 수용체 작용을 일으키거나 자극하는, 수용체 작용의 작용제로서 작용할 수 있다.
부가적으로, 본 발명의 다양한 항체는 예를 들어 호산구, 호염기성 세포, 및 림프구와 같은 백혈구, 또는 수용체 유전자로 트랜스펙팅되는 세포상에서 수용체의 발현을 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있다. 이와 같이, 진단 또는 조사 목적상, 본 발명의 항체는 세포 분류(예를 들어, 유량 혈구 계산, 형광 활성화 세포 분류)와 같은 적용에서 유용성을 갖는다.
항-유전자형 항체가 또는 제공된다. 항-유전자형 항체는 또다른 항체의 항원-결합 부위와 관련된 항원 결정소를 인식한다. 항-유전자형 항체는 제 2 항체를 제조하는데 사용되는 동물과 같은 종, 및 바람직하게는 같은 계통의 동물을 면역시킴으로써 제 2 항체에 대해 제조될 수 있다. U.S. 특허 제 4,699,880 호를 참조한다.
한 구체예에서, 항체는 수용체 또는 이의 일부에 대해 증가되고, 이 항체는 항-유전자형 항체를 제조하는데 사용된다. 이렇게 제조된 항-Id는 수용체 작용의 리간드, 억제제 또는 프로모터와 같은 수용체를 결합시키는 화합물을 결합시킬 수 있고 상기 화합물을 검출하거나 확인하거나 정량화하는 면역학적 검정에서 사용될 수 있다. 상기 항-유전자형 항체는 수용체 자체를 결합시키지 않을 지라도, 수용체 작용의 억제제일 수 있다.
항-유전자형(즉, 항-Id) 항체는 그 자체가 항-유전자형 항체(즉, 한티-항-Id)를 증가시키는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 원 면역 항체와 비교하여 특이성면에서 유사하거나 동일할 수 있다. 한 구체예에서, 수용체에의 결합을 차단시키는 항체 작용제는 항-Id를 증가시키는데 사용될 수 있고, 항-Id는 항체 작용제의 특이성과 유사하거나 동일한 특이성을 가질 수 있는 항-항-Id를 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 항-항-Id 항체가 수용체 작용상의 억제 효과에 대해 검정되어 이들이 작용제인가를 결정할 수 있다.
단일 사슬 항-유전자형 항체, 및 키메라성 또는 CDR-이식 단일 사슬 항-유전자형 항체 이외에 키메라성, 인체 적용 또는 영장류성(CDR-이식) 항체가 제조될 수 있고, 용어 "항-유전자형 항체"에 포함된다. 상기 항체이 항체 단편도 또한 제조될 수 있다.
수용체 작용의 리간드, 억제제 또는 프로모터의 확인
본원에서 사용된 바와 같이, 리간드는 수용체 단백질에 결합하는 기질이다. 선택된 포유류 CKR-3 수용체의 리간드는 선택된 포유류 수용체에 결합하는 기질이다. 한 구체예에서, 리간드는 CKR-3을 포함하여, 2개 이상의 포유류 케모킨 수용체에 선택적으로 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 고친화성을 갖는 포유류 CKR-3 수용체의 리간드 결합이 일어난다. 용어 "리간드"는 천연 리간드(분리 및/또는 정제 , 합성, 및/또는 재조합 리간드일 수 있음), 천연 리간드의 상동체(예를 들어, 또다른 포유류로부터의 것), 항체, 상기 분자의 일부, 및 수용체를 결합시키는 다른 기질을 제한하지 않고서 포함하는 기질에 관한 것이다. 선택 포유류 수용체의 천연 리간드는 생리학적 조건하에서 수용체에 결합할 수 있고, 포유류 CKR-3 수용체의 것과 동일한 포유류원에 속한다. 용어 "리간드"는 결합하여 억제제 또는 프로모터 활성을 결여시키는 기질 이외에, 수용체 활성의 억제제 또는 프로모터인 기질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 억제제는 포유류 C-C 케모킨 수용체(예를 들어, 포유류 CKR-3 수용체)의 하나 이상의 작용 특성, 예를 들어 결합 활성도(예를 들어, 결합하는 리간드, 억제제 및/또는 프로모터), 신호화 활성도(예를 들어, 시토졸성 유리 칼슘 [Ca2+]i의 농도의 빠르고 과도한 증가를 유도하는 포유류 G 단백질의 활성화), 및/또는 세포형 반응의 자극을 억제하는 기질이다. 용어 "억제제"는 수용체(예를 들어, 항체, 천연 리간드의 변종, 리간드 결합의 다른 경합성 억제제)를 결합시키는 작용제를 포함하는 기질, 및 결합하지 않고서(예를 들어, 항-유전자형 항체에 결합) 수용체 작용을 억제시키는 기질에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 프로모터는 포유동물 C-C 케모킨 수용체(예를 들어, 포유동물 CKR-3 수용체)의 특징이 되는 하나 이상의 기능, 예를 들어 결합 활성(예를 들어, 리간드, 억제제 및/또는 프로모터 결합), 신호화 활성(예를 들어, 포유동물 G 단백질의 활성화, 시토졸 유리 칼슘 [Ca2+]i의 농도의 급격하고 일시적인 증가의 유도) 및/또는 세포 반응의 자극을 촉진(유도 또는 증강)시키는 물질이다. 프로모터란 용어는 수용체와 결합하는 작용제(예를 들어, 항체, 또 다른 종으로부터의 천연 리간드의 동족체)를 포함하는 물질 및 결합 없이 수용체 기능을 증진시키는(예를 들어, 관련 단백질을 활성화시킴으로써) 물질을 의미한다.
본 발명의 핵산 및 단백질에 따라, 하기에 설명된 검정은 단독으로, 또는 다른 적합한 방법과 결합하여, 포유류 CKR-3 수용체 단백질 또는 폴리펩티드의 리간드, 억제제 또는 프로모터를 확인하는데 사용될 수 있다. 사람 CKR-3는 일반적으로 고-작업 처리량 스트리닝에 적합한 수준으로 세포중에 존재하지 않아서; 본 발명의 핵산을 함유하고 발현시키는 세포는 특히 CKR-3 수용체 단백질의 리간드, 억제제 및 프로모터를 확인하는데 중요하다.
포유류로부터 CKR-3 수용체 유전자의 분리시에, 유전자는 발현 시스템내로 포함되어 상기에 설명된 수용체 단백질 또는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 본 발명의 핵산을 포함하는 구성물로 안정하거나 과도한 트랜스펙팅되는 세포, 또는 수용체를 포함하는 세포 분율(예를 들어, 트랜스펙팅된 세포로부터의 막 분율)중에 발현된 수용체와 같은 분리 및/또는 재조합 수용체 단백질 또는 폴리펩티드는 수용체 작용에 대한 시험에서 사용될 수 있다. 수용체는 원하는 경우 더 정제될 수 있다. 수용체 작용의 시험은 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
도 1A 내지 1C(서열 번호: 2 참조), 도 2A 내지 2B(서열 번호: 4 참조) 또는 서열 번호: 6 과 같은 단리된 재조합 포유류 CKR-3 수용체 단백질이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있고, 화합물의 효과는 본원에 설명된 수용체 작용을 측정하거나 다른 적합한 기술을 사용함으로써 검정된다. 예를 들어, A31/293/#20의 안정한 트랜스펙턴트, 마우스 L1-2 pre-B 세포의 안정한 트랜스펙턴트(실시예 3 참조), Sf9 세포로 감염된 바큘로바이러스(실시예 4 참조)와 같은 안정하거나 과도한 트랜스펙턴트가 결합 검정에서 사용될 수 있다. 예를 들어 화학주성화시킬 수 있는 마우스 L1-2 pre-B 세포 또는 다른 적합한 세포의 안정한 트랜스펙턴트가 화학주성 검정법에서 사용될 수 있다(실시예 3 참조).
본 발명의 방법에 따라, 화합물은 개별적으로 스크린될 수 있거나 하나 이상의 화합물은 본원의 방법에 따라 동시에 시험될 수 있다. 화합물의 혼합물이 시험되는 경우에, 설명된 방법에 의해 선택된 화합물은 적당한 방법(예를 들어, PCR, 서열화, 크로마토그래피)에 의해 분리되고(적절하게 분리됨) 확인된다. 시험 샘플중에 하나 이상의 화합물(예를 들어, 리간드, 억제제, 프로모터)의 존재는 상기 방법에 따라 또한 결정될 수 있다.
결합적 화학 합성 또는 다른 방법에 의해 제조된 거대 결합 라이브러리의 화합물(예를 들어, 유기 화합물, 재조합 또는 합성 펩티드, " 펩토이드", 핵산)이 시험될 수 있다 [참고 문헌: Zuckerman, R.N. et al., J. Med. Chem., 37: 2678-2685 (1994) 및 본원에 인용된 참고 문헌; 표지화된 화합물에 관련된 0hlmeyer, M.H.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993) 및 Dewitt, S.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993); Rutter, W.J. et al. U.S. 특허 제 5,010,175; Huebner, V.D. et al., U.S. 특허 제 5,182,366 호; 및 Geysen, H.M., U.S. 특허 제 4,833,092 호]. 본 발명의 방법에 의해 결합형 라이브러리로부터 선택된 화합물이 특이한 표지를 운반하는 경우, 크로마토그래프 방법에 의한 개개의 화합물의 확인이 가능하다.
한 구체예에서, 파지 전시 방법학이 사용된다. 예를 들어, 수용체는 수용체 결합에 적당한 조건하에서(예를 들어, 적당한 결합 완충액) 폴리펩티드를 전시하는 파지(예를 들어, 파지 또는 라이브러리와 같은 파지의 모음)와 접촉된다. 수용체에 결합된 파지는 표준 기술 또는 다른 적합한 방법을 사용하여 선택된다. 파지는 적당한 용리 완충액을 사용하여 수용체로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 이온 세기 또는 pH의 변화는 파지의 방출을 유도할 수 있다. 대안적으로, 용리 완충액은 화합물의 결합을 분해시키려는 방출 성분들(예를 들어, 결합을 경합적으로 억제시키는 리간드, 억제제, 및/또는 프로모터와 같은 수용체에의 전시 펩티드의 결합을 분해시킬 수 있는 하나 이상의 화합물)을 포함할 수 있다. 임의적으로, 선택 방법이 반복될 수 있고 또다른 선택 단계가 수용체를 결합시키는 파지를 풍부하게 하는데 사용될 수 있다. 전시 폴리펩티드는 특징화된다(예를 들어 파지 DNA의 서열화에 의함). 확인된 폴리펩티드는 제조되어 리간드 결합, 억제제 및/또는 프로모터 작용에 대해 더 시험될 수 있다. 증가된 안정화도 또는 다른 원하는 성질을 갖는 상기 펩티드의 유사체가 제조될 수 있다.
한 구체예에서, 불규칙한 서열 핵산에 의해 코드화된 N-종말 펩티드로 피복된 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키키고 전시하는 파지가 제조될 수 있다. 본 발명의 수용체 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 적합한 숙주 세포는 파지와 접촉되고, 결합된 파지는 선택되고, 회수되고 특징화된다 [참고 문헌: G 단백질-커플 수용체가 사용된 파지 전시 방법을 설명하는 Doorbar, J. 및 G. Winter, J. Mol. Biol.,244: 361 (1994)].
포유류 CKR-3 수용체의 잠재적인 리간드, 억제제 및/또는 프로모터의 다른 공급원은 다른 케모어트랙턴트(예를 들어, 아나필라톡신 C5a 및 박테리아성 포르밀화 트리펩티드(fMLP))와 같은 기질, 또다른 포유 동물의 수용체와 같은 포유류로부터의 포유류 케모킨(예를 들어 사람 수용체에 대한, 비-사람 공급원으로부터 얻어지는 사람 케모킨의 상동체)과 같은 다른 케모킨(예를 들어, 에오택신); 천연, 합성 또는 재조합 변이체와 같은 다른 케모어트랙턴트 또는 케모킨의 변이체; 다른 포유류 CKR-3 수용체 리간드, 억제제 및/또는 프로모터(예를 들어, 항체, 작용제, 길항제), 및 이들의 변이제; 다른 G-단백질 커플 수용체 리간드, 억제제 및/또는 프로모터(예를 들어, 작용제 또는 길항제); 및 수용체 작용을 억제시킬 수 있는 적당한 수용체 펩티드 또는 유사체와 같은 포유류 CKR-3 수용체의 가용성 부분을 제한하지 않고서 포함한다 [참고 문헌: Murphy, R.B., WO 94/05695].
본 발명의 생체외 방법은 고-작업 처리량 스크리닝에 사용될 수 있다. 이러한 검정은 다수의 샘플(예를 들어, 96 웰 포맷)을 처리하는데 적합할 수 있다. 상기 스크리닝을 있어서, 단리된 호산구 대신에, 수용체를 발현시키는 숙주 세포의 사용은 호산구를 분리시키는데 있어서의 어려움으로 인하여 바람직하다.
결합 검정에 있어서, 적합한 숙주 세포중에서 수용체의 고수준 발현이 바람직하다. 수용체의 발현은 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 발현은 수용체 또는 이의 일부를 결합시키는 본 발명의 항체를 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 시판되는 항체는 수용체 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, FLAG-표지화 수용체; 실시예 3 참조)를 포함하는 항원- 또는 에피토프- 표지화 융합 단백질의 발현을 검출하는데 사용될 수 있다.
결합 검정
분리 및/또는 재조합 수용체 단백질, 이의 일부, 또는 본 발명의 적합한 융합 단백질은 사람 CKR-3 수용체와 같은 포유류 CKR-3 수용체 단백질(하나 이상의 단백질)에 결합하고, 리간드, 또는 수용체 활성의 잠재적인 억제제 또는 프로모터인 화합물을 선택하고 확인하는 방법에서 사용될 수 있다. 리간드, 억제제 또는 프로모터를 포함하는, 상기 방법에 의해 선택된 화합물은 수용체 작용에 대한 억제 또는 자극 효과 및/또는 치료적 이용도에 대해서 추가 검정될 수 있다.
한 구체예에서, 활성, 분리 및/또는 재조합 포유류 CKR-3 수용체 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하는 화합물은 본 방법에 의해 확인된다. 상기 구체예에서, 사용된 수용체 단백질 도는 폴리펩티드는 신호화 활성(예를 들어, 포유류 G 단백질의 활성화), 자극 작용(예를 들어, 화학주성 또는 염증 매개체 방출의 촉진), 및/또는 결합 작용(예를 들어, 리간드, 억제제 및/또는 프로모터 결합)과 같은 CKR-3 수용체의 하나 이상의 작용 특성을 갖는다. 특히 바람직한 구체예에서, 분리 및/또는 재조합 포유류 CKR-3 수용체의 하나 이상의 작용 특성, 예를 들어 수용체 단백질 또는 폴리펩티드는 리간드 결합 작용을 가져서, 수용체의 천연 리간드를 결합시킨다.
예를 들어, 분리 및/또는 재조합 포유류 CKR-3 수용체의 단백질 또는 폴리펩티드는 결합에 적합한 조건하에서 측정될 수 있고, 수용체는 시험하려는 화합물과 접촉되고, 결합은 검출되거나 측정된다. 한 구체예에서, 수용체 단백질은 본 발명의 수용체를 코드화시키는 핵산 서열을 포함하는 구성물로 안정하게 또는 과도하게 트랜스펙팅된 세포중에서 발현될 수 있다. 세포는 수용체의 발현에 적합한 조건하에서 유지된다. 세포는 결합에 적합한 조건하에서(예를 들어, 적합한 결합 완충액중에서) 화합물과 접촉되고, 결합은 표준 기술에 의해 검출된다. 결합 정도를 측정하기 위해, 결합의 정도는 적합한 대조구(예를 들어, 화합물의 부재하에 결정되는 바탕값, 제 2 화합물(즉, 표준물)이 결합된 것, 트랜스펙팅되지 않은 세포에 화합물이 결합된 것)와 비교하여 결정될 수 있다. 임의로, 수용체를 함유하는 세포 분획, 예를 들어 막 분획은 전체 세포 대신에 사용될 수 있다(실시예 9 참조).
한 구체예에서, 화합물은 적당한 라벨(예를 들어, 형광성 라벨, 동위체 라벨)로 라벨화되고, 결합은 라벨의 검출에 의해 결정된다. 결합의 특이성은 예를 들어 경합물질로서 라벨화되지 않은 화합물 또는 제 2 리간드를 사용하여, 경합 또는 치환에 의해 검정될 수 있다.
동일한 포유류종 또는 또다른 포유류종으로부터 천연 리간드를 함유하는 포유류 수용체의 리간드는 이러한 방식으로 확인될 수 있다. 수용체를 결합시키는 프로모터 또는 억제제의 결합 활성도는 또는 상기 리간드 결합 검정을 사용하여 검정될 수 있다.
결합 억제 검정은 수용체와 결합하여 또 다른 화합물, 예를 들어 리간드의 결합을 억제시키는 리간드 및 억제제 및 프로모터를 확인하기 위해 또한 사용될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 본 발명은 (a) 시험하려는 화합물을 활성 재조합 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질을 리간드의 존재하에 리간드와 결합하기에 적당한 조건하에 결합시키는 단계 및 (b) 상기 리간드와 단리된 활성 단백질 사이의 복합체의 형성을 검출 또는 측정하는 단계를 포함하여, 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부의 억제제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 제 2 화합물의 존재하에 제 1 화합물의 결합과 비교하여, 제 1 화합물의 결합의 감소(제 2 화합물의 부재하의 결합)가 검출되거나 측정되는 결합 검정이 수행될 수 있다. 수용체는 제 1 및 제 2 화합물과 동시, 또는 순서대로 차례차례로 접촉될 수 있다. 제 2 화합물의 존재하에 제 1 화합물의 결합 정도의 감소는 제 2 화합물에 의한 결합의 억제를 나타낸다. 예를 들어, 제 1 화합물의 결합은 감소되거나 제거될 수 있다.
한 구체예에서, 제 2 시험 화합물에 의한 사람 CKR-3 수용체에의 제 1 화합물(예를 들어, RANTES와 같은 케모킨)의 결합의 직접 억제가 측정된다. 예를 들어, 사람 CKR-3에의125I-라벨화 RANTES 또는125I-라벨화 MCP-3의 결합을 억제하는 화합물의 능력이 측정될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 전체 세포(예를 들어, 매개체산-분화 HL-60 세포, 또는 사람 CKR-3 수용체를 코드화하는 핵산을 함유하는 적당한 세포 라인) 또는 상기 세포로부터의 막 분획을 사용하여 수행될 수 있다.
신호화 작용 및/또는 세포 반응의 자극을 포함하는, 수용체 결합에 의해 일어나는 사건을 측정하는 방법과 같은 수용체를 결합시키는 화합물의 존재를 확인하는 다른 방법이 유용하다(하기 참조). 예를 들어, 결합은 리간드와의 결합에 반응하여 활성 재조합 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질을 발현시키는 숙주 세포의 신호화 활성 또는 세포 반응을 검출 또는 측정함으로써 모니터될 수 있다.
본 발명의 항체의 억제 효과는 결합 억제 검정중에서 검정될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 수용체를 결합시키는 항체간의 경합은 또한 항체 결합에 적합한 조건하에서, 검정에서의 제 1 화합물이 또다른 항체인 방법에서 검정될 수 있다.
상기 방식으로 확인되는 수용체-결합 억제제(예를 들어, 작용제) 이외에도, 리간드는 결합 이후에, 이들이 CKR-3 수용체의 다른 작용을 억제하거나 활성화시키는지를 결정하고/또는 이들의 치료학적 이용성을 검정하기 위해 검정될 수 있다.
신호화 검정
작용제와 같은 리간드 또는 프로모터의 결합은 G 단백질-커플 수용체에 의한 신호화에 의해 일어나고, G 단백질의 활성은 자극된다. 화합물에 의한 유도 신호화 작용의 유발은 모든 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, GTP에서 GDP로의 가수분해와 같은 G 단백질 활성, 도는 세포내(시토졸성) 유리 칼슘[Ca2+]i의 농도의 빠르고 과도한 증가의 유발과 같은 수용체 결합에 의해 일어나는 후기 신호화 사건이 종래 기술 또는 다른 적합한 방법에 의해 검정될 수 있다 [참고 문헌: Neote, K. et al., Cell, 72: 415-425 (1993); Van Riper et al., J. Exp. Med., 177: 851-856 (1993); Dahinden, C.A. et al., J. Exp. Med., 179: 751-756 (1994)].
혼성 G 단백질 커플 수용체를 사용하는, Sledziewski 외의 작용성 검정은 수용체를 결합시키고 G 단백질을 활성화시키는 리간드 또는 프로모터의 능력을 측정하는데 사용될 수 있다 [참고 문헌: Sledziewski et al., U.S. 특허 제 5, 284,746 호, 참고 문헌으로서 본원에 인용된 기술].
숙주 세포의 생물학적 감응(혼성 수용체에 결합함으로써 일어남)이 측정되고, 감응의 감지는 시험 샘플중의 리간드의 존재를 나타낸다. Sledziewski 외의 특허에는 시험 샘플중의 리간드의 존재를 검출하는 방법으로서, 이 리간드는 수용체의 리간드-결합 도메인에 의해 결합될 수 있는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법이 기술되어 있다. 상기 방법의 한 구체예에서, 이스트 숙주 세포는 생물학적으로 활성인 혼성 G 단백질-커플 수용체(즉, 융합 단백질)의 발현을 유도할 수 있는 DNA 구성물로 트랜스펙팅된다. 혼성 수용체는 STE2 유전자 생성물과 같은 이스트 G 단백질-커플 수용체의 상응하는 도메인으로 대체된 리간드-결합 도메인과 다른 하나 이상의 도메인을 갖는 포유류 G 단백질-커플 수용체를 포함한다. 구성물을 함유하는 이스트 숙주 세포는 혼성 수용체가 발현되는 조건하에서 유지되고, 세포는 혼성 수용체에 리간드를 결합시키기에 적합한 조건하에서 시험 샘플과 접촉된다. 검정은 설명된 바와 같이 수행되고 숙주 세포의 생물학적 감응(혼성 수용체에 결합됨으로써 일어남)은 측정되고, 감응 검출은 신호화 작용을 나타낸다.
예를 들어, STE2 유전자 생성물로부터 유도된 혼성 수용체에의 결합이 BAR1 프로모터의 유발을 일으키는 것에 대한 검정이 제공된다. 프로모터의 유발은 BAR1 프로모터에 결합되고 제 2 구성물상에서 숙주 세포내로 도입되는 보고 유전자(β-gal)에 의해 측정된다. 수용체 유전자의 발현은 예를 들어 세포 용해물상의 생체외 효소 검정 또는 매질중에 지시자(X-gal)를 함유하는 플레이트상의 블루 칼로니의 존재에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 검정은 수용체 기능의 잠재적인 억제제를 확인하기 위해 사용된다. 화합물의 억제 활성은 검정에서 리간드 또는 프로모터를 사용하고, 리간드 또는 프로모터에 의해 유도된 활성을 억제하는 화합물의 능력을 평가함으로써 결정될 수 있다.
공지된 리간드의 변이체는 또한 커플링된 G 단백질의 활성을 자극시키는 감소된 능력(저하된 능력 또는 무능력)을 대비하여 스크린될 수 있다. 상기 구체예에서, 화합물이 리간드 결합 활성(전후에 또다른 방법에 의해 결정됨)을 가질지라도, 수용체의 사용은 커플링된 G 단백질의 활성을 일으키지 않거나 단지 약하게 일으킨다. 상기 화합물은 잠재적인 작용제이고 적합한 검정을 사용하여 더 검정될 수 있다. 예를 들어, 동일한 검정이 리간드 또는 프로모터의 존재하에서 수행될 수 있고, 리간드 또는 프로모터의 활성을 억제시키는 화합물의 능력이 검정된다.
세포 자극의 화학주성 및 검정법
화학주성 검정은 또한 수용체 작용을 검정하는데 사용될 수 있다. 이러한 검정은 화합물에 의해 유도된 생체외 또는 생체내 세포의 작용성 이동을 기초로 하고, 리간드, 억제제 또는 프로모터의 결합 및/또는 케모어트랙턴트 효과를 검정하는데 사용될 수 있다. 생체외 트랜스엔도텔리얼 화학주성 검정법의 이용이 실시예 1 에 설명되어 있다. Springer 외의 특허에는 트랜스엔도텔리얼 림프구 화학주성 검정법이 기술되어 있다 [참고 문헌: 1994. 9. 15 에 공보된 Springer et al., WO 94/20142, 본원에 참고 문헌으로서 인용된 기술; Berman et al., Immunol Invest. 17: 625-677 (1988)]. 또한 콜라겐 겔내로의 내피를 통과하는 이동은 하기 문헌에 기술되어 있다 [참고 문헌: kavanaugh et al., J. Immunol, 146: 4149-4156 (1991)]. 화학주성화시킬 수 있는 마우스 L1-2 pre-B 세포 또는 다른 적합한 숙주 세포의 안정한 트랜스펙턴트는 화학주성 검정법에서 사용될 수 있다(실시예 3 참조).
일반적으로, 화학주성 검정법은 상반된 제 2 표면을 향한 장벽의 제 1 표면으로부터, 화합물의 증가된 수준을 향하여, 장벽(예를 들어, 내피, 필터)내 또는 이를 통해, 백혈구와 같은 적합한 세포(예를 들어, 림프구, 호산구, 호염기성 세포)의 지향성 움직임 또는 이동을 측정한다. 막 또는 필터는 편리한 장벽을 제공하여, 필터의 제 1 표면으로부터 필터의 상반된 제 2 표면을 향하여, 화합물의 증가된 수준을 향하여, 필터내 또는 이를 통과하는 적합한 세포의 지향성 움직임 또는 이동이 측정된다. 일부 검정에서, 막은 ICAM-1, 피브로넥틴 또는 콜라겐과 같이, 착생을 촉진하는 기질로 피복된다.
예를 들어, 발명자는 미공성 막내 또는 이를 통과하는 제 1 챔버로부터 시험하려는 화합물을 함유하고 막에 의해 제 1 챔버로부터 단리된 제 2 챔버로의, 적당한 용기(함유 수단)내에서의 세포의 이동을 검출하거나 측정할 수 있다. 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리카르보네이트를 포함하는화합물에 따른 특정 이동을 측정하기 위한 적합한 기공 크기를 갖고, 적합한 막이 선택된다. 예를 들어, 약 3 내지 8 마이크론, 및 바람직하게는 약 5 내지 8 마이크론 크기의 기공이 사용될 수 있다. 기공 크기는 필터상에서 균일하거나 적당한 기공 크기의 범위내에 속할 수 있다.
이동을 검정하기 위해, 필터내로의 이동의 거리, 필터의 제 2 표면에의 착생을 유지시키는 필터를 가로지르는 세포의 수, 및/또는 제 2 챔버에서 축적되는 세포의 수는 표준 기술(예를 들어, 마이크로스코피)를 사용하여 결정될 수 있다. 한 구체예에서, 세포는 검출성 라벨(예를 들어, 방사성 동위 원소, 형광성 라벨, 항원 또는 에피토프 라벨)로 라벨화되고, 이동은 적당한 방법(예를 들어, 방사성, 형광성의 검출, 면역학적 검정)을 사용하여 막에 착생된 라벨 및/또는 제 2 챔버에 존재하는 라벨의 존재를 결정함으로써 측정될 수 있다. 화합물에 의해 유도된 이동의 크기는 적당한 대조구(예를 들어, 화합물의 부재하에 결정되는 바탕 이동, 제 2 화합물(즉, 표준물)에 의해 유도된 이동의 크기, 화합물에 의해 유도된 트랜스펙팅되지 않은 세포의 이동)와 비교하여 결정될 수 있다.
챔버는 플라스틱, 유리 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등과 같은 다양한 고형물로부터 형성될 수 있다. 바이오코우트(합작 생의학적 생성물) 또는 트랜스웰(코스타르, 캠브리지, MA) 배양 인서트와 같이, 챔버로부터 분리될 수 있는 막은 착생 세포를 계수하는 것을 촉진시킨다.
용기에서, 필터는 제 1 챔버내의 세포를 함유하는 유체, 및 제 2 챔버내의 유체와 접촉되도록 위치된다. 검정의 목적을 위해 존재하는 시험 화합물 또는 부가 리간드, 억제제 또는 프로모터와 다르게, 막의 한 측면상의 유체는 바람직하게는 동일하거나 상당히 유사하다. 챔버내의 유체는 세포, 및/또는 배양 매질의 안정도를 증가시키고 이들의 비특이적 결합을 억제시키도록 작용할 수 있는 단백질 용액(예를 들어, 소 혈청 알부민, 태아 송아지 혈청, 사람 혈청 알부민)을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 특히 호산구, 호산구형 세포, 림프구, 또는 CKR-3 수용체를 발현시키는 세포에 있어서, 트랜스엔도텔리얼 이동이 측정된다. 트랜스엔도텔리얼 이동 검정이 바람직하다. 상기 검정은 백혈구가 용기 벽을 라이닝시키는 내피 세포층을 가로지름으로써 염증의 부위에서 조직중에 존재하는 케모어트랙턴트를 향하여 혈관으로부터 유주되는 생체내 조건을 더욱 정확하게 반복하기 때문에, 이 검정은 더욱 양호한 생리학적 모델이다. 부가적으로, 트랜스엔도텔리얼 검정은 더 낮은 바탕값(시그날 대 노이즈 비율)을 갖는다.
상기 구체예에서, 내피 세포층을 통과하는 유출이 검정된다. 세포층을 제조하기 위해, 내피 세포는 미공성 필터 또는 막상에 배양될 수 있고, 임의로 내피 세포의 부착을 촉진시킬 수 있는 콜라겐, 피브로넥틴, 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질과 같은 기질로 피복될 수 있다. 바람직하게는, 내피 세포는 융합성 단일층이 형성될 때까지 배양된다. 단일층 형성에 유용한 많은 포유류 내피 세포는 예를 들어 사람 제정맥 내피 세포(Clonetics Corp, San Diego, CA)와 같은 정맥, 동맥 또는 미소도관 내피 또는 실시예 1 에 사용되는 ECV 304 세포 라인과 같은 적당한 세포 라인을 포함할 수 있다. 특정 포유류 수용체에 따라 화학주성을 검정하기 위해서는, 동일한 포유류의 내피 세포가 바람직하지만; 이종 포유류 종 또는 속으로부터의 내피 세포가 또한 사용될 수 있다.
일반적으로, 검정은 필터의 제 1 표면으로부터 필터의 상반된 제 2 표면을 향하여, 증가된 수준의 화합물을 향하는 방향으로, 막 또는 필터의 내부 또는 이를 통과하는 세포의 지향성 이동을 검출함으로써 수행되고, 필터는 제 1 표면상에 내피 세포층을 함유한다. 지향성 이동은 필터의 반대면상에 위치한 화합물을 향하여, 막 내부 또는 통과하여, 제 1 표면에 인접한 영역으로부터 발생한다. 제 2 표면에 인접한 영역중에 존재하는 화합물의 농도는 제 1 표면에 인접한 영역중의 농도보다 더 크다.
한 구체예에서, 화학주성은 화합물의 리간드 또는 프로모터 활성에 대해 시험하는데 사용되고, 이동가능한 세포를 포함하고 포유류 CKR-3 수용체를 발현시키는 조성물은 제 1 챔버에 방치되고 시험하려는 화합물을 포함하는 조성물은 바람직하게는 제 1 챔버에서 세포의 화학주성을 유도할 수 있는 다른 리간드 또는 프로모터(케모어트랙턴트 작용을 가짐)의 존재하에서 제 2 챔버에 방치된다. 그러나, 케모어트랙턴트 작용을 갖는 하나 이상의 리간드 또는 프로모터가 존재할 수 있다. 수용체를 결합시키고 상기 검정에서 포유류 CKR-3 수용체를 발현시키는 세포의 화학주성을 유도할 수 있는 화합물은 수용체 작용의 리간드 또는 프로모터이다.
억제제에 대해 시험하는데 사용되는 한 구체예에서, 이동가능한 세포를 포함하고 포유류 CKR-3 수용체를 발현시키는 조성물은 제 1 챔버에 방치된다. 제 1 챔버에서 세포의 화학주성을 유도할 수 있는 하나 이상의 리간드 또는 프로모터를 포함하는 조성물(케모어트랙턴트 작용을 가짐)은 제 2 챔버내에 방치된다. 세포가 제 1 챔버내에 방치되기 직전, 또는 세포와 함께, 시험하려는 화합물을 포함하는 조성물은 바람직하게 제 1 챔버에 방치된다. 상기 검정에서 수용체를 결합시킬 수 있고, 리간드 또는 포유류에 의해, 포유류 CKR-3 수용체를 발현시키는 세포의 화학주성의 유발을 억제할 수 있는 화합물은 수용체 작용의 억제제(즉, 자극 작용의 억제제)이다. 시험 화합물의 존재하에서 리간드 또는 프로모터에 의해 유도된 이동 범위의 감소는 억제 활성을 나타낸다(실시예 5 참조). 분리 결합 연구(상기 참조)는 억제가 수용체에의 시험 화합물의 결합의 결과인지 또는 상이한 메카니즘을 통해 발생하는지를 결정하기 위해 수행될 수 있다.
조직에서 화합물의 주입에 따른, 조직의 백혈구 침투를 측정하는 생체내 검정은 하기에 기술되어 있다(염증의 모델 참조). 상기 모델은 염증 부위로의 유주 및 화학주성에 의해 리간드 또는 프로모터에 감응하는 세포의 능력을 측정한다.
설명된 방법외에 부가적으로, 수용체의 자극 작용에 대한 리간드, 억제제 또는 프로모터의 효과는 수용체를 함유하는 적합한 숙주 세포를 사용하여, 활성 수용체에 의해 유도된 세포형 감응을 측정함으로써 검정될 수 있다. 유사하게, 상기 검정은 수용체의 작용을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 엑소사이토시스(예를 들어, 호산구 양이온성 단백질 및/또는 하나 이상의 효소, 다른 과립 성분의 방출; 호염기성 세포로부터의 히스타민의 방출, 류코트리엔(예를 들어, 류코트리엔 C4)과 같은 생활성 지질의 방출과 같은 염증 매개체 방출을 유도하는 호산구의 과립 감소), 및 호흡 균형(Rot, A. et al., J. Exp. Med., 176: 1489-1495 (1992))은 종래에 공지된 방법 또는 다른 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다 [참고 문헌: Bischoff. S.C. et al., Eur. J. Immunol., 23: 761-767 (1993) 및 Baggliolini, M. 및 C.A. Dahinden, Immunology Today, 15: 127-133 (1994) 및 본원에 인용된 참고 문헌].
한 구체예에서, 리간드, 억제제 및/또는 프로모터는 상기 작용이 가능한 세포에 의한 과립 감소 또는 엑소사이토시스 경우 효소의 방출을 측정함으로써 확인된다. 본 발명의 핵산을 함유하고, 엑소사이토시스 또는 과립 감소를 자극할 수 있는 활성 수용체 단백질을 코드화하는 세포는 적당한 조건하에서 적합한 매질중에 유지되어, 수용체는 발현되고 과립 감소는 유도될 수 있다. 수용체는 처리하려는 화합물과 접촉되고, 효소 방출은 검정된다. 매질내로 효소의 방출은 면역학적 검정, 또는 효소 활성에 대한 생화학적 검정과 같은 적합한 검정을 사용하여 검출되거나 측정될 수 있다.
매질은 매질중에 검정의 성분(예를 들어, 기질, 보조-인자, 항체)를 도입(예를 들어, 세포 및 화합물이 결합되기 전, 동시 또는 후에 도입)시킴으로써, 직접 검정될 수 있다. 대안적으로, 검정은 세포로부터 분리되거나 검정 이전에 더 분획되는 매질중에서 수행될 수 있다.
예를 들어, β-글루쿠로니다아제 및 호산구 퍼옥시다아제와 같은 효소에 대한 편리한 검정이 유용하다 [참고 문헌: White, S.R. et al., 호산구 및 호산구-조건화 매질에서의 호산구 퍼옥시다아제 활성에 대한 동적 검정, J. Immunol. Methods, 144(2): 257-63 (1991)].
화합물에 의한 탈과립의 자극은 화합물이 포유류 CKR-3 수용체의 리간드 또는 프로모터인 것을 나타낼 수 있다. 또다른 구체예에서, 탈과립의 억제는 억제제를 나타낸다. 상기 구체예에서, 수용체를 발현시키는 세포는 리간드 또는 프로모터와 결합되고, 시험하려는 화합물은 결합 전, 후 또는 동시에 첨가된다.
염증의 모델
많은 생체내 염증의 모델이 이용될 수 있고, 치료제로서 생체내 리간드, 억제제, 또는 프로모터의 효과를 검정하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 허파에 호산구성 침투를 갖는 영장류는 생체내 시험에 유용하다 [참고 문헌: Wegner, C.D. et al., Science, 247: 456 (1990)]. 한 구체예에서, 사람 CKR-3과 반응하고, 영장류 CKR-3과 교차결합하는 항체(예를 들어, 단클론성 항체)는 동물에게 투여된다. 브론코알베올라 세척액중의 호산구의 수, 호흡 컴플라이언스, 및 호흡 속도를 제한하지 않고 포함하는 많은 변수가 생체내 효율을 검정하기 위해 측정될 수 있다. 기도 미남도의 증상의 감도는 치료적 장점을 나타낸다.
부가적으로, 천식에 대한 양 모델, 피동적 피부 아나필락시에 대한 돼지쥐 모델, 또는 다른 적합한 모델은 생체내 화합물을 검정하는데 사용될 수 있다 [참고 문헌: Weg, V.B. et al., J. Exp. Med., 177: 561 (1993); Abraham, W.M. et al., J. Clin. Invest., 93: 776 (1994)].
부가적으로, 토끼, 쥐, 또는 돼지쥐와 같은 적합한 동물내로 화합물의 피내 주사시의 백혈구 침투가 측정될 수 있다 [참고 문헌: Van Damme J. et al., J. Exp. Med., 176: 59-65 (1992); Zachariae, C.O.C. et al., J. Exp. Med. 171: 2177-2182 (1990); Jose, P.J. et al., J. Exp. Med. 179: 881-887 (1994)]. 한 구체예에서, 피부 생체 검사는 백혈구(예를 들어, 호산구, 과립구)의 침투에 대해 조직학적으로 검정된다. 또다른 구체예에서, 화학주성 및 혈관 유출이 가능한 라벨화된 세포(예를 들어,111In으로 라벨화된, CKR-3 수용체를 발현시키는 안정하게 트랜스펙팅된 세포)는 동물에게 투여된다. 시험 샘플(예를 들어, 적당한 완충액 또는 생리학적 담체중의 시험하려는 화합물)에의 주사에 따른 세포의 침투는 샘플중에의, 길항제와 같은 리간드 또는 프로모터의 존재를 나타낸다. 상기 검정은 화학주성 및 백혈구 혈관의 유출의 억제제를 확인하기 위해 수정될 수 있다. 예를 들어, 억제제는 리간드 또는 길항제가 시험 동물에게 투여되기 전, 동시 또는 후에 투여될 수 있다. 억제제 부재하의 침투의 범위와 비교한 억제제 존재하의 침투의 범위의 감소는 억제도를 나타낸다.
진단학적 적용
본 발명은 다양한 진단학적 적용을 갖는다. 이러한 적용은 본원에 설명된 적용을 제한하지 않고서 포함한다.
포유류 CKR-3 수용체 단백질을 코드화하는 유전자의 변종은 코드화된 수용체의 하나 이상의 작용을 변형시켜, 수용체 작용을 감소시키거나 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 수용체의 변이체를 생성하거나 발현의 수준을 변화시키는 변종은 수용체 작용을 감소시키거나 개선시켜, 수용체에 의해 매개된 염증 방법을 감소시키거나 개선시킬 수 있다.
예를 들어, 개체의 세포(예를 들어, 백혈구)내 수용체 또는 이러한 세포로부터 단리된 수용체의 활성을 특성화시키는데 수용체의 기능을 검출하거나 측정하는 방법을 사용할 수 있다. 이들 검정법에서, 감소 또는 증진된 수용체 기능성이 평가될 수 있다.
본 발명의 핵산은 감소 또는 증진된 활성을 갖는 수용체를 코드화시키는 결함성 포유류 CKR-3 수용체 유전자를 특징화 및/또는 단리시키기 위해 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 시제(예를 들어, 프로브, PCR 프라이머)를 제공한다. 예를 들어, 결함성 유전자를 스크리닝하기 위한 표준 방법이 사용될 수 있다. 결함성 유전자 및 코드화된 수용체의 활성은 단리되고, 포유류 CKR-4 수용체에 대해 본원에서 기술되는 추가적인 평가를 위한 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 다수의 사람 질병은 G-단백질 결합 수용체 기능의 결함과 관련되어 있다[참고문헌: Clapham, D.E., Cell, 75: 1237-1239(1993); Lefkowitz, R.J., Nature, 365:603-04(1993)].
본 발명의 항체는 수용체가 세포 표면상에서 검출될 수 있는 과정에서 응용한다. 상기 수용체는 특히, 호산구에서 발현되는 백혈구 세포 유형의 마아커를 제공한다. 예를 들어, 수용체 단백질 또는 펩티드에 대해 증가된 항체가 사용되어 수용체를 발현시키는 세포를 셀 수 있다. 세포 세기는 증가되거나 감소된 백혈구 세포 유형(예를 들어, 과호산구증가증(예를 들어, 과호산구성 증상), 호산구감소증)가 관찰되는 다양한 질병 또는 상태를 진단하는데 사용될 수 있다. 개체로부터 입수된 샘플중의 증가된 정도로 호산구가 존재하는 것은 천식과 같은 염증성 질환 또는 상태, 또는 기생충 감염과 같은 감염으로 인한 호산구성 침윤의 징후일 수 있다. 또한, 부가하여, 항체는 세포의 혼합물중에서부터 수용체를 발현시키는 세포를 분류하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적으로 세포를 세고/거나 분류하기 위한 적합한 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 흐름 세포계수법, 형광 활성 세포 분류).
또한, 항체가 백혈구의 염증 과정이 변경된 (예를 들어, 적합한 대조군에 비해 증가 또는 감소된, 예를 들어 정상 개체에서의 발현 정도) 다양한 질환 또는 상태에서 수용체의 감소된 또는 증가된 발현을 검출하거나 측정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 백혈구(예를 들어, 호산구, T 림프구와 같은 림프구, 단구, 호염기구)는 개체로부터 얻을 수 있으며, 적합한 면역학적 검정법(예를 들어, ELISA, FACS 분석법)이 발현 정도를 평가하는 데 사용될 수 있다. 포유류 CKR-3 수용체의 발현 정도는 포유류 CKR-3 수용체가 증가 또는 감소되어 발현된 질병 또는 상태를 진단하는 데 사용될 수 있다.
형질전환된 동물
동물 숙주의 게놈이 재조합 DNA 기술을 사용하여 변성된 형질전환된 동물이 구성될 수 있다. 하나의 구체예에서, 변성은 유전성을 갖지 않는다(예를 들어, 골수내 선조 세포와 같은 체세포는 변경된다). 또 다른 구체예에서, 변성은 유전될 수 있다(배선은 변경된다). 형질전환된 동물은 표준 기술 또는 기타 적합한 방법을 사용하여 구성될 수 있다[참고문헌: Cooke, M.P. et al., Cell, 65:281-291(1991) regarding alteration of T lymphocytes; Hanahan, D., Science, 246: 1265-1275, (1989)].
어느 한 관점에서, 내인성 포유류 CKR-3 수용체 유전자는 적합한 동물 숙주로 (예를 들어, 유전자 파괴 기술에 의해) 전체적으로 또는 부분적으로 비활성되거나 무능력화되어 형질전환된 동물을 생성시킬 수 있다. 본 발명의 핵산은 비활성화되거나 무능력화된 CKR-3 유전자를 함유하는 숙주의 성공적인 구성을 평가하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 남부의 혼혈). 또한, 비활성화되거나 무능력화된 CKR-3 유전자를 함유하는 숙주의 성공적인 구성은 코드화된 수용체의 기능을 관찰하는 적합한 검정법에 의해 평가될 수 있다.
또다른 구체예에서, 포유류 CKR-3 수용체 단백질 또는 폴리펩티드를 코드화시키는 핵산이 적합한 숙주에 도입되어 형질전환된 동물을 생성시킨다. 바람직한 구체예에서, 형질전환된 동물에 존재하는 내인성 CKR-3 수용체 유전자는 비활성화된다(예를 들어, 내인성 유전자를 파괴하고 교체시키는 상동 재조합체에 의한 핵산의 도입과 동시에). 예를 들어, 백혈구에서 상이한 포유류종(예를 들어, 사람)의 포유류 CKR-3 수용체를 코드화시키는 핵산을 발혀시킬 수 있는 형질전환된 동물(예를 들어, 마우스, 기니아 피그, 양)이 생성될 수 있으며, 도입된 수용체의 기능을 평가하기 위한 용이한 동물 모델을 제공한다. 또한, 화합물이 형질전환된 동물에 투여될 수 있으며, 수용체에 의해 매개된 염증 과정에서 화합물의 효과가 적합한 검정법에 의해 관찰될 수 있다[참조예: Weg, V.B. et al., J. Exp. Med., 177: 561(1993); Abraham, W.M. et al., J. Clin. Invest., 93:776(1994)]. 상기 방법으로, 수용체 기능을 억제하거나 촉진시키는 화합물이 생체내 효과로 확인되거나 평가될 수 있다.
치료 방법
포유류 CKR-3 수용체의 하나 이상의 기능 특성을 억제 또는 촉진하므로써 본 발명에 따른 포유류 CKR-3 수용체 기능의 변조은 백혈구-매개된 염증 작용을 억제시키거나 촉진시키는 효과적이고 선택적인 방법을 제공한다. CKR-3 수용체 기능에 대한 하나 이상의 리간드, 억제제, 및/또는 프로모우터, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 확인된 것들이 치료 목적으로 백혈구 기능을 변조하는 데 사용될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 본 발명은 단백질을 단백질의 하나 이상의 기능의 억제제 또는 프로모터와 접촉시키는 단계를 포함하여 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질의 하나 이상의 기능을 조절하는 방법에 관한 것이다.
주요 호산구 및 케모킨 수용체로서, 포유류 CKR-3 수용체는 사람과 같은 포유류에서 호산구 및/또는 림프구의 기능을 방해하거나 촉진시키기 위한 목적을 제공한다. 일관성 있게, T-세포 및 호산구의 공동-편재화가 특정한 염증성 침윤물에 관찰딘다. 따라서, 본 발명에 따라 확인된 리간드, 억제제 및 프로모우터와 같은 CKR-3 수용체 기능을 억제하거나 촉진하는 화합물은 특히 치료 목적으로 호산구 및/또는 림프구를 변조하는데 유용하다.
따라서, 본 발명은 이러한 치료에 필요한 개체에서 염증 반응을 억제하거나 촉진시키는 방법에 관한 것으로, 이러한 치료를 필요로 하는 개체에 포유 대해 동물 CKR-3 수용체 기능을 억제시키거나 촉진시키는 화합물을 투여함을 포함한다.
일 구체예에서, 포유류 CKR-3 수용체(예를 들어, 사람 CKR-3 수용체)의 하나 이상의 기능을 억제시키는 화합물이 투여되어 염증을 억제시킨다(즉, 감소시키거나 예방한다). 결과적으로, 하나 이상의 염증 과정, 예를 들어, 백혈구 이동, 화학주성, 세포외추출(예를 들어, 효소, 히스타민의), 또는 염증 매개자 방출이 억제된다. 예를 들어, 염증 부위(예를 들어, 천식)에 대한 호산구 침윤이 본 발명의 방법에 따라 억제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 포유동물에 치료적 유효량의 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질의 억제제를 투여하여, 염증을 감소시키는 것을 포함하여, 염증성 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 포유류 CKR-3 수용체(예를 들어, 사람 CKR-3 수용체)의 하나 이상의 기능을 촉진하는 화합물이 투여되어 염증 반응, 예를 들어, 백혈구 이동, 화학주성, 세포외추출(예를 들어, 효소, 히스타민의), 또는 염증 매개자 방출을 촉진하여, 결과적으로 염증 과정을 유리하게 자극한다. 예를 들어, 호산구는 보충되어 기생충 감염을 구제할 수 있다.
사람과 같은 영장류 이외에, 다양한 기타 포유류가 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다. 예를 들어, 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 구니아, 피그, 쥐 또는 기타 소, 양과 동물, 말과 동물, 개과 동물, 설치 동물 또는 쥐과 동물 종을 포함하는 포유류가 치료될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 그러나, 상기 방법은 조류종(예를 들어, 닭)과 같은 기타 종에서 실시될 수 있다.
염증 및 감염과 관련된 질병 및 상태는 상기 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질병 또는 상태는 염증 반응을 조정하기 위해 호산구 및/또는 림프구의 작용이 억제되거나 촉진되어야 하는 것중 어느 하나이다.
CKR-3 수용체 기능의 억제제로 치료될 수 있는 사람 또는 기타 종의 질병 또는 상태로 하기의 질병 또는 상태가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다:
· 호흡기 알레르기성 질환, 예를 들어, 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐질환, 과민성 폐렴, 호산구성 폐렴(예를 들어, 로에플러(Loeffler) 신드롬, 만성 호산구성 폐렴), 간질성 폐질환(ILD)(예를 들어, 특발 폐섬유증, 또는 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 전신성 경화증, 스조그렌(Sjogren) 신드롬, 다발성 근염 또는 피부근염과 관련된 ILD); 전신성 과민증 또는 과민성 반응, 약제 알레르기(예를 들어, 페닐실린, 세팔로스포린에 대해), 곤충자상 알레르기; 염증성 배변 질환, 예를 들어, 크로온(Crohn) 질환 및 궤양성 대장염; 척추골관절병증; 피부경화증; 건선 및 염증성 피부병, 예를 들어, 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 두드러기; 맥관염(예를 들어, 괴사성, 피부성, 및 과민성 맥관염)을 포함하는 염증성 또는 알레르기성 질환 및 상태,
· 호산구성 근염, 호산구성 근막염,
· 자가면역 질환, 예를 들어, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 중증군무력증, 연소성 발현 당뇨병, 사구체신염, 자가면역 갑상성며, 베케트(Behcet) 질환,
· 동종 이식 거부 또는 이식편-대-숙주 질환을 포함하는 이식 거부(예를 들어, 이식술),
· 피부 또는 기관의 배혈구 침윤된 암,
· 리퍼푸션(reperfusion) 손상, 죽상경화증, 특정 혈액 악성증, 시토킨-유도 독성(예를 들어, 폐혈성 쇼크, 내독소성 쇼크), 다발성근염, 피부근염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 기타 질환 또는 상태로서, 억제되어야 하는 바람직하지 않은 염증 반응이 치료될 수 있는 질환 또는 상태.
CKR-3 수용체 기능의 프로모우터로 치효될 수 있는 사람 또는 기타종의 질환 또는 상태는 하기와 같으나, 이에 한정되지는 않는다:
· 예를 들어, 면역결핍증, 예를 들어, AIDS가 있는 개체, 방사선 치료, 화학치료, 자가면역 질환 치료 또는 기타 약물 치료(예를 들어, 코르티코스테로이드 치료)를 받고 있는 개체에서의 면역억제증로서, 면역억제를 유발시키는 면역억제증; 수용체 기능의 선천성 결핍 또는 기타 원인으로 인한 면역억제,
· 예를 들어, 윤충 감염, 예를 들어 선충류(회충); (트리쿠리아시스(Trichuriasis, 엔테로비아시스(Enterobiasis), 아스카리아시스(Ascariasis), 훅크웜(Hookworm), 스트롱일로이디아시스(Strongyloidiasis), 트리키노시스(Trichinosis), 필라리아시스(Filariasis)); 흡충류(플룩세스(fluxes)(스키스토소미아시스(Schistomiasis), 클로노르키아시스(Clonorchiasis)); 내장충, 유충내장이행중(예를 들어, 톡소카라(예를 들어, Toxocara), 호산구성 위소장염(예를 들어, Anisaki spp., Phocanema ssp.), 피내유충이행증(Ancylostoma braxiliense, Ancylostoma caninum)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 기생충 질환과 같은 감염 질환.
특정 염증 반응, 특히 천식에서 표적 세포로서의 호산구
호산구는 뼈의 골수에서 생성되어 폐, 위장관 계통, 및 비뇨생식기 계통과 같은 조직, 점막조직으로 영구히 순환한다. 호산구는 전형적으로 혈액내 백혈구의 1-3%를 구성한다. 그러나, 알레르기성 질환 및 기생충의 기생 감염증을 앓고 있는 사람들에게서, 증가된 호산구 축적이 조직 및 혈액에서 일어난다. 호산구 축적은 숙주에 이롭기도 하고 동시에 불리하기도 하다.
예를 들어, 호산구는 양이온성 단백질을 함유하는, 다수의 미립물을 보유하고 있다. 예를 들어, IgG, IgA, 또는 IgE 수용체의 맞물림에 의해, 또는 혈소판-활성화 인자(PAF), 류코트리엔, 또는 케모킨과 같은 염증성 매개체에 의해 촉진되어 발생되는 호산구의 탈미립화는 미립물내의 조성물을 방출시킨다. 호산구로부터의 생성물은 또한 숙주 세포에 손상을 야기시킨다. 가장 손상을 입히는 것은 양이온성 단백질이며, 이는 천식을 앓고 있는 환자에게 있어서 상승 농도의 형태로 검진할 수 있다. 호산구는 또한 류코트리엔 C4, 및 혈소판-활성화 인자(PAF)를 포함하는, 다수의 염증성 매개체를 발생시킨다. 이들 매개체는 기도 평활근을 수축시키고, 점액의 분비를 촉진시키고, 도관 투과성을 변경시키며 추가의 호산구 및 호중구 침윤을 도출해 낸다.
호산구는 침윤 및 알레르기성/천식 체질의 유지와 연루되어 있다. 그 결과, 바람직한 구체예에서, 상기 방법이 천식 또는 과민증(알레르기성) 상태, 특히, 점막 조직과 관련된 질환, 및 그 밖의 호산구 관련 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 포유류 CKR-3 수용체(예를 들어, 사람의 CKR-3 수용체)의 하나 이상의 기능을 억제하는 화합물은 천식을 앓고 있는 개체에 투여된다.
호산구는 다수 세포의 기생충 기생과 같은, 거대, 비식세포성 미생물에 대항하는 숙주 방어 및 파괴에서 명백하게 중요하다. 호산구는 또한 고수준의 IgE 항체를 유도하는 그 밖의 병원균에 대항하는 면역반응에서 중요한 작동제 세포이다. 따라서, 기생충 질환과 같은 감염질환을 치료하고, 염증성 방어를 고무시키고 촉진시키거나, 숙주에 파괴적인 염증 반응을 억제하는데 상기 방법을 사용할 수 있다.
호산구 및 천식의 병인
천식은 기도 또는 기관지의 장애를 특징으로하며, 기관지 과민증 및 광범위한 약리학적인 매개체에 반응하여 신속한 수축으로부터 유발된다. 기관지 점막벽의 만성 염증은 천식의 발병에 기본적인 역할을 하는 것으로 널리 믿어진다.
호산구, 대식구 및 림프구에 의한 기관지 점막의 강한 침윤은 천식 및 그외의 과민증에서 관찰된다. 자주 호산구가 염증이 발생한 기도에 선택적으로 이동되는 것은 현저할 수 있고, 이는 내피로의 호산구의 선택적 결합 및 혈액으로부터의 추출의 결과로 보인다. 특히 호산구는 기관지 점막 손상의 원인 제제로서 관련되어 있다. 천식 환자들의 연구는 혈액 호산구 총수가 기관지 과반응성과 상관관계가 있음을 제시한다. 부가하여, 천식 환자로부터의 기관지 생체검사 및 기관지소와상 세척액은 호산구의 정도 및 임상적 병세 사이의 명확한 관계를 보여준다. 따라서, 특히 천식에 있어서, 호산구의 존재 및 불리한 면역 반응 사이에는 강한 관련이 있다.
화학유인제에 반응하여선택적 백혈구 화학주성, 혈관외유출 및 활성화의 형태로 작용하는 호산구 및 림프구에 대한 주요한 케모킨 수용체는 호산구 보충을 간섭하기 위한 우수한 표적을 제공한다. 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 사람) CKR-3 수용체의 하나 이상의 기능을 갖는(케모킨이 이 수용체에 결합하는 것을 억제함) 억제물질의 투여는 천식을 치료하는 효과적이고 선택적인 방법을 제공할 수 있다. 염증이 발생한 폐 및 기도 조직에 백혈구(특히, 호산구)가 보충(혈관외유출, 침윤)되는 것을 감소시키거나 억제하고, 및/또는 이들 조직중에서 백혈구 작용을 감소시킴으로서, 천식의 유해한 염증 프로세스는 억제될 수 있고, 증상은 완화될 수 있다.
호산구가 폐에 보충되는 것을 블록킹하는 것은 천식 증상을 완화시킬 수 있다는 증거가 있다. α4 인터그린(intergrin)과 반응성인 단클론성 항체의 투여는 폐 및 기도로의 호산구의 축적을 억제하는 것으로 보고되었고, 양에서의 항원 공격에 대한 기도 과반응성을 블록킹하였다. 천식의 영장류 모형에 있어서, ICAM-1에 대한 단클론성 항체는 기도 호산구증다증 및 과반응성을 약화시키는 것으로 보고되어 있다. 부가하여, 수동적 피부 과민증에 대한 기니피그 모형에 있어서, 시험관내에서 호산구를 항-α4 단클론성 항체로 전처리하는 것은 호산구 축적을 억제하는 것으로 보고되었다. [참조: 상기 모형에 대하여, Wegner, C.D. 등, Science, 247: 456 (1990); Weg, V.B. 등, J. Exp. Med., 177: 561 (1993); 및 Abraham, W.M. 등, J. Clin. Invest., 93: 776 (1994)].
투여 형태
본 발명의 방법에 따르면, 하나 이상의 화합물은 적당한 루트에 의해 단독으로 또는 또 다른 약물과 조합되어 숙주에 투여될 수 있다. 유효량의 화합물(예를 들어, 리간드가 항체 또는 항체 단편과 결합하는 것을 억제하는 수용체 펩티드)이 투여된다. 유효량은 투여의 조건하에서 CKR-3 수용체 기능을 억제 또는 촉진시켜, 염증 반응을 각각 억제 또는 촉진시키기에 충분한 양과 같이 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 양이다.
투여 루트는 경구적, 식이적, 경피적, 비경구적(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근내, 피하 주사), 흡입(예를 들어, 기관지내, 비내 또는 경구적 흡입, 비내 점적)을 포함하는 다양한 루트가 가능하지만 이들에 제한되지 않고, 이 투여 루트는 치료하려는 질환에 의존하여 변할 수 있다. 천식과 같은 호흡성 알레르기 질환의 경우에, 흡입이 바람직한 투여 형태이다.
투여시키려는 화합물의 제형화는 선택된 투여 루트(예를 들어, 용액, 에멀션, 캡슐)에 따라 변할 것이다. 투여시키려는 화합물을 포함하는 적당한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 운반체 또는 담체내에서 제조될 수 있다. 용액 또는 에멀션을 위해, 적당한 담체는 예를 들어, 식염 및 완충 매질을 포함하는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 비경구적인 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 락테이트된 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥내 운반체는 다양한 첨가제, 방부제, 또는 유체, 영양물 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다 (참조: 일반적으로, Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980). 흡입의 경우에, 화합물은 가용화되어, 투여를 위한 적당한 디스팬서(예를 들어, 분무기, 연무기 또는 가압 에어로졸 디스팬서)내로 로딩될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 설명될 것이며, 이들 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
사람 호산구 및 호산성-류 세포주의 화학주성 특성
사람 호산구의 화학주성
호산성 케모킨 수용체의 길항물질을 확인하기 위해, 호산구 화학주성을 위한 중요한 케모킨을 확인하고, 이들 케모킨이 결합하는 수용체를 결정하는 것이 필요하다. 화학주성 실험은 화학주성 웰의 폴리카르보네이트막상에서 성장된 내피 세포주를 사용하는 감수성 있는 개선된 화학주성 검정법으로 수행하였다.
호산구의 단리
100ml의 헤파린화 혈액을 PBS로 1:1 희석시켰다. 20ml의 분액을 65%, 75% 퍼콜(Percoll) 스텝 기울기 상에서 층화시켰다. 구배를 실온에서 25분 동안 1500rpm으로 원심분리시켰다. 호산구/호중구층을 새로운 튜브로 이동시키고, 적혈구를 20ml의 0.2% NaCl을 1분 동안 첨가한후 30ml의 1.8% NaCl을 첨가하여 용해시켰다. 세포를 PBS, 0.5% BSA, 0.5mM EDTA로 이루어진 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 저온 완충액(PBS, 0.5% BSA, 0.5mM EDTA)중에서 5x107세포/50㎕로 재현탁시키고, 50㎕의 CD16 마이크로비드를 세포에 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 25분 동안 인큐베이팅시킨후, 900㎕ 저온 완충액을 첨가하였다. 미니막스[등록상표: miniMACS] 분리 유니트(Miltenyi Biotec, Inc., Auburn CA 95603)를 사용하여 CD16 포지티브 세포(호중구)를 고갈시켰다. 세포를 200㎕ 분액으로 칼럼상에 로우딩시켰다. 유동 세포를 수집하고 조직학적으로 평가하였다. 호산구 제제형의 순도는 99% 이상이었다.
화학주성 검정
케모킨을 페프로테크, 인코포레이티드(Peprotech, Inc.; Rocky Hill, N.J.)로부터 구입하였다. 화학주성 실험은 24개의 웰 플레이트중에서 3.0 마이크론 바이오코우트(Biocoat) 세포 배양물 인서트 (Collaborative Biomedical Products)를 사용하여 수행하였다. 내피 세포를 화학주성 실험 전에 2일 동안 인서트상에서 컨플루언시 상태로 성장시켰다. 사용된 내피 세포는 ECV 304(European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, U.K.)로 명명되는 세포주이며, 이 세포주는 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자와 같은 내피 세포 마커 뿐만 아니라 ICAM-1 및 VCAM-1을 발현시킨다. 이러한 내피 세포주는, 사람 배꼽정맥 내피 세포가 사실상 변화할 수 있고, 단지 수 회의 계대접종 동안에 사용될 수 있고, ECV 304 보다 훨씬 서서히 성장할 수 있기 때문에 이들 검정을 매우 용이하게 한다. 검정은 37℃에서 1.5시간 동안 수행하였고, 이동된 세포는 도립현미경을 사용하여 계수하였다.
결과
도 4에 제시된 결과는 5회 이상의 실험의 대표물이다. 폴리카르보네이트막상에서 ECV 304 상피 세포의 성장은 거의 완전하게 배경 이동을 감소시켰다. 경내피적 화학주성에 적용된 호산구는 다수의 케모킨, 특히 RANTES, MCP-3, 및 보다 적은 정도의 MCP-1로의 이동을 나타내었다. MIP-1β, IL-8, MCP-2, 및 IP-10은 호산구 화학주성에 대해 거의 효과를 가지지 않았다. MIP-1α는 비활성인 것이 일반적이지만, 일부 실험에서는 호산구에 대해 화학주성을 나타내었다. 이들 실험에 있어서, 서로다른 케모킨에 대한 백혈구 반응성의 변화 및 케모킨 제제형의 특성에 대한 불확실성으로 인해 일정 범위의 케모킨 농도가 사용되었다. 일관된 발견은 RANTES 및 MCP-3에 대한 고수준의 호산구 화학주성이었다.
실시예 2
주요 호산성 케모킨 수용체의 확인
프라이머 선별 및 설계
5개의 케모킨 수용체 유전자를 배열하고 비교하여, 호산구로부터 신규한 케모킨 수용체를 PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝하는데 사용하기 위한 변성 올리고누클레오티드의 세트를 생성시켰다. 이들 5개 수용체 유전자의 선별은 이들 유전자가 결합하는 케모킨 리간드의 유형(IL-8 수용체 A(IL8RA), Il-8 수용체 B(IL8RB), MIP-1α 수용체(MIP1αR)), 또는 발현이 림프계 세포 또는 림프성 조직으로 제한되는 것으로 보고된 이들 수용체와 현저한 서열 유사성을 갖는 오르펀(orphan) 수용체(Epstein Barr Inducible receptor-1(EBI1R) 및 Burkitt's Lymphoma Receptor-1(BLR1))를 기초로 하였다. 수용체 서열은 많은 공표된 배열을 기초로 하여 수작업으로 배열하였다 (IL-8RA, Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991); IL-8RB, Murphy, P.A. et al., Science, 253: 1280-1283 (1991); MIP1α/RANTES, Neote, K. et al., Cell, 72: 415-425 (1991); EBI1R, Birkenbach, M. et al., J. Virol., 67: 2209-2220 (1993); 및 BLR1 (Dobner, T. et al., Eur. J. Immunol., 22: 2795-2799 (1992)).
트랜스멤브레인(TM) 영역 2, 6 및 7내의 서열 뿐만 아니라 TM3에 대한 C-말단에 바로 인접한 영역은 고도의 서열 유사성에 기초한 변성 올리고누클레오티드 설계를 위한 표적으로서 선택되었다. 변성 올리고누클레오티드 프라이머의 누클레오티드 서열은 하기 표에 설명되어 있다.
표
프라이머 세트 2
호산구 단리 및 정제
100㎖의 헤파린화된 혈액을 PBS로 1:1로 희석시킨다. 20㎖의 분취액을 65%, 75% 퍼콜(Percoll) 단계 그래디언트 상에 적층시킨다. 그래디언트를 실온에서 25분 동안 1500 rpm에서 원심분리시킨다. 호산구/호중구 층을 새로운 관으로 옮기고, 적혈구를 1분 동안 20㎖의 0.2% NaCl을 첨가한 후에, 30㎖의 1.8 NaCl을 첨가하여 용해시킨다. 세포를 인사염 완충 식염 (PBS), 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)의 용액으로 2회 세척한다. 세포를 냉각 완충액 (PBS, BSA, EDTA 용액) 중에 5×107세포/50㎕로 재현탁시킨다. 혼합물을 4℃에서 25분 동안 인큐베이팅시킨 후, 900㎕의 냉각 완충액을 첨가한다. 상표명 miniMACS의 분리 장치 (95603 캘리포니아, 오버언에 소재하는 밀테니이 바이오텍, 인코포레이티드 (Miltenyi Biotec, Inc.)의 제품)를 사용하여 CD16 양성 세포 (호중구)을 제거한다. 세포를 칼럼 상에 200㎕ 분취액 중에 로딩시킨다. 흐름-통과 세포를 모으고, 조직학적으로 평가한다. 이러한 기준에 의해, 호산구 prep는 순도가 99% 보다 높다.
mRNA 단리 및 PCR
RT-PCR (역전사-폴리머라아제 연쇄 반응)을 위한 mRNA를 인비트로젠 (Invitrogen)으로부터 입수한 상표명 Micro-FastTrack의 mRNA 단리 킷을 사용하여 정제된 세포로부터 직접 추출시킨다. mRNA의 품질을 사용에 앞서 7TMS 변성 프라이머에 의한 β-액틴 및/또는 GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소화 효소) mRNA의 PCR 증폭에 의해 평가한다.
20 내지 50 ng의 mRNA를 제조업자가 규정한 바와 같이 20㎕의 최종 부피로 프라이머로서 올리고 DT 및/또는 랜덤 헥사머를 갖는 등록 상표 GeneAmp RNA PCR 킷을 사용하여 역전사시킨다. 2 내지 5㎕의 상기 cDNA (역전사된 호산구 메시지)를 200μM dNTPs 및 50 내지 100 pmol의 변성 프라이머와 50㎕ 부피로 혼합시킨다. 마그네슘 농도 및 pH를 각각의 프라이머쌍에 대해 최적화시킨다. 마그네슘 농도는 1.0 내지 3.0 mM이고, pH는 8.5 내지 10.0이다. 여러 사이클의 변수를 또한 평가한다. 일반적으로 사용되는 조건은 하기의 조건과 유사하다 : 3 사이클 : 94℃, 30초 ; 37℃, 30초 ; 72℃ 까지 2분 램프, 1분, 그다음에 30 사이클 : 94℃, 45초 ; 48℃, 1분 ; 72℃, 1분. (램프 = 점차적 증가).
단리된 201 bp 단편 (하기 참조)에 대해, 프라이머쌍 2a-1과 7-1, 또는 프라이머쌍 2a-1과 3R을 60 mM Tris-HCl (pH 9.5) 및 1.5 mM MgCl2중에서 PCR 반응 (상기 기술된 바와 같음)에 사용한다. 각각의 반응으로부터의 생성물 1㎕를 "네스티드" 프라이머 2a-2와 3R과 함께 PCR의 분리 (제 2) 라운드에 사용한다. ("네스티드" 프라이머는 외측 프라이머 내의 서열에 혼성되는 프라이머이다.). 네스티드 PCR에 대한 반응 조건은 실제로 제 1 PCR에 대해 기술된 바와 같다.
PCR 생성물을 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 평가하고 분리시키고, 적합한 크기를 갖는 단편을 정제하고 상표명 pCR-Script SK + 클로닝 킷 (스트라타젠)을 사용하여 서브클로닝시킨다. (적합한 단편 크기는 하기와 같다 : 영역 2a 및 7로부터의 프라이머쌍에 의한 PCR (상기 표 참조)에 대해, 약 700 bp ; 영역 2a 및 3R로부터의 프라이머에 의한 PCR에 대해, 약 200 bp ; 프라이머 3F와 영역 6b로부터의 프라이머에 의한 PCR에 대해, 약 400 bp ; 및 프라이머 3F와 영역 7로부터의 프라이머에 의한 PCR에 대해, 약 550 bp). 기대되는 단편 크기는 관련된 수용체 단백질이 일부 구조 유사성을 공유한다는 가설에 근거하여 예측된다.
신속한 스크리닝 검정
많은 클론을 7TMS 부류의 신규한 멤버에 대해 빠르게 스크리닝시키기 위해, 상기 기술된 바와 같이 얻어지는 박테리아 콜로니의 삽입체 (즉, pCR-Script+내로 서브클로닝된 적절한 크기의 단편을 포함하는 플라스미드의 트랜스펙턴트)를 상표명 pCR-Script의 폴리링커를 플랭킹하는 서열에 상보적인 T3 및 KS를 사용하여 PCR에 의해 스크리닝한다. 특히, 밤새 트랜스펙션으로부터의 박테리아 콜로니의 일부를 200μM dNTPs, 20mM Tris (pH 8.5), 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 50 pmol의 각각의 프라이머 및 0.25 유닛 Taq 폴리머라아제를 함유하는 40㎕의 PCR 혼합물과 직접 혼합시킨다. 사이클 조건은 25 사이클 : 94℃, 20초 ; 55℃, 20초; 및 72℃, 30초이다. 정확한 크기의 삽입체를 1.5% 아가로오스 겔 상에서 20㎕의 PCR 생성물의 평가에 의해 확인한다. 나머지 20㎕의 반응물을 Alu I, Hha I 및 Rsa I로 분해 (삼중 분해)시키고, 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 재용해시켜서, 상이한 분해 파트너를 스크리닝시킨다. 상이한 파트너의 클론을 서열 분석을 위해 선택한다.
결과
변성 올리고로부터 발생한 PCR 단편의 서열 분석으로, pCR-Script 중의 201 bp 부분 cDNA 클론이 확인되었다. (변성 올리고는 2a-1, 2a-2, 3F, 3R 및 7-1이다.). Eos L2 (또한, L2 및 EL2로서 언급된)로서 표시되는 상기 부분 클론은 MIP1α/RANTES 수용체에 대해 78.3% 아미노산 유사성 (81.1% 핵산 유사성), 및 MCP-1 수용체에 대한 60.8% 아미노산 유사성 (61.6% 핵산 유사성)을 갖는 것으로 관찰되었다. 가장 최근의 서열 데이터 베이스는 상기 부분 클론이 독특함을 나타낸다.
서던 및 노던 분석
PCR 단편을 표지화시키고, 서던 및 노던 블롯 둘 모두를 검사하기 위해 사용한다. PCR 프로브를 제조하기 위해, 201 bp 단편을 제한 효소 EcoRI 및 Not I에 의해 pCR-Script 벡터로부터 방출시킨다. 이러한 분해는 벡터로부터의 201 bp 단편 및 39 염기쌍의 폴리링커로 이루어진 240 bp의 단편을 생성시킨다. 분획을 아가로오서 겔을 통해 전기 영동에 의해 벡터로부터 분리시키고, 실제로 제조업자가 추천한 바와 같이 정제한다. (위스콘신주, 매디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션의 제품인 Magic Mini Prep에 의해). 약 200 ng의 물질을 제조업자가 추천한 표지화 방법에 따라, 뵈링거 만하임으로부터 입수한 랜덤 프라임 DNA 라벨링 킷을 사용하여 표지화시킨다.
서던 블롯에 대해, 게놈 DNA (캘리포니아, 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래버러토리이즈로부터 입수함)을 밤새 제한 효소로 분해시키고, 0.7% 아가로오스 겔 상에서의 전기영동, 및 후속되는 Hybond-N 나일론막 (Amersham)으로의 모세관 전달에 의해 분리시킨다. 5× 덴하르트 용액 (1× 데하르트 용액은 0.02% 소 혈청 알부민, 0.02% 피콜, 0.02% 폴리비닐피롤리돈임), 10% w/v 덱스트란 설페이트, 2% SDS 및 전단된 연어 정액 DNA (100㎍/㎖)을 함유하는 6× SSC (1× SSC는 0.15M 염화나트륨, 0.015M 시트르산 나트륨임) 중에서 밤새 65℃에서 혼성화가 수행된다. 막을 65℃에서 2× SSC, 0.5% SDS로 2회 세척한 후, 65℃에서 0.2× SSC, 0.5% SDSFH 2회 (각각 15분) 세척한다.
서던 혼성화는 각각 효소를 사용하여 단일 강혼성 단편 및 단일 약혼성 단편을 나타낸다. 약혼성 단편은 또한 MIP1α1/RANTES 수용체이다.
다중 조직 노오더 블롯은 캘리포니아, 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래버러토리이즈, 인코포레이티드로부터 입수한다. 상표명 ExpressHyb의 용액을 또한 클론테크 래버러토리이즈, 인코포레이티드로부터 입수한다. 다중 조직 노던 블롯을 제조업자가 추천한 바와 같이 수행한다. 프로브는 서던 블롯에 대해 상기 설명한 바와 같다. 노던 혼성화의 결과는 비장, 말초 혈액 백혈구 및 흉선에서 약 1.6 kb 메시지의 고수준을 나타낸다. 부가적 노던 분석은 실시예 5에 제공되어 있다.
게놈 라이브러리 스크리닝
클론테크 래버러토리이즈, 인코포레이티드 (캘리포니아, 팔로 알토)로부터 입수한, EMBL3 SP6/T7 벡터 중에 구성된 사람 게놈 파지 라이브러리를 201 bp PCR 단편으로 스크리닝시켜서 온길이 클론을 수득한다. 약 25,000개의 플라크 생성 단위를 NZCYM 상부 아가로오스 중의 라이브러리가 제공되고 NZCYM 세균 배양기 (NZCYM 브로트, 세균 배양기 및 아가로오스는 Gibco/BRL로부터 입수함)를 함유하는 15㎜ 페트리 접시 상에 플레이팅시킨 대장균 변형체 K802의 600㎕의 밤샌 박테리아 배양액과 혼합시킨다. 37℃에서 7시간 동안 배양시킨 후, 플레이트를 5분 동안 BA-85 니트로셀룰로오스 막 (Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 오버레이시켜서 파지를 막으로 전달한다. 막을 덴터링 용액 (1.5M 염화나트륨, 0.5N 수산화나트륨) 중에서 5분 동안 비누화시킨 후, 1.5M 염화나트륨, 0.5M Tris (pH 8.0) 중에서 중화시킨다. 필터를 15분 동안 공기 건조시킨 후, 진공하에 80℃에서 2시간 동안 베이킹시킨다. 필터를 서던 블롯을 위해 상기 기술된 바와 같이 혼성시킨다. 201 bp PCR 단편은 올리고누클레오티드 프라이머 2a-2 (TM2)와 3R (TM3) 사이에 누클레오티드를 함유한다.
Eos L2.8로 표시되는 하나의 게놈 파지 클론은 서던 블롯 상에 나타나는 1.8 kb Hind III 단편을 포함하는 삽입체 (완전 삽입 크기는 결정되지 않지만, 약 17 kb임)를 함유한다.
파지 클론 Eos L2.8을 Hind III 제한 효소로 분해시키고, 아가로오스 겔 상에서 전기 영동시킨다. 약 1.8 kb의 Hind III 단편을 절단시키고, 아가로오스로부터 전기 용리시키고, 페놀/클로로포름 추출시키고, 에탄올로 침전시킨다. 1.8 kb 단편을 물중에 재혀탁시키고, pBuescript II KS+ 벡터 (스트라타진)의 Hind III 자리 내로 결찰시킨 후, Gibco/BRL로부터 입수한 DH5α 컴피턴트 세포로 트랜스펙팅시킨다.
상기 Hind III 단편의 2가닥 모두를 서열화시키며, 단편은 Eos L2 수용체 (사람 CKR-3 수용체)에 대한 전체 아미노산 코드화 영역을 함유하는 것으로 발견되었다. 상기 서열과 하기에 기술되는 cDNA 클론의 비교는 클론이 온길이 클론임을 나타낸다. 1065 누클레오티드의 개방 리딩 프레임은 예측되는 분자량이 41 Kd인 355 아미노산 (SEQ ID NO:2)의 단백질을 코드화시킨다.
온길이 Eos 12 수용체와 MIP1α/RANTES 및 MCP-1 수용체의 서열의 비교는 각각 73.4% 및 60.5%의 아미노산 유사성을 나타낸다. 상기 비교를 위해, 서열을 손으로 정렬시키고, 유사한 아미노산의 수를 아미노산의 총수로 나눈 값에 100을 곱한다.
서열을 또한 상표명 MegAlign (드나스타, 인코포레이티드)를 사용하여 클러스탈 방법에 의해 정렬시킨다. 다른 화학 운동 수용체 서열과의 비교는 각각 CKR-1, CKR-2B 및 CKR-4에 대해 62%, 47% 및 41%의 아미노산 유사성을 나타낸다. 대조적으로, IL-8 수용체 A 및 B에 대한 아미노산 서열 유사성은 두 수용체 모두에 대해 단지 27%이다. 둘 모두 C-C 화학 운동 수용체인 MIP1α/RANTES 및 MCP-1 수용체에 대한 상기 수용체의 서열 유사성은 본원에 보고된 결과와 일치하며, 이는 Eos L2가 C-C 화학 운동 수용체임을 나타낸다.
실시예 3
트랜스펙팅된 세포주에서의 Eos L2의 발현
FLAG-말단 Eos L2 (CKR-3) 수용체 구성물
Eos L2 수용체 융합 단백질을 하기와 같이 구성한다 :
1. pCMS 중의 FLAG-PAF 수용체 구성물 (문헌 [Kunz, D. et al., J. Biol. Chem., 267:9101-9106 (1992)]에 보고된 바와 같이 구성된)을 Hind III 및 EcoRI로 2회 분해시켜서 FLAG 펩티드를 코드화시키는 누클레오티드를 함유하는 48 bp 단편을 방출시킨다. 누클레오티드 서열은 AAGCTTCCA GCA GCC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAA GAATTC (SEQ ID NO:15)이다. 아미노산 서열은 MDYKDDDDKEF (SEQ ID NO:16)이다. FLAG 누클레오티드를 함유하는 48 bp Hind III/EcoRI 단편을 pcDNA3 벡터 (캘리포니아 산 디에고에 소재하는 인비트로젠의 제품)의 Hind III/EcoRI 자리 내로 서브클로닝시켜서 pcDNA3/FLAG를 발생시킨다.
2. 1.8 kb Eos L2 Hind III 단편을 함유하는 pBluescript II KS+ 벡터를 BamHI 및 XhoI로 분해시켜서 1.261 kb 단편을 방출시킨다. 상기 BamHI-XhoI 단편은 스톱 코돈 및 동일한 3' 비번역된 영역 및 21 bp의 pBluescript II KS+ 벡터를 통해 Eos L2 아미노산 91을 코드화시키는 누클레오티드를 함유한다.
3. 2개의 PCR 프라이머를 발생시켜서 Eos L2 유전자의 5' 말단을 증폭시키지만, 제 1 Met를 제거하고 EosRI 자리에서 조작하여, 단계 1에서 상기 기술된 EosRI 자리와 양립시킬 것이다. 5' 프라이머 (SEQ ID NO:17)은 하기와 같다 :
상기 프라이머는 Met 코돈을 제외한, EosL2의 EcoRI 자리 및 제 1의 17 누클레오티드를 함유한다.
3' 프라이머 (SEQ ID NO:18)는 하기와 같다 :
상기 프라이머는 Eos L2 유전자에서 3'로부터 BamHI 자리 까지 프라이밍시킨다. 템플레이트로서 1.8 kb Eos L2 단편을 함유하는 pBluescript II KS+ 벡터를 사용하는 상기 2개의 프라이머에 의한 증폭은 EcoRI 및 BamHI에 의해 분해될 수 있는 Eos L2의 5' 말단을 함유하는 280 bp 단편을 증폭시켜서 하기 기술되는 바와 같이 결찰을 위한 단편을 제공할 것이다.
증폭에 대한 조건은 하기와 같다 : 1.8 kb Eos L2 단편을 함유하는 10 ng의 pBluescript II KS+를 50㎕의 반응 부피로 200μM dNTPs 및 50 pmol의 프라이머와 조합시킨다. 최종 마그네슘 농도는 2.5μM이고, pH는 8.0이다. 단편을 25 사이클로, 94℃, 30초; 55℃, 30초; 72℃, 30초에서 증폭시킨다. 증폭된 생성물을 아가로오스 겔 상에서 분리시키고, 상기 기술된 바와 같이 전기용리에 의해 정제한다. 단편을 아가로오스 겔 상에서 다시 정제한 EcoRI 및 BamHI로 분해시킨다.
4. FLAG-말단 EosL2 유전자의 구성을 위해, FLAG 단편을 함유하는 pcDNA3 벡터 (단계 1에 기술되어 있음)을 전기영동에 의해 폴리링커 단편으로부터 분리시키고, 벡터 단편을 다른 전기용리된 단편에 대해 기술된 바와 같이 정제한다. 벡터 단편을 3개의 단계에서 PCR에 의해 발생된 EcoRI-BamHI 단편과 조합시킨다. 상기 2개의 단편을 2개의 단계로부터 1.261 kb BamHI-XhoI 단편과 조합시킨다. 모든 3개의 단편을 함께 삼중 결찰시켜서, pcDNA3 중의 FLAG-말단 Eos L2 수용체를 수득한다. 결찰된 DNA를 DH5αFH 트랜스펙팅시킨다.
일시적 트랜스펙턴트
293 세포 (ATCC 수탁번호. CRL 1573)을 Gibco/BRL로부터 입수하고 10% 소태아혈청, 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신 (모두 Gibco/BRL로부터 입수함)으로 보충시킨 최소 필수 매질 (MEM) 알파 매질 중에서 성장시킨다. 각각의 일시적 트랜스펙팅을 위해, 2×106개의 293 세포를 35-㎜ 조직 배양 접시에서 형질전화 1일 전에 플레이팅시킨다. 트랜스펙팅시에, 세포 (접시에 부착되어 성장함)을 인산염 완충 식염 (PBS, Gibco/BRL)로 1×로 세척하고, DNA와 상표명 lipofectAMINE 시약 (Gibco/BRL)의 혼합물을 세포에 도포시킨다.
DNA/lipofectAMINE 시약 혼합물은 100㎕의 상표명 OptiMEM (Gibco/BRL)의 최종 부피 중의 2㎍의 FLAG-말단 Eos L2 수용체 발현 벡터를 실온에서 45분 동안 100㎕ 부피 중의 12㎕의 lipofectAMINE 시약으로 인큐베이팅시켜서 제조한다. 최종 혼합물 부피는 200㎕이다. 45분 동안 인큐베이팅시킨 후에, 800㎕의 OptiMEM을 200㎕의 DNA/lipofectAMINE 시약에 첨가하고, 1㎖의 용액을 상기 기술된 바와 같이 세포 상에 적층시킨다. 세포를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이팅시키며, 이 때에 상기 기술된 바와 같이 보충된 1㎖의 MEM 알파 매질을 첨가한다. 세포를 추가로 12시간 동안 인큐베이팅시키며, 이 때에 모든 매질을 제거하고, PBS 및 상기 기술된 바와 같이 보충된 2㎖의 MEM 알파 매질로 2×로 세척한 세포를 첨가한다. 형질 전환된 세포를 추가로 72시간 동안 인큐베이팅시킨다. 세포는 이들을 PBS 및 10mM EDTA 중에서의 인큐베이팅 후에 서서히 피펫팅함으로써 수득한다.
FLAG-말단 Eos L2 수용체의 세포 표면 발현을 일시적으로 트랜스펙팅된 293 세포에서 설명한다. 약 2.6%의 세포가 면역형광 스테이닝 및 FACS 분석에 의해 결정되는 바와 같이 표면 상에서 수용체를 발현시킨다. 일부 세포 중에서의 발현 수준은 기준 보다 2 로그 더 높은 것으로 발견되었으며, 이는 상기 세포주에서 고수준의 발현이 달성될 수 있음을 나타내는 것이다. Eos L2 유전자가 네오마이신 저항성 유전자를 함유하는 pcDNA3 발현 벡터 (캘리포니아 산 디에고에 소재하는 인비트로젠 코포레이션의 제품)에 의해 운반됨에 따라, 안정한 293 트랜스펙턴트는 제네티신(G418) 셀렉션을 사용하여 선택될 수 있다.
안정한 세포주
마우스 L1-2 pre-B 세포의 500개 이상의 안정한 세포주를 FLAG-말단 수용체를 사용하여 발생시킨다. L1-2 pre-B 세포는 캘리포니아 스탠포드에 소재하는 스탠포드 유니버시티의 유겐 부처 (Eugene Butcher) 박사로부터 입수하고, 10% 소 혈청 알부민, 및 Pen/Strept, 피부르산 나트륨 및 β-메르캅토에탄올로 보충시킨 RPMI-1640 (Gibco/BRL) 중에 유지시킨다. 200개 이상의 클론으로부터의 세포를 M2 항-FLAG 단클론성 항체 (코네티컷 뉴 헤븐에 소재하는 인터내셔날 바이오테크놀로지, 인코포레이티드의 제품)으로 스테이닝시킨 후에, 항-마우스 Ig-FITC (잭슨 이뮤노리서치 래버러토리이즈, 인코포레이티드의 제품)으로 스테이닝시켜서 표면 발현에 대해 스크리닝하고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 분석한다. 면역형광 스테이닝 및 FACS 분석을 문헌 [Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Colagen, J. et al., Eds., (John Wiley & Sons, Inc.; New York, NY)]에 기술된 바와 같이 수행한다. 수개의 세포주에 대한 FACS 분석의 결과는 고수준의 Eos L2 말단 수용체를 발현시키는 많은 클론을 나타낸다 (도 6). 비트랜스펙팅된 세포 (도시되지 않음)은 스테이닝에 대해 네가티브하다. 고수준으로 발현된 안정한 세포주는 Eos L2 수용체와 반응성인 항체의 생성을 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 그외에, 이들 세포주는 물질 주성 및 리간드 결합을 연구하는 데에 유용하다.
바쿨로바이러스 발현
바쿨로바이러스 발현 벡터의 구성을 위해, pcDNA3 중의 FLAG-말단 Eos L2 수용체를 Hind III로 분해시켜서, FLAG-말단 유전자를 제거하다. 유전자를 함유하는 Hind III 단편은 Klunow 단편 및 dNTP과의 오버행 중에 충전시킴으로써 무디게 종결되다. 무디게 종결된 단편을 pVL1393 (인비트로젠)의 SmaI 자리 내로 서브클로닝된다. Eos L2 유전자를 함유하는 2.0㎍의 pVL1393 벡터를 0.5㎍의 AcMNPV 바이러스 DNA (인비트로젠)와 혼합시키고, 제조업자의 지시에 따라 상표명 Insection (인비트로젠)에 의해 SF9 삽입 세포 (인비트로젠)로 코트랜스펙팅시킨다. 트랜스펙팅시킨 다음날, SF-900 매질 (혈청을 함유하지 않음)을 5㎖의 SF-9 매질 (10% 소태아혈청을 함유하는 그레이스의 보충된 삽입 매질 (Gibco/BRL))로 대체시키고, 세포를 5일 동안 성장시킨다. 재조합 바이러스를 문헌 [D. R. O'Reilly, L. K. Miller, and V. A. Luckow (1994) Baculovirus expression vector: A Laboratory Manual, Oxford University Press, pp. 149-158]에 기술된 바와 같이 플라크 정제시킨다.
Eos L2 수용체의 발현을 상기 기술된 플라크 정제된 재조합 바이러스로 sf9 세포를 감염시킴으로써 sf9 세포상에 얻는다. sf9 세포 (2×106세포/㎖)를 10:1의 중복 감염으로 감염시킨다. 감염을 72시간 동안 진행시키며, 이 때에 세포를 M2 항-FLAG 항체로 스테이닝시킨다.
상기 수용체의 성공적인 발현을 또한 sf9 세포 중의 바쿨로바이러스 발현계의 사용으로 달성시킨다. 항-FLAG 항체에 의한 스테이닝에 근거하여 양호한 수준의 발현이 달성된다 (실시예 5 참조). 리간드 결합은 또한 FACS에 의해 발현 수용체인 것으로 입증된 동일한 세포 sf9 트랜스펙턴트의 사용으로 달성시킨다. 완전한 세포 표면 발현은 요오드화 폴리피듐의 배제에 의해 달성되지만, 이들 세포에 대한 발현은 네가티브 대조군과 비교하여 낮은 수준인 것으로 보인다. (즉, sf9 세포는 Eos L2 유전자 삽입체가 결핍된 발현 벡터에 의해 트랜스펙팅된다). 감염의 길이는 감소할 수 있고, 더 높은 세포 표면 발현에 대해 MOI가 더 최적화될 수 있다.
실시예 4
리간드 결합 실험
리간드 결합 방법
Eos L2 수용체 또는 정제된 정상 사람 호산구로 트랜스펙팅시킨 세포를 행크 밸러스 식염 용액 (HBSS)로 세척하고, 50 mM HEPES, 1 mM CaCL2, 5 mM MgCl2, 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA)를 포함하는 결합 완충액 (pH 7.3) 중에 재현탁시킨다. 마이크로퓨즈관에서, 5×105개의 세포를 실온에서 60분 동안 200㎕의 분취액 중의 0.1 nM의 방사성표지된 케모킨 (매사츄세츠에 소재하는 뉴 잉글랜드 누클리어로부터 입수함)으로 인큐베이팅시킨다. 세포를 방사성표지된 케모킨만으로 인큐베이팅시키거나, 제시된 농도로 사용되는 경합 물질로서 비표지된 케모킨 (PeproTech로부터 입수함)과 함께 인큐베이팅시킨다. 인큐베이팅의 종결시에, 세포를 결합 완충액 중에서 3회 세척시키며, 각각의 세척은 2분 동안 7000×g에서 마이크로퓨즈에서의 원심분리를 포함한다. 세척 후에, 펠릿을 LP3 관 내로 옮기고, 결합량을 나타내는 세포의 방사능을 감마 카운터에서 측정한다. 모든 샘플을 중복으로 취하고, 모든 실험을 3회 이상 반복한다. 스캣챠드 플롯 (Scatchard Plot)을 매킨토시 컴퓨터 상의 마이크로소프트 엑셀 및 크릭켓그래프로부터 계산한다.
사람 호산구에 대한 결합
물질주성 검정으로부터의 발견에 근거하여 (실시예 1 참조), RANETS, MIP-1α 및 MCP-3에 대해 중점적으로 리간드 결합을 연구한다. 리간드 결합 연구는 방사성표지된 케모킨 및 경합 물질로서 여러 "콜드" 케모킨을 사용하여 리간드 결합 연구를 수행한다. 정제된 정상 사람 호산구를 여러 콜드 케모킨 (250 nM MIP-1α, RANTES, IL-8, MCP-1 또는 MCP-3)의 존재 또는 부재하에 0.1 nM125I-표지된 MIP-1α 또는 RANTES 중 어느 하나에 의해 인큐베이팅시킨다. 세포를 광범위하게 세척한 후, 결합을 감마 카운터에 의해 측정한다.
도 6은 RANTE 또는 MIP-1α에 대한 사람 호산구의 결합을 도시한 막대 그래프이다. 결과는 호산구가 MIP-1α에 단지 약하게 결합하고, 이러한 결합은 MIP-1α 자체에 의해 억제되고, 다른 6-패밀리 케모킨, 예를 들어 MCP-1, MCP-2 및 RANTES에 의해 억제될 수 있음을 제시한다 (도 6 참조). 대조적으로, 호산구는 RANTES를 더욱 많이 결합시킨다 (도 6 참조). RANTES에 의한 결합은 과량의 '콜드' MIP-1αDP 의해 효과적으로 억제될 수 없으며 (도 7 참조), 이는 호산구가 MIP-1α 및 RANYES에 대한 현저한 수용체임을 제시하는 것이다.
스캣챠드 플롯 분석은 1.8×103개의 MIP-1α 결합 자리가 91 pM의 친화도를 가짐을 나타낸다. 상기 분석은 또한, 더 많은 결합 자리 (3.6×104/세포)를 갖는, RANTES에 대한 더 낮은 친화도 (883 pM)의 수용체를 나타낸다. 사용되는 조건하에, 호산구에 대한 상당한 MCP-1 결합은 없고 (도시되지 않음), MCP-1은 매우 낮은 농도에서는 제외하고, RANTES 결합을 억제하지 않는다 (2500배 과량, 도 7).
Eos L2 수용체 트랜스펙턴트
Eos L2의 클로닝 및 발현 후에, 트랜스펙팅된 세포를 사용하여 많은 케모킨에 결합을 시험한다. 293 트랜스펙턴트를 사용하는 제 1 시도는 성공적이지 않고, 결합에 간섭하는 콜드 케모킨의 첨가에 따라, 다른 연구자들에 의해 하나의 현상이 관찰되었다. 대조적으로, 바쿨로바이러스 감염 SF9 세포를 사용하여, 우수한 RANTES 결합이 검출되었다 (도 8). SF9 세포에 대한 검정 조건은 포유동물에 대한 조건과는 다르다. 0.1 nM125I-표지된 RANTES의 결합을 0.5% BSA로 보충시킨, 50 mM HEPES (pH 7.3), 5 mM MgCl2및 1 mM CaCl2중에서 수행한다. 실온에서 60분 후에, 세포를 0.5 M NaCl을 함유하는 결합 완충액 중에서 3회 세척하고, 세포 펠릿 중의 방사능을 감마 카운터를 사용하여 측정한다.
이들 리간드 결합 검정에서, MIP-1α 또는 RANTES 결합의 가장 효과적인 이종 경합 물질은 MCP-3이다. 사실상, MCP-3은 또한 활성화된 T-세포에 대한 MCP-1의 결합을 효과적으로 억제한다. 이와 같이, MCP-3은 CKR-1, CKR-2 및 CKR-3에 결합하는 것으로 보인다 : [참조 : CKR-1, Gap, J. L., et al., J. Exp. Med., 177:1421-1427 (1993) and Neot, K. et al., Cell, 72:415-425 (1993); CKR-2, Charo, I. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2752-2756 (1994) and Myers, S. J., et al., J. Biol. Chem., 270:5786-5792 (1995)].
방사성표지된 MCP-3 (Peprotech, Inc. Rocky HiLL, N.J.)을 결합을 연구하기 위해 사용한다. MCP-3 결합을 하기의 변형된 방식에 따라 상기 기술된 바와 같이 수행한다. 세포를 0.1 nM125I-표지된 MCP-3으로 인큐베이팅시킨다. 사용되는 결합 완충액은 HBSS와 0.5% BSA 및 0.1% 아지드화 나트륨이다. 결합은 37℃에서 30분 동안 수행된다. 비결합 동위체를 2분 동안 12,000×g에서, 800㎕의 20% 슈크로오스를 통해 세포를 방사시킴으로써 분리시킨다. 관을 건조 얼음 중에서 스냅 건조시키고, 상단을 한쌍의 플라이어로 막고, 카운트한다.
실시예 5
호산성 케모킨 수용체의 발현
Eos L2가 호산구에 대한 작용성 수용체임을 확인하기 위해, 수용체의 발현을 (a) 노던 블롯 분석, 및 (b) 수용체와 반응성인 단클론성 항체 항-펩티드 항체를 사용하는 유동 시토메트리에 의해 평가한다.
사람 호산구, 호중구 및 PBMC의 정제
호산구를 항-CD16 자성 비이드에 의한 조합된 밀도 기울기 원심분리 및 네가티브 선택에 의해 고수준의 순환 혈액 호산구 (5-7%)를 갖는 사람의 헤파린화 혈액으로부터 단리시킨다 : [참조 : Hansel, T.T. et al., J. Immunol. Meth., 122:97 (1989)]. 간략하게, 퍼콜 원심분리를 30분 동안 CD16 마이크로비이드 (캘리포니아, 서니베일에 소재하는 밀테니이 바이오텍, 인코포레이티드의 제품)으로 수행한다. 세포를 MACS 칼럼 (밀테니이 바이오텍, 인코포레이티드의 제품)을 통해 통과시키고, 호산구를 흐름 중에 수집한다. 호산구는 광현미경에 의해 Diff-Quick-스테이닝된 세포원심분리 제조물에 의해 측정하여 99% 보다 더 순수한 것으로 입증되었다.
사람 호산구를 실온에서 퍼콜 밀도 기울기 원심분리(δ=1.088)에 의해 헤파린화된 정맥 혈액으로부터 단리시킨다 : [참조 : Coligan et al., Eds., 1992, Current Protocols in Immunology, (John Wiley & Sons: New York, NY)]. RBS를 저장성 용해에 의해 제거한다.
PBMC를 또한 상기 기술된 바와 같이 단리시킨다 : [참조 : Coligan et al., Eds., 1992, Current Protocols in Immunology, (John Wiley & Sons: New York, NY)]. 단핵 세포를 자성 비이드를 사용하여 CD14 포지티브 선발에 의해 정제하고, T 세포를 나일론 울 상에서의 림프구의 통과에 의해 정제한다. CD3 아세포를 발생시키기 위해, RPMI-1640 및 10% FCS 중의 2×106PBMC/㎖를 먼저 항-CD3 항체 TR77로 피복시킨 조직 배양판에 부가한다. 4 내지 6일 후, 아세포를 분리해내어 새로운 매질에 넣고, 50 단위/㎖에서 IL-2 (Genzyme)로 보충한다.
노던 블롯 : CKR-3을 호산구 중에서 선택적으로 발현시킴
에오택신이 호산구에 대한 선택성 화학 유인제이지만, CKR-3 수용체는 또한 단핵 세포 및 T 세포를 유인하는 것으로 공지된 RANTES 및 NCP-3을 결합시킨다. 수용체의 메시지 발현을 여러 백혈구 군에서 시험한다.
초기 노던 혼성 (실시예 2 참조)의 결과는 비장, 말초 혈액 백혈구 및 흉선, 및 호산구 및 T 세포와 같은 많은 밸혈구 아군, 및 HL-60 세포주에서 약 1.6 kb 메시지의 발현을 나타낸다. 메시지 수준은 호산구 경로 아래로의 부티르산 유도시에 HL-60 세포주에서 급격히 증가한다.
상기 메시지는 또한, 서던 블롯상에서 교차 혼성되는 MIP1α/RANTES가 약하고 약 3.0 kb인 것으로 보고되어 있기 때문에 Eos L2의 메시지와 유사하다. 원래의 201 bp PCR 단편이 서던 블롯에서 프로브로서 사용되는 경우에, 강한 혼성 1.8 kb HindIII 단편이 나타난다. 이것은 클로닝되고 본원에 기술된 단편이다. 상기 단편 이외에, 약 10 kb에서 매우 약한 혼성 단편이 관찰된다. 상기 10 kb 단편은 MIP1α/RANTES 수용체의 보고된 HindIII 단편 크기에 상응한다. 상기 MIP1α/RANTES 수용체는 노던 블롯 상에서는 관찰되지 않는 약 3 kb의 메시지를 생성시킨다. 따라서, 노던 블롯 상에 나타나는 약 1.6 kb 메시지는 Eos L2 유전자로부터 유도될 것이다. Eos L2의 가장 풍부한 발현은 과호산구성 증후군에 걸린 환자로부터 정제된 호산구의 제조물에서 관찰된다. (실시예 8 참조).
다른 CC 케모킨 수용체에 대한 CKR-3의 높은 서열 유사성, 및 온길이 클론이 서던 블롯에서 다중 서열에 혼성된다는 점 때문에, 부가적인 노던 분석은 서던 블롯 중의 다른 서열과 교차 혼성되지 않는 게놈 클론의 3'-비번역된 영역으로부터 250 bp 단편을 사용한다. 혼성화를 위해, 누클레오티드 1203-1453을 포함하는, CKR-3에 대해 특이적인 3'-비번역된 영역 프로브가 사용된다. (도 1C 참조).
단핵 세포, 호중구, 림프구, T 세포, CD3 MAb에 의한 활성화에 의해 생성되는 T 아세포, 및 호산구를 포함하는 서로 다른 백혈구 군으로부터 RNA를 사용하여 노던 블롯 패널을 제조한다. RNA를 제조업자가 추천한 방법에 따라, 상표명 TriZOL 시약 (Gibco/BRL)을 사용하여 단리시킨다. 각각의 고정제 백혈구 군으로부터 단리된 15㎕의 전체 DNA를 1.2% 포름알데히드 아가로오스 겔 상에서 분리시키고, 상표명 Nytran-Plus 나일론 막 (쉴라이허 및 슈엘)으로 운반하고, 등록 상표 Stratalinker를 사용하여 교차결합시킨다. 방사성표지와 3'-비번역된 영역 프로브와의 혼성은 제조업자가 추천한 방법을 사용하여 상표명 ExpressHyb 용액 (클론테크)에 의해 수행된다. 노던 블롯을 스크린을 강화시키면서 3 내지 5일 동안 X-OMAT AR 필름에 노출시킨다. CKR-3 특이적 프로브는 0.5% SDS 중에서의 비등에 의해 제거되며, 블롯은 β-액틴에 의해 재-프로브화되어, 충전의 변동을 조절한다.
검출할 수 있는 신호를 제공하는 유일한 세포군은 1.8 kb 크기의 메시지가 발견된 호산구이다. 이러한 결과는 도 13A 내지 13D에서 면역학적으로 검출되는 표면 발현의 패턴과 일치한다. 메시지가 상기 실험에서 나머지 또는 활성화된 T 세포에서 검출되지 않더라도, T 세포의 일부가 수용체를 발현시킬 수 있는 것이 가능하다.
호산구성 케모킨 수용체와 반응성인 단클론성 항체(MAbs)
Eos L2 수용체와 반응성인 MAb를 N-말단 35 아미노산에 상응하는 합성 펩티드로 마우스를 면역시킴으로써 발생시킨다. 누클레오티드 서열 (도 1A 내지 1C 참조 ; 또한, SEQ ID NO:2)로부터 유도된 Eos L2의 N-말단 35 아미노산을 합성하고, 담체 단백질 PPD (미코박테이움 투버쿨로시스의 정제된 단백질 유도체 ; 영국 캠브릿지에 소재하는 세버언 바이오텍 리미티드의 제품)에 커플링시킨다.
Balb/C 마우스 암컷을 PBS 중의 50㎍의 상기 펩티드-담체 콘쥬게이트로 2주 간격으로 4회 면역시킨다. 마우스에 프로인트 완전 애쥬번트 (첫번째 주사) 및 불완전 애쥬번트 (후속 주사)를 사용하여, 펩티드 콘쥬게이트를 복강내 주입시킨다. 애쥬번트 없이 정맥내 주입시켜서 최종 면역화시킨다. 다클론성 항혈청을 또한 합성 펩티드로 면역시킨 마우스로부터 수집한다.
2회의 연속 융합을 수행하여 15,000개 이상의 하이브리도마를 발생시킨다. 최종 주입 4일 후, 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액을 혈청-비함유 DMEM 매질 중에서 제조한다. 이들 세포를 지. 갈프레 (Galfre, G) 등의 문헌 [Galfre, G. et al., Nature, 266:550-552 (1977)]에 따라 하이브리도마 융합 파트너 SP2/0과 융합시킨다. 20㎖의 비장 세포 및 20㎖의 SP2/0를 조합시키고, 800g에서 5분 동안 방사시키고, 매질을 제거한다. 37℃로 예열시킨 50% 폴리에틸렌 글리콜 1500의 용액 (인디아나, 인디아나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임의 제품)을 2분 이상 세포 펠릿에 첨가한 후, 3분 이상 10㎖의 DMEM 매질을 첨가한다. 세포 현탁액을 400g에서 3분 동안 방사시키고, 상등액을 제거한다. 펠릿을 20% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민, 100 단위/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트 및 HAT 선별 매질 (인디아나, 인디아나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임의 제품)을 함유하는 DMEM 매질 중에서 서서히 재현탁시킨다. 세포를 200㎕/웰에서 96-웰 플랫 바닥 마이크로티터 플레이트 내로 플레이팅시킨다.
10 내지 14일 후, 웰로부터의 상등액을 ELISA 검정에서 효소-표지된 항-마우스 항체 (양고추냉이 퍼옥시다아제-표지된 항-마우스 IgG (잭슨))를 사용하여 펩티드에 대한 반응성에 대해 스크리닝한다. 관심있는 하이브리도마를 희석을 제한하면서 서브클로닝시킨다.
항체가 천연 표면 발현 분자를 인식할 수 있는 지를 측정하기 위해, MAb를 사람 Eos L2 게놈 DNA를 운반하는 AcMNPV 바이러스로 감염시킨 SF9 삽입 세포에 대해 스크리닝한다. 이들 삽입 세포는 세포의 약 10%의 강한 항-FLAG 스테이닝에 이해 판단되는 바와 같이 세포 표면 상에 Eos L2 (CKR-3) 수용체를 발현시킨다. 스테이닝은 M2 항-FLAG 항체를 사용한 후에 항-마우스 Ig-FITC (잭슨 이뮤노리서치 래버러토리이즈, 인코포레이티드의 제품)을 사용하여 수행하고, 정량적 발현에 대한 FACScan 분석을 사용하여 형광 활성화 세포 분류에 의해 분석한다 : [참조 : Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Colagen, J. et al., Eds., (John Wiley & Sons, Inc.; New York, NY)].
약 33%의 항-펩티드 하이브리도마는 제 2의 항체로서 항-마우스 Ig-FITC(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)를 사용한 FACS 분석에 의하면 FLAG 항체의 오염 패턴과 유사한 오염 패턴으로 Eos L2 트랜스펙팅된 곤충 세포와 반응한다. 항-FLAG로 오염된 비트랜스펙팅된 곤충세포는 완전히 음성반응을 보였다. 항-펩티드 항체도 비트랜스펙팅된 세포에 대하여 시험하였으며, 그 결과도 오염에 있어서 음성반응을 보였다.
트랜스펙팅된 곤충세포를 오염시키는 것으로 밝혀진 MAbs를 FACS 분석을 이용하여 사람 호산구, 말초혈액 림프구, 단구, 호중구, 및 활성화된 T 세포(활성화된 T 세포; 림프구를 활성화된 T 세포에 대한 항-CD3 항체로 처리한다)로 이들의 활성에 대하여 시험하였다. 세포를 mAb LS26-5H12로 오염시키고, 이어서, FITC-항-마우스 Ig(Jackson ImmunoReseaech Laboratories, Inc.)로 오염시켰다. Fc 수용체 결합을 과량의 정상 사람 혈청을 사용하여 조절하였다.
모든 호산구를 선택된 항-Eos L2 mAb, LS26-5H12로 오염시켰다(도 12A). 단구는 면역형광분석에서 약간의 양성반응을 보였다. 적은 비율의 림프구가 오염에 양성반응을 보이며(도 12B), 실질적으로 모든 활성화된 T 세포가 항체 LS26-5H12로 오염(도시되지 않음)되고 있으므로, T세포는 T 세포 활성화시에 불규칙화되는 수용체를 발현하고 있음을 제시하고 있는 것이다. 호중구는 검정 조건하에서 LS26-5H12 항체로 거의 오염되지 않는다. Eos L2 수용체의 예측되는 분포 및 RANTES 결합에서의 작용을 근거로 하면, MAb LS26-5H12는 이러한 수용체의 자연적으로 발현된 형태를 인식하는 것으로 보인다. LS26-5H12 MAb에 추가하여, 약 5가지의 MAb가 유사하게 활동한다.
LS26-5H12 하이브리도마를 제한 희석법으로 추가로 정제하였다. 또 다른 실험에서, 고도로 정제된 백혈구 서브셋(실시예 5에 기재된 바와 같이 정제됨)을 MAb LS26-5H12로 오염시켜 유출 세포계수법(도 13A 내지 13D)로 분석하였다. 오염 원안은 4회 이상의 실험으로 나타낸다. T 세포를 CD3오염을 근거로 확인하였다. 단구 및 호중구를 전방 및 측방 산포범위로 확인하였다.
고도로 정제된 호산구가 LS26-5H12(도 13A)로 강하게 오염된 것은 호산구 표면상의 광범위한 수용체의 발현, 및 리간드 결합 및 스캐챠드 분석(Scatchard analysis)으로 측정된 높은 수용체 수와 일관됨을 제시한다. 호중구, T 혈구, 및 단구는 이러한 MAb 로 오염되지 않거나 거의 오염되지 않음을 보였다(도 13b 내지 13D). 재클론화된 하이브리도마로부터의 항체를 이용한 이러한 결과는 CKR-3이 호산구상에서 선택적으로 발현되고 시험된 그밖의 백혈구 형태에서는 인지할 수 있을 만큼 발현되지 않고 있음을 제시하고 있다. 그러나, T 세포의 서브셋은 수용체를 발현시킬 수 있다.
실시예 6
안정한 L1.2 세포 트랜스펙턴트의 선택
2% 내지 5%의 일시적으로 트랜스펙팅된 COS, HEK-293 및 CHO 세포는 FLAG-표지 수용체(상기 참조)에 대한 항체를 사용한 검정에서 표면 양성적이었으며, 실질적으로 세포내 단백질이 검출되어, 불충분한 단백질의 이동을 제시하고 있다. L1.2 마우스 예비-B 세포주를 사용하여, 보다 높은 수준의 표면발현(참조, 도 6)을 나타내는 세포주를 선별하여 리간드 결합 특이성 및 CKR-3에 의한 시그날 형질도입에 대하여 추가로 검정하였다. 이러한 세포주는 그밖의 화학친화 수용체의 연구에 성공적으로 사용되어 왔으며[문헌, Honda, S., et al., J. Immunol., 152: 4026-4035 (1994)], 트랜스펙팅된 사람 케모킨 수용체의 발현을 다양한 리간드에 대한 특이적인 화학주성 활성과 비교하였다(이하 참조).
CKR-3의 표면발현을 모니터링하기 위해서, 마우스를 CKR-3의 N-말단 35 아미노산에 상응하는 서열을 지닌 합성 펩티드로 면역화시킴으로써 단일클론성 항체(MAb)를 수용체의 N-말단 영역에 생성시켰다. 항-펩티드 MAb는 ELISA로 검출되며, 본래의 수용체를 인식하는 MAb를 사람 호중구와의 반응성 뿐만 아니라 일시적인 트랜스펙턴트의 오염으로 확인하였다.
CKR-3/pcDNA3의 구성
PCR을 사용하여 HindIII 제한부위 및 최적의 코작(Kozak) 서열 5'를 개시코돈에 삽입함으로써 1.8kb 게놈 단편에 함유된 CKR-3 유전자를 변경시켰다. 암호영역 및 3'-비전사된 영역의 448bp를 pcDNA3(Invitrogen)의 hindIII 부위에 삽입시켜, 벡터의 사람 CMV 즉시 초기 유전자 프로모터의 조절하에 유전자를 위치시켰다. 이러한 FLAG-표지된 Eos L2(CKR-3) 수용체 구성물(이하, CKR-3/pcDNA3이라 칭함)의 구성에 대한 상세한 설명은 실시예 3에 기재되어 있다.
트랜스펙션 및 안정한 세포주 선택
쥐의 예비-B 림프종 세포주 L1.2를 유진 뷰쳐 박사(Dr. Eugene Butcher: Stanford University)로부터 얻었고 10% 소의 혈청으로 보충된 RPMI-1640에 현탁시켰다. 20㎍의 선형화된 CKR-3/pcDNA3을 사용하여 하기된 바와 같이 세포주를 트랜스펙팅시켰다. L1.2 세포를 HBSS에서 2회 세척하고, 0.8㎖의 HBSS에 재현탁시켰다. 플라스미드 DNA를 세포와 혼합하고, 실온에서 10분동안 배양하여 0.4㎝ 전기영동 크벳(electroporation cuvette)에 옮겨, 250 V, 960㎌의 단일의 펄스를 가하였다. 전기영동을 한 후에 실온에서 10분동안 배양시켰다. G418을 0.8㎎/㎖ 48시간 후-트랜스펙팅의 최종 농축물에 가하고 세포를 25,000세포/웰로 96 웰 평판에 평판시켰다. 약물 선택하의 2 내지 3주 후에, G418 내성 세포를 5H12 항-수용체 mAb(이하 참조)로 오염시키고 FACScan(등록상표)으로 분석하였다.
검출될 수 있는 표면 오염을 나타내는 세포주를 제한희석법으로 수회 클론화시켰다. 가장 밝은 표면 오염을 나타내는 클론을 노던(Northern) 교잡으로 분석하여 트랜스펙팅된 수용체의 존재을 확인하였을 뿐만 아니라, 5' 프라이머로서 pcDNA3에 상보적인 T7 프라이머 및 3' 프라이머로서 CKR-3 특이성 프라이머를 이용한 RT-PCR로 확인하였다. 역전사효소를 가하지 않으면 증식이 관찰되지 않는다.
일시적인 트랜스펙팅을 위해서, 20㎍의 초나선형화된 DNA를 정확히 안정한 세포주 생산에 대해 기재된 바와 같이 전기영동에 사용하였다. 세포 표면오염을 48 내지 72시간 후에 검정하였다.
CKR-3/pcDNA3으로 트랜스펙팅된 L1.2 세포를 조직배양 매질중에 1 × 106세포/㎖로 희석시켰다. n-부티르산(나트륨염, Sigma Chemical Corp., Cat. No. B5887)을 최종농도 5mM(조직배양 매질중의 1M 원액으로 희석)이 되게 가하였다. 세포를 사용하기 전에 37℃, 5% CO2에서 밤새(18 내지 24시간) 성장시켰다. 낮은 농도가 성공적으로 사용된다(예, 2.5mM 및 1mM n-부티르산). n-부티르산 처리는 비유도된 대조군에 비해 10-배까지의 단백질 수준을 유도하는 것으로 보고되어 있다[참조문헌, Palermo, D.P., et al., J. Biotech., 19: 35 - 48(1991) 및 인용된 참조문헌]. 사람 CMV의 아주 초기의 유전자 프로모터에 의해 유도된 CKR-3 mRNA 수준을 n-부티르산염 처리로 평가하였다.
단일클론성 항체 생산 및 흐름 세포계수
합성의 펩티드에 반응성인 MAb를 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 생성시켰다. MAb를 다음과 같이 ELISA로 스크리닝하였다. 탄산염 완충액중의 2㎍/㎖의 농도의 펩티드 50㎕를 사용하여 4℃에서 4시간동안 NUNC 96-웰 맥시소프 판을 도포하였다. 300㎕/웰의 블로킹 완충액(PBS + 1% BSA)를 2시간 이상동안 가하였다. 평판을 PBS/Tween 20으로 4회 세척하고, 50㎕의 MAb 상등물을 각각의 웰에 가하여 37℃에서 1 시간동안 배양하였다. 평판을 PBS/Tween 20으로 4회 세척하고, PBS로 1:500으로 희석된 알카리성 프로테아제-컨쥬게이트 제 2 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA)를 각각의 웰에 가하였다. 37℃에서 30분동안 배양한 후에, 평판을 PBS/Tween 20으로 4회 세척하였다. 착색반응 동안 사용된 기질은 디에탄올아민 완충액(Bio-Rad)중에 용해된 p-니트로페닐포스페이트이다. 평판을 ELISA 해독기상의 410nm에서 해독하였다.
항-펩티드 MAb가 본래의 표면 발현된 CKR-3을 인식할 수 있를 지를 측정하기 위해서, 항-펩티드 MAb를 일시적으로 트랜스펙팅된 세포 및 호산구에 대하여 스크리닝하였다. MAb 오염을 위해서, 세포를 일단 PBS로 세척하고, 2% FCS, 0.1% 아지드화나트륨(FACS 완충액), 5㎍/㎖의 정제된 항체, 5㎍/㎖의 MOPC-21 IgG1동기준 표본 매치된 대조 MAb(Sigma) 또는 100㎕의 하이브리도마 배양 상등물을 함유하는 100㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 후에, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 100㎕의 FITC-컨쥬게이트된 친화성 정제 F(ab')2염소 항-마우스 IgG(Jackson)에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분동안 배양한 후에, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 FACScan(등록상표)으로 분석하여 표면발현의 수준을 측정하였다. 프로피디움 요오디드를 사용하여 치사(致死) 세포를 배제시켰다.
L1.2 세포주의 안정한 트랜스펙턴트에 대한 수용체의 표면발현
도 10A는 항-수용체 MAb, LS26-5H12를 사용하여 검출할 수 있는 L1.2 세포의 서브군에 대한 일시적으로 트랜스펙팅된 수용체의 표면 오염을 도시하는 도면이다. 비트랜스펙팅된 L1.2 세포는 음성반응적이다(도 10B). 안정한 세포주는 트랜스펙턴트의 제한 희석 클로닝 및 상기된 바와 같은 표면 오염에 대한 선택성에 의해 구성된다. 이러한 과정은 보다 높은 수준의 수용체 발현을 나타내는 세포주를 생성시킨다(도 10C). 노던 블롯 분석으로 E5로 설명되는 서브클론중 한 서브클론에서 트랜스펙팅된 CKR-3 mRNA의 존재 및 비트랜스펙팅된 L1.2 세포에서의 부재를 확인하였다(도시되지 않음).
실시예 7
안정한 L1.2 트랜스펙턴트의 리간드 결합특이성
케모킨
문헌[Clark-Lewis, I., et al., Biochemistry, 30: 3128-3135(1991)]에 기재된 바와 같은 완전한 자동 펩티드 합성기(model 430A; Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)에 최적화되고 적합하게 되어 있는 고형상 방법을 사용하여 제조된 사람 에오택신을 제외한, 재조합 사람 케모킨를 페프로테크, 인코포레이티드(Peprotech, Inc.: 미국 뉴져지 로키 힐 소재)로부터 얻었다. 사람 에오택신도 페프로테크로부터 얻을 수 있다.
125I-표지화
125I-표지된 에오택신을 문헌[Coligan, J.E., et al., Eds., 1992, Current protocols in Immunology(New York: John Wiley and Sons)]에 기재된 볼턴 헌터 시약(Bolton Hunter reagent: NEN)을 사용하여 생성시켰다. 방사성 표지된 에오택신의 특이적 활성이 180 Ci/mM으로 계산되었다.
리간드 결합
표적 세포에 대한 케모킨 결합을 본발명 이전에 보고된 방법[문헌, Van Riper, G., et al., J. Exp. Med. 177: 851-856(1993)]의 변형된 방법을 이용하여 수행하였다. 세포를 PBS로 일회 세척하고 결합 완충액(50mM HEPES, pH7.5, 1mM CaCl2, 5mM MgCl2, 0.5% BSA 및 0.05% 아지드)에 1 × 107/㎖의 농도로 현탁시켰다. 50㎕(5 × 105세포)의 분취액을 마이트로퓨즈관내로 확산시킨 후에, 저온 경합물질 및 방사성표지된 케모킨을 가하였다. 최종 반응용적은 200㎕였다. 비-특이적 결합을 250 내지 500nM의 비표지된 케모킨의 존재하에 방사성표지된 케모킨과 함께 세포를 배양함으로써 측정하였다. 실온에서 60분 동안 배양한 후에, 세포를 0.5 M NaCl을 함유하는 1㎖의 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 세포 펠릿을 계수하였다.
경합반응은 방정식 100(S-B)/(T-B)로 계산된 특이적 결합의 백분율이며, 여기서, S는 샘플의 방사성 활성을 나타내며, B는 바탕 결합을 나타내며, T는 경합물질이 없는 상태에서의 전체 결합을 나타낸다. 바탕 결합은 세포를 방사성표지된 케모킨 및 400배 이상의 비표지된 케모킨과 함께 배양함으로써 얻었다. E5에 대한 에오택신의 전체 결합은 11611 ± 119 cpm과 바탕 결합 2248 ± 745 cpm이었다. 호산구에 대한 에오택신의 전체 결합은 7866 ± 353 cpm과 바탕 결합 1148 ± 518 cpm이었다. 실험 전체를 반복하였고 표준편차는 항상 평균의 10% 이하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복하였다. 곡선은 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 소프트웨어로 계산하였다.
실시예 6에서 계산된 E5 세포주를 방사성 에오택신을 결합시키는 활성에 대하여 시험하였다. 세포를 0.6nM125I-표지된 에오택신 및 다양한 농도의 저온 경합물질과 함께 배양하였다. 도 11A는 트랜스펙팅된 세포가125I-표지된 에오택신을 특이적으로 및 고친화도로 결합시키고 있음을 나타낸다. 결합 데이터의 스캐챠드 분석은 정제된 사람 호산구를 사용하여 얻은 0.5nM(도 11D)의 값과 유사한 값으로 1.5nM(도 11C)의 해리상수(Kd)를 나타냈다. 또한, RANTES 및 MCP-3 모두가 결합에 대해 특이적으로 경합할 수 있었다. MIP-1α, MIP-1β, 또는 IL-8을 포함하여 시험된 그밖의 케모킨 어느 것도 방사선 표지된 리간드에 대하여 특이적으로 경합할 수 있는 것이 없었다(도 12).
화학주성 검정
사람 호산구와의 화학주성을 경피 검정법[문헌, Carr, M.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3652-3656(1994)]을 변형시켜 검정하였다. 이러한 검정에 사용된 경피 세포는 유러피언 컬렉션 오브 에니멀 셀 컬쳐스(European Collection of Animal Cell Cultures, 영국의 포톤 다운에 소재)로부터 얻었다. 내피세포를 6.5㎜ 직경의 바이오코트(등록상표) 3.0μM 세공크기의 트랜스웰 조직배양 삽입물(미국 매사츄세츠 캠브리지 소재의 Costar Corp)상에서 배양하였다. ECV 304 세포에 대한 배양배지는 M199 + 10% 송아지 태아 혈청, L-글루타민 및 항생물질로 구성된다.
동일한 중량부의 RPMI 1640 및 M199와 0.5%BSA로 구성된다. 검정 24시간 전에, 2 × 105ECV 304 세포를 24-웰 화학주성 평판의 각각의 삽입물에 평판시키고, 37℃에서 배양하였다. 화학주성 인자(검정배지에서 희석됨)를 24-웰 조직 배양 평판에 최종 용적 600㎕가 되게 가하였다. 내피-피복된 조직배양 삽입물을 각각의 웰에 삽입시키고 106세포를 상부 챔버에 최종용적 100㎕로 가하였다. 평판을 5% CO2/95% 공기중의 37℃에서 4시간 동안 배양하였다.
하부 챔버로 이동한 세포를 흐름 세포계수법으로 계수하였다. 하부 챔버로부터 얻은 500㎕의 세포 현탁액을 튜브에 넣고, 비교 세포 총수는 30초 동안 포착되는 수를 계수함으로써 얻는다. 이러한 계수 방법은 재현가능한 것으로 밝혀졌으며, 백혈구에 대한 게이팅(gating) 및 단편(debris) 또는 그밖의 세포의 배제를 가능하게 한다. 이러한 방법으로 얻은 총수는 현미경으로 계수한 총수와 밀접하게 조화된다.
내피세포를 바이오코트(등록상표) 트랜스웰(Transwell) 조직배양 삽입물로 피복시키는데 사용하지 않음을 제외하고는 동일한 검정법을 이용하여 L1.2 세포 또는 L1.2 수용체 트랜스펙팅된 세포주의 화학주성을 검정하였다.
에오택신, RANTES 및 MCP-3에 화학주성을 주는 L1.2 세포에서의 CKR-3 발현
L1.2 수용체 트랜스펙턴트를 다양한 농도 범위에 대해 케모킨 패널에 대한 반으로 이동하는 능력을 시험하였다. CKR-3 세포주 E5는 특이적 이동이 10ng/㎖까지 검출될 수 있지만 에오택신, RANTES, 및 MCP-3에 대한 화학주성 반응을 나타냈으며, 에오택신에 대한 피크 반응은 100ng/㎖에서 나타냈다(도 13A). RANTES에 대한 반응은 10ng/㎖ 및 100ng/㎖에서 입증되었지만, 반응의 크기는 에오택신 만큼 크지 않다. MCP-3은 호중구상에서 보다 E5 세포주 상에서 덜 효능적인 화학친화제인 것으로 나타났으며, 100ng/㎖이하에서는 이동이 검출되지 않았다. 이러한 세포주와 함께 시헙된 그밖의 케모킨에 대한 현저한 반응은 나타나지 않았다. 다른 대조시험에서, 세포는 케모킨이 상부 웰에 단독으로 가해졌을 경우에 하부 챔버로 이동하지 않음으로써, 세포이동은 화학이동이 아니라 화학주성임을 확인시켰다(도시되지 않음).
비트랜스펙팅된 L1.2 세포주는 시험된 어떠한 케모킨에 대한 반응으로 이동하지 않는다(도 13B). 사실, L1.2 세포주의 두드러진 특징은 비-특이성 리간드에 대해 아주 낮은 바탕 화학주성이었다. 특이성 대조군으로서, IL-8 RB로 트랜스펙팅된 L1.2 세포주는 IL-8 및 GROα(도 13C), 뿐만 아니라, NAP-2 및 ENA-78(도시되지 않음)에 대한 반응으로 특이적으로 이동하지만, 다른 CXC 또는 CC 케모킨에 대해서는 이동하지 않는다. 트랜스펙팅에 의해 L1.2 세포에 도입되는 그밖의 케모킨 수용체가 또한 CKR-2 트랜스펙턴트(MCP-1 및 MCP-3에 반응), CKR-1 트랜스펙턴트 (MIP-1α에 반응) 및 IL-8 RA 트랜스펙턴트(IL-8에 반응)를 포함한 그들의 특이적 리간드에 화학주성을 부여한다(도시되지 않음). 호중구 및 CKR-3 트랜스펙턴트의 화학주성 반응을 제거시킨 백일해 독소는 수용체가 정상 및 형질감염된 세포에서의 Gα 서브클래스[문헌, Simon, M.I., et al., Science, 252: 802-808(1991)]를 통해 시그날화 한다는 것을 나타낸다(도시되지 않음).
CKR-3 트랜스펙턴트의 화학주성과 유사한 호산구의 화학주성 프로필
정상의 호산구의 기능이 CKR-3 L1.2 트랜스펙턴트의 기능과 유사한지를 검정하기 위해서, 높은 호산구 수준(약 6 내지 8%의 WBC)을 지닌 다수의 정상 개체(사람)로부터의 호산구(실시예 5에 기재된 바와 같이 정제)를 사용하여 화학주성 실험을 수행하였다. 도 14A 및 14B는 두가지의 상이한 개체에서 관찰된 호산구 화학주성의 두가지의 특성 패턴을 나타낸다. 한 패턴은 에오택신에 대한 강한 이동 및 RANTES 및 MCP-3에 대한 낮은 반응에 의해 특정화되었다(도 14A). 다른 패턴은 에오택신, RANTES 및 MCP-3에 대한 반응으로 근본적으로 동일한 화학주성을 나타냈다(도 14B). 이러한 패턴은 각각의 개체내에서 장시간동안 고도로 재현될 수 있으므로 검정에서의 변수에 기인하는 것이 아니다. MIP-1α는 개체의 제 2의 부류에서 호산구에 단지 약한 화학주성 활성을 나타냈다.
실시예 8
cDNA 암호화 Eos L2의 클로닝
호산구 cDNA 라이브러리의 구성
호산구를 고유의 과-호산구 증후군으로 진단된 환자(M.V.)로부터 얻었다[문헌, Costa, J.J. et al., J. Clin. Invest., 91: 2673(1993)]. 표준 구아니디늄 이소티오시아네이트/세슘 클로라이드 방법[문헌, In: Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 1, Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY) page 4.2.2-4.2.3 (1991)]을 이용하여 RNA를 분리하였다. mRNA를 다이나비드스(Dynabeads: 등록상표; Dynal, Inc.)를 이용하여 얻었으며, 박테리아파아지 라이브러리를 슈퍼스크립트TM람브다 시스템(SUPERSCRIPTTMLambda System)을 사용하여 구성시켜 cDNA 및 λgt22A, NotI-SalI와 함께오는 λ 클로닝(Gibco BRL, Life Technologies) 및 cDNA를 합성하였다.
라이브러리 스크리닝
본 발명자들은 이중으로 생성된 사람의 호산구 cDNA 라이브러리의 약 750,000 박테리아파아지 플라크를 스크리닝하였다. 사용된 프로브는 MIP-1α/RANTES 수용체를 암호화하는 온길이의 방사성표지된 cDNA 프로브였다[문헌, Gao et al., J. Exp. Med., 177: 1421 (1993)]. p4 cDNA를 pcDNAI(Invitrogen)의 BamHI (5') 및 XhoI(3') 부위내로 클로닝하였다. 이러한 코돈의 BamHI-XhoI 단편은 분해를 제한시킴으로써 얻었으며, 유전자 클린(Clean)(Bio101)을 이용하여 분리하였다. 단편은 랜덤 프라이머 표지화 키트(Boehringer Mannheim Biochemicals)를 이용하여32P로 표지하였다.
필터는 50% 포름아미드, 5 × SSC, 1X 덴하트스(Denhardt's), 10% 덱스트란 술페이트(Dextran Sulfate), 20 mM TRIS, pH 7.5, 0.1% SDS(나트륨 도데실 술페이트)의 용액중의 42℃에서 2시간동안 배양시킴으로써 예비 잡종화시켰다. 잡종화는 상기와 동일한 용액중의 42℃에서 밤새 수행하였다. 이어서, 호산구 cDNA 라이브러리 필터를 실온에서 2X SSC/0.1% SDS로 2회 세척하고, 42℃에서 2X SSC/0.1% SDS로 2회 세척하였다. 각각의 세척은 30분동안 수행한다. 필터를 밤새 노출시켜 양성 플라크를 이중으로 채취하였다. 클론을 가볍게 세척한 후에 이중으로 양성을 보이는 때를 평가하였다.
cDNA 클론의 특정화
플라크를 정제하고, DNA를 소량의 파아지 용해 원안(In: Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 1, Suppl. 10, Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY), page 1.13.7(1991)]. 박테리아파아지 DNA를 EcoRI(벡터의 암에서의 부위) 및 NotI로 분해시켰다. 분해에 의해 방출되는 삽입물을 겔상에 가시화시켰으며, 길이가 약 1.6kb인 것으로 밝혀졌다. 약1.6kb 삽입물은 Mip-16 또는 M-16으로 나타내는 플라크에 존재하였고, 유전자 클린(Bio101)을 이용하여 분리하였으며, 블루우스크립트(Bluescript: 등록상표) 벡터 KS(Stratagene)의 EcoRI 및 NotI 부위내로 클로닝시켜 비대칭 말단을 생성하도록 EcoRI 및 NotI로 분해시켰다. 결찰된 플라스미드를 문헌[Hanahan, D., (1985), In: DNA Cloning, Volume 1, D.M. Glover, Ed. (IRL Press: Washington, D.C.), pp. 109-135]에 기재된 바와 같이 적합하게 XL1-Blue 대장균 세포(stratagene)내로 도입시켰다.
M-16/블루우스크립트 구성물의 디데옥시 서열화는 USB(미국 오하이오 클리브랜드 소재의 United states Biochemical)으로부터 얻은 디데옥시뉴클레오티드 서열화 키트를 사용하여 수행하였다. 이러한 클론의 뉴클레오티드 서열화를 측정하여 MIP-1α/RANTES 수용체와 아주 정밀한 상동성을 지닌 신규한 단백질을 암호화하였다. 그러나 서열 데이타에 의하면, 클론은 온길이가 아닌 것으로 나타났다.
전체의 클론을 확인하기 위해서, 15-20의 추가 플라크를 분리하여 정제하고, 플라크중에 존재하는 삽입물을 제한 효소분석 및/또는 서열화로 특정화시켰다. M31로 나타내며 분리된 또다른 λ 클론은 약 1.8kb 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 삽입물을 상기된 바와 같은 블루우스크립트 벡터 KS(Stratagene)의 EcoRI 및 NotI 부위내로 클로닝시켰다. 이러한 클론(블루우스크립트중의 M31 삽입물, M31/블루우스크립트 구성물이라 일컬어짐)의 DNA 서열화는 상기된 바와 같이 수행하였으며, 그 결과 온길이의 수용체를 암호화하는 것으로 밝혀졌다.
M31 삽입물은 M31/믈루우스크립트 구성물을 EcoRI 및 NotI로 분해시킴으로써 얻어진다. 생성되는 단편을 유전자 클린(Bio101)을 이용하여 분리하였으며, 벡터 AprM9의 EcoRI 및 NotI 부위내로 삽입시켜, 비대칭 말단을 생성하도록 EcoRI 및 NotI로 분해시켰다. 벡터 AprM9[문헌, de Fougerolles, A.R. et al., J. Exp. Med., 177: 1187-1192(1993)]는 p블루우스크립트로부터의 β-락탐 및 pSP64로부터의 폴리링커를 함유하는 CDM8(Invitrogen)의 유도체이다. A31로 나타낸 생성되는 구성물을 적합한 XL1-블루우 세포내로 도입시켰다.
온길이의 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 암호화된 단백질의 예측되는 아미노산 서열을 도 2A 및 도 2B(참조, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4)에 도시한다. 도 2A 및 도 2B에 도시된 cDNA 서열을 클론 A31(염기 15 - 365(도 2A 및 도 2B에서와 같이 번호부여)), M-16/블루우스크립트 구성물(염기 366-1152(도 2A 및 도 2B에서와 같이 번호부여))으로부터 측정하였다. 신규한 수용체의 아미노산 서열을 그밖의 단백질과 비교한 결과 신규한 수용체와 MIP-1α/RANTES 수용체는 62%의 서열 상동성을 공유하며, 신규한 수용체와 MCP-1수용체는 50.57%의 서열 상동성을 공유하는 것으로 밝혀졌다. 서열의 상동성은 위스콘신 UW GCG 패키지(Wisconsin UW GCG package; program gap)을 사용하여 니들맨 및 운쉬 알고리즘[문헌, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453(1970)]으로 측정하였다.
노던 분석
노던 분성용의 RNA를 고-호산구증을 앓고 있는 환자로부터 얻었다. 호산구는 문헌[Costa, J.J., et al., J. Clin. Invest., 91: 2673(1993)]에 기재된 바와 같이 분리하였다. 전체 호산구 RNA를 표준방법으로 분리하였다[문헌, In: Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 1, Ausubel, F. M. et al., Eds., (john Wiley & Sons: New York, NY) page 4.2.2-4.2.3(1991)]. 전체 RNA를 1% 아가로스 겔상에 분배시키고, 이어서, 유전자 스크린 필터(New England Nuclear)상으로 블롯팅하였다. 필터는 제조자의 원안에 따라 아주 정확하게 프로브화시켜 유전자 스크린 블롯(New England Nuclear)으로 아주 정확하게 세척하였다.
수가지의 노던 분석용을 제조하였다. 하나는 M16/블루우스크립트 구성물의 EcoRI-NotI 단편으로 프로브화되고, 다른 것들은 클론 A31로부터의 EcoRI-NotI 단편으로 프로브화되었다. EcoRI-NotI 단편은 3' 비전사된 영역을 포함한다. 프로브는 랜덤 프라이머 표지화 키트(Beohringer Manheim Biochemicals)를 사용하여32P로 표지하였다.
노던 블롯은 각각 전체 사람 호산구 RNA에서 약 1.8kb의 강한 단일의 시그날을 나타냈다. 이러한 결과는 A31 RNA가 이러한 환자의 호산구에서 높은 수준으로 발현되고 있음을 나타낸다.
실시예 9
cDNA 암호화 Eos L2 수용체의 발현 및 리간드 결합의 연구
구성물
벡터 A31(상기됨) 및 A31-pcDNA3을 발현 및 결합의 분석에 사용하였다. A31-pcDNA3을 구성시키기 위해서, 벡터 A31을 EcoRI 및 NotI로 분해시켜, 약 1.8kb 삽입물을 유전자 클린(Bio101)을 이용하여 분해시키고, 벡터 pcDNA-3 (Invitrogen)의 EcoRI 및 NotI 부위내로 삽입시켜, EcoRI 및 NotI로 분해시켰다.
일시적인 트랜스펙션
신장 세포주 293중의 A31을 사용하여 일시적으로 트랜스펙팅시키는 것은 A31을 방사성 RANTES와 고친화도로 초기 결합시키는 것으로 제시된다. 이러한 초기 결합 연구는 재생과는 상이한 연구이다. 따라서, 안정한 세포주를 RBL(래트 호산구 백혈병) 및 293 세포내로 안전하게 도입된 A31/pcDNA3으로 생성시켰다. RBL 세포(수탁번호 ATCC CRL 1378호)를 미국 20852 메릴랜드 록크빌 파크라운 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC)으로부터 얻었으며, 293 세포(수탁번호 ATCC CRL 1573호)를 아이. 챠로, 글라드스톤 카디오바스큘러 인스티튜트(I. Charo, Gladestone Cardiovascular Institute)로부터 얻었다.
안정한 세포주
안정한 세포주를 다음과 같이 구성시켰다. A31-pcDNA3을 NotI로 분해시켜 선형화시켰다. 선형화된 플라스미드를 전기영동으로 RBL 및 293 세포내로 도입시켰다. 100 × 20㎜ 평판에서 성장하는 융합물 293 및 RBL 세포를 트립신화시켜, 1cc의 인산염 완충된 염수(PBS)에 재현탁시키고, 960 마이크로패러드 및 250볼트로 고정된 0.4㎝ 크벳(BioRad)에 전기영동시켰다. 안정한 트랜스펙턴트를 게네티신을 함유하는 배지중에서 양성 선택으로 분리하였다. 특히, 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: 둘베코의 변형된 이글배지; BRL), 10% 송아지 태아혈청에서 수일 동안 배양시키고, 이어서, DMEM, 0.9㎎/ccdml 게네틴(BRL)을 함유한 10% 송아지 태아 혈청으로 교체하였다. 3일 후에, 살아있는 콜로니를 클로닝 실린더로 무균적으로 분리하고, 각각의 클론을 DMEM, 0.9㎎/ccdml 게네티신(BRL)을 함유한 10% 송아지 태아 혈청중의 각각의 웰에서 성장시켰다.
A31 RNA를 높은 수준으로 발현시키는 살아있는 클론을 노던 분석으로 검출하였다. RBL 주의 120의 안정한 트랜스펙턴트, 및 293 세포주의 38의 안정한 트랜스펙턴트를 스크리닝하였다. 특히, 각각의 클론으로부터의 RNA를 산 페놀 방법을 이용하여 분리하였다[문헌, Chomczynski, P. and N. Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156-159(1987)]. RNA를 전기영동으로 분배시켜, 유전자스크린(New England Nuclear)상으로 블롯팅하고, 노던 블롯을 제조자의 제안에 따라 프로브화하여 아주 정밀하게 세척하였다. 플라스미드 A31로부터의 EcoRI-NotI 삽입물를 분리하고, 랜덤 프라이머 표지화 키트(Beohringer Manheim Biochemicals)를 사용하여32P로 표지하여, 프로브로 사용하였다. RNA를 겔상에서 에티디움 브로미드 오염화로 정량하였다. 비트랜스펙팅된 293 또는 RBL 세포를 상응하는 트랜스펙턴트에 대한 음성 대조군으로 사용하였다.
A31-293-#8, A31-293-#9, A31-293-#17, 및 A31-293-#20으로 나타낸 안정한 세포주는 그밖의 세포주에 비해 아주 높은 수준으로 A31 RNA를 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 노던 분석에 의해 A31 메시지를 발현하는 클론 A31-293-#20을 더 연구하기 위해서 수거하였다.
RBL 세포주는 저-배지량의 RNA를 발현하는 것으로 밝혀졌지만, 사용된 조건에서는 RANTES를 결합시키지 않는 것으로 밝혀졌다(도시되지 않음).
리간드 결합
안정한 클론 A31-293-#20을 결합검정에 충분한 양으로 성장시켰다. 특히, 세포를 DMEM, 10% 송아지 태아 혈청, 0.9㎎/cc 게네티신중의 100㎜ 평판에서 성장시켰다. 평판을 컨플루언스 상태로 성장시키고, 막을 하기된 바와 같이 제조하였다. 배양 배지를 제거하고, 세포를 인산염 완충된 염수로 세척하였다. 세포를 TEM(40mM TRIS, pH 7.5, 1 mM EDTA, 및 150mM NaCl)로 세척하였다. 세포를 액체질소로 냉동시키고, 실온으로 해동시켜, 막의 분획을 원뿔형 튜브에서 18,000rpm으로 10분동안 원심분리하여 수거하였다. 각각의 결합점을 컨플루언스 상태로 성장한 단일 100mm 평판으로부터 수거되는 막의 반을 이용하여 측정하였다.
125I-표지된 RANTES를 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear)로부터 구매하였고, 저온 RANTES를 페프로테크(Peprotech: 미국 뉴저지 프린스톤 소재)로부터 구매하였다.125I-표지된 MCP-3은 뉴 잉글랜드 뉴클리어로부터 얻었으며, 저온 MCP-3은 벨기에 비-3000 류벤 소재의 유니버시티 오브 류벤의 레가 인스티튜트 포 메디칼 리서치의 제이. 반 다메(J. Van Damme)로부터 얻었다[문헌, Opdenakker, G. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 191(2): 535-542 (1993)]. 결합 검정은 하기 기재된 바와 같이 변형시키면서 문헌[Van Riper, G. et al., J. Exp. Med., 177:851(1993)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 특히, 0.125 나노몰의125I-RANTES의 막에 결합시키는 것은 다양한 농도의 비표지된 리간드의 존재하에 수행하였다. 결합 완충액은 50mM 헤페스(Hepes), 1mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0.5% BSA, pH 7.2 이다. 방사성표지되고 냉각된 리간드를 막(상기 참조)에 동시에 가하고, 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 결합 반응물을 2cc의 세척 완충액(0.5M NaCl, 50mM 헤페스, 1mM CaCl2, 5mM MgCl2, 0.5% BSA, pH 7.2)에 가하고, 와동 혼합하여, 폴리에틸렌이민 처리된 와트만 GFC 필터 상에 위치시켰다. 필터를 추가로 2cc의 세척 필터로 세척하였다. 세척후 필터상에 유지된 활성을 섬휘계수로 측정하였다. 필터를 5cc의 섬휘유체에 넣고, 미나악시-베타 리퀴드 신틸레이션 계수기(miniaxi-beta liquid scintillation counter: 미국 일리노이즈 도우너스 그로브 팩커드 소재의 United Technologies)에서 계수하였다. 2nM에서의 점은 2회 측정함을 제외하고는 모든 점을 3회 측정하였다.
검정의 결과는 RANTES가 A31 클론(도 15)에 의해 암호화된 수용체에 높은 친화도로 결합함을 나타낸다. 데이터의 스캐챠드 분석은 RANTES에 대해 정상 세포에서 예측되는 약 2.5 nM의 Kd를 나타냈다.
MCP-3이 클론 A31-293-#20으로부터의 막에 결합하는 것은 A31-293-#20 막에 결합하는 RANTES에 대한 전술된 리간드 결합을 이용하여 검정하였다(도 16). 결합 반응물은 0.125나노몰125I-표지된 MCP-3을 함유한다.
또한, 결합의 특이성을 표지된 MCP-3(저온 MCP-3의 부재하에 결합)가 저온 MCP-3에 의해 대체될 수 있는 범위를 측정함으로써 검정하였다(도 17). 모든 점을 2회 측정하였다.
비트랜스펙팅된 세포로부터의 막에 결합하는 MCP-3은125I-표지된 MCP-3에 의해 대체되지 않아서 비-특이성 결합을 나타냈다. 반면, A31-293-#20 세포로부터의 막에 결합하는 MCP-3은 뜨거운 MCP-3에 의해 대체되어 특이적 결합을 나타냈다.
이러한 검정의 결과는 A31 cDNA에 의해 암호화된 수용체가 사람 MCP-3을 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 10
1개의 우세한 수용체를 통해 다수의 CC 케모킨에 반응하는 사람 호산구
세포, 세포주 및 조직 배양물. 호산구를 포나트(Ponath) 박사 등의 문헌[J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996)]에 기재된 바와 같이 CD 16 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용하여 헤파린화된 혈액으로부터 단리시키면, 이것은 세포학적으로 99% 이상의 순도를 나타내었다. 호중구 및 PBMC를 포나트(Ponath) 박사 등의 문헌[J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996)]에 기재된 바와 같이 단리시켰다. CD3 블라스트를 생성시키기 위해, RPMI-1640 + 10% FCS 중의 2 x 106PBMC/㎖를 항-CD3 항체 TR66으로 1차 코팅된 조직 배양물 플레이트에 첨가시켰다. 4 내지 6일 후에, 블라스트를 신선한 배지에 옮기고, IL-2(스위스 바젤에 소재한 안토니오 란자벡키아(Antonio Lanzavecchia)에 의해 제공됨)를 50 단위/㎖로 보충하였다. 사용딘 그 밖의 세포주로는 CCR3(참조: Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)), IL-8 RA (참조: Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183 :2437-2448 (1996)), IL-8 RB (참조: Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183 :2437-2448 (1996)), CCR2b, CCR4 및 CCR5, 및 CCR1 (참조: Campbell, J.J., et al., J. Cell Biol., 134:255-266 (1996)) 중의 어느 하나를 고수준으로 발현시키는 L1.2 쥐과동물 pre B 세포 림프종의 트랜스펙턴트가 있다. 트랜스펙턴트를 10% 우혈청 및 800 ㎍/㎖ G418이 보충된 RPMI-1640에서 유지시켰다. 다양한 트랜스펙턴트를 CCR3(참조: Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183 :2437-2448 (1996)), IL-8 RA, IL-8 RB 또는 CCR2(참조: Qin, S., et al., Eur. J. Immunol. 26:640-647 (1996)); (참조: Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996))에 특이적인 mAb를 사용하여 관련 수용체의 발현에 대해 모니터하였다. CCR4 및 CCR58의 경우, 발현을 항-플래크 mAb M2를 사용하여 모니터하였는데, 이는 이들 수용체가 N-말단에서 이러한 에피토프로 구성되기 때문이다.
사람 호산구를 ECV304 세포의 서브컨플루언트 단일막을 함유하는 조직 배양 플라스크를 사용하여 5 내지 7일간 10% FCS 및 5ng/㎖의 재조합 사람 IL-5(Genzyme Corp., Cambridge, MA)을 함유하는 RPMI 1640 중에서 배양하였다.
IL-8 RA, IL-8 RB 및 CCR2 (MCP-IR)에 대한 MAb는 킨, 에스.(Qin, S.)등의 문헌[Eur. J. Immunol. 26:640-647 (1996)]에 기재되어 있다. 세포의 mAb 스테이닝을 앞서 포나트 박사 등의 문헌[J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)]에 기재된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 세포 당 항체 결합 부위를 조사하기 위해, 7B11-FITC의 F/P 비를 심플리 셀룰라(Simply Cellular) 비드(Flow Cytometry Standards Corp., San Juan, PR)에 의해 측정하고, FACScan을 제조업자의 지시에 따라 퀀텀 26 비드(Flow Ctytometry Standards Corp.)로 눈금을 측정하였다. 공여자로부터의 전혈 100㎕를 0.5% 아지드를 함유하는 PBS 중에서 7B11-FITC의 과포화량(400 ng)과 반응시켰다. 적혈구를 염화암모늄 용해액으로 용해시키고, 7B11 스테이닝된 세포의 평균 채널 형광도를 흐름 세포계수기에 의해 측정하였다.
발현 벡터 구성 및 CCR3 안정한 트랜스펙턴트의 생성
피블루스크립트(pBluescript) II KS+ 벡터(Stratagene)의 HindIII 부위에 연결된 1.8 kb CKR-3(CCR3) 게놈 단편 (실시예 2)을 실시예 3에 기재된 4단계 방법(FLAG 태그된 Eos L2 (CKR-3) 수용체 구성물의 구성)으로 개시 코돈에 대해 바로 5′에 HindIII 제한 부위 및 최적 Kozak 서열을 삽입시킴으로써 발현을 위해 변형시켰다.
쥐과동물 pre-B 림프종 세포주 L1.2를 10% 우혈청이 보충된 RPMI-1640 중에서 유지시켰다. FLAG 태그된 CKR-3/pcDNA3 구성물 (실시예 3) 20㎍을 ScaI으로 분해시킴으로써 선형화시키고, L1.2 세포주를 하기와 같이 트랜스펙팅시키기 위해 사용하였다. L1.2 세포를 HBSS 중에서 2회 세척하고, 동일한 완충액 0.8㎖ 중에 재현탁시켰다. 플라스미드 DNA를 세포와 혼합시키고, 실온에서 10분간 인큐베이팅시키고, 0.4-cm 일렉트로포레이션 큐벳으로 옮긴 후, 단일 펄스를 250V, 960 μF로 인가시켰다. 일렉트로포레이션을 실온에서 10분 인큐베이팅시킨 후에 수행하였다. G418을 트랜스펙팅한지 48시간 후에 0.8 ㎎/㎖의 최종 농도로 첨가시키고, 세포를 96-웰 플레이트 중에 웰 당 25,000개 세포로 플레이팅시켰다. 약물 선택하의 2 내지 3주 후에, G418 내성 세포를 5H12 항-수용체 단클론성 항체로 스테이닝시키고, FACScan(Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA)에 의해 분석하였다. mAb 스테이닝의 경우, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 2% FCS, 0.1% 아지드 나트륨(FACScan완충액), 5㎍/㎖ 친화성 정제된 항체 또는 5㎍/㎖ MOPC-21 IgG1-이소타입 매칭된 대조 mAb(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 또는 100μL 하이브리도마 배양 상층액을 함유하는 100㎕ PBS 중에 재현탁시켰다. 5H12 항체를 하이브리도마 배양 상층액으로서 사용하였다. 4℃에서 30분간 유지시킨 후, 세포를 FACScan완충액으로 2회 세척하고, FITC 컨쥬게이팅된 친화성 정제된 F(ab´)2염소 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) 100㎕ 중에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분간 유지시킨 후, 세포를 FACScan완충액 중에서 2회 세척하고, FACScan에 의해 분석하였다. 요오드화 프로피듐을 사용하여 사멸 세포를 배제시켰다. 안정한 트랜스펙턴트를 분석(FACS 스테이닝 또는 결합) 또는 면역화하기 24시간 전에 5nM n-부티르산(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Catalog No. B 5887)로 처리하였다. 도 18A 및 18C에 도시된 L1.2 트랜스펙턴트를 포함하는 모든 안정한 트랜스펙턴트를 n-부티르산으로 처리하였다. 검출성 표면 스테이닝을 갖는 라인을 증식시키고, 제한 희석에 의해 수회 클로닝시켰다. 네거티브 대조군으로서, CKR-3 트랜스펙팅된 세포를 무관한 대조 IgG1 MAb (MOPC-21) 및 동일한 제 2 항체로 스테이닝시켰다. 또한, 동시 처리된 IL-8RB로 트랜스펙팅된 대조 L1.2 세포를 5H12 및 제 2 항체로 스테이닝시켰다. 형광 세기에 의해 측정된 가장 밝은 표면 스테이닝을 갖는 CKR-3 트랜스펙팅된 클론을 하기 기재된 바와 같이 면역원으로서 사용하였다. 일반적으로, 5H12 스테이닝된 세포 제조물의 평균 형광 세기는 대조군의 스테이닝 보다 2 내지 3 로그 높았다. 7B11로 표시되는 단클론성 항체를 생성시키는 면역화에 사용된 트랜스펙턴트는 MOPC-21 스테이닝된 트랜스펙턴트 및 IL-8RB 대조군 보다 2 로그 높은 형광 세기를 나타내었다.
표면 스테이닝이 가장 밝은 클론을 트랜스펙팅된 수용체의 발현을 확인하기 위한 노던 혼성화에 의해 뿐만 아니라 5´ 프라이머로서 pcDNA3 벡터에 상보적인 T7 프라이머 및 3´프라이머로서 CKR-3 특이적 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의해 추가로 분석하였다.
단클론성 항체 제조 및 흐름 세포계수
전술한 대로 제조한 L1.2 CCR3 트랜스펙팅된 세포를 PBS 중에서 3회 세척하고, 107개 세포 당 PBS 200㎕ 중에서 재현탁시켰다. CCR3와 반응하는 단클론성 항체는 2주 간격으로 5 내지 6회에 걸쳐 C57BL6 마우스를 10 L1.2 CCR3 트랜스펙팅된 세포로 복막내 면역화시킴으로써 생성시켰다. 최종 면역화를 정맥 주사하였다. 4일 후, 비장을 분리시키고, 세포를 콜리간, 제이.이. 등의 문헌에 기재된 바와 같이 SP2/0 세포주로 융합시켰다 [참조: 1992, In: Current Protocols In Immunology (John Wiley 및 Sons, New York), Unit 2.5.4].
CCR3와 반응하는 단클론성 항체를 트랜스펙팅되지 않는 L1.2 세포, 및 FACScan(Becton Dickinison & Co., Mountain View, CA)을 사용하는 면역형광 스테이닝 분석을 사용하여 확인하였다. 하이브리도마 배양 상층액을 항-마우스 Ig-FITC를 사용하는 96-웰 포맷으로 간접 면역형광 분석에 사용하였다. 트랜스펙팅되지 않은 L1.2 세포 및 CCR3 트랜스펙팅된 L1.2 세포를 PBS로 1회 세척하고, 2% FCS, 0.1% 아지드 나트륨(FACScan완충액)을 함유하는 PBS 50㎕ 중에 재현탁시켰다. 하이브리도마 배양 상층액 50μL를 첨가하였다. 4℃에서 30분간 유지시킨 후, 세포를 FACScan완충액으로 2회 세척하고, FITC 컨쥬게이팅된 친화성 정제된 F(ab´)2염소 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories) 100㎕ 중에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분간 인큐베이팅시킨 후, 세포를 FACS완충액 중에 2회 세척하고, FACScan에 의해 분석하였다. CCR3 트랜펙턴트를 스테이닝시키지만 L1.2 세포를 트랜스펙팅시키지 않는 항체를 선택하였다. CCR3과 반응하는 2개의 단클론성 항체를 2가지 상이한 융합물로부터 수득하였다. 7B11 하이브리도마에 의해 생성된 이들 항체 중의 하나를 7B11로 표시하였다.
케모킨, 화학주성 검정 및 리간드-결합 검정.
재조합 사람 케모킨을 상기 포나트 박사 등의 문헌[J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996)]에 기재된 에오택신을 제외하고는 페프로테크(Peprotech, Rocky Hill, NJ)로부터 구입하였고, 에오택신은 이안 클라크-루이스(Ian Clark-Lewis) 박사로부터 증정받았다. 사람 호산구의 화학주성을 포나트 박사 등의 문헌[J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996)]에 기재된 세포주 ECV304를 사용하여 경내피 검정[참조: Carr, M.W., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 91:3652-3656 (1994)]의 변형법을 사용하여 평가하였다. 하부 챔버로 이동된 세포를 튜브에 넣고, 상대적인 세포 개수를 FACScan을 사용하여 얻었다.
I125표지된 에오택신을 아머샴(Arlington Heights, IL)로부터 구입하였고, 이것의 비활성은 2000 Ci/mM 인 것으로 나타났다. 표적 세포에 대한 케모킨 결합을 앞서 언급된 문헌[Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996); Van Riper, G., et al., J. Exp. Med., 177: 851-856 (1993)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 실험 내내 2벌을 사용하였고, 표준 편차는 항상 평균값의 10% 미만이었다. 50% 특이적 결합(IC50)을 억제하는 커브 핏(fit) 및 농도를 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 소프트웨어(Synergy Software, Reading, PA)에 의해 계산하였다.
세포내 칼슘 농도([Ca2+]i)의 측정.
Fura-2 AM (Molecular Probes, Eugene OR) 50㎍을 44㎕의 DMSO 중에 용해시키고, 이것을 로딩 완충액(Hanks Balanced Salt Solution, Gibco/BRL, catalogue # 14025-092, 2% BSA 함유)으로 4.4㎖로 희석시켰다. 호산구를 로딩 완충액 중에 ㎖ 당 107개 세포로 재현탁시키고, 1.5㎖의 세포를 37℃에서 30분간 Fura-2 용액 300㎕와 혼합시켰다. 표지화 후, 과량의 염료를 원심분리에 의해 제거하고, 세포를 125mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 1mM CaCl, 0.5mM 글루코오스, 0.025% BSA 및 20mM HEPES (pH 7.4) 중에 106/㎖의 농도로 재현탁시켰다. [Ca2+]i를 히타치(Hitachi) F-2000 형광 분광계 상에서 340 및 380nm에서 여기를 사용하여 측정하였다. 눈금측정을 전체 방출에 대해 1% NP-40을 사용하고, 유리 Ca2+를 킬레이팅시키기 위해 25μM EGTA를 사용하여 수행하였다.
결과
mAb인 7B11을 사용한 CCR3 트랜스펙턴트에 대한 에오택신, RANTES 및 MCP-3의 결합의 완전 블록킹.
고수준의 CCR3를 발현하는 L1.2 트랜스펙턴트를 항-CCR3 펩티드 mAb 5H12 (실시예 5 참조, 본원에 LS26-5H12로도 언급됨; Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996))를 사용하여 선택하였다. mAb를 표면 발현된 CCR3에 대해 생성시키고, CCR3로 트랜스펙팅된 L1.2 세포와 반응하고, CCR1, CCR2b, CCR4, CCR5, CXCR1 또는 CXCR2로 트랜스펙팅된 L1.2 세포와 반응하지 않는 하나의 mAb인 7B11을 확인하였다 (도 18A). mAb 7B11는 사람 호산구를 강력하게 스테이닝시켰다 (도 18B). 이 mAb는 림프구, CD3 활성화된 T 세포 및 단구와 반응하지 않았다. 이들 세포 중의 소부분이 매우 낮은 수준의 수용체를 발현시킬 수 있다고 하더라도 호중구에 대한 스테이닝은 대부분 네거티브였다. 7B11에 의해 강력하게 스테이닝된 과립구의 작은 서브셋(도 18A)은 과립구 게이트에 함유된 호산구였다.
CCR3 트랜스펙턴트에 대한 mAb 7B11을 I125표지된 에오택신, I125-RANTES, I125-MCP-2 및 I125-MCP-3의 결합을 억제시키는 이것의 능력에 대해 평가하였다. mAb 7B11은 트랜스펙턴트에 대한 I125표지된 에오택신의 결합을 완전 억제시키며(도 18C), 이러한 억제는 100nM의 저온 에오택신으로 수득되는 억제 만큼 효율적이었다. 이는 mAb 7B11이 CCR3에 대한 에오택신의 결합을 완전 블록킹할 수 있음을 나타내었다. 이러한 mAb는 CCR3 트랜스펙턴트에 대한 I125-RANTES, I125-MCP-3 및 I125-MCP-2의 결합을 완전 블록킹할 수 있으며(도 18C), 이는 7B11에 의해 인식된 에피토프가 다수의 CC 케모킨의 결합에 관여함을 나타낸다. 대조적으로, mAb 7B11은 CCR1 트랜스펙턴트에 대한 RANTES의 결합을 억제하지 못했다 (도 18C).
호산구에 대한 방사성표지된 에오택신, RANTES 및 MCP-3의 결합을 블록킹하는 mAb 7B11.
호산구에 대한 에오택신, RANTES 및 MCP-3의 결합이 CCR3를 통해 일어나는 지를 시험하기 위해, 호산구에 대한 방사성표지된 케모킨의 결합을 다양한 농도의 블록킹 mAb 7B11 또는 대조 mAb의 존재하에 수행하였다 (도 19). 호산구에 대한 I125표지된 에오택신의 결합은 7B11 mAb의 적당량을 사용하여 완전 억제될 수 있었으며, 이는 에오택신이 호산구 상의 CCR3에만 결합함을 나타내는 결과과 일치하였다 [참조: Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)]. 그러나, RANTES 및 MCP-3은 CCR3 외에 케모킨 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있다 [참조: Neote, K., et al., Cell 72:415-425 (1993); Gao, J.L., et al., J. Exp. Med., 177:1421-1427 (1993); Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)]. 도 19는 mAb 7B11이 호산구에 대한 I125표지된 RANTES 및 I125표지된 MCP-3의 결합을 또한 억제시킴을 도시한다. mAb 7B11 50ng/㎖은 정상 호산구에 대한 모든 케모킨의 결합의 완전 억제를 달성하기에 충분하며, 이는 2500배를 넘는 저온 케모킨에 의해 달성되는 억제와 유사하였다. mAb 7B11의 약간 적은 양은 RANTES 및 MCP-3 결합을 블록킹하는 데에 필요하며, 이는 CCR에 대한 RANTES 및 MCP-3의 낮은 친화성과 일치한다 [참조; Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)].
항-CCR3 mAb를 사용하는 CC 케모킨에 대한 호산구 화학주성의 억제.
화학주성 실험을 적당히 높은 수준의 호산구(-3 내지 6%의 WBC)를 갖는 정상 개체로부터의 호산구를 사용하여 수행하였다. 도 20A는 mAb 7B11이 에오택신에 대한 호산구의 화학주성을 용량 의존적 방식으로 완전 억제시킬 수 있음을 도시한다. 5 내지 10 ug/㎖가 하부 웰 중의 케모킨 100ng/㎖(12.5 nM)을 사용하여 100% 억제를 달성하기에 필요하였다. 도 20B는 RANTES, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4에 대한 호산구 화학주성 반응이 ㎖ 당 5 내지 10 ug의 mAb 7B11을 사용하여 완전 억제될 수 있음을 도시한다. 더욱이, mAb 7B11은 RANTES에 대한 PBMC 화학주성을 억제할 수 있으며, 이는 CCR3 이외의 케모킨 수용체를 통해 일어난다.케모킨에 대한 호산구 화학주성 반응에서의 공여체 대 공여체 변이가 관찰되었다 [참조: Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)]. 그러나, 이렇게 조사된 모든 개체(n = 8) 중에서, mAb 7B11은 호산구의 에오택신, RANTES, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4의 이동을 95% 넘게 억제시킬 수 있었다.
CC 케모킨에 반응하여 호산구에 의한 [Ca+2]i의 변화를 억제하는 mAb 7B11.
에오택신, RNATES, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4는 사람 호산구에 의한 [Ca+2]i의 변화를 유도시킨다 [참조: Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996); Uguccioni, M., et al., J. Exp. Med., 183:2379-2384 (1996)]. mAb 7B11의 작용제/길항제 기능을 조사하기 위해, 호산구를 mAb 7B11 또는 무관한 대조 mAb의 주입 후 [Ca+2]i에 대해 평가하였다. 무관한 mAb와 인큐베이팅된 호산구는 최적량의 에오택신, RANTES, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4의 주입 후 [Ca+2]i의 변화를 생성시켰다 (도 21의 상부 패널). 호산구 [Ca+2]i의 효능있는 자극제인 C5a를 대조군으로서 사용하였다.
6.4㎍/㎖의 7B11 mAb와 40초간 인큐베이팅시킨 호산구는 에오택신, RANTES, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4에 반응할 수 없었다 (도 21의 하부 패널). 이러한 억제는 이러한 효과가 빠르기 때문에 세포 표면으로부터의 수용체 조절로 인한 것이 아니며, 실온에서 mAb 7B11와 인큐베이팅시킨 호산구의 면역형광 스테이닝은 강력한 스테이닝을 나타내었다. 또한, mAb 7B11은 작용적이라기 보다는 길항적인데, 이는 10㎍/㎖ 만큼 높은 농도의 mAb는 [Ca+2]i의 변화를 유도시키기 못하기 때문이었다. 7B11 처리된 호산구는 C5a에 대해 [Ca+2]i의 변화를 나타내었다 (도 21). mAb 7B11은 MIP-1α 또는 RANTES에 대한 부티레이트 분화된 HL-60 세포의 [Ca+2]i에 영향을 미치지 못하며, 이는 CCR3 이외의 수용체를 통해 매개되는 반응이다.
CCR3를 통해 CC 케모킨에 반응하지만 IL-8 수용체를 상향조절시키는 IL-5 프라이밍된 호산구.
IL-5로 시험관내 프라이밍시킨 호산성 개체로부터의 호산구 및 정상 호산구는 화학주성 검정(참조: Schweizer, R.C., et al., Blood, 83:3697-3704 (1994); Sehmi, R., et al., Clin. Exp. Allergy, 23:1027-1034 (1994))에서 IL-8에 반응하며, 이는 활성화된 호산구가 변경된 케모킨 수용체 발현을 가짐을 제시한다. 프라이밍되거나 활성화된 호산구가 정상 호산구에서 반응하는 것과 동일한 방식으로 CC 케모킨에 대해 반응하는 지를 시험하기 위해, 도 20 및 21에 도시된 실험과 유사한 블록킹 실험을 5 내지 7일째 IL-5 자극된 호산구 및 호산성 개체로부터의 호산구를 사용하여 수행하였다. IL-8 수용체, CXCR1 및 CXCR2은 조사된 모든 정상 개체 (n = 12)로부터의 호산구에 대한 mAb 스테이닝에 의해 검출불가능하였다. 그러나, 사람 IL-5와 5 내지 7일간 시험관내 배양을 수행한 후, CXCR2 및 CXCR1(보다 낮은 정도로)는 항-CXCR2 mAb 및 흐름 세포계수기를 사용하여 검출된 바와 같이 (도 22B) 호산구의 표면에 대해 검출가능하였고, 이러한 발현은 화학주성 검정에서의 IL-8로 이동하는 이들 호산구의 능력과 대등하였다 (도시되지 않음). 조사된 하나의 호산성 공여체(18 내지 25%의 WBC가 호산구, 1년 미만 동안) 중에서, CXCR2는 약간 낮은 수준으로 호산구 상에서 발현되었다 (도 22C).
mAb 7B11은 정상 호산구에 대해 기술된 방식과 유사한 방식으로 에오택신 및 RANTES (도 22D) 뿐만 아니라 MCP-2, MCP-3 및 MCP-4에 대한 IL-5 프라이밍된 호산구(도 22D) 및 호산성 공여체로부터의 호산구 둘 모두의 칼슘 반응을 완전 블록킹할 수 있었다. mAb 7B11은 IL-8 반응에 영향을 미치지 못하며(도 22D), MIP-1α 반응은 이들 실험에 있어서 명백하지 않았다. CCR3 발현은 IL-5 프라이밍된 호산구 상에서 및 다수의 건강한 개체로부터의 호산구로부터 평가하였다. 건강한 개체로부터의 호산구 당 7B11 결합 부위의 수는 17,400± 1600인 것으로 계산되었고 (n = 12), IL-5 자극 후 현저한 변화는 관찰되지 않았다. 그러나, 분석된 하나의 호산성 공여체에서, 7B11 결합 부위의 수는 26,000인 것으로 밝혀졌다.
토의
에오택신, RANTES, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4를 포함하는 특징화된 호산구에 대한 모든 효능있는 케모킨의 작용 효과는 효능있는 길항 활성을 갖는 항-CCR3 mAb에 의해 완전 블록킹될 수 있다. 이러한 mAb는 CCR3에 특이적이며, 그 외의 화학유인제 수용체에 대한 억제 효과는 관찰되지 않았다. 이들 결과는 CCR3가 CC 케모킨에 대한 호산구 반응에 대한 주요 수용체이며, CCR1, CCR2, CCR4 또는 CCR5에 대한 필수적인 역할을 질의함을 추가로 입증한다.
호산구에 대한 우세한 CC 케모킨 수용체는 CCR3 이다. 이러한 수용체는 리간드 결합 실험 및 mAb 스테이닝에 의해 나타난 바와 같이 고수준으로 발현된다. 최근 실험은 사람 호산구가 MIP-1α 수용체, 즉 CCR1, CCR4 또는 CCR5 중의 어느 하나를 CCR3의 수준의 약 1 내지 5%로 발현시키며 (참조; Daugherty, B.L., et al., J. Exp. Med., 183:2349-2354 (1996)), MIP-1α에 대한 보통의 호산구 화학주성 반응은 일부 개체에서 관찰되었다 [참조: Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996); Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996)]. 그러나, mAb 7B11을 사용한 결과는 MIP-1α 수용체(들)이 RANTES 또는 MCP-3에 대한 호산구의 기능적 반응에 거의 기여하지 못함을 나타낸다. 공여체 변이는 CC 케모킨에 대한 호산구 반응에서 관찰되었지만, 이들 반응은 mAb 7B11을 사용하여 모든 개체에서 완전 블록킹되었으며, 이는 기타 CC 케모킨 수용체가 존재하는 경우에, 이들이 적은 기능적 중요성을 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, CC 케모킨에 대한 IL-5 자극된 호산구의 반응은 mAb 7B11에 의해 또한 블록킹될 수 있으며, 이는 IL-2 프라이밍된 T 세포에 대해 일어나는 바와 같이 신규한 수용체가 사이토킨 프라이밍된 호산구 상에서 상향조절되지 않음을 제시한다 [참조: Loetscher, P., et al., J. Exp. Med., 184:569-577 (1996)]. IL-5 프라이밍되거나 활성화된 호산구에 대한 IL-8 수용체의 관련성은 불확실하다. 본원에 기술된 표현형 및 기능성 분석은 IL-5 자극된 호산구 또는 호산성 공여체로부터의 호산구가 화학주성 검정에서 IL-8에 반응함을 나타내는 이전 보고와 일치한다 [참조: Schweizer, R.C., et al., Blood, 83:3697-3704 (1994); Sehmi, R., et al., Clin. Exp. Allergy, 23:1027-1034 (1994)].
따라서, 본원에 기술된 바와 같이, CC 케모킨 수용체에 대해 완전 길항적인 mAb가 확인되었다. CCR3 길항제는 천식과 같은 질병의 치료에 이용되며, 여기에서 기도로의 호산구 이동의 억제가 유리하다. 천식에서 기도로의 호산구 이동에서의 에오택신-CCR3의 역할은 제시되어 있는데, 이는 호산구의 선택적 보충이 이러한 질병에서 종종 발생하기 때문이다. 더욱이, 에오택신 및 기타 케모킨은 천식 환자의 기도에서(참조: J. Rottmann 및 D. Ringler) 뿐만 아니라 알레르기성 기도 질병의 동물 모델에서(참조: Jose, P.J., et al., J. Exp. Med., 179:881-887 (1994); Gonzalo, J. -A., et al., Immunity, 4:1-14 (1996)) 고도로 상향조절된다.
실시예 11
항-CCR3 단클론성 항체 7B11에 의한 에오택신, RANTES 및 MCP-3에 의해 유도된 호산구 탈과립의 블록킹.
C5a 유도된 호산구 탈과립에 대한 항-CCR3 단클론성 항체 7B11의 효과.
에오택신, RANTES, MCP-3 또는 C5a에 의해 자극된 호산구 탈과립을 에오택신, RANTES, MCP-3 또는 C5a 중의 하나에 의한 자극 후의 배지(EPO) 내로의 호산구 퍼옥시다아제 방출에 의해 측정하였다. EPO는 호산구 특이적 과립에 존재하는 호산구 효소이다.
본원에 기재된 실험은 항-CCR3 단클론성 항체 7B11이 CCR3 케모킨 에오택신, RANTES 및 MCP-3에 의해 자극된 호산구 탈과립을 억제시키는 반면에, C5a에 의해 자극된 호산구 탈과립에 대해 영향을 미치지 않음을 나타낸다. C5a는 상이한 수용체에 결합하며, 이로써 네거티브 대조군으로서 작용한다.
재료 및 방법
행크(Hank)의 밸런스드 솔트 용액(Balanced Salt Solution)(HBSS, Cat. No. 14025-092) 및 둘베코(Dulbecco)의 포스페이트 완충 식염(Phosphate Buffered Saline)(PBS, Cat. No. 14190-144)을 깁코 BRL로부터 구입하였다. 시토칼라신(Cytochalasin) B(C-6762), 과산화수소(H2O2, 3% 용액, H-6520), DMSO(D-5879), 트리스(히드록시메틸)아미노 메탄(T-1503) 및 o-페닐렌디아민(P2903)을 시그마 케미칼 코포레이션(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 폴리스티렌 V 또는 둥근 바닥 플레이트를 코스타(Costar)로부터 구입하였다. 정제된 사람 호산구를 전술한 바와 같이 준비하였다.
호산구 탈과립 검정 및 단클론성 항체 7B11에 의한 블록킹.
7B11 항체 용액을 1 및 0.1 ㎎/㎖ (100 X 검정 최종 농도)로 PBS 중에서 제조하였다. 케모킨 또는 C5a를 HBSS, 25mM Hepes, 0.25% BSA 완충액(검정 완충액) 중에서 2X 검정 최종 농도로 용해시켰다.
호산구를 검정 완충액(HBSS, 25mM Hepes, 0.25% BSA) 중에서 2.5 x 106/㎖로 재현탁시켰다. 1:1000 부피의 100% DMSO 중의 5㎎/㎖ 시토칼라신 B 용액을 호산구 현탁액에 첨가시켰다 (5㎍/㎖의 최종 농도). 그 후, 세포 현탁액 100㎕를 96 웰 V 바닥 플레이트에 분산시켰다 (웰 당 0.25 X 106개 세포). PBS 또는 항체 용액 2㎕(10 또는 1ug/㎖ 최종 항체 농도에 대해 각각 1 또는 0.1 ㎎/㎖)를 세포에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터 내에서 10분간 방치시켰다. 인큐베이팅 후, 100㎕의 케모킨 용액 또는 완충액만을 세포에 첨가하고, 30분간 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅 후, 플레이트를 10℃, 160g에서 5분간 원심분리시켰다. 원심분리 후, 상층액을 모으고, 하기 기술된 바와 같이 호산구 퍼옥시다아제의 존재에 대해 검정하였다. 검정을 보통 2벌로 수행하였다.
호산구 퍼옥시다아제 검정
EPO 농도의 분석을 화이트, 에스.알. 등의 문헌[J. Immunol. Meth., 44:257-263 (1991)]에 기재된 프로토콜을 약간 변형시켜 수행하였다. 이 검정은 H2O2의 존재하에 EPO에 의한 o-페닐렌디아민의 산화를 기초로 한다. 기질 및 H2O2의 검정 최종 농도는 각각 16mM 및 0.01% 였다. 기질 원액(27mM 기질, 0.016% H2O2)을 0.1M 트리스 pH 8.0, 0.1% 트리톤 X-100에서 사용하기 직전에 제조하였다. 간단히 요약하면, 기질 용액 75㎕를 492nm에서 5분간 매 15초 마다 판독값을 수득하기 직전에 평평한 바닥 96 웰 플레이트 중에서 샘플 50㎕와 배합시켰다. 분광학적 판독을 마이크로플레이트 흡광 분광계(Dynatech MR 4000, Dynatech Laboratories, INC., Chantilly, Virginia)에서 수행하였다. 데이터를 모으고, 검정 관리 소프트웨어인 비올링스(Biolinx) TM 버전 2.1을 사용하여 분석하였다. 반응의 속도를 연속 3 또는 4 지점 사이의 내삽에 의해 계산하였다. 양고추냉이 과산화효소(HRP)를 표준으로서 사용하였다. 동력학적 데이터를 2, 5, 10 및 20ng의 HRP로 수득한 표준 곡선에 대해 외삽하고, 활성을 1 단위가 HRP 1ng의 활성과 등가인 활성에 해당하는 백만개 세포 당 EPO의 단위로 표현하였다. 따라서, EPO의 단위는 HRP 1ng와 동일한 활성을 제공하는 단백질의 양으로서 정의된다.
결과
두 개의 별도의 실험에서, mAb 7B11은 호산구로부터의 에오택신 유도된 퍼옥시다아제 방출을 블록킹시켰다. 도 23A는 10㎍/㎖의 농도의 7B11가 10 또는 100 nM의 에오택신 및 100nM의 RANTES 또는 MCP-3에 의해 유도된 탈과립을 억제시킴을 도시한다. 100nM의 에오택신, RANTES 또는 MCP-3에 의해 유도된 탈과립은 각각 99, 77 및 72%가 억제되었다. 주목할 만하게도, 도 23B에 도시된 바와 같이, mAb 7B11은 C5a에 의해 유도된 탈과립을 억제시키지 못했다.
앞의 실험은 EPO의 에오택신 자극된 방출이 기타 호산성 과립 효소 및 호산구 양이온성 단백질(ECP) (도 24A), 글루커로니다아제 및 아릴술파타아제 B (도 25 내지 27)와 같은 단백질의 방출에 대등함을 나타내었다. EPO, ECP 및 글루커로니다아제는 호산구 특이적 과립에 존재하며, 아릴술파타아제 B는 소형 과립에 존재한다. 따라서, 에오택신은 특이적 및 소형 과립 둘 모두의 탈과립을 유도시킨다. 도 25 내지 27은 EPO 방출에 대한 에오택신 용량 반응 곡선이 기타 호산성 단백질의 방출에 대한 용량 반응 곡선과 대등함을 도시한다. 이들 검정은 본질적으로 호산구 탈과립 검정에 대한 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그 후, 상층액을 정립된 과정을 사용하여 호산구 과립 단백질의 존재에 대해 검정하였다. ECP의 경우, 시판되는 방사면역검정 키트를 사용하였다 (참조: Pharmacia Diagnostics, Cat. No. 10-9165-01). 글루커로니다아제 및 아릴술파타아제 B에 대한 효소 검정은 크로겔, 씨. 등의 문헌[J. of Immunol., 1472:3518-3526 (1989)]에 기재되어 있다.
EPO는 검정 및 정량의 편리함으로 인해 호산구 탈과립 실험에서 선택된 효소였다. 에오택신에 의한 EPO 방출은 일반적으로 호산구 탈과립의 반영한다. EPO 방출이 기타 호산구 단백질 및 효소의 방출에 필적하기 때문에, 유사하게는, EPO 방출의 블록킹에 의해 측정되는 에오택신에 의해 유도된 탈과립의 7B11 블록킹은 기타 호산구 단백질 및 효소의 방출의 블록킹을 또한 반영해야 한다.
실시예 12.
CCR3를 발현하는 호염구
재료 및 방법
흐름 혈구측정. 전혈 중의 CCR3를 발현하는 세포를 흐름 세포계수기에 의해 확인하였다. 헤파린화된 전혈 100㎕을 실온에서 20 내지 30분간 0.1% 아지드 함유 PBS 100㎕의 존재하에 7B11 (항-CCR3)-FITC 제조물 400ng 및 비오틴 커플링되 항-사람 IgE(PharMingen, San Diego, CA)으로 스테이닝시켰다. 세포를 아지드 함유 PBS 중에서 1회 세척하고, 실온에서 15 내지 30분간 스트렙타비딘-퀀텀 레드(Sigma Immuno Chemicals, St. Louis, MO)로 스테이닝시켰다. 적혈구를 염화 암모늄 용해 완충액 2㎖를 사용하여 용해시키고, 백혈구를 펠릿화시키고, PBS 중에 현탁시켜서, FACScan 흐름 세포계수기(Becton Dickinson, Mountainview, CA) 상에서 분석하였다. 스테이닝된 집단으로부터의 세포의 가시적 분석을 상기와 같이 스테이닝시킨 세포를 소팅하고, FACSvantage 흐름 세포계수기(Becton Dickinson)을 사용하고, 수거된 세포의 디프 퀵(Diff Quik)(Baxter Scientific Products, McGaw Park, II) 스테이닝된 슬라이드를 제조한 후 수행하였다.
세포 당 부위의 수의 계수. 세포를 상기와 같이 스테이닝시켜 흐름 세포계수하였다. 샘플의 분석 후, 퀀텀 26 비드를 함유하는 튜브(Flow Cytometry Standards Corp., San Juan, PR)을 사용하여 형광도를 눈금 측정하였다. 7B11/FITC 제조물에 대한 MFSF/단백질 비를 심플리 셀룰라 비드(Flow Cytometry Standards Corp.)을 사용하여 측정하였다. 그 후, 스테이닝된 세포의 중간 채널 형광도를 사용하여 세포 당 결합된 항체 분자의 평균 개수를 계산하였다.
결과
CCR3를 인식하는 것으로 이미 밝혀진 단클론성 항체 7B11은 전혈 제조물로부터의 세포의 단지 2개 집단을 인식하였다. 이들 집단 중의 하나는 이것의 표면 상에 고수준의 IgE를 갖는 것으로 밝혀질 수 있지만, 나머지 하나는 그렇지 않았다. IgE가 결여되어 있지만 7B11으로 스테이닝된 소팅된 세포는 소팅된 세포로부터 제조된 슬라이드 상에서 확인된 바와 같이 97.3% ± 0.6 호산구였다. IgE 스테이닝, 세포 용해 및 샘플의 소팅에 의해 다수의 세포가 탈과립된다고 하더라도, 표면 상에 고수준의 IgE를 함유하고 또한 7B11에 의해 스테이닝된 세포는 스테이닝된 제조물에 대해 호염구(92% ± 4.6)인 것으로 나타났다. 호산구는 주어진 개체로부터의 호염구 보다 약간 높은 수의 세포 당 수용체를 발현시켰다 (p<0.001, 쌍을 이룬 t-테스트). 30개 개체의 분석으로부터, 7B11 결합 부위/호산구의 평균 개수는 24,700 ± 5700인 것으로 밝혀졌고; 부위/호염구의 평균 개수는 19,000 ± 4500 이었다.
전혈을 7B11-FITC으로 스테이닝시키고, 항-사람 IgE-비오틴으로 스테이닝시킨 다음, 스트렙타비딘 퀀텀 레드로 스테이닝시키고, 흐름 세포계수에 의해 분석하였다. 전혈로부터의 2회 칼라 스테이닝의 분석 결과 CCR3를 함유하는 2개의 집단 (도 28)이 나타났고, 이중 한 집단을 항-사람 IgE로 이중 스테이닝시켰다. 항-CCR3 항체에 의한 스테이닝의 세기의 비교 결과 호산구는 일관하여 CCR3의 발현에 대해 호염구 보다 더욱 강력하게 스테이닝됨을 나타냈다. 이들 두 집단에서의 세포의 동일성을 통상적인 조직학적 스테이닝에 의해 확인하였고, IgE(+)CCR3(+) 집단은 호염구인 것으로 밝혀진(탈과립됨) 반면에, IgE(-) CCR3(+) 집단은 호산구였다. 두 집단의 백게이팅(backgating)을 사용하는 정방향 및 측방향 산란은 이들 세포가 이들의 세포 유형의 기타 표시와 일관하는 광 산란 특성을 가짐을 나타낸다.
실시예 13.
항-CCR3 mAb에 의해 블록킹되는 에오택신 및 MCP-4에 대한 호염구 화학주성
백혈구를 사전 승낙후 선택되지 않은 건강한 자원자로부터 수득하고, 단리시키고, 하기 문헌에 기재된 바와 같이 불연속 밀도 원심분리에 의해 분류하였다 [참조: Kurimoto, Y., et al., J. Exp. Med., 170:467 (1989); Bischoff, S.C., et al., Blood, 79:2662 (1990)]. 간단히 요약하면, 정맥혈을 10mM EDTA로 응고방지시키고, 0.25 부피의 덱스트란(NaCl 0.9% 중의 6%)와 혼합시키고, 적혈구를 실온에서 침강시켰다. 90분 후, 백혈구를 수거하고, HA 완충액(20mM Hepes, 125mM NaCl, 5mM KCl, 0.5mM 글루코오스, 0.025% 우혈청 알부민) 중에서 3회 세척하였다. 호염구 과립구를 부화시키기 위해, 백혈구를 쿠리모토, 와이.(Kurimoto, Y.) 등의 문헌[J. Exp. Med., 170:467 (1989)]에 정확히 기재되어 있는 바와 같이 피콜 하이팩(Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리에 의해 분류하였다 [참조: Kurimoto, Y., et al., J. Exp. Med., 170:467 (1989)]. 정제된 호염구를 불연속 퍼콜(Percoll) 구배 원심분리(참조: Bischoff, S.C., et al., Blood, 79:2662 (1990))에 의해 백혈구 분류에 의해 수득하였다. 호염구 풍부 세포층을 수거하고, CD3(12ul), CD4(15ul), CD8(12ul), CD14(5ul), CD16(5ul) 및 CD19(5ul)에 대해 mAb로 코팅된 파라마그네틱 비드와 40분간 인큐베이팅시켰다. 자기적으로 스테이닝된 세포 현탁액을 강력한 자기장에 놓인 분리 칼럼 상을 통과시켜서, 오염 세포를 제거하였다 (MACS system, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, FRG). 면역자기 비드에 의한 퍼콜 구배 원심분리 및 네거티브 선을 조합하면 80 내지 95% 순도의 호염구 제조물(소형 림프구에 의해서만 오염됨)을 30 내지 60%의 회수율(May Gruewald/Giemsa로 스테이닝된 세포원심분리 슬라이드 및 전체 히스타민 함량의 측정에 의해 측정됨)로 생성시켰다. 세포를 HA 완충액 중에서 최종적으로 3회 세척시키고, HACM 완충액(1mM MgCl 및 1mM Cal2이 보충된 HA 완충액) 중에서 현탁시켰다.
히스타민 및 LTC4방출.
125mM 글루코오스 및 0.025% BSA를 함유하는 20mM Hepes(pH 7.4) 중의 호염구(80 내지 180 x 103/㎖)를 37℃로 가온시키고, 항-CCR3(5ug/㎖)의 존재 또는 부재하에 IL-3(10ng/㎖)로 노출시킨후, 시험하였다. 20분후, 튜브를 얼음 상에 놓고, 히스타민 및 LTC4를 상층액 중에서 측정하였다 [참조: Dahinden, C.A., et al., J. Exp. Med., 179:751 (1994)]. 히스타민 방출을 샘플의 전체 함량의 %로 표현하였다 (세포 용해 후에 측정됨). LTC4생성을 전체 히스타민 ng 당 pg LTC4/D4/E(1,000 호염구에 상응함)로서 표현하였다.
도 29에 도시된 바와 같이, 호염구는 케모킨에 반응하여 히스타민을 방출시키고, 히스타민은 MAb 7B11에 의해 블록킹될 수 있다.
화학주성
케모킨을 48웰 주화 챔버(Neuro Probe, Cabin John, MD)의 하부 웰에 첨가시켰다. 세포를 항-CCR3(5ug/㎖)의 존재 및 부재하에 RPMI 1640, 20 mM Hepes 및 1% PPL (pH 7.4) 중에 현탁시키고, 상부 웰에 넣었다 (웰 당 50,000개 세포). 폴리카보네이트 필터(폴리비닐 피롤리돈 비함유, 5 um 포어 크기; Nucleopore Corp., Pleasanton, CA)를 가로지르는 이동을 5% CO2중에서 37℃에서 50분간 인큐베팅한 후 평가하였다. 이동된 세포를 May-Gruenwald/Giemsa로 스테이닝시킨 후 필터의 하부 표면 상에서 현미경으로 계수하였다.
도 30A 및 30B에 도시된 바와 같이, 호염구는 에오택신 및 MCP-4에 대해 화학주성을 나타내며, 반응은 항-CCR3 mAb 7B11으로 블록킹된다.
균등물
당업자라면 통상의 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구의범위에 의해 포함되도록 의도된다.
서열 목록
(1) 일반적 사항
(i) 출원인:
(A) 명칭: 루코사이트, 인코포레이티드
(B) 스트리트: 퍼스트 스트리트 215
(C) 도시: 캠브리지
(D) 주: 매사추세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 02142
(G) 전화: (617) 621-9350
(H) 팩스: (617) 621-9349
(ii) 발명의 명칭: G 단백질 커플링된 수용체 길항체
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(A) 수신인: 해밀톤, 브루크, 스미스 & 리놀즈, P.C.
(B) 거리: 투 밀리샤 드라이브
(C) 도시: 렉싱톤
(D) 주: 매사추세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편 번호: 02173
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: Patentin Release #1.0, 버전 # 1.30
(vi) 우선 출원 상황:
(A) 출원 번호: US 08/720,565
(B) 출원일: 1996년 9월 30일
(C) 분류:
(vii) 변리사/대리인 상황
(A) 성명: 데이비드 이. 브루크
(B) 등록 번호: 22,592
(C) 참고/서류 번호: LKS94-05A3PCT
(ix) 통신처
(A) 전화: 781-861-6240
(B) 팩스: 781-861-9540
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1689 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(i) 서열의 종류: DNA (게놈)
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2) 서열 번호 2에 대한 사항:
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(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
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(ii) 서열의 종류: cDNA
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(2) 서열 번호 9에 대한 사항:
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(2) 서열 번호 10에 대한 사항:
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(2) 서열 번호 11에 대한 사항:
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(2) 서열 번호 12에 대한 사항:
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(2) 서열 번호 13에 대한 사항:
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(2) 서열 번호 14에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 25 염기쌍
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(xi) 서열 설명: 서열 번호 :14:
(2) 서열 번호 15에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 48 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
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(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: CDS
(B) 존재 위치: 16..48
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :15:
(2) 서열 번호 16에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 11 아미노산
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(D) 토폴로지: 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 단백질
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(2) 서열 번호 17에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
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(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :17:
(2) 서열 번호 18에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :18:

Claims (28)

  1. 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 대해 결합 특이성을 갖는 항체로서, 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11과 경합할 수 있는 항체.
  2. 제 1항의 항체의 항원 결합 단편.
  3. 제 1항에 있어서, 항체가 7B11임을 특징으로 하는 항체.
  4. 제 3항의 항체의 항원 결합 단편.
  5. 제 1항의 항체를 생성시키는 하이브리도마.
  6. 제 5항에 있어서, 하이브리도마가 7B11 하이브리도마임을 특징으로 하는 하이브리도마.
  7. 치료 또는 진단에 사용하기 위한 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체가 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11와 경합할 수 있는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편.
  8. 치료 또는 진단에 사용하기 위한 항체 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편.
  9. 염증성 질병 또는 질환 치료용 약제를 제조하기 위해 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 결합 친화성을 갖는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 사용하는 방법으로서, 항체가 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11과 경합할 수 있는 방법.
  10. 염증성 질병 또는 질환 치료용 약제를 제조하기 위해 항체 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편을 사용하는 방법.
  11. 케모킨 수용체 3 단백질을 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하여 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질의 기능을 한 가지 이상 억제시키는 방법으로서, 항체 또는 단편이 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11과 경합할 수 있는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편이 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  13. 포유동물 수용체의 기능을 한 가지 이상 억제시키기 위해 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 사용하는 방법으로서, 항체 또는 단편이 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11와 경합할 수 있는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편이 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  15. 포유동물에 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 대해 결합 특이성을 갖는 치료적 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함하여 염증성 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 항체 또는 단편이 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 결합하기 위해 단클론성 항체와 경합할 수 있는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편이 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 염증성 질병 또는 질환이 예를 들어, 알레르기성 질병, 천식, 자가면역 질병, 이식편 거부 또는 암임을 특징으로 하는 방법.
  18. 염증성 질병 또는 질환을 치료하기 위해 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 대해 결합 친화성을 갖는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 사용하는 방법으로서, 항체 또는 단편이 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11과 경합할 수 있는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편이 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 염증성 질병 또는 질환이 예를 들어, 알레르기성 질병, 천식, 자가면역 질병, 이식편 거부 또는 암임을 특징으로 하는 방법.
  21. 세포를 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하여 세포의 표면에 있는 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부를 검출 또는 측정하는 방법으로서, 항체 또는 단편이 사람 케모킨 수용체 3 단백질에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11과 경합할 수 있는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 세포가 백혈구임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편이 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  24. 세포의 표면에 있는 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 일부를 검출 또는 측정하기 위해 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질에 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 사용하는 방법으로서, 항체 또는 단편이 사람 케모킨 수용체 3 단백질에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11과 경합할 수 있는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 세포가 백혈구임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편이 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  27. 백혈구의 염증성 작용이 변경된 질병 또는 질환의 진단에서 개체의 백혈구에 있는 수용체의 발현의 수준을 측정하기 위해 포유동물 케모킨 수용체 3 단백질에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하는 방법으로서, 항체 또는 단편이 사람 케모킨 수용체 3 단백질 또는 이것의 단편에 결합하기 위해 단클론성 항체 7B11과 경합할 수 있는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 항체 또는 이것의 단편이 7B11 또는 이것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
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