KR20000037134A - 결핵균 감염을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 그 방법 - Google Patents

결핵균 감염을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 그 방법 Download PDF

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엘르자베스 비제르
마르고트 에이. 스키너
린다 엠. 스코트
로즈 엘. 프레스티지
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왓슨 제임스 디.
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Abstract

본 발명은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드 및 이와 같은 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 분자, 미코박테리움 감염 진단 및 치료에 이를 이용하는 방법을 제공한다. 미코박테리움 바카이 배양 여과물 또는 지질이 제거된 미코박테리움 바카이의 투여를 포함한 항원에 대한 면역 반응을 강화시키는 방법을 제공한다.

Description

결핵균 감염을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 그 방법{Compounds and Methods for Treatment and Diagnosis of Mycobacterial Infections}
결핵은 미코박테리움 튜베르쿨로시스 즉 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 감염이 되는 만성 감염성 질환이다. 이 질환은 주로 개발도상국에서 발생하고, 선진국에서도 그 수가 증가되는 문제를 가지고 있는데 매년 새로운 환자가 8백만 명이 발생하고, 3백만 명이 사망을 한다. 감염은 상당한 시간동안 증상이 나타나지 않지만, 이 질병의 대체로 간의 만성적인 염증으로 인하여 발열 및 호흡 증상으로 명확히 나타나는데, 치료를 하지 않고 방치한다면 상당한 치사율을 가진다.
결핵은 방대한 항생제 치료법을 이용하여 일반적으로 치료가 되기는 하지만, 이와 같은 치료는 이 질병이 만연하는 것을 예방하는데에는 역부족이다. 감염자는 증상을 나타내지는 않지만, 일정 시간동안 전염성을 가진다. 또한, 치료 섭생에 적응하는 것이 중요하지만 환자의 특징을 모니터하는 것이 어렵다. 일부 환자의 경우는 치료과정을 완전히 끝내지 않아, 치료 효과를 얻지 못하고, 약에 저항성을 가지는 결핵균을 발생하도록 하는 경우가 있다.
결핵균이 확산되는 것을 방지하려면 효과적인 백신 및 질병을 초기에 정확하게 진단하는 것이 필수적이다. 현재, 보호성 면역을 유도하는데 가장 효과적인 방법은 살아있는 균으로 백신을 만드는 것이다. 이 목적으로 이용되는 가장 흔한 결핵균속이 바실러스 칼미테-구에린[Bacillus Calmett-Guerin (BCG)]으로, 이는 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 무균 균주이다. 그러나, BCG의 안정성 및 효과에 대해 논쟁이 되고 있고, 미국과 같은 일부 국가에서는 일반 대중에게 백신을 하지 않고 있다. 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 감염을 진단하는 데에는 피부 테스트를 이용하여 이루어지는데, 이 테스트는 내피를 튜베르쿨린(PPD; 단백질-정제된 유도체) 노출시키는 것이다. 주사 후 48-72시간 경에, 주사 부위에 항원-특이적인 T 세포 반응으로 경화가 나타나면 결핵균 항원에 노출되었다는 것을 의미한다. 그러나, 이 테스트는 감응성 및 특이성에서 문제가 있는데, BCG로 백신주사를 맞은 개인과 감염된 개인을 구별할 수 없다는 것이다.
결핵 및 나병의 면역치료법에 이용되었던 잘 알려지지 않은 결핵균 속은 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae)로 사람에게서는 비-병인성이다. 그러나, BGC와 비교하였을 경우에 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 효과에 대해서는 정보가 없고, 일반 대중에게 백신을 접종하는데에는 널리 사용되지 않았다. 미코박테리움 보비스(M. bovis), BCG, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 결핵균(M. tuberculosis) 감염에 노출된 개인의 면역계가 인지할 수 있는 항원 화합물을 포함하고 있는 것으로 보인다.
따라서, 결핵을 예방, 치료 및 감지하는데 효과적인 화합물 및 그 방법이 당분야에서 필요하다.
발명의 요약
전술한 것과 같이, 본 발명은 결핵균 속 감염을 예방, 치료 및 진단하는 화합물 및 그 방법, 감염성 질환 및 암의 면역치료 및 백신에 이를 어쥬번트로 이용하는 것에 관계한다.
첫 번째로, 항원의 면역원 부분 또는 이와 같은 항원의 변이체로 구성된 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae)에서 유도한 폴리펩티드를 제공한다. 한 구체예에서, 항원에는 다음에서 선택된 아미노산을 포함한다; (a) 서열 번호: 1-4, 9-16, 18-21, 23, 25, 26, 28, 29, 44, 45, 47, 52-55, 63, 64, 70, 75, 89, 94, 98, 100-105, 109, 110, 112, 114, 117, 118, 121, 124, 125, 134, 135, 140, 141; (b) 서열 번호 1-4, 9-16, 18-21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 44, 45, 47, 52-55, 63, 64, 70, 75, 89, 94, 98, 100-105, 109, 110, 112, 114, 117, 118, 121, 124, 125, 134, 135, 140, 141에서 명시하는 서열과 적어도 99% 동일한 서열(BLASTP 컴퓨터 연산방식으로 측정을 하였을 때).
두 번째 특징에서, 본 발명은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드를 제공하는데, 이때 항원은 다음에서 선택된 DNA에 의해 인코드되는 아미노산서열로 구성된다; (a) 서열 번호: 40-42, 46, 48-51, 74, 88, 93, 97, 99, 106-108, 111, 113, 115, 116, 120, 122, 123, 132, 133, 136-138; (b) 서열 번호: 40-42, 46, 48-51, 74, 88, 93, 97, 99, 106-108, 111, 113, 115, 116, 120, 122, 123, 132, 133, 136-138의 서열의 상보서열; (c) (a) 또는 (B)에 명시하는 서열과 적어도 99% 동일한 서열(FASTA 컴퓨터 연산방식으로 측정을 하였을 때).
본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열, 이와 같은 DNA 서열로 구성된 발현 벡터, 이와 같은 발현 벡터에 의해 형질감염 또는 형질 전환된 숙주세포를 제공한다.
또 다른 특징에서, 본 발명은 제1 및 제2 신규한 폴리펩티드 또는 신규한 폴리펩티드와 공지의 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 항원으로 구성된 융합 단백질을 제공한다.
또 다른 특징 내에서, 본 발명은 적어도 한 개의 신규한 폴리펩티드 또는 이와 같은 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 및 제약학적으로 수용 가능한 담체로 구성된 제약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 한 개의 상기 폴리펩티드, 비-특이적인 면역 증폭제로 구성된 백신을 제공하는데, 이때 백신은 이와 같은 폴리펩티드를 인코드하는 적어도 한 개의 DNA 서열 및 비-특이적인 면역 반응 증폭제로 구성될 수도 있다.
또 다른 특징에서, 면역 반응 증폭제와 함께 상기 한가지 이상의 폴리펩티드 효과량을 환자에 투여하는 것으로 구성된 환자에서 보호성 면역성을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 특징에서, 환자에서 결핵을 감지하는 방법 및 진단 키트를 제공한다. 한 구체에에서, 이 방법은 환자의 피부 세포를 하나이상의 상기 폴리펩티드와 접촉을 시키고, 환자의 피부에서 면역반응을 감지하는 것으로 구성된다. 제 2 구체예에서, 생물학적 샘플을 적어도 하나의 상기 폴리펩티드와 접촉시키고, 폴리펩티드에 결합을 할 수 있는 항체가 샘플내에 존재하는 지를 감지하여, 생물학적 샘플에 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된다. 적절한 생물학적 샘플에는 전체 혈액, 가래, 혈청, 혈장, 타액, 척수 및 뇨를 포함한다.
환자의 피부 세포에 폴리펩티드를 접촉시킬 수 있는 장치에 상기 하나이상의 폴리펩티드가 복합된 것으로 구성된 진단 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 감지물질과 복합된 신규한 폴리펩티드로 구성된 진단 키트를 제공한다.
또 다른 특징에서, 본 발명은 전술한 폴리펩티드에 결합하는 (다클론성 및 단클론성) 항체 및 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는데 이를 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 항원에 대한 비-특이적인 면역반응을 강화시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 이와 같은 방법은 다음에서 선택된 성분으로 구성된 조성물을 투여하는 것인데; (a) 지방을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; (b) 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; (c) 지방을 제거하고, 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; (d) 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물. 제 2 구체예에서, 방법은 항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드를 투여하는 것으로 구성되는데, 이때 항원은 다음에서 선택된다; (a) 서열 번호: 114, 117, 118; (b) 서열 번호 : 114, 117, 118의 서열에 적어도 97% 상동성을 가지는 서열.
또 다른 특징에서, 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 및 지질을 제거하고 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 에서 선택된 성분으로 구성된 조성물, 이와 같은 성분으로 구성된 백신 및 이와 같은 조성물 및 백신을 환자에서 보호성 면역을 유도하는데 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 이와 같은 특징 및 다른 특징은 다음의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 분명하게 나타난다. 여기에서 언급을 하는 모든 문헌은 전문을 참고자료로 제공한다.
본 발명은 일반적으로 감염성 질환을 감지, 치료 및 예방하는 것에 관계한다. 특히, 본 발명은 (Mycobacterium tuberculosis) 및 미코박테리움 아비붐(Mycobacterium avium)을 포함하는 결핵균속 감염을 치료하는 화합물 및 그 방법에 관계한다. 본 발명은 또한 비-특이적인 면역 반응 증폭제 역할을 하는 화합물 및 이와 같은 증폭제를 감염성 질환에 대한 백신제조 또는 면역치료제에서 어쥬번트 및 면역 질환 및 암의 특정 치료에 사용하는 용도에 관계한다.
도 1A, 1B는 살아있는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) H37Rv으로 감염을 시키기 전에 증기멸균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 분절안된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 쥐에 면역 주사하여 보호효과를 설명하는 것이다.
도 2A, B는 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 배양 여과물의 성분을 나타낸 것이다.
도 3은 미코박테리움 보비스(M. bovis), 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis), 미코박테리움 레프라(M. leprae)와 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 얻은 항원 85A 단백질 서열을 비교한 것이다.
도 4A(i) - (iv)는 증기살균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 10㎍, 100㎍, 1㎎와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 분절안된 배양 여과물 75㎍의 비-특이적인 면역 증폭 효과를 설명하는 것이다. 도 4B(i)-(ii)는 각각 증기살균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 비-특이적인 면역 증강효과를 설명한다. 도 4C(i)는 전체 증기살균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 비-특이적인 면역 증폭 효과를 설명한다. 도 4C(ii)는 당지질은 제거하고 단백질은 SDS로 추출한 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 비-특이적인 면역 증폭 효과를 설명한다. 도 4C(iii)는 도 4C(ii)의 준비물의 어쥬번트 효과가 단백질분해효소 프로네이즈로 처리를 하면 파괴된다는 것을 설명한다. 도 4D는 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도4D(i)), 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis (도4D(ii)), 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG(도4D(iii)), 미코박테리움 프라이(M. phlei(도4D(iv)), 미코박테리움 스메가마티스(M. smegmatis(도4D(v))의 비-특이적인 면역 증폭 효과를 설명하는 것이다.
도 5는 지질을 제거한 그리고 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도한 SDS-추출한 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 결과를 보여준다.
도 6은 SDS-추출한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질에서 다른 분자량 부분의 비-특이적 면역 증폭 효과를 설명한다.
도 7은 SDS-추출한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질에서 다른 pI 부분의 비-특이적 면역 증폭 효과를 설명한다.
도 8은 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 냉동 건조한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)("지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)라고도 칭함"), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질에 의한 IL-12 유도를 설명한다.
도 9에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 재조합 단백질, 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 지질을 제거하고 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)("지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)라고도 칭함"), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질 및 리포폴리사카라이드를 여러 가지 다른 농도로 C57BL-6 복막 대식세포(도 9A); BALB/C 복막 대식세포(도 9B); C3H/HeJ 복막 대식세포(도9C)에서의 인터페론-감마 생산을 자극하는 것을 설명한다.
전술한 것과 같이, 본 발명은 일반적으로 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 아비붐(M. avium)을 포함하는 결핵균 감염을 예방, 치료 및 진단하는 조성물 및 방법에 관계한다.
결핵균 감염 특히 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)에 대한 면역 반응을 밝히기 위한 상당한 연구 노력을 하여왔다. 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 면역성에 주요 영향물질로 대식세포가 작용하는 것으로 알고 있었는데, T 세포가 이와 같은 면역성에 주요 유도물질이다. 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)로부터 보호하는데 T 세포의 주요 역할은 AIDS 환자에서 흔히 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)가 발생되는 것으로 설명을 할 수 있는데, 그 이유는 사람 면역결핍 바이러스(HIV)와 CD4 T 세포의 고갈이 연합되어 있기 때문이다. 미코박테리움에 반응성이 있는 CD4 T 세포는 감마-인터페론(IFN-γ)의 강력한 생산물질로써, 이는 쥐에서 항-미코박테리움 효과를 가지는 대식세포를 자극한다. 사람에서 IFN-γ의 역할은 이직 분명하지는 않지만, 연구에 따르면, 1,25-디하이드록시-비타민 D3 단독으로 또는 IFN-γ 및 종양 괴사 인자-알파와 연합하여 사람의 대식세포를 자극하여 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)의 감염을 방지한다. 또한, IFN-γ은 사람의 대식세포를 자극하여 1,25-디하이드록시-비타민 D3을 만들게 하는 것으로 알려져있다. 유사하게, IL-12는 미코박테리움 튜베르큘로시스감염에 저항을 자극하는 역할을 하는 것으로 보인다. CD4+T 세포와 대식세포의 또 다른 특징은 병인균에 감염된 세포를 죽일 수 있는 CD8+세포독성 T세포를 활성화시키는 능력이 있다는 것이다. CD8+T세포는 대식세포 및 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)가 머무는 다른 세포를 죽인다. 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 감염의 면역학에 대해서는 Chan and Kaufmann in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994을 참고로 복습을 할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 적어도 한가지 면역원 부분 또는 이의 변이체로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 폴리펩티드는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)에 노출된 개인의 T 세포 증식을 자극하고 또는 T세포로부터 인터페론 감마 분비를 자극한다. 특정 구체예에서, 신규한 폴리펩티드는 가용성 미코박테리움 바카이(M. vaccae)항원의 면역원 부분으로 구성된다. 이때, "가용성 미코박테리움 바카이(M. vaccae)항원"은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물에 있는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 고유 단백질이다. 여기에서 사용하는 것과 같이, "폴리펩티드"는 전체 길이의 단백질(가령, 항원)을 포함하는 임의 길이의 아미노산 잔기를 포함하는데, 이때 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다. 따라서, 상기 항원중 한 개의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드는 전체 면역원 부분으로 구성될 수 있고 또는 추가 서명을 포함할 수 있다. 추가 서열은 고유 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도될 수 있고 또는 이형의 서열이 될 수 있는데, 이 서열은 면역원이 될 수도 있으나 반드시 그러할 필요는 없다.
여기에서 사용하는 것과 같은 "면역원"이란 사람 또는 환자의 생물학적 샘플에서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 말한다. 특히, 면역원 항원은 T 세포, NK 세포, B 세포, 대식세포에서 선택된 하나이상의 세포로 구성된 생물학적 샘플에서 세포 증식, 인터루킨-12 생산 또는 인터페론-감마 생산을 자극할 수 있고, 이때 세포는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)-면역 개체에서 유도한다. 하나이상의 미코박테리움 바카이(M. vaccae)항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드는 일반적으로 결핵을 감지하거나 환자에서 결핵에 대한 보호성 면역성을 유도하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 이와 같은 상기 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 여기에서 사용한 것과 같이, "변이체"는 본 발명의 서열에 적어도 50%, 적절하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 동일성을 나타내는 임의 서열을 포함한다. 가장 적절하게는 "변이체"는 신규한 서열과 적어도 99% 동일한 임의 서열이 된다. DNA 서열에 대한 동일성은 컴퓨터 연산 FASTA(version 2.0u4, February 1996; Pearson W. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988)을 이용하여 측정을 하고, 해독된 DNA 서열에 대한 동일성 확률은 컴퓨터 연산 TBLASTX을 이용하여 측정을 하고, 단백질 서열에 대한 동일성 확률은 BLASTP(Altschul, S. F. et al. J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990)을 이용하여 측정을 한다. 따라서, "변이체"용어에는 가능성에 의한 일치를 발견하는 확률(smallest sum probability)은 상기 테스트에 의해 특정하였을 경우에 약 1% 미만인 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 단백질의 N-단부에는 시그날(또는 리더)서열에 결합되어 있을 수 있는데, 이는 단백질 이전에 관계하는 것으로 동시에 해독되거나 나중에 해독된다. 폴리펩티드에는 또한 폴리펩티드(poly-His)의 합성, 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위한 또는 고형 서포터에 폴리펩티드를 잘 결합시키도록 하기위한 링커 또는 다른 서열이 결합되어 있을 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드에는 이뮤노글로블린 Fc 부분이 결합되어 있을 수 있다.
일반적으로 미코박테리움 바카이(M. vaccae)항원 및 이와 같은 항원을 인코드하는 DNA 서열은 다양한 공정을 이용하여 준비할 수 있다. 예를 들면, 가용성 항원을 하기에서 설명하는 것과 같이, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 분리할 수 있다. 발현 벡터에 항원을 인코드하는 DNA 서열을 삽입하고, 적절한 숙주에서 항원을 발현시켜 재조합적으로 항원을 생산할 수도 있다. 당업자에게 공지된 임의 발현 벡터를 이용할 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터로 형질변환 또는 형질감염된 임의 적절한 숙주 세포에서 발현을 실행할 수 있다. 적절한 숙주 세포로는 원핵세포, 이스트 및 고등 진핵 세포를 포함한다. 바람직하게는 이용되는 숙주세포는 대장균(E. coli), 결핵균, 곤충, 이스트 또는 포유류 세포주 가령 COS 또는 CHO등이 된다. 이와 같은 방법으로 발현된 DNA 서열은 자연 발생 항원, 자연 발생 항원의 일부분 또는 이의 다른 변이체를 인코드할 수 있다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원을 인코드하는 DNA 서열은 분리한 가용성 항원의 부분적인 아미노산 서열에서 유도한 축중(degenerate) 올리고뉴클레오티드에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열에서 적절한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 적절한 축중 올리고뉴클레오티드는 고안 합성할 수 있으며, 스크리닝 방법은 Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989을 참고로 한다. 하기에서 설명하는 것과 같이, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 핵산 프로브를 분리한다. 라이브러리 스크린은 분리된 프로브를 이용하여 실행할 수 있다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원을 인코드하는 DNA 분자는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원에 대해 특이적으로 형성된 항-혈청(가령, 토끼 또는 원숭이)과 적절한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 발현 라이브러리를 스크리닝하여 분리할 수 있다.
준비하는 방법에 관계없이, 여기에서 설명하고 있는 항원은 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 가진다. 좀더 구체적으로는 항원은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)면역 개체에서 유도한 T 세포, NK 세포, B 세포 또는 대식세포에서 세포 증식 또는 사이토킨 생산(가령, 인터페론-감마 또는 인터페론-12 생산)을 유도하는 능력이 있다. 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)면역 개체는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)에 대해 효과적인 T 세포 반응을 가지고 있어서, 결핵 발생에 저항성을 가지는 것으로 간주되는 개인을 말한다. 이와 같은 개인은 결핵 단백질(PPD)에 대한 피부 내 테스트반응에 강한 양성(가령, 10㎜이상 경화된 경우), 결핵 감염의 임의 증상이 없는 것으로 확인할 수 있다.
항원에 대한 면역 반응을 평가하는데 이용할 수 있는 세포 형태를 선택하는 것은 원하는 반응에 따라 달라진다. 가령, 인터루킨-12 생산은 B 세포 또는 대식세포를 포함하는 준비물을 이용하여 평가할 수 있다. 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)면역 개체로부터 유도한 T세포, NK 세포, B세포 및 대식세포는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 준비할 수 있다. 예를 들면, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs) 준비물은 추가 성분 세포를 분리하지 않고도 이용할 수 있다. PBMCs는 FicollTM(Winthrop Laboratories, NY)을 이용하여 밀도 원심분리에 의해 준비할 수 있다. 여기에서 설명하는 검사에 이용되는 T 세포는 PBMCs에서 바로 정제할 수 있다. 또는 결핵균 단백질에 대한 T 세포주 반응성 또는 개별 결핵균속 단백질에 반응성이 있는 T세포 클론을 이용할 수 있다. 이와 같은 T 세포 클론은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)-면역 개체에서 얻은 PBMCs를 2-4주간 결핵균 단백질로 배양을 하여 만들 수 있다. 이로써 결핵균 단백질-특이적인 T 세포만을 연장시켜 이와 같은 세포만으로 이루어진 세포주가 된다. 이들 세포를 당분야에 공지된 방법을 이용하여 클론시키거나 개별 단백질을 이용하여 테스트를 하여 좀더 정확하게 개별 T 세포 특이성을 정의할 수 있다. 하기에서 설명하는 과정을 이용하여 T 세포, NK 세포, B 세포 또는 대식세포에서 세포 증식 또는 사이토킨 생산을 위한 검사를 실행할 수 있다.
일반적으로, 면역원성 항원은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)-면역 개체의 적어도 25%에서 유도된 T 세포, NK 세포, B 세포 또는 대식세포에서 세포 증식 또는 사이토킨 생산(가령, 인터페론-감마 또는 인터페론-12 생산)을 자극하는 항원이다. 이들 면역원성 항원가운데, 우수한 치료요법적 성질을 가지는 폴리펩티드는 상기 검사에 반응하는 비율 및 반응이 측정된 개체의 비율에 근거하여 구별할 수 있다. 또한, 우수한 치료요법적 성질을 가지는 항원은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)-면역이 없는 개체의 25%이상에서 유도한 세포로부터 in vitro 상태에서 세포 증식 또는 사이토킨 생산을 자극할 수 없고 따라서 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)-반응성 세포로 인하여 비-특이적인 반응이 제거된다. 따라서, 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)-면역 개체(다른 개체로부터 얻은 세포 준비물에서 반응 빈도가 낮은)로부터 T세포, NK세포, B세포 또는 대식세포 준비물에 상당비율로 반응을 유도하는 이들 항원은 우수한 치료 성질을 가진다.
우수한 치료요법적 성질을 가지는 항원은 백신으로 투여하였을 경우에 실험동물에서 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 감염 또는 다른 결핵균 감염의 심각성을 감소시키는 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 하기에서는 실험동물에서 이용할 수 있는 적절한 백신 물질에 대해 설명을 한다.
우수한 진단 성질을 가지는 항원은 일반적으로 활성 결핵을 가지는 개체에서 실행된 피부내 테스트에 대한 반응을 유도하나, 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)에 감염되지 않은 개체에서 실행한 테스트에서는 반응을 유도하지 않는 능력에 기초하여 확인을 할 수 있다. 피부 테스트는 일반적으로 하기에서 설명하는 것과 같이 행해지는데, 적어도 5㎜ 정도의 경화 양성 반응을 가진다.
여기에서 설명하는 것과 같은 항원의 면역원성 부분은 Paul. Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, pp.243-247에서 요약한 것과 같은 공지의 기술을 이용하여 준비하고, 확인할 수 있다. 이와 같은 기술에는 면역원성 성질에 대한 고유 항원의 폴리펩티드 부분을 스크리닝하는 것을 포함한다. 여기에서 설명하는 대표적인 증식 및 사이토킨 생산 검사를 이 스크리닝에 이용할 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성 부분은 이와 같은 검사에서 전체 길이의 항원에 의해 발생되는 것과 실제 유사한 면역 반응(가령, 세포 증식, 인터페론-γ생산 또는 인터루킨-12 생산)을 만든다. 환언하면, 항원의 면역원성 부분은 여기에서 설명을 하는 모델 증식 검사에서 전체 길이의 항원에 의해 유도되는 증식의 적어도 약 20%, 적절하게는 약 65%, 가장 적절하게는 약 100%를 만들 수 있다. 항원의 면역원성 부분은 여기에서 설명을 하는 모델 증식 검사에서 전체 길이의 항원에 의해 유도되는 인터페론-감마 또는 인터루킨-12 생산의 적어도 약 20%, 적절하게는 약 65%, 가장 적절하게는 약 100%를 만들 수 있다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 일부 및 다른 변이체는 합성 또는 재조합 방법에 의해 만들 수 있다. 약 100개 아미노산 이하, 일반적으로 약 50개 아미노산 이하의 합성 폴리펩티드는 당분야자가 공지의 기술을 이용하여 만들 수 있다. 가령, 이와 같은 폴리펩티드는 Merrifield 고형상 합성 방법과 같은 상업적으로 이용할 수 있는 고형-상 기술을 이용하여 합성을 할 수 있는데, 이때 아미노산은 길어지는 아미노산에 연속하여 첨가할 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963). 자동화된 폴리펩티드의 합성 장비는 Perkin Elmer/Applied BioSystems, Inc(Foster City, CA)와 같은 시판되는 것을 이용할 수 있고, 제조업자의 지시에 따라 작동할 수 있다. 올리고뉴클레오티드-부위 특이적인 돌연변이발생과 같은 표준 돌연변이 기술을 이용하여 고유 항원의 변이체를 만들 수 있다. 절두형 폴리펩티드를 만들기 위해 표준 기술을 이용하여 DNA 서열의 일부를 제거할 수 있다.
일반적으로, 준비하는 방법에 무관하게, 여기에서 설명하는 폴리펩티드는 실제 순수한 형태로 만든다. 바람직하게는 폴리펩티드는 적어도 약 80%, 좀더 바람직하게는 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수하다. 하기에서 설명하는 특정 구체예에서, 실제 순수한 폴리펩티드가 제약학적 조성물 또는 백신에 포함되어, 여기에서 설명하는 하나이상의 방법에 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 제1과 제2 신규한 폴리펩티드로 구성된 융합 단백질 또는 본 발명의 폴리펩티드와 38kD 항원과 같은 공지의 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 항원(in Andersen and Hansen, Infect. Immun. 57:2481-2488, 1989)으로 구성된 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질에는 또한 제1과 제2 폴리펩티드사이에 링커 펩티드를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질을 인코드하는 DNA 서열은 공지의 재조합 DNA 기술을 이용하여 적절한 발현 벡터내에 제1과 제2 폴리펩티드를 인코드하는 별개의 DNA 서열을 합체하여 만들 수 있다. 제 1 폴리펩티드를 인코드하는 DNA서열의 3' 말단은 펩티드 링커를 사용하여 또는 링커없이 제 2 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열의 5'말단에 결찰시켜 서열의 리딩 프레임이 상안에 있게되어 두 개 DNA 서열의 mRNA 해독을 하여 한 개 융합 단백질로 하고, 이 융합 단백질은 제1과 제2 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하고 있다.
펩티드 링커 서열을 이용하여, 각 폴리펩티드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴드할 수 있도록 충분한 거리로 제1과 제2 폴리펩티드를 떨어지게 한다. 이와 같은 펩티드 링커 서열은 당분야에 공지의 표준 기술을 이용하여 융합 단백질에 포함시킬 수 있다. 적절한 펩티드 링커 서열은 다음의 인자에 근거하여 선택할 수 있는데; (1) 유연성있는 연장된 모양을 채택하는 능력; (2) 제1과 제2 폴리펩티드에 있는 기능을 하는 에페토프와 상호작용을 할 수 있는 제 2 구조를 채택하는 능력; (3) 폴리펩티드에서 기능을 하는 에피토프와 반응을 할 수 있는 소수성 또는 전하를 가지는 잔기가 없는 것. 적절한 펩티드 링커 서열에는 Gly, Asn, Ser 잔기를 포함한다. Thr, Ala와 같은 중성 아미노산에 근접한 다른 아미노산이 링커 서열에 이용될 수 있다. 링커로써 유용하게 이용을 할 수 있는 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 및 미국 특허 4,935,233; 4,751,180에서 상술하는 것을 포함한다. 링커 서열은 길이가 1 내지 약 50개 아미노산 잔기가 된다. 제1과 제2 폴리펩티드에 비-필수적인 N-말단 아미노산 부분을 가지고 있어, 기능적 도메인을 분리할 수 있고, 공간적인 방해가 없는 경우에는 펩티드 링커 서열이 필요없다.
융합 단백질을 인코드하는 결찰된 DNA를 당분야에 공지된 기술을 이용하여 절한 발현 시스템안에 클론시킨다.
또다른 특징에서, 본 발명은 하나이상의 신규 폴리펩티드 또는 융합 단백질(또는 이와 같은 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 인코드하는 DNA 분자)을 이용하여 환자에서 결핵에 대해 보호성 면역을 유도하는 방법을 제공한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "환자"는 임의 온혈 동물 적절하게는 사람을 말한다. 환자는 질병에 걸릴수도 있고, 감지가능한 질병 또는 감염이 없을 수도 있다. 환언하면, 보호성 면역을 유도하여 결핵을 예방하거나 치료를 할 수 있다.
이에 대해서, 제약학적 조성물 또는 백신에는 일반적으로 융합 단백질 또는 DNA 분자가 존재한다. 제약학적 조성물은 하나이상의 폴리펩티드로 구성되는데, 각 조성물에는 하나이상의 상기 서열(또는 이의 변이체) 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 백신에는 하나이상의 상기 폴리펩티드와 어쥬번트 또는 리포좀과 같은 비-특이적인 면역 반응 증폭제로 구성되는데, 이때 증폭제에 폴리펩티드가 결합하게 된다. 이와 같은 제약학적 조성물 및 백신에는 상기 논의된 바와 같이 융합 단백질에 결합하게 되는 또는 별도의 폴리펩티드에 존재하게 되는 다른 결핵균 항원을 포함할 수 있다.
또는, 본 발명의 백신에는 전술한 것과 같은 하나이상의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA을 포함하고 폴리펩티드는 즉시 생성된다. 이와 같은 백신에서 DNA는 당분야에 공지된 다양한 수송 시스템내에 존재할 수도 있는데, 예를 들면 핵산 발현 시스템, 베균 및 바이러스성 발현 시스템을 포함한다. 적절한 핵산 발현 시스템에는 환자에서 발현하는데 필수적인 DNA 서열(예를 들면 적절한 프로모터 및 종료 시그날)을 포함한다. 박테리아 운반 시스템은 세포 표면에서 폴리펩티드의 면역원성 부분을 발현하는 세균(가령 Bacillus-Calmette-Guerrin)을 투여하는 것이다. 적절한 구체예에서, DNA는 바이러스성 발현 시스템(가령 백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 이용하여 도입시킬 수 있는데, 이는 비-병인성 또는 결손된 복제 컴피턴스 바이러스를 이용하는 것이다. 이와 같이 발현 시스템안에 DNA를 결합시키는 기술은 당분야에 공지되어 있다. Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 and reviewed by Cohen, Science 259:1691-1692, 1993에서 설명하는 것과 같이 DNA는 "naked"일 수도 있다. naked DNA의 수용을 증가시키기 위해서는 세포안으로 효과적으로 이송될 수 있는 생분해가능한 비드에 DNA를 코팅시키면 된다.
상기에서 설명하고 있는 DNA 백신은 본 발명의 폴리펩티드 또는 상기에서 설명한 38kD와 같은 공지의 결핵 항원과 동시에 또는 연속적으로 투여할 수도 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA를 투여한 후에, 항원을 투여하여 백신의 보호성 면역 효과를 강화시킨다.
개인별로 투여 경로 및 빈도, 약량등이 달라질 수 있고, BCG를 이용하여 면역주사하는데 현재 이용되는 것과 비슷하다. 일반적으로 제약학적 조성물 및 백신은 주사(가령, 경피, 근육, 정맥 또는 피하 주사), 비강(흡입에 의해) 또는 구강으로 투여할 수 있다. 1-36주간 1 내지 3 약량이 투여될 수 있다. 적절하게는 3-4개월 간격으로 3약량이 투여되고, 그 다음에는 주기적으로 부스터(booster) 투여를 할 수 있다. 개인 환자에 적합한 다른 프로토콜을 이용할 수도 있다. 전술한 것과 같이 투여를 할 경우에, 적절한 약량은 적어도 1-2년 동안 환자를 결핵균 감염으로부터 보호할 수 있도록 충분한 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드 또는 DNA의 양을 말한다. 일반적으로 약량에 있는 폴리펩티드의 양은 숙주 체중㎏당 약 1pg 내지 약 100㎎, 적절하게는 약 10pg 내지 약 1㎎, 가장 적절하게는 약 100pg 내지 약 1㎍ 범위가 된다. 적절한 약량 범위는 환자의 체구에 따라 다양하게 되는데, 일반적으로 약 0.1㎖ 내지 약 5㎖범위가 된다.
본 발명의 제약학적 조성물에는 당분야에 공지된 임의 적절한 담체를 이용할 수 있는데, 담체 형태는 투여 방식에 따라 달라진다. 피하 주사와 같은 장관외 투여의 경우에, 담체는 적절하게는 물, 염, 알코올, 지방, 왁스 및 완충액으로 구성된다. 경구 투여의 경우에는 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아레이트 마그네슘, 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로오즈, 포도당, 슈크로즈 및 탄산 마그네슘등과 같은 고형 담체를 이용할 수도 있다. 생분해가능한 미소구(가령, 폴리라틱 갈락티드)등을 본 발명의 제약학적 조성물의 담체로 이용할 수도 있다. 적절한 생분해가능한 미소구는 미국 특허 4,897,268; 5,075,109에서 설명을 하고 있다.
본 발명의 백신에 임의의 다양한 어쥬번트를 이용하여, 비특이적인 면역반응을 강화시킬 수 있다. 대부분의 어쥬번트에는 수산화 알루미늄 또는 미네랄 오일과 같은 신속한 대사과정으로부터 항원을 보호하도록 고안된 물질; 그리고 하기에서 논의되는 것과 같이, 지질 A(lipid A), 보로데텔라 페루투시스(Bordetella pertussis), 미코박테리움 튜베르큘로시스(M.tuberculosis) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 같은 비-특이적인 면역 반응 자극물질을 포함한다. 적절한 어쥬번트로는 플루언트 인컴플리트 어쥬번트(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 플루언트 컴플리트 어쥬번트(Freund's Complete Adjuvant)(Difco Laboratories, Detroit, MI), 머랙 어쥬번트(Merck Adjuvant 65)(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ)등이 시판되고 있다. 다른 적절한 어쥬번트에는 알룸, 생분해가능한, 미소구, 모노포스포릴 리피드 A, Quil A등을 포함한다.
또 다른 특징에서, 본 발명은 피부 테스트를 이용하여 결핵을 진단하기 위해 상기 설명하고 있는 하나이상의 폴리펩티드를 이용하는 방법을 제공한다. 여기에서 사용되는 바와 같이, "피부 테스트"는 환자에서 직접 실행하는 것으로써, 상기에서 설명하는 하나이상의 폴리펩티드를 피부 내로 투여한 후에, 지연된 형태의 과민성(DTH) 반응(가령, 부품, 빨게지거나 또는 피부염)을 측정하는 것이다. 적절하게는 반응은 주사후 적어도 48시간 바람직하게는 48-72시간 후에 측정을 한다.
DTH 반응은 세포-중개된 면역 반응으로 시험 항원(가령, 이용되는 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 면역원성 부분)에 이미 노출된 환자에게서 크다. 반응은 룰러(ruler)를 이용하여 시각적으로 측정을 할 수 있다. 일반적으로, 약 0.5㎝ 이상, 바람직하게는 직경이 1.0㎝인 경우에 결핵 감염을 알리는 양성 반응이 된다.
피부 테스트에 이용하는 경우에, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 설명한 것과 같이 폴리펩티드, 생리학적으로 수용가능한 담체로 구성된 제약학적 수용가능한 조성물의 형태로 조제한다. 이와 같은 조성물은 일반적으로 하나이상의 폴리펩티드를 약 1㎍ 내지 100㎍, 적절하게는 10㎍ 내지 50㎍을 0.1㎖ 용적 안에 포함한다. 적절하게는 이와 같은 제약학적 조성물에 이용되는 담체는 페놀 또는 Tween 80TM과 같은 보존제를 포함하는 염 용액이 된다.
적절한 구체예에서, 피부 테스트에 이용되는 폴리펩티드는 반응하는 시간동안에 주사부위에 남아 있을 수 있는 충분한 크기가 된다. 일반적으로, 길이가 적어도 9개인 아미노산으로 된 폴리펩티드이면 충분하다. 폴리펩티드는 또한 주사후 한 시간이내에 대식세포 또는 수지상 세포에의해 적절히 분해되어 T-세포에 제공된다. 이와 같은 폴리펩티드에는 상기 서열 또는 다른 면역원성 또는 비-면역원성 서열이 하나이상 반복된 것을 포함할 수 있다.
또 다른 특징에서, 상기 하나이상의 폴리펩티드 단독 또는 복합한 것을 이용하여 생물학적 샘플내에서 결핵균 감염을 감지하는 방법을 제공한다. 다중 폴리펩티드를 이용하는 구체예에서, 38kD 항원과 같이 여기에서 특징적으로 명기하지 않은 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 여기에서 이용되는 것과 같이, "생물학적 샘플"은 환자로부터 취한 임의 항체를 포함하는 샘플이다. 바람직하게는 샘플은 전체 혈액, 가래, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수 또는 뇨등이 된다. 좀더 적절하게는 샘플은 환자 또는 혈액 공급소에서 구한 혈액, 혈청, 혈장이 될 수 있다. 하기에서 설명하는 검사에서 폴리펩티드를 이용하여 예정된 절단값에 대해 샘플에서 폴리펩티드에 대한 항체의 유무를 결정한다. 이와 같은 항체가 존재한다는 것은 결핵 감염이 있다는 것을 의미한다.
한 가지 이상의 폴리펩티드를 이용하는 구체예에서, 이용된 폴리펩티드는 상보적인 것이 바람직하다(가령, 한가지 성분의 폴리펩티드는 또 다른 성분의 폴리펩티드에 의해 감지되지 않는 감염이 있는 샘플에서 감염을 감지할 수 있는 경향이 있다). 상보적인 폴리펩티드는 결핵균(Mycobacterium)에 감염된 것으로 알려진 환자들로부터 수득한 혈청 샘플을 평가하기 위해 개별적으로 각 폴리펩티드를 이용하여 상보적인 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 각 폴리펩티드로 샘플 테스트 양성(하기에서 설명하는 것과 같음)을 결정한 후에, 테스트하는 대부분의 샘플 또는 모든 샘플에서 감염을 감지할 수 있는 두 가지 이상의 폴리펩티드 복합물을 제조한다. 가령, 결핵에 감염된 개인으로부터 혈청의 25-30%는 임의 단일 단백질 가령, 상기에서 설명하는 38kD 항원에 대한 항체에 음성이다. 상보적인 폴리펩티드는 따라서, 38kD 항원과 복합사용하여 진단 테스트의 감응성을 개선시킨다.
당분야에서는 샘플내에 항체를 감지하는 하나이상의 폴리펩티드를 이용하는 다양한 검사 포맷이 공지되어 있다(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 적절한 구체예에서, 검사는 샘플에 있는 항체에 결합하고 항체를 제거하는 고형 서포트에 고정된 폴리펩티드를 이용하는 것과 관계있다. 결합된 항체는 리포터 기를 포함하는 감지 시약을 이용하여 감지할 수 있다. 적절한 감지 시약에는 항체/폴리펩티드 복합체와 리포터 기로 라벨된 자유 폴리펩티드(가령, 반-경쟁성 검사)에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 또는, 경쟁성 검사를 이용할 수 있는데, 폴리펩티드에 결합하는 항체는 리포터기로 라벨을 할 수 있고, 이는 샘플과 항원을 배양한 후에 고정된 항원에 결합을 할 수 있다. 샘플에 있는 성분이 폴리펩티드에 라벨된 항체가 결합을 방해하는 정도는 고정된 폴리펩티드에 샘플의 반응성 정도를 나타낸다.
고형 서포트는 항원이 부착할 수 있는 임의 고형 물질이 될 수 있다. 적절한 물질은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 고형 테스트는 미량적정 플레이트 또는 니트로셀룰로오즈 또는 다른 적절한 막에서 테스트가 잘 된다. 또는 서포트는 유리, 유리섬유, 라텍스 또는 폴리스테린 또는 폴리비닐클로라이드와 같은 플라스틱 재질과 같은 비드 또는 디스크가 된다. 서포트는 미국 특허 5,359,681에서 공지된 것과 같은 자석 입자 또는 광섬유 센서등이 될 수 있다.
폴리펩티드는 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 고형 서포트에 결합될 수 있다. 본 발명의 내용에서, "결합된"이란 용어는 흡착과 같은 비공유결합 및 공유 결합을 말하는데, 이는 서포트에 있는 기능기와 항원간에 EH는 교차 결합제에 의해 연결되는 것을 말한다. 흡착에 의해 미량적정 판 또는 막에 결합되는 것이 바람직하다. 이와 같은 경우에, 적정 시간동안에 고형 서포트와 폴리펩티드를 포함하는 완충액을 접촉시켜 흡착이 이루어질 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양해질 수 있는데, 일반적으로 약 1시간 내지 1일이 된다. 일반적으로 약 10ng 내지 1㎍, 바람직하게는 100ng범위의 폴리펩티드와 플라스틱 미량 적정판의 웰과 접촉하는 시간은 적정량의 항원이 결합하는데 충분한 시간이 된다.
고형 서포트에 폴리펩티드의 공유 결합은 일반적으로 폴리펩티드에 있는 하이드록실 또는 아미노기와 같은 기능기와 서포트에 반응할 수 있는 이가기능기 시약과 우선 서포트를 반응시켜 이루어진다. 예를 들면, 폴리펩티드는 벤조퀴논을 이용한 적절한 고분자 코팅을 가지는 서포트에 결합되거나 또는 폴리펩티드에 있는 활성 수소와 아민과 서포트에 있는 알데히드기의 응축에 의해 결합될 수 있다(Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13).
특정 구체예에서, 검사는 효소-연결된 면역흡착 검사(ELISA)이다. 이 검사는 고형 서포트에 고정된 폴리펩티드 항원과 샘플을 우선 접촉시키고, 샘플내에 있는 폴리펩티드에 대한 항체가 고정된 폴리펩티드에 결합하도록 한다. 결합안된 샘플은 고정된 폴리펩티드로부터 제거하고, 고정된 폴리펩티드-항체 복합체에 결합할 수 있는 감지 시약을 첨가한다. 고형 서포트에 결합되어 남아 있는 감지 시약의 양은 특정 감지 시약에 적절한 방법을 이용하여 결정을 할 수 있다.
좀더 구체적으로는, 폴리펩티드가 전술한 것과 같이 일반 서포트에 결합하면, 서포트에 남아있는 단백질 결합 부위는 일반적으로 차단된다. 당분야에 공지된 소혈청 알부민 또는 Tween 20TM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 같은 공지의 임의 적절한 차단 물질을 이용할 수 있다. 고정된 폴리펩티드는 샘플과 배양을 하고, 항체는 항원에 결합되도록 한다. 샘플은 배양하기 전에 인산 완충염(PBS)으로 적절의 희석을 한다. 일반적으로, 적절한 배양 시간 또는 접촉 시간은 결핵균(M. tuberculosis)감염된 샘플 내에 있는 항체의 존재를 감지하는데 충분한 시간이 된다. 적절하게는, 접촉 시간은 결합된 항체와 결합안된 항체간에 평형이 적어도 95%가 되는 결합 수준을 얻는데 충분한 시간이 된다. 평형을 이루는데 필요한 시간은 시간에 따른 결합 수준을 검사하여 용이하게 결정을 할 수 있다. 실온에서, 약 30분 정도의 배양 시간이면 충분하다.
결합안된 샘플은 0.1% Tween 20TM을 포함하는 PBS와 같은 적절한 완충액으로 고형 서포트를 세척하여 제거할 수 있다. 그 다음 감지 시약은 고형 서포트에 첨가한다. 적절한 감지 시약은 고정된 항체-폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 임의 화합물이고 당분야에 공지된 다양한 수단중 한가지 방법을 이용하여 감지할 수 있다. 적절하게는 감지 시약에는 리포트 기에 공액될 수 있는 결합 시약(단백질 A, 단백질 G, 이뮤노글로블린, 렉틴 또는 자유 항원)을 포함한다. 적절한 리포트기에는 효소(양고추냉이 과산화효소), 기질, 공인자, 저해물질, 염료, 방사선 핵종, 발광기, 형광기 및 바이오틴등을 포함한다. 리포터기에 결합 물질을 공액시키는 것은 당분야에 공지의 방법을 이용한다. 통상적인 결합제를 구입하여 많은 시판되는 원료로부터 다양한 리포터기에 공액시킨다(Zymed Laboratories, San Francisco, CA, and Pierce, Rockford, IL).
감지 시약은 결합된 항체를 감지하는데 충분한 시간동안 고정된 항체-폴리펩티드 복합체와 배양을 시킨다. 적절한 시간은 제조업자의 지시 또는 시간에 따른 결합 수준을 검사하여 일반적으로 결정을 할 수 있다. 그 다음 결합안된 시약은 제거하고, 결합된 감지 시약은 리포터 기를 이용하여 감지한다. 리포터 기를 감지하는데 이용되는 방법은 리포터기의 특징에 따라 달라진다. 방사능활성기의 경우에, 신틸레이션 카운터 또는 자기방사그래프 방법이 일반적이다. 분광광도 방법은 염료, 발광기 및 형광기를 감지하는데 이용된다. 바이오틴은 상이한 리포터기(흔히 방사능활성 또는 형광기 또는 효소)에 결합된 아비딘을 이용하여 감지한다. 효소 리포터 기는 기질(일반적으로 특정 시간에)을 첨가하고, 반응 생성물의 분광광도 또는 다른 분석을 이용하여 감지할 수 있다.
샘플에서 항-결핵균 항체의 유무를 결정하기 위해, 고형 서포트에 결합되어 남아 있는 리포터기에서 감지되는 시그날은 일반적으로 예정된 차단(cut-off) 값을 가지는 시그날에 비교한다. 적절한 한 구체예에서, 차단 값은 감염안된 환자의 샘플과 고정된 항원을 배양하였을 경우에 수득되는 평균 시그날이다. 또 다른 적절한 구체예에서, 차단 값은 Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pp. 106-107 방법에 따라 Receiver Operator Curve을 이용하여 결정을 할 수 있다. 일반적으로, 예정된 차단 값 이상의 시그날은 결핵 감염에 양성으로 간주한다.
신속한 관통(flow-through) 또는 스티립 테스트 포맷에서 검사를 실행할 수 있는데, 이때 항원은 니트로셀룰로오즈와 같은 막에 고정시킨다. 관통 테스트에서, 샘플내에 있는 항체는 샘플이 막을 통과할 때 고정된 폴리펩티드에 결합한다. 감지 시약을 포함하는 용액이 막을 통과할 때 감지 시약(가령 단백질 A-콜로이드성 금)이 항체-폴리펩티드 복합체에 결합을 한다. 결합된 감지 시약의 감지는 상기 설명한 것과 같이 실행한다. 스트립 테스트 포맷에서 폴리펩티드가 결합된 막의 한 단부는 샘플을 포함하는 용액에 잠긴다. 샘플은 감지 시약을 포함하는 부분을 통하여 막을 따라 이동하여 고정된 폴리펩티드에 까지 도달한다. 폴리펩티드에서 감지 시약의 농도는 샘플에 항-결핵균 항체의 존재를 나타낸다. 일반적으로, 이 부위에서 감지 시약의 농도는 시각적으로 볼 수 있는 라인과 같은 패턴을 발생한다. 이와 같은 패턴이 없는 경우는 음성을 나타낸다. 일반적으로, 생물학적 샘플에 상기에서 설명한은 ELISA에서 양성 시그날을 발생하는데 충분한 양의 항체 수준을 포함하는 경우에 시각적으로 구별할 수 있는 패턴을 만드는 정도의 막에 고정된 폴리펩티드의 양이 선택된다. 바람직하게는 막에 고정된 폴리펩티드의 양은 약 25ng 내지 1㎍, 바람직하게는 약 50ng 내지 500ng이 된다. 이와 같은 테스트는 일반적으로 환자의 혈청 또는 혈액 소량(가령 한 방울)으로도 실행할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 이용하는데 적합한 다수의 검사 프로토콜이 있다. 상기 설명은 예시에 불과하다.
본 발명은 또한 신규한 폴리펩티드에 대한 항체를 제공한다. 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술중 하나를 이용하여 준비할 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 이와 같은 한 가지 기술중에 하나에서, 항원성 폴리펩티드를 포함하는 이뮤노겐은 임의 다양한 포유류(가령, 쥐, 들쥐, 토끼, 양, 염소)에 우선 주사란다. 한가지 이상의 부스터 면역을 포함하는 예정된 과정에 따라 동물 숙주에 이뮤노겐을 주사하고, 동물의 피를 주기적으로 뽑는다. 적절한 고형서포트에 결합된 폴리펩티드를 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드에 특이적인 다클론성 항체는 이와 같은 항혈청으로부터 정제한다.
원하는 항원성 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체는 Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976의 기술을 이용하여 준비할 수 있다. 간략하게 설명을 하면, 이들 방법은 원하는 특이성(가령, 원하는 폴리펩티드와의 반응성)을 가지는 항체를 생산할 수 있는 불멸 세포주를 준비하는 것과 관계한다. 이와 같은 세포주는 전술한 것과 같이 면역주사를 맞은 동물에서 수득되는 췌장 세포에서 생산될 수 있다. 췌장 세포는 골수 세포 융합 짝과 융합하여 불멸화시킬 수 있는데, 바람직하게는 당분야에 공지의 기술을 이용하여 면역주사를 맞은 동물에 공조효과가 있는 것이다.
생성된 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 단일클론 항체를 분리해낼 수 있다. 도한, 다양한 기술을 이용하여 쥐와 같은 적절한 척추동물의 복강안으로 하이브리도마 세포주를 주사하여 결과를 강화시킨다. 그 다음 단클론 항체는 복수 또는 혈액으로부터 수득한다.
진단 테스트에 항체를 이용하여 상기에서 설명하는 유사한 검사 또는 당분야에 공지된 다른 기술을 이용하여 결핵균 항원의 존재를 감지할 수 있고, 이는 환자에서 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 같은 결핵균 감염을 감지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 시약은 상기 하나이상의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 또는 이의 하나이상의 부분으로 구성된다. 예를 들면, DNA 서열의 적어도 10개 연속 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 테스트의 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 이용할 수 있다. 유사하게, 해당 DNA 서열의 적어도 10개 연속하는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 이용하여 특정 서열에 하이브리드할 수 있다. PCR계 테스트 및 하이브리드 테스트에 대한 기술은 당분야에 공지된 것이다. 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 가래, 혈액, 혈청, 침, 뇌척수 또는 오줌과 같은 생물학적 샘플에 있는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 및 다른 결핵균 감염을 감지한다. 전술한 것과 같은 올리고뉴클레오티드로 구성된 DNA 프로브 또는 프라이머를 단독 또는 서로 복합하여 이용하거나 또는 전술한 것과 같은 38kD 항원과 같은 이미 확인된 서열과 복합하여 이용할 수 있다.
전술한 것과 같이, 효과적인 백신은 적어도 다른 두 가지 성분을 포함한다. 첫째는 항원으로 구성된 폴리펩티드인데, 이는 대식세포 또는 다른 항원-제공 세포에 의해 처리되고, CD4+T 세포 또는 CD8+T 세포에 대해 나타난다. 이들 항원은 면역 반응에 "특정" 표적을 형성한다. 백신의 제 2 성분은 항원이 결합하게 되는 어쥬번트 또는 리포좀과 같은 비-특이적인 면역 반응 증폭제가 된다. 어쥬번트는 구조적으로 무관한 화합물 또는 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증폭시킨다. 보로데텔라 페루투시스(Bordetella pertussis,), 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis), 미코박테리움 보비스(M. bovis) BCG와 같은 미생물로부터 몇가지 어쥬트 준비한다. 어쥬번트는 수산화알루미늄 또는 미네랄 오일과 같은 분해로부터 폴리펩티드를 보호하는 성분들을 포함할 수 있다. 백신의 항원성 성분에는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 같은 특정 병인균에 대한 면역 공갹을 하는 폴리펩티드를 포함하는데, 어쥬번트는 많은 상이한 백신 조제물에 광범위하게 이용될 수 있다. 특정 병인균 가령 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 특정 암은 공지의 세포 중개된 면역성인 T 세포에 의해 바로 면역 공격에 의해 효과적으로 억제될 수 있다. 폴리보바이러스와 같은 다른 병인균 역시 억제하기 위해 B 세포에 의해 생산되는 항체를 요구한다. 이와 같은 상이한 종류의 면역 공격(T 세포 또는 B 세포)는 Th1와 Th2로 불리는 상이한 부집단 CD4+T 세포에 의해 제어를 받는다. 어쥬번트의 원하는 성질은 CD4+T 세포의 Th1 또는 Th2 집단의 기능을 선택적으로 증폭시키는 기능이다. 하기 실시예 6에서 설명하는 것과 같이, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 이의 변형된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 어쥬번트 성질을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, "변형된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에는 지질을 제거한 미코박테리움 바카이, 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이, 지질을 제거하고 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae 이라고 칭함)을 포함한다. 또한, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원에 대한 면역 반응을 증폭시키고 뿐만 아니라 다른 원료에서 나온 항원에 대한 면역반응도 증폭시킨다. 따라서, 본 발명은 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물 또는 변형된 미코박테리움 바키아(M. vaccae)로 구성된 항원에 대한 면역 반응을 강화시키는 방법을 제공한다. 하기에서 설명하는 것과 같이, 추가 연구에서는 이와 같은 비-특이적인 면역 증폭 효과는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)에서 이미 확인된 열쇼크 단백질 65(GroEL)에 상동성을 가지는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 때문이다.
실시예 10에서 설명하는 것과 같이, 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 구성원에는 사이토킨 자극 성질을 가지는 것으로 밝혀졌다. 특히, 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 냉동건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-M. vaccae는 대식세포로부터 인커루킨 12(IL-12)의 생산을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 대식세포로부터 IL-12의 생산되는 것은 Th1 면역 반응의 자극을 강화시키는 것으로 알려졌다.
다음의 실시예는 설명을 위해 제공하는 것이나 이에 국한하려는 의도는 아니다.
실시예 1
결핵균에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 쥐에 면역 주사하였을 경우에 효과
이 실시예에서는 살아있는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)로 자극하기 전에 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 면역 주사하는 경우의 효과를 설명한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae (ATCC Number 15483))는 멸균 배지 90(이스트 추출물 2.5g/l; 트립톤, 5g/l; 포도당 1g/l)로 37℃에서 배양한다. 세포는 원심분리에 의해 수득하고, 포도당이 포함된 멸균 Middlebrook 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)로 옮기고 하루동안 37℃에서 배양한다. 배지는 그 다음 원심분리하여 세균을 펠렛화시키고, 배양 여과물은 제거한다. 세균 펠렛은 ㎖당 1010미코박테리움 바카이(M. vaccae)가 되도록 10㎎/㎖농도에서 인산완충염에 재현탁시킨다. 그 다음 세포 현탁액은 120℃에서 15분간 증기멸균시킨다. 배양 여과물은 0.45μM 필터를 통과시켜 멸균 병안으로 옮긴다.
도 1A에서 볼 수 있는 것과 같이, 쥐에 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 1㎎, 100㎍, 10㎍으로 면역 주사하고, 3주 후에 살아있는 미코박테리움 튜베르큘로시스 H37Rv 5×105CFU를 감염시킨다. 이 실시예에서, 감염 후 3 주 뒤에 췌장, 간, 폐 조직을 쥐에서 떼내어, 살아있는 바실라스를 결정한다(CFU로 결정). 면역주사안된 기준 쥐의 조직과 비교하여 바실러스의 수가 간, 폐 조직에서 2log정도 감소하였고, 췌장 조직에서는 1log 정도 감소하였다. 열에 의해 죽인 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tubercluosis) H37Rv로 면역 주사한 쥐에서는 살아있는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) H37Rv로 감염시킨 쥐에서와 같은 보호성 효과를 가지지 않는다.
도 1B에서는 쥐에 100㎍ 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 면역주사하고, 3주 후에 5×105CFU 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis ) H37Rv로 감염을 시켰는데, 상당한 보호효과를 볼 수 있다. 감염 후 3주 뒤에 쥐에서 췌장, 간, 폐 조직을 떼내어 살아있는 바실러스 수(CFU)를 측정한 결과, 면역주사안한 기준 쥐와 비교를 하였을 경우에 그 수가 약 1-2 log 감소되었다는 것을 알 수 있다.
실시예 2
미코박테리움 바카이 배양 여과물로부터 폴리펩티드를 정제 및 특징화
이 실시예에서는 배양 여과물에서 수득한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 가용성 단백질을 준비하는 것에 관계한다. 다른 언급이 없는 한, 다음의 실시예에 있는 모든 비율은 중량비를 나타낸다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae (ATCC Number 15483))는 37℃에서 Medium 90에 배양을 하였다. 세포는 원심분리에 의해 수득하고, 포도당이 포함된 멸균 Middlebrook 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)로 옮기고 하루동안 37℃에서 배양한다. 세포는 원심분리에 의하여 수득하고, 포도당이 있는 Middlebrook 7H9 배지에 옮겨 하루동안 37℃ 배양한다. 배지는 그 다음 원심분리하여(큰 세포는 남기고), 배양 여과물은 0.45μM 필터를 통과시켜 멸균 병안으로 옮긴다.
배양 여과물은 냉동건조에 의해 농축시키고, MilliQ 물에 재용해시킨다. 소량의 불용성 물질은 0.45μ막을 통하여 여과시켜 제거한다. 배양 여과물은 3,000kD 분자량 차단(MWCO) 막을 포함하고 있는 400㎖ Amicon 교반된 셀에서 막 여과에 의해 염을 제거한다. 압력은 질소 기체를 이용하여 50psi로 유지한다. 배양 여과물은 막 여과에 의해 반복적으로 농축시키고, 물로 희석하여 샘플의 전도율이 1.0 mS이하가 되도록 한다. 이 과정으로 샘플의 용적은 20ℓ에서 약 50㎖로 감소된다. Bradford 단백질 검사(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정한다.
염이 제거된 배양 여과물은 10mM Tris HCl 완충액 pH 8.0으로 균등화시킨 Q-Sepharose(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)(16×100㎜)컬럼에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분류한다. 폴리펩티드는 상기 완충액에서 0 내지 1.0M의 염화나트륨 선형 농도차를 이용하여 용출한다. 컬럼 용출물은 280㎚에서 모니터한다.
이온 교환 컬럼으로부터 용출되는 폴리펩티드 푸울은 3,000 MWCO을 포함하는 400㎖ Amicon 교반된 쎌에서 농축시킨다. 압력은 질소 기체를 이용하여 50psi에서 유지한다. 폴리펩티드는 막 여과에 의해 반복적으로 농축시키고, 1% 글리신으로 희석하여 샘플의 전도율이 0.1mS이하가 되도록 한다.
정제된 폴리펩티드는 Rotofor 장치(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 준비된 등정점 포커슨에 의해 분취한다. pH차는 1.6% pH 3.5-5.0 암포라이트, 0.4% pH 5.0-7.0 암포라이트로 구성된 Ampholytes (Pharmacia Biotech) 혼합물로 만든다. 아세트산(0.5M)을 양극액으로 이용하고, 0.5M 에탄올아민을 음극액으로 이용한다. 제조업자의 지시에 따라 6시간동안 12W 정압에서 등전성 포커스를 실행한다. 20개 분취물을 수득할 수 있다.
등전점 포커스에서 분취물을 복합하고, 폴리펩티드는 Vydac C4 컬럼(Separations Group, Hesperia, CA, USA) 300Å, 5미크론 입자 크기(10×250㎜)에서 정제한다. 폴리펩티드는 아세토니트릴(0-80%v/v)/0.05%(v/v) 트리플로로아세트산(TFA) 선형 농도차로 컬럼으로부터 용출한다. 유속은 분당 2.0㎖이고, HPLC 용출물은 220㎚에서 모니터한다. 폴리펩티드를 포함하는 분취물은 수득하여 개별 샘플의 순도를 최대화한다.
상대적으로 풍부한 폴리펩티드 분취물은 Vydac C4 컬럼(Separations Group) 300Å, 5미크론 입자 크기(4.6×250㎜)에서 정제한다. 폴리펩티드는 아세토니트릴(20-60%v/v)/0.05%(v/v) TFA 선형 농도차로 컬럼으로부터 유속을 분당 1.0㎖로 하여 용출한다. 용출된 폴리펩티드를 포함하는 분취물은 수득하여 개별 샘플의 순도를 최대화한다. 약 20개 폴리펩티드 샘플을 수득하고, 이들은 Laemmli (Laemmli, U.K., Nature 277:680-685, 1970)과정에 따라 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 순도를 분석한다.
상당히 오염된 것으로 나타나는 폴리펩티드 분취물은 Mono Q 컬럼 (Pharmacia Biotech) 10 미크론 입자 크기(5×50㎜)또는 Vydac 디페닐 컬럼(Separations Group) 300Å, 5미크론 입자 크기(4.6×250㎜)에서 추가 정제를 한다. Mono Q 컬럼으로부터 폴리펩티드는 0-0.5M NaCl/10mM Tris HCl pH 8.0선형 경사 농도를 이용하여 용출한다. Vydac 디페닐 컬럼으로부터 폴리펩티드는 아세토니트릴(20-60% v/v)/0.1% TFA의 선형농도를 이용하여 용출한다. 유속은 분당 1.0㎖이고, 컬럼 용출물은 두 가지 컬럼으로부터 220㎚에서 모니터한다. 폴리펩티드 피크 분취물을 수득하고 상기 설명한 것과 같이 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 순도를 분석한다.
서열화를 위해, 폴리펩티드는 개별적으로 BiobreneTM(Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA)-처리된 유리 섬유 여과물에서 건조한다. 폴리펩티드가 있는 여과물은 Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492 단백질 서열기에 적하하고, 폴리펩티드는 통상적인 Edman 화학을 이용하여 아미노 말단에서부터 서열화한다. 각 폴리펩티드에서 PTH 아미노산 유도체의 보유 시간과 적절한 PTH 유도체 표준의 것을 비교하여 아미노산 서열을 결정한다.
일부 항원의 경우에, 항원을 엔도프로테아제 Lys-C로 절단하거나 또는 시아노겐 브로마이드로 항원을 화학적으로 절단하여 내부 서열을 또한 결정하였다. 이들 과정중 어느 것에 따라 생성된 펩티드는 이동상으로 0.05% (v/v) 트리플로오르아세트산을 이용하고, 0.05% (v/v) TFA (1%/min)을 포함하는 아세토니트릴 농도차를 이용하여 Vydac C18 칼럼에서 역상 HPLC에 의해 분리한다. 용출물은 214㎚에서 모니터한다. 주요 내부 펩티드는 이들의 UV 흡수도에 의해 확인되었고, 이의 N-말단 서열은 상기와 같이 결정한다.
전술한 과정을 이용하여, 6개 가용성 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 즉, GVc-1, GVc-2, GVc-7, GVc-13, GVc-20, GVc-22를 분리하였다. GVc-1에 대한 결정된 N-말단 내부 서열은 각 서열 번호 1, 2, 3으로 지정한다. GVc-2의 N-말단 서열은 서열 4이고; GVc-7의 내부 서열은 서열 5-8이 되고; GVc-13의 내부 서열은 서열 9-11이 되고; GVc-20의 내부 서열은 서열 12이 되고; GVc-22의 N-말단 및 내부 서열은 서열 56-59이다. 시아노겐 브로마이드(Met) 또는 Lys-C(Lys)의 공지의 절단 특징에 기초하면, 제공되는 내부 각 서열에는 폴리펩티드에서 이 위치에 존재하는 것으로 가정되는 아미노산 잔기로 시작된다.
GVc-16, GVc-18, GVc-21로 지정한 세 가지 추가적인 폴리펩티드는 상기에서 설명을 하고 있는 미리 준비된 등전점 포커스와 함께 준비된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 분리하였다. 특히, 이미 설명한 것과 같은 예비 등전점 포커스 정제 단계로부터 폴리펩티드 혼합물로 구성된 분취물은 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE로 정제한다. 샘플은 환원 샘플 완충액에 용해하고, 겔에 얹는다. 분리된 단백질은 10%(v/v) 메탄올을 포함하는 10mM 3-)사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산(CAPS) 완충액 pH 11에서 일렉트로블랏팅하여, 폴리비닐리덴디플로라이드(PVDF)막에 옮긴다. 옮겨진 단백질 밴드는 코마시 블루로 PVDF 막을 착색하여 확인을 할 수 있다. 가장 풍부한 펩티드 종을 포함하는 PVDF 막 부분을 절단하고, Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492 단백질 서열기의 샘플 카트릿지에 바로 넣는다. 상기에서 설명한 것과 같이 단백질 서열을 결정한다. GVc-16, GVc-18, GVc-21에 대한 N-말단 서열은 서열 13, 14, 15에 나타내었다.
GVc-12, GVc-14, GVc-15, GVc-17, GVc-19로 지정한 추가 항원은 전술한 것과 같이 크로마토그래피 과정에 추가하여 예비 SDS-PAGE 정제 단계를 이용하여 분리한다. 특히, 이미 설명한 것과 같이 Vydac C4 HPLC 정제 단계로부터 항원 혼합물로 구성된 분취물은 폴리아크릴아미드 겔에서 예비 SDS-PAGE에 의해 분취한다. 분리된 단백질은 CAPS 완충액 pH 11에서 일렉트로블랏팅하여, PVDF막에 옮긴다. 옮겨진 단백질 밴드는 코마시 블루로 PVDF 막을 착색하여 확인을 할 수 있다. 가장 풍부한 펩티드 종을 포함하는 PVDF 막 부분을 절단하고, Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492 단백질 서열기의 샘플 카트릿지에 바로 넣는다. 상기에서 설명한 것과 같이 단백질 서열을 결정한다. GVc-12, GVc-14, GVc-15, GVc-17, GVc-19의 N-말단 서열은 각각 서열 16-20에 나타내었다.
상기 모든 아미노산 서열은 GeneAssist system을 이용하여 SwiaaProt 데이커 베이스(version R32)에서 공지의 아미노산 서열과 비교한다. 아미노산 서열 GVc-2 내지 GVc-22에 상동성인 서열은 없었다. GVc-1에 대한 아미노산 서열은 미코박테리움 보비스(M. bovis)와 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis)에서 이미 확인된 서열과 일부 유사성을 가지는 것으로 확인되었다. 특히, GVc-1은 세포 표면 단백질인 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) MPT83 뿐만 아니라 MPT70과 약간의 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 이들 단백질은 단백질 족의 일부분을 형성한다(Harboe et al., Scand. J. Immunol. 42:46-51, 1995).
서열 연구에 의해 GVc-14와 GVc-22의 DNA 서열을 분리하였다(각 서열 107, 108). 이에 상응하는 GVc-14와 GVc-22의 아미노산 서열은 각각 서열 109와 110에서 나타낸다.
GVc-1(서열1) 및 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) MPT70의 아미노산 서열로 부터 각각 증폭 프라이머 AD86와 AD112(서열 60, 61)을 만들었다. 이와 같은 프라이머를 이용하여, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA에서 310bp 단편을 증폭시키고, 이를 추가된 dTTP 잔기를 포함하는 EcoRV-처리된 벡터 pBluescript(Stratagene)에 클론시킨다. 클론된 삽입물의 서열은 서열 62에 나타내었다.
정제된 폴리펩티드에 대해 면역 사람 제공자의 말초 혈액에서 T-세포 증식 및 IFN-γ를 유도하는 능력에 대해 스크린하였다. 이와 같은 제공자는 PPD(M. tuberculosis에서 유도된 정제 단백질) 피부 테스트에 양성으로 공지되어 있고, 이의 T 세포는 PPD에 반응하여 증식되는 것으로 나타났다. 제공자 PBMCs와 미코박테리움 바카이(M. vaccae)배양 여과물로부터 정제안된 가용성 단백질은 10%(v/v) 자가이식 혈청, 페니실인(60㎍/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 글루타민(2mM)이 보충된 RPMI 1640로 구성된 배지에서 배양하였다.
3일 후에, 하기에서 설명하는 것과 같이, IFN-γ 수준을 결정하기 위해 각 웰로부터 50㎕ 배지를 빼낸다. 플레이트는 추가 4일간 배양을 하고, 추가 18시간동안 1μCi/well 3중수소 티미딘으로 펄스하고, 수득하여 신틸레이션 카운터로 3중수소가 결합된 양을 결정한다. 배지만으로 배양된 세포에서 관찰되는 증식에 2배 이상 증식을 자극하는 분취물은 양성이라고 간주한다.
IFN-γ는 효소-결합된 면역흡착 검사(ELISA)를 이용하여 측정한다. ELISA 플레이트는 4℃에서, 4시간동안 사람 IFN-γ(Endogen, Wobural, MA) 1㎍/㎖인산-완충 염(PBS)에 대한 쥐 단클론성 항체로 피복한다. 웰은 실온에서 1시간동안 0.2% Tween 20을 포함하는 PBS로 차단한다. 플레이트는 그 다음 PBS/0.2% Tween 20으로 4번 세척을 하고, 샘플은 배양 배지로 1:2로 희석을 하고, ELISA 플레이트는 실온에서 하룻밤동안 배양을 한다. 플레이트는 다시 세척을 하고, 바이오티닐화된 다클론성 토끼 항-사람 IFN-γ혈청(Endogen)은 PBS로 1㎍/㎖로 희석을 하고, 각 웰에 첨가한다. 그 다음 플레이트는 실온에서 1시간동안 배양을 하고, 세척을 하고, 양고추냉이 과산화효소-결합된 아비딘 A(Vector Laboratories, Burlingame, CA)는 PBS로 1:4,000으로 희석을 하여 첨가한다. 실온에서 추가 1시간동안 배양을 한 후에, 플레이트는 세척을 하고 오르소페닐렌디아민(OPD) 기질을 첨가한다. 반응은 10분 후에 10%(v/v) HCl로 중단시킨다. 490㎚에서 광학 밀도를 측정한다. 배지만으로 배양된 세포의 평균 OD의 약 2배이상의 OD값을 가지는 분취물은 양성으로 간주한다.
표 1에서는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) T세포의 증식 및 IFN-γ 생산을 자극하는 서열을 포함하는 폴리펩티드의 예를 나타낸 것으로, 이때 (-)는 활성이 부족함; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 크지만 2배 미만인 결과를 나타내는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 활성이 2배 내지 4배를 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타낸다.
항원 증식 IFN-γ
GVc-1 ++ +/-
GVc-2 + ++
GVc-7 +/- -
GVc-13 + ++
GVc-14 ++ +
GVc-15 + +
GVc-20 + +
실시예 3
2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로부터 수득된 폴리펩티드의 정제 및 특징화
하기에서 설명하는 것과 같이 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 가용성 단백질을 배양 여과물로부터 분리하였다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae (ATCC Number 15483))는 37℃에서 Medium 90에 배양을 하였다. 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) 균주 H37Rv(ATCC No/ 27294)는 Tween 80 및 올레인산/알부민/덱스트로즈/카탈라제 첨가물(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)가 있는 멸균 Middlebrook 7H9 배지에서 배양하였다. 세포는 원심분리에 의하여 수득하고, 포도당이 있는 Middlebrook 7H9 배지에 옮겨 하루동안 37℃ 배양한다. 배지는 그 다음 원심분리하여(큰 세포는 남기고), 배양 여과물은 0.45μM 필터를 통과시켜 멸균 병안으로 옮긴다.
배양 여과물은 냉동건조에 의해 농축시키고, MilliQ 물에 재용해시킨다. 소량의 불용성 물질은 0.45μ막을 통하여 여과시켜 제거한다.
배양 여과물은 3,000kD 분자량 차단(MWCO) 막을 포함하고 있는 400㎖ Amicon 교반된 셀에서 막 여과에 의해 염을 제거한다. 압력은 질소 기체를 이용하여 60psi로 유지한다. 배양 여과물은 막 여과에 의해 반복적으로 농축시키고, 물로 희석하여 샘플의 전도율이 1.0 mS이하가 되도록 한다. 이 과정으로 샘플의 용적은 20ℓ에서 약 50㎖로 감소된다. Bradford 단백질 검사(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정한다.
염이 제거된 배양 여과물은 10mM Tris HCl 완충액 pH 8.0으로 균등화시킨 Q-Sepharose(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)(16×100㎜)컬럼에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분류한다. 폴리펩티드는 상기 완충액에서 0 내지 1.0M의 염화나트륨 선형 농도차를 이용하여 용출한다. 컬럼 용출물은 280㎚에서 모니터한다.
이온 교환 컬럼으로부터 용출되는 폴리펩티드 푸울은 예비 2D 겔 전기영동에 의해 분취한다. 200-500㎍ 폴리펩티드를 포함하는 샘플은 요소에서 8M로 만들고, 폴리아크릴아미드 포커스 로드 겔(직경 2㎜, 길이 150㎜, pH 5-7)에 얹는다. 등전점 포커스 단계후에, 1차원 겔은 환원 완충액으로 평형시키고, 2차 겔(16% 폴리아크릴아미드)에 얹는다. 도 2A, 2B는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) H37Rv 배양 여과물에서 각각 관찰되는 2-?? 겔 패턴을 나타낸다. 2차원 분리에 의해 수득된 폴리펩티드는 10%(v/v)메탄올을 포함하는 10mM CAPS 완충액 pH 11에서 일렉트로블랏팅하여, PVDF막에 옮긴다. 코마시 블루로 PVDF 막을 착색하여 단백질을 확인할 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 포함하는 PVDF 부분을 절단하고, Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492 단백질 서열기의 샘플 카트릿지에 바로 넣는다. 폴리펩티드는 통상적인 Edman 화학을 이용하여 아미노 말단에서부터 서열화한다. 각 폴리펩티드에서 PTH 아미노산 유도체의 보유 시간과 적절한 PTH 유도체 표준의 것을 비교하여 아미노산 서열을 결정한다. 이와 같은 과정을 이용하여, 11개 폴리펩티드 즉 GVs-1, GVs-3, GVs-4, GVs-5, GVs-6, GVs-8, GVs-9, GVs-10, GVs-11, GV-34, GV-35을 분리하였다. 이들 폴리펩티드의 결정된 N-말단 서열은 각 서열 21-29, 63, 64에 나타내었다. 상기에서 설명한 것과 같은 정제 과정을 이용하여, 더 많은 단백질을 정제하여, GVs-9에서 이미 수득한 아미노산 서열을 연장하였다. GVs-9에 대해 연장된 아미노산 서열은 서열 65에 제공하였다. 또한 추가 연구하여, GVs-9의 DNA 서열을 분리하여 서열 111에 나타내었다. 이에 상응하는 예측 아미노산 서열은 서열 112에 나타내었다.
상기 모든 아미노산 서열은 GeneAssist system을 이용하여 SwiaaProt 데이커 베이스(version R32)에서 공지의 아미노산 서열과 비교한다. GVs-3, GVs-4, GVs-5, Gvs-9를 제외하고는 상당한 상동성이 나타나지는 않았다. GVs-9에서는 두 가지 이미 확인된 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) 단백질 즉, 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) 큐티나제 전구물질 및 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) 가상 22.6 kD 단백질과 어느 정도 상동성을 가지고 있다. GVs-3, GVs-4, GVs-5에서도 미코박테리움 레프레(M. leprae) 85A와 85B 단백질(각 서열 30, 31); 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) 85A와 85B 단백질(각 서열 30, 31); 미코박테리움 보비스(M. bovis) 85A와 85B 단백질(각 서열 34, 35); 미코박테리움 레프라(M. leprae) 85C 항원 단백질(서열 36). 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 얻은 본 발명의 신규한 항원 85A 단백질과 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 보비스(M. bovis) 및 미코박테리움 레프라(M. leprae)에서 구한 것과 비교를 한 것을 도 3에 나타내었다.
실시예 4
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 85 시리즈의 DNA 클로닝 전략
항원 85A, 85B, 85C에 대한 프로브(서열 38, 39)는 주어진 미코박테리움 종에 있는 족과 미코박테리움 종간에 보존된 항원 85 게놈 서열의 부분에 대한 축중 올리고뉴클레오티드를 이용하여 중합효소 사슬 연쇄 반응(PCR)으로 준비하였다. 이와 같은 올리고뉴클레오티느는 스트린젼스 조건을 완화시킨 상태하에서 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA로부터 표적 서열을 증폭시킨다. 약 0.5kb 크기 밴드를 확인하여 정제하고, T-tailed p Bluescript II SK(Stratagene, La Jolla, CA)에 클론시킨다. 항원 85 PCR 생성물 존재에 대해 24개 개별 콜로니를 스크리닝하고, Perkin Elmer/Applied Biosystems Model 377 자동화된 서열화기와 M13계 프라이머, T3와 T7를 이용하여 서열화한다. GenBank 데이터베이스의 상동성 조사에서 23개 콜로니에는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 보비스(M. bovis)에서 공지된 항원 85 유전자에 상당한 상동성이 있는 삽입물을 포함하는 것으로 나타났다. 대략 절반정도가 항원 85C 유전자 서열에 대부분 상도성을 가지고, 나머지는 항원 85B 서열에 더욱 유사한 것이다. 또한, 이들 가상 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 85 게놈 서열은 서로 80% 상동성을 가진다. 이와 같은 높은 유사성 때문에, 항원 85C PCR 단편을 선택하여 세 가지 항원 85 유전자에 대해 매우 낮은 스트린젼시 조건하에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 라이브러리를 스크린한다.
부분적으로 BamHI로 절단한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA를 비슷하게 절단된 λvector에 클로닝시켜, λZapExpress(Stratagene, La Jolla, CA)에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 라이브러리를 만들었는데, 개별적인 플락 형성 단위는 3.4×105이다. 스크리닝을 목적으로, 증폭 안된 이들 라이브러리에서 27000 플락을 8개 100㎠ 플레이트에 저 밀도로 플레이팅한다. 각 플레이트에서, 이중 플락 리프트는 Hybond-N-나일론 막(Amersham International United Kingdom)으로 취하고, 약화된 스트린젼시 조건하에서(55℃), 방사능라벨된 항원 85C PCR 생성물에 하이브리드시킨다. 자가방사그래프에서, 79개 플락은 일관적으로 이와 같은 조건하에서 항원 85C 프로브에 하이브리드된다. 추가 분석을 위하여, 무작위로 13개 양성 하이브리드된 플락을 선별하고, 라이브러리 플락으로부터 분리하는데, 각 양성 클론을 이용하여 약 200개 플락을 포함하는 2차 스크리닝 플레이트를 만든다. 각 플레이트의 이중 리프트는 Hybond-N-나일론 막을 이용하여 취하고, 1차 스크리닝에서 이용된 조건과 같은 조건하에 하이브리드한다. 스크리닝한 13개 플레이트 각각에는 여러개의 양성 하이브리드되는 플락을 확인하였다. 추가 분석을 위해 각 2차 플레이트로부터 두 개의 잘분리된 양성 파아지를 선택한다. in vitro 절단을 위해, 26개 플락을 파아지미드로 전환시키고 제한효소지도를 작성한다. 이 지도를 기초하여 클론을 네 가지 그룹으로 분류할 수 있다. 각 그룹의 몇가지 대표적인 것에 대한 5'와 3'단부에서 서열 데이터를 Perkin Elmer/Applied Biosystems Model 377 자동화된 서열화기와 M13계 프라이머, T3와 T7를 이용하여 얻는다. GeneBank 데이터베이스 FASTA 분석 및 와 GeneAssist 소프터웨어 패키지를 이용하여, 서열의 상동성을 결정한다. 이들 클론 세트중 두 개가 미코박테리움 보비스(M. bovis)와 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 항원 85A 단백질에 상동성인 것으로 나타났는데, 이들 각각에는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 유전자의 5' 또는 3'단부를 포함한다(이 유전자는 내부에 BamHI 부위를 가지기 때문에 라이브러리를 만드는 동안에 절단된다). 남아있는 클론에서는 여러 미코박테리움 종의 항원 85B와 85C에 상동성인 서열을 포함하는 것을 알 수 있다. 각 유전자에 나머지 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해, 적절한 서브클론을 만들고 서열화한다. 겹쳐지는 서열은 DNA Strider software를 이용하여 배열한다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 85A, 85B, 85C에 대한 결정된 DNA 서열을 각각 서열 40-42에 나타내고, 예측된 아미노산 서열은 각각 서열 43-45에 나타내었다.
다음과 같이 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 GVc-3, GVc-5를 발현시키고, 정제한다. GVc-3와 GVc-5의 삽입 서열(각 서열 40, 42)로부터 가상 리더 서열로부터 하류 서열 데이터 및 클론의 3' 말단을 이용하여, 증폭 프라이머를 고안하였다. GVc-3에 대한 프라이머 서열을 서열 66, 67에 나타내고, GVc-5에 대한 프라이머 서열은 서열 68, 69에 나타낸다. 클로닝의 편의를 위해, GVc-3에 대한 프라이머에 XhoI 제한 효소 부위를 삽입시키고, GVc-5에 대한 프라이머에 EcoRi와 BamHI 제한 효소 부위를 삽입시킨다. 게놈 미코박테리움 바카이 DNA로부터 증폭후에, 단편은 pProEX HT 원핵세포 발현 벡터(Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD)내의 적절한 부위에 클로닝하고, 정확한 리딩 프레임 및 방향을 확인하기 위해 서열화한다. 제조업자의 지시에 따라 재조합 단백질의 발현 및 정제를 한다.
다음과 같이 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 GVc-4(항원 85B 상동)의 단편을 발현시킨다. 상기에서 설명한 프라이머 AD58와 AD59를 이용하여, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA의 485bp 단편을 증폭시킨다. 이 단편은 표준 기술을 이용하여 겔-정제하고, EcoRV-절단한 pBluescript(dTTP 잔기가 첨가되어 dLTdma)안에 클로닝한다. 5개 클론에서 삽입체의 염기 서열을 결정하고, 이들이 서로 동일함을 확인하였다. 이들 삽입물은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)의 항원 85B에 가장 큰 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 클론중 한 개에서 삽입물은 pProEX HT 원핵 발현 벡터(Gibco BRL)의 EcoRI/XhoI 부위에 스버클론하여, 제조업자의 지시에 따라 발현시키고, 정제한다. 이와 같은 클론은 유전자의 일부만이 발현되었기 때문에 GVc-4P로 명명한다. 부분적인 클론 GVc-4P의 아미노산 및 DNA 서열은 서열 70과 106에 각각 나타내었다.
후속 연구에서, 상기에서 설명하는 유사한 과정을 이용하여, GVc-3, GVc-4P, GVc-5를 또 다른 벡터 pET16(Novagen, Madison, WI)에 다시 클로닝한다.
상기 실시예 2에서 설명하는 것과 같이, 정제된 재조합 GVc-3, GVc-4P, GVc-5이 PPD-양성 건강한 제공자로부터 사람 PBL에서 T 세포 증식 및 인터페론-γ생산을 자극하는 능력을 검사한다. 이 검사의 결과는 다음의 표 2에 나타내었는데, 이때 (-)는 활성이 부족함을 나타내고; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 2배정도의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 2배 내지 4배 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상 활성이 큰 폴리펩티드를 나타내고, ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
제공자 G97005 제공자 G97006 제공자 G97007 제공자 G97008 제공자 G97009 제공자 G97010
증식 IFN-γ 증식 IFN-γ 증식 IFN-γ 증식 IFN-γ 증식 IFN-γ 증식 IFN-γ
GVc-3 ++ + ND ND ++ ++ ++ ++ ++ +/- + ++
GVc-4P + +/- ND ND + ++ ++ ++ +/- +/- +/- ++
GVc-5 ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + + ++
실시예 5
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 DNA 클로닝 전략
GVc-7의 결정된 아미노산 서열(서열 5-8)에 대한 축중 올리고뉴클레오티드를 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 GVc-7에 대한 84bp 프로브를 증폭시킨다. 이 프로브를 이용하여, 실시예 4에서 설명하는 것과 같은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA를 스크리닝한다. GVc-7의 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열 46에 나타내고, 예측 아미노산 서열은 서열 47에 나타내었다. 데이터뱅크에 있는 것과 이들 서열을 비교하였을 때, 미코박테리움 튜베르큘로시tm(M. tuberculosis)의 가상 15.8kD 막 단백질에 상동성이 있는 것으로 나타났다.
가상 리더 서열의 하류 서열을 이용하여 GVc-7 유전자의 발현 클로닝용 증폭 프라이머(서열 71, 72)를 만드는데, 서열 46의 서열을 이용한다. A XhoI 부위를 프라이머에 추가하여 클로닝을 편리하게 한다. 게놈 미코박테리움 바카이(M. vaccae) DNA로부터 증폭시킨 후에, 단편은 pProEX HT 원핵 발현 벡터(Gibco BRL)의 XhoI-절단 부위에 클론시키고, 서열화하여 정확한 리딩 프레임 및 그 방향을 확인한다. 제조업자의 프로토콜에 따라 융합 단백질의 발현 및 정제한다. 후속 연구에서, GVc-7은 벡터 pET16(Novagen)안에 다시 클론시킨다.
상기 실시예 2에서 설명하는 것과 같이, 정제된 재조합 GVc-7이 PPD-양성 건강한 제공자로부터 사람 PBL에서 T 세포 증식 및 인터페론-γ생산을 자극하는 능력을 검사한다. 이 검사의 결과는 다음의 표 3에 나타내었는데, 이때 (-)는 활성이 부족함을 나타내고; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 2배정도의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 2배 내지 4배 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상 활성이 큰 폴리펩티드를 나타내고, ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
제공자 증식 인터페론-γ
G97005 ++ +/-
G97008 ++ +
G97009 + +/-
G97010 +/- ++
서열 6에 나타낸 GVs-8 펩티드 서열에 대해 축중 올리고뉴클레오티드 프로브를 만들고, 이를 이용하여 상기에서 설명하는 것과 같이 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝한다. 양성 플락을 분리하였다.
네 가지 상이한 게놈 클론을 확인하였는데 여기에서는 GVs-8A, GVs-8B, GVs-8C, GVs-8D로 명한다. 클론 GVs-8A, GVs-8B, GVs-8C, GVs-8D의 결정된 DNA 서열은 각 서열 48-51에 나타내었고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 52-55에 각각 나타내었다. 클론 GVs-8A에는 공지의 원핵 발일-tRNA 합성효소에 일부 상동성을 가지는 부분을 포함하고; GVs-8B에서는 미코박테리움 스메가마티스(M. smegmatis) 세미알데히드 데하이드로게나제에 일부 유사한 부분을 포함하고; GVs-8C는 H. influenza 폴일폴리글루카메이트 합성효소 유전자에 일부 유사한 부분을 포함하는 것으로 나타났다. GVs-8D는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 레프라(M. leprae)에서 이미 확인된 서열에 일부 유사성을 나타내는 오픈 리딩 프레임을 포함하는데, 이의 기능은 확인되지 않았다.
후속 연구를 위해서, 람다 ZAP 발현 벡터(Stratagene)의 BamH1-부위에서 만들어진 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리는 서열 6에 제공된 GVs-8에서 만든 축중 올리고뉴클레오티드(MPG15라고도 부름: 서열 73)로 서크리닝하였다. 염화테트라메틸암모니움(TMAC) 존재 하에 라이브러리의 스크리닝을 실행하고, 뉴클레오티드 염기상은 서열의 각 표준 온도에서 용융된다(예를 들면, A-T쌍과 G-C쌍은 동일한 온도에서 용융된다). 따라서, 하이브리드반응 스트린젼시는 프로브로 이용되는 올리고뉴클레오티드의 길이와 축중성에 따라 달라진다(Wood et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1585-1588, 1985). 적절한 TMAC세척 온도이하인 ~15℃이하의 온도에서 하룻밤동안 전달 및 미리-하이브리드하는 표준 반응을 이용하여 필터를 준비한다. 100pmol 프로브를 포함하는 새로 만든 하이브리드반응용 용액에서 하룻밤동안 하이브리드를 실행한다.
올리고뉴클레오티드 원액의 하이브리드 반응용 용액:
1M NaCl 5M
0.1M Tris pH 8 1M
5X Denhardt's 100X
0.05% NaPPi 5%
0.1% SDS 10%
0.1㎎/㎖yeast tRNA 10㎎/㎖
125units/㎖ heparin
필터는 예산된 온도에서 세척하여 TMAC 세척 완충액에 약 4% 미스메취(mismatch)가 이루어지도록 한다. 좀더 구체적으로는, 세척 과정에는 다음과 같은 과정이 포함된다: 실온에서 6X SSC, 0.05% NaPPi에 15분간 2회; 실론에서 하기 TMAC 세척액에서 15분간 1회; 계산된 스트린젼트 온도에서 TMAC에서 15분간 2회; 실온에서 6X SSC, 0.05% NaPPi에서 15분간 1회.
TMAC 세척액
3M 염화 테트라메틸암모니움(TMAC)
50mM Tris pH 8.0
0.2mM EDTA
양성 플락을 찍어내어, 20㎕ 클로로포름이 있는 1㎖ SM 완충액에 보관한다. 상기 설명한 과정에 따라 순수한 플락이 될 때까지 스크리닝을 반복한다.
원하는 삽입물을 포함하는 pBK-CMV 파아지미드는 제조업자의 지시에 따라 ExAssist 헬퍼 파아지 존재 하에 람다 ZAP 발현 벡터에서 잘라낸다. 8kb 삽입물(GVs-8D)을 포함하는 파아지미드의 제한효소 지도 및 서브-클로닝을 하여 특징을 조사한다. 삽입물의 3'말단에서 오픈 리딩 프레임을 확인하였고, 이 오픈 리딩 프레임에 의해 인코드된 항원은 GV-33이라 명명한다. 삽입물에서 GVs-8에 상응하는 염기 서열이 발견되지 않았고, GV-33은 TMAC 스크리닝의 비-특정 생성물로 수득되었음을 알 수 있다. 추가 서브-클로닝 및 염기 서열화를 통하여, 유전자의 3'말단을 결정한다. GV-33에 대해 결정된 부분적인 DNA 서열은 서열 74에 나타내고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 75에 나타내었다. 클론의 3'말단의 서열 데이터에서 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)의 이미 확인된 40.6 kDa 외막 단백질에 대해 상동성을 가지는 것을 알 수 있다.
부분적인 GV-33 유전자는 결정된 뉴클레오티드 서령에 기초한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이와 같은 DNA 단편은 추가 dTTP 잔기를 가지는 EcoRv-절단한 pBluescript(Stratagene)에 클로닝시키고, EcoRI과 HindIII-서브클로닝을 이용하여, pProEX HT 발현 벡터(Gibco BRL)로 옮긴다. 재조합 단백질은 제조업자의 지시에 따라 정제한다. 후속 연구를 위해, GV-33은 또 다른 벡터 pET16(Novagen)에 다시 클로닝시킨다.
상기 실시예 2에서 설명하는 것과 같이, 정제된 재조합 항원이 PPD-양성 건강한 제공자로부터 사람 PBL에서 T 세포 증식 및 인터페론-γ생산을 자극하는 능력을 검사한다. 이 검사의 결과는 다음의 표 4에 나타내었는데, 이때 (-)는 활성이 부족함을 나타내고; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 2배정도의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 2배 내지 4배 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상 활성이 큰 폴리펩티드를 나타내고, ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
제공자 증식 인터페론-γ
G97005 ++ +
G97006 ++ ++
G97007 - +/-
G97008 +/- -
G97009 +/- -
G97010 +/- ++
실시예 6
전체 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물에서 비-특이적인 면역 증폭제의 감지
본 실시예에서는 전체 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물의 준비 및 이의 비-특이적인 면역 증폭 또는 어쥬번트의 성질을 설명한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 실시예1에서 설명하는 것과 같이 배양하고, 펠렛화시키고, 증기살균을 한다. 살아있는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 배양 여과물은 포도당을 포함하는 7H9 배지에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 24시간 배양한 것의 상청액을 의미한다. Virsonic 초음파기(Virtis, Disa, USA)를 이용하여 얼음에서 30초간 4회 격렬하게 증기살균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 초음파 파쇄하여 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 얻는다. 그 다음 물질은 원심분리한다(9000rpm, 20minutes, JA10 rotor, brake = 5). 생성된 펠렛은 100㎖ 클로로포름/메탄올(2:1)에 현탁시키고, 실온에서 1시간동안 배양한다음; 다시 원심분리를 하고, 클로로포름/메탄올 추출을 반복한다. 펠렛은 원심분리하여 얻고, 진공 하에서 건조시키고, 무게를 재고, 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 ㎖당 50㎎(건중량)을 PBS에 재현탁시킨다.
2시간동안 50% v/v 에탄올에 재환류시켜 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 당지질을 제거한다. 원심분리하여(10,000rpm, JA20 rotor, 15mins, brake = 5) 불용성 물질을 수득한다. 재환류하에 50%v/v 에탄올로 추출하는 과정을 2회 이상 반복한다. 불용성 물질은 원심분리에 의해 모으고, PBS에 세척을 한다. 2시간동안 56℃에서 2% SDS/PBS에서 펠렛을 재현탁을 하여 단백질을 추출한다. 불용성 물질은 원심분리에 의해 모으고, 56℃에서 2% SDS/PBS를 이용한 추출은 2회 이상 반복한다. 모아진 SDS 추출물은 4℃로 냉각을 시키고, 침전된 SDS는 원심분리(10,000rpm, JA20 rotor, 15mins, brake = 5)에 의해 제거한다. 동량의 아세톤을 첨가하고, 2시간동안 -20℃에서 배양을 하여 상청액으로부터 단백질을 침전시킨다. 침전된 단백질은 원심분리에 의해 수득을 하고, 50% v/v 아세톤으로 세척을 하고, 진공 하에서 건조시키고, PBS에 다시 용해를 시킨다.
쥐에서 구조적으로 무관한 단백질인 오브알부민에 대한 세포 독성 T 세포 면역 반응을 발생시키는데 있어서, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양물 상청액(S/N), 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 어쥬번트 활성에 대해 테스트를 하였다. 이와 같은 항-오브알부민-특이적인 세포 독성 반응은 다음과 같이 감지한다; C57BL/6 쥐(한 집단에 2마리)에 다음의 테스트 어쥬번트와 함께 100㎍ 오브알부민을 복막내 면역 주사를 한다; 어쥬번트(증기멸균된 미코박테리움 바카이; 지질이 제거된 미코박테리움 바카이; 지질이 제거되고, 당지질 및 단백질은 SDS로 추출된 미코박테리움 바카이; SDS 단백질 추출물은 프로네이즈(단백질을 붕괴시키는 효소); 전체 미코박테리움 바카이 배양 여과물; 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 튜베르큘로시스 또는 열 처리에 의해 죽은 미코박테리움 보비스(M. bovis) BCG, 미코박테리움 플라이(M. phlei) 또는 미코박테리움 스메가마투스(M. smegmatus) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물. 10일 후에, 췌장 세포는 E.G7세포로 추가 6일간 in vitro에서 자극을 하는데, 이때 E.G7세포는 오브알부민 유전자로 트랜스펙트된 EL4세포(C57BL/6-유도된 T 세포 임파종)으로 오브알부민을 발현시킨다. 비-특이적으로 EL4 표적 세포를 죽이는 또는 오브알부민을 발현시키는 E.G7세포를 특이적으로 죽이는 췌장 세포의 능력에 대해 검사를 한다. 죽이는 활성은 이 검사를 하기 전에 EL4 및 E.G7세포에 라벨된51크로미늄(100μCi per 2×106)의 방출에 의해 감지된다. 죽이는 활성 또는 세포용해 활성은 다음의 식을 이용하여 특정 용해율%로 나타낸다.
일반적으로 오브알부민-특이적인 세포 독성 세포는 어쥬번트와 함께 오브알부민으로 면역주사를 한 쥐에서만 발생하고, 오브알부민 단복으로 면역 주사를 한 쥐에서는 발생되지 않는다는 것이 공지의 사실이다.
도 4에 만든 다이아그램은 C57BL/6쥐에서 오브알부민에 대한 세포독성 T 세포의 발생에서 다양한 미코박테리움 바카이에서 유도된 어쥬번트 물질의 효과를 나타낸다. 도 4A에서 볼 수 있는 것과 같이, (i) 10㎍, (ii) 100㎍ (iii) 1㎎ 증기멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 (iv) 75㎍ 미코박테리움 바카이 배양 여과물로 면역주사한 쥐에서 세포독성 세포를 만든다. 도 4B에서는 (i) 1㎎ 전체 증기멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는(ii) 1㎎ 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역 주사한 쥐에서 세포독성 세포가 발생되었음을 보여준다. 도 4C(i)에서는 1㎎ 전체 증기멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사한 쥐에서 발생된 세포독성 세포를 나타낸다; 도 4C(ii)에서는 당지질이 제거되고, 단백질은 SDS로 추출한 100㎍ 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 있는 활성 물질을 나타낸다. 도 4C(iii)에서는 도 4C(ii)의 어쥬번트에 있는 활성 물질이 단백질 분해성 효소 프로네이즈로 처리하여 파괴된다는 것을 보여준다. 비교를 위해, 100㎍ SDS-추출된 단백질에는 1㎎ 전체 증기멸균된 미코박테리움 바카이(도 4C(i))의 것보다 더 강한 면역 강화 활성(도 4C(ii))을 가진다는 것을 알 수 있다.
1㎎ 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도 4D(i))로 면역주사를 맞은 줴에서 오브알부민에 대한 세포독성 세포가 발생되나, 별도로 1㎎ 열에 의해 죽은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)(도 4D(ii)), 1㎎ 미코박테리움 보비스(M. bovis)BCG(도 4D(iii)), 1㎎ 미코박테리움 플라이(M. phlei)(도 4D(iv)), 1㎎ 미코박테리움 스메가마투스(M. smegmatis)(도 4D(v))로 면역주사를 한 쥐에서는 세포독성 세포가 발생되지 않았다.
지질이 제거된 그리고 당지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도한 SDS-단백질을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석을 하였다. 도 5에서 볼 수 있는 것과 같이, 실버착색 후에 세 가지 밴드를 확인할 수 있다.
후속 연구에서, 상기에서 설명한 SDS-추출한 단백질은 BioRad Prep Cell(Hercules, CA)에서 SDS-PAGE로 준비할 수 있다. 분자량 범위에 상응하는 분취물은 트리클로로아세트산으로 침전을 시켜, 상기에서 설명하는 C57BL/6쥐에서 항-오브알부민-특이적인 세포독성 반응 검사에서 어쥬번트 활성을 검사하기전에 SDS를 제거한다. 도 6에서 볼 수 있는 것과 같이, 어쥬번트 활성은 60-70kDa 분취물에서 최대이다. 이 크기 분포에서 가장 풍부한 단백질은 SDS-PAGE에 의해 정제를 하고, 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF)로 블랏틴시키고, 서열화한다. 처음 10개 아미노산 잔기의 서열은 서열 76에 나타내었다. 전술한 것과 같이 유전자 은행에 있는 서열과 비교하면, 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis )의 열 쇼크 단백질 65(GroEL)에 상동성이 있는 것을 알 수 있는데, 이는 이 단백질이 GroEL 족 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 구성원이라는 것을 말한다.
전술한 것과 같이 준비된 미코박테리움 바카이에서 분비된 단백질로 면역 주사를 한 원숭이(cynomologous)의 혈청을 이용하여, BamH1-lambda ZAP Express(Stratagene)에 있는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 발현 라이브러리를 스크리닝한다. 양성 플락은 발색계를 이용하여 확인을 할 수 있다. 이들 플락은 다음의 표준 과정에 따라 순수할 때까지 재스크리닝을 한다. 삽입물을 포함하는 pBK-CMV phagemid 2-1는 제조업자의 프로토콜에 따라 ExAssist helper 존재하에 람다 ZAP Express(Stratagene)로부터 잘라낸다. 이 클론의 삽입물(GV-27아라고 칭함)의 5'말단의 염기 서열은 Perkin Elmer/Applied Biosystems Dvision 자동화 서열기에서 형광 프라이머로 Sanger 서열과정을 이용하여 결정한다. 부분적인 미코박테리움 바카이(M. vaccae) GroEL-상동 클론 GV-27의 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열 77에 나타내었고, 이의 아미노산 서열은 서열 78에 나타내었다. 이 클론은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) GroEL에 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae )의 65kDa 열 쇼크 단백질의 부분적인 서열은 Kapur et al.(Arch. Pathol. Lab. Med. 119:131-138, 1995)에 공지되어 있다. Kapure에서 설명하는 단편의 뉴클레오티드 서열은 서열 79에 나타내고, 이에 상응하는 예상 아미노산 서열은 서열 80에 나타내었다.
후속 연구에서, GV-27의 전체 길이(단 예측된 51개 말단 뉴클레오트디는 제외함) DNA 서열은 서열 113에 나타내었다. 이에 상응하는 예측되는 아미노산 서열은 서열 114에 나타내었다. GV-27은 아미노산 수준에서 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) GroEL과 93.7% 동일한 것으로 밝혀졌다.
GV-27의 N-말단(이하 GV-27A라고 칭함)과 C-말단(이하 GV-27B라고 칭함)으로 구성된 두 개 펩티드 단편은 공지의 기술을 이용하여 준비한다. GV-27A와 GV-27B의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 115와 116에 나타내고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 각각 117과 118에 나타내었다. GV-27A의 서열은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) GroEL의 서열과 95.8% 동일하고, 여기에는 상기에서 설명한 Kapur et al.의 짧은 M. vaccae 서열을 포함한다. GV-27B의 서열은 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) HSP65와 약 92.2%가 동일한 것으로 나타났다.
상기에서 설명을 하고 있는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 등전점 포커스를 이용하여 분취하고, 분취물은 상기에서 설명하는 것과 같이 C57BL/6 쥐에서 항-오브알부민 특이적인 세포 독성 반응 검사에서 어쥬번트 활성에 대해 검사를 한다. 도 7에서 볼 수 있는 것과 같이, pI가 4.2-4.32(분취물 번호;7-9), 4.49-4.57 (분취물 번호; 13-17), 4.81-5.98(분취물 번호; 23-27)에 상응하는 분취물에서 피크 어쥬번트 활성이 나타났다.
실시예 7
미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 감염된 대식세포에 대해 증기살균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 세포독성 CD8 T 세포를 만든다.
본 실시예에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)가 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)에 감염된 대식세포를 적절하게 죽이는 세포독성 CD8 T 세포를 자극하는 능력에 대해 설명한다.
쥐는 실시예 1에서 설명하는 것과 같이 준비한 500㎍ 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 복막 내로 주사하여 면역화시킨다. 면역주사를 한 후 2주 뒤에, 면역주사를 맞은 쥐의 췌장 세포는 CD8 T세포가 있는 컬럼(R＆D Systems, St. Paul, MN, USA)을 통하여 통과시킨다. 컬럼에서 회수한 췌장 세포에는 최고 90% CD8 T 세포가 있는 것으로 나타났다. 이들 T 세포와 면역 주사를 받지 않은 쥐에서 취한 CD8 T 세포를 감염안된 대식세포 또는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)에 감염된 대식세포를 죽이는 능력에 대해 테스트를 하였다.
대식세포는 1㎖ 3% 티오글리콜레이트를 복막으로 주사한 후에 5일 뒤 쥐의 복강에서 얻는다. 대식세포는 대식세포당 2개 미코박테리아의 비율로 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)로 하룻밤동안 감염을 시킨다. 모든 대식세포 준비물은 104대식세포 당 2μci에서51크로미늄으로 라벨을 한다. 그 다음 대식세포는 킬러와 표적의 비율을 30:1로 하여 하룻밤동안(약 16시간) CD8 T 세포와 배양을 한다. 특이적인 죽음은51크로미늄이 방출되는 것으로 감지를 하고, 실시예 5에서 계산된 것과 같은 특정 용해%로 나타낸다.
CD8 T 세포를 대식세포와 공동 배양을 한 후 3일 뒤에 IFN-γ의 생산 및 이것이 배지로 방출되는 양은 효소-결합된 면역흡착 검사(ELISA)를 이용하여 측정을 할 수 있다. ELISA 플레이트는 쥐 IFN-γ(Pharmigen, San Diego, CA, USA)/PBS에 대한 쥐 단클론성 항체로 4℃에서 피복을 한다. 웰은 한 시간동안 실온에서 0.2% Tween 20을 포함하는 PBS로 차단을 하였다. 플레이트는 0.2% Tween 20을 포함하는 PBS로 4번 세척을 하고, ELISA 플레이트에서 배양 배지로 1:2로 희석된 샘플은 실온에서 하룻밤동안 배양한다. 플레이트는 다시 세척을 하고, 바이오티닐화된 단클론 쥐 항-마우스 IFN-γ항체(Pharmigen)는 PBS로 희석을 하여 1㎍/㎖로 한 후에, 각 웰에 첨가한다. 그 다음 플레이트는 실온에서 한 시간동안 배양을 하고, 세척을 하고, 양고추냉이 과산화효소 결합된 아비딘-D(Sigma A-3151)는 PBS에서 1:4,000으로 희석한 후에 첨가한다. 실온에서 추가 1 시간 배양을 한 후에, 플레이트는 세척을 하고, OPD 기질을 첨가한다. 반응은 10분 후에 10% (v/v) HCl를 이용하여 종료시킨다. OD는 490㎚에서 결정한다. 두 개 플레이트 모두에서 배지만 있는 경우에서 배양된 세포의 평균 OD보다 2배 이상 큰 OD값을 가지는 분취물은 양성으로 간주한다.
표 5에서 볼 수 있는 것과 같이 미코박테리움 바카이로 면역주사를 한 쥐의 췌장에서 취한 CD8 T 세포는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)에 감염된 대식세포에 대해 세포독성이 있으나, 감염되지 않은 대식세포는 용혈시키지 않았다. 면역주사를 하지 않은 쥐의 CD8 T 세포는 대식세포를 용혈시키지 않았다. 고유 또는 면역주사를 맞지 않은 쥐의 CD8 T 세포는 감염된 대식세포와 배양을 하였을 경우에 IFN-γ을 생산하였다. 배양물에서 생산된 IFN-γ의 양은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 쥐에서 유도한 CD8 T 세포보다 많았다.
미코박테리움 튜베르큘로시스에 감염된 그리고 감염안된 대식세포에 효과
CD8 T cells 대식세포 용혈률 % IFN-γ(ng/㎖)
미감염 감염 미감염 감염
기준 0 0 0.7 24.6
M. vaccae으로 면역주사 0 95 2.2 43.8
실시예 8
미코박테리움 바카이(M. VACCAE) 항원 GV-23, GV-24, GV-25, GV-26, GV-38A , GV-38B에 대한 DNA 클로닝 전략
미코박테리움 바카이(M. vaccae)(ATCC Number 15483)는 4일간 37℃에서 멸균된 Medium 90에서 생장을 시키고, 원심분리에 의해 수득을 한다. 세포는 1㎖Trizol(Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland)에 재현탁을 시키고, 표준 과정에 따라 RNA를 추출한다. 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) H37Rv(ATCC Number 27294)는 Tween 80TM과 올레산/알부민/덱스트로즈/카탈라제 첨가물(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)을 포함하는 멸균 Middlebrooke 7H9 배지에 생장을 시키고, 적절한 안정된 조건하에서 수득을 한다. 세포는 1㎖ Trizol(Gibco BRL)에 재현탁을 시키고, 제조업자의 지시에 따라 RNA를 추출한다.
총 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) RNA에는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) rRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드 AD10과 AD11(서열 81, 82)에 총 RNA 분취물이 하이브리드되어, 16S와 23S 리보좀 RNA(rRNA)가 없다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 Bottger(FEMS Bicrobiol. Lett. 65:171-176, 1989)에서 공지한 미코박테리움 16S rRNA에서 만든 것이고, 그리고 데이터뱅크에 기탁된 서열에서 만든 것이다. 나일론 막(Hybond N, Amersham International, United Kingdom)에 고정시킨 올리고뉴클레오티드 AD10, AD11에 총 RNA를 하이브리드시켜 고갈시킨다. rRNA 밴드가 에티디움 브로마이드-착색된 아가로즈 겔에서 보이지 않을 때까지 하이브리드반응을 반복한다. 20dATP-잔기로 구성된 올리고뉴클레오티드 AD12(서열 83)은 RNA 결찰효소를 이용하여 농축 mRNA 분취물의 3'말단에 결찰을 시킨다. 제 1 가닥 cDNA 합성은 폴리(dT) 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 AD7(서열 84)을 이용하여 표준 과정에 따라 실행을 한다.
단일 측면-특정 PCR(3S-PCR)의 주형으로 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) cDNA를 이용하였다. 이 프로토콜에서, 축중 올리고뉴클레오티드 AD1(서열 85)은 보존된 리더 서열 및 막 단백질에 기초하여 고안되었다. 5'프라이머로는 프라이머 AD1을 그리고 3'프라이머로는 AD7을 이용하여 30회 증폭을 한 후에, 생성물은 요소/폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 미코박테리움 바카이에 특이적인 DNA 밴드를 잘라내어 프라이머 AD1과 AD7을 이용하여 다시 증폭을 시켰다. 겔 정제후에, 밴드는 pGEM-T(Promega)에 결찰을 시키고 염기 서열을 결정한다.
밴드 12B21의 결정된 뉴클레오티드 서열(서열 86) 및 예측 아미노산 서열(서열 87)을 가지고 조사를 하면, Furuchi et al.(Jnl. Biol. Chem. 266: 20928-20933, 1991)에서 공지한 스페르미딘/푸트레신 ABC 수송 복합체의 ATP-결합 단백질을 인코드하는 대장균(E. coli)의 pota 유전자에 상동성이 있는 것으로 나타났다. 대장균(E. coli)의 스페르미딘/푸트레신 수송 복합체는 네 개 유전자로 구성되고 이는 ABC 수송 족에 속한다. ABC(ATP-결합 카제트) 운반물질은 일반적으로 네 가지 유전자로 구성된다; ATP-결합 유전자, 가상 결합 유전자 및 두 개의 막통과 유전자. 막통과 유전자는 6개 막 스패닝 부분을 가지는 단백질을 인코드한다. 이 ABC 수송물질의 상동성은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza) (Fleischmann et al. Science 269: 496-512, 1995)와 미고플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)(Fraser, et al. Science, 270:397-403, 1995)의 게놈에서 확인되었다.
BamH1-절단된 람다 ZAP Express(Stratagene)에서 만든 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리는 표준 공정에 따라 방사능동위원소 라벨된 238bp 밴드 12B21로 프로브를 시킨다. 플락은 반복적인 스크리닝으로 순수하게 정제하고, 4.5kb 삽입물을 가지는 파아지미드는 서던 블랏팅 및 하이브리드에 의해 확인을 할 수 있다. 전체 길이의 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 상동 pota (ATP-결합 단백질)의 뉴클레오티드 서열은 4.5kb 단편을 서브클로닝시키고 염기 서열화에 의해 확인을 할 수 있다. 유전자는 가상 -10과 -35 프로모터 원소를 포함하는 320bp의 해독안되는 5'부분을 포함하는 1449bp로 구성된다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) pota 상동부의 뉴클레오티드와 예측되는 아미노산 서열은 각각 서열 88과 89에 나타내었다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) pota 상동부의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 발현 클로닝을 위한 프라이머 EV24(서열 90)와 EV25(서열 91)를 만든다. 증폭된 DNA 단편은 pProEX HT 원핵 발현 시스템(Gibco BRL)에 클론시키고, 적절한 대장균(E.coli)에서 발현은 0.6mM 이소프로필티오 β-갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 유도시킨다. 재조합 단백질은 GV-23로 명명하고, 제조업자의 지시에 따라 합체로부터 정제한다. 후속 연구에서, GV-23(서열 88)은 또 다른 벡터 pET16(Novagen)에 다시 클로닝시킨다.
상기에서 설명하는 4.5kb의 3'말단에서 322bp Sall-BamHl 서브클론은 대장균(E. coli)의 스페르미딘/푸트레신 ABC 수송물질 복합체의 potd 유전자(페리플라즘 단백질)에 상동성을 보여준다. 이 서브클론의 뉴클레오티드 서열은 서열 92에 나타내었다. 유전자를 확인하기 위해, 이 서브클론의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 표준 과정에 따라 lambda Zap Express(Stratagene)의 SalI-부위에서 만든 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리에 프로브한다. 클론은 1342bp가 대장균(E. coli)의 potd 유전자와 상동성을 보여준다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 potd 상동부분은 서브-클로닝과 염기 서열화에 의해 확인한다. 결정된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각 서열 93과 94에 나타내었다.
발현 클로닝을 위해, 결정된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) potd 로부터 프라이머 EV26(서열 95)과 Ev27(서열 96)을 만든다. 증폭된 단편은 pProEX HT 원핵 발현 시스템(Gibco BRL)안에 클론시킨다. 적절한 대장균(E. coli) 숙주에서 발현을 유도하기 위해 0.6mM IPTG를 첨가하고, 재조합 단백질은 GV24라 명명한다. 공급업자의 지시에 따라 합체에서 재조합 항원을 정제한다. 후속연구를 위해, GV-24(서열 93)는 또 다른 적절한 벡터 pET16(Novagen)에 대시 클론시킨다.
상기 실시예 2에서 설명하는 것과 같이, 정제된 재조합 단백질 GV23과 GV-24가 사람 PBL에서 T 세포 증식 및 인터페론-생산을 자극하는 능력을 검사한다. 이 검사의 결과는 다음의 표 6에 나타내었는데, 이때 (-)는 활성이 부족함을 나타내고; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 2배정도의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 2배 내지 4배 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상 활성이 큰 폴리펩티드를 나타내고, ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
제공자 G97005 제공자 G97006 제공자 G97007 제공자 G97008 제공자 G97009 제공자 G97010
증식 IFN-γ 증식 IFN-γ 증식 IFN-γ 증식 IFN-γ 증식 IFN-γ 증식 IFN-γ
GV-23 ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ + - + ++
GV-24 ++ + ++ + ND ND + +/- + +/- +/- ++
미코박테리움 바카이(M. vaccae) potd 상동부분에 인접한 염기 서열에서는 ABC 수송 복합체에서 두 개 막통과 단백질중에 하나인 대장균(E. coli)의 스페르미딘/푸트레신 ABC 수송 복합체의 potb 유전자에 상동성이 있는 것으로 나타났다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) potd 상동부분(GV-25라 명명함)은 추가로 서브콜로닝과 염기 서열화에 의해 확인을 할 수 있다. GV-25의 결정된 뉴클레오티드 서열 및 예측되는 아미노산 서열은 각 서열 97과 98에 나타내었다.
인접한 509bp의 추가 서브클로닝 및 서열을 조사하였으나 대장균(E. coli )의 두 번째 막통과 단백질인 PotC에 상동성은 나타나지 않았고, 이는 제 2 막통과 단백질은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 상동부분 ABC 수송물질에는 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 그러나, 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 아세틸-CoA 아세틸 전이효소에 상동성이 있는 오픈 리딩 프레임은 막통과 단백질의 하류 시작 530bp로 확인되었고, 해독된 단백질은 GV-26로 명명한다. GV-26의 결정된 뉴클레오티드 서열 및 단백질 서열은 각 서열 99와 100에 나타내었다.
GV-23을 분리하는 상기 설명하는 과정과 유사한 과정을 이용하여, 3S-PCR 밴드 12B28(서열 119)를 이용하여, 람다 ZAP Express(Stratagen)의 BamHI-부위에서 만들어진 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 라이브러리에서 분리한 클론은 새로운 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 이 유전자에 의해 인코드되는 항원은 GV-38A라 명명한다. GV-38A의 결정된 뉴클레오티드 서열 및 이의 예측된 아미노산 서열은 각 서열 120과 121에 나타내었다. 유전자 뱅크에 있는 것과 이들 서열을 비교해보면, 코스미드 MTCY428.12.(SPTREMBL:P71915)에서 이미 확인된 미지의 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 단백질에 일부 상동성이 있는 것으로 나타났다.
GV-38A의 상류 제 2 신규한 오픈 리딩 프레임이 확인되었고, 이 유전자에 의해 확인되는 항원은 GV-38B라 명명한다. GV-38B의 결정된 5'와 3'뉴클레오티드 서열은 각 서열 122와 123에 나타내고, 이의 예측된 아미노산 서열은 각 서열 124과 125에 나타내었다. 코스미드 MTCY428.11.(SPTREMBL:P71914)에서 이미 확인된 미지의 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 단백질에 일부 상동성이 있는 것으로 나타났다.
GV-38A와 GV-38B 항원은 발현 클로닝을 위해 증폭을 시키고, pET16 (Novagen)에 클론시킨다. GV-38A는 프라이머 KR11와 KR12(서열 126, 127)로 ??폭을 시키고, GV-38B는 프라이머 KR13와 KR14(서열 128, 129)로 증폭을 시킨다. 숙주 세포 BL21(DE3)에서 단백질 발현은 1mM IPTG를 첨가하여 유도하나 이들 구조에서는 단백질 발현이 되지 않았다. 항원 GV-38A 및 GV-38B의 N-말단은 이들 구조의 발현을 저해하는 소수성 부분으로 확인되었다. GB-38A의 소수성 부분은 6개 막 스패닝 부분이 있는 막통과부분 모티프로 확인되었다. 소수성 부분 없이 항원을 발현시키기 위해, GV-38A의 프라이머 KR20(서열 130) 및 GV-38B의 프라이머 KR21(서열 131)을 고안하였다. 절두된 GV-38A 유전자는 프라이머 KR20와 KR12으로 증폭을 시키고, 절두형 GV-38B는 KR21와 KR14으로 증폭을 시킨다. 절두형 GV38A와 GV-38B의 결정된 뉴클레오티드 서열은 각 서열 132와 133에 나타내었고, 이에 상응하는 예상 아미노산 서열은 각 서열 134와 135에 나타내었다.
실시예 9
예비 등전점 포커스 및 예비 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 미코박테리움 바카이 배양 여과물의 폴리펩티드 정제 및 특징의 조사
하기에서 설명하는 것과 같은 예비 등전점 포커스 및 예비 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 배양 여과물에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 가용성 단백질을 분리하였다. 다른 언급이 없는 한, 다음의 실시예에서 모든 %는 용적당 중량비를 말한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae)(ATCC Number 15483)는 250ℓ멸균 Medium 90에 배양을 하고, 이는 한외여과시켜 10kDa이상의 단백질은 모두 제거한다. 배지는 원심분리하여 박테리아를 제거하고, 0.45m 필터를 통하여 여과시켜 멸균시킨다. 멸균된 여과물은 10kDa 분자량을 차단하는 막으로 한외여과에 의해 농축시킨다.
10% 트리클로로아세트산으로 침전을 시켜 농축된 배양 여과물에서 단백질을 분리하였다. 침전된 단백질은 100mM Tris.HCl pH 8.0에서 다시 용해를 시키고, 동량의 아세톤을 첨가하여 다시 침전을 시킨다. 아세톤 침전물은 물에 용해를 시키고, 단백질은 동량의 클로로포름:메탄올 2:1(v/v)을 첨가하여 다시-침전을 시킨다. 클로로포름:메탄올 침전물은 물에 용해를 시키고, 용액은 냉동-건조를 시킨다.
냉동-건조된 단백질은 등전점 포커스 완충액에 다시 용해를 시키는데, 완충액에는 8M 탈이온화된 요소, 2% Triton X-100, 10mM 디티오트레톨, 2% 암포라이트(pH 2.5 - 5.0)를 포함한다. 샘플은 미리준비된 Ultrodex 겔의 수평 베드에서 16시간동안 8watt 정압으로 등전점 포커스에 의해 분취한다. 단백질은 물로 겔 베드 분취물로부터 용출을 시키고 10% 트리클로로아세트산으로 농축을 시킨다.
원하는 단백질을 포함하는 분취물 푸울은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인을 하고, 예비 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분취한다. 샘플은 12.5% SDS-PAGE 겔에서 분취하고, 니트로셀룰로오즈 막에 일렉트로블랏팅을 한다. 단백질은 Ponceau Red로 착색을 하여 막에 위치시키고, 물로 탈색을 g고, 40% 아세토니트릴/0.1M 중탄산 암모니움 pH 8.9를 이용하여 막으로부터 용출을 시키고, 그 다음 냉동건조하여 농축을 한다.
용출된 단백질은 실시예 2에서 설명하는 것과 같이, 면역 제공자의 말초 혈액 임파세포로부터 증식 및 인터페론-γ분비를 유도하는 능력에 대해 테스트를 한다. 이 검사에서 강한 반응을 나타내는 단백질은 추가 연구를 위해 선별한다.
선택된 단백질은 트리플로오르아세트산-아세토니트릴 시스템을 이용하여 Vydac Protein C4 컬럼에서 역상 크로마토그래프를 하여 추가 정제를 한다. 정제된 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 단백질 서열을 조사하고, PVDF 막에 일렉트로블랏팅을 한다. 단백질은 GV-40, GV-41, GV-42, GV-43, GV-44로 명명한다. 이들 폴리펩티드의 결정된 N-말단 서열은 각 서열 101-105에 나타내었다. 후속 연구에서는 GV-42의 5' 말단, 중간 단편 및 3' 말단 DNA 서열(서열 136, 137, 138)을 분리하였다. 이에 상응하는 예상 아미노산 서열은 서열 139, 140, 141에 각각 나타내었다.
모든 아미노산 서열은 TFASTA을 이용하여, EMBL 데이터 베이스에서 공지의 아미노산 서열과 비교를 한다. GV-40, GV42, GV-44에서는 유의성이 있는 상동성이 없었으나, GV-41에서는 단백질의 생합성이 종료될 때 mRNA에서 리보좀을 유리시키는 역할을 하는 단백질인 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 리보좀 리사이클링 인자와 유사하였다. GV-43에서는 이미 확인된 미지의 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 레프라(M. leprae)에 상동성을 가진다.
실시예 10
미코박테리움 바카이의 지질을 제거하고, 글리코실화를 제거한 미코박테리움 바카이와 재조합 단백질의 면역 조절 성질
본 실시예에서는 상이한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 구성원 및 이의 면역 조절 성질을 설명한다.
열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물
M. vaccae(ATCC Number 15483)는 37℃에서 멸균 Medium 90(이스트 추출물 2.5g/ℓ; 트립톤, 5g/ℓ; 포도당 1g/ℓ)에서 배양하였다. 세포는 원심분리하여 수득하고, 포도당이 첨가된 멸균 Middlebrook 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에 하루동안 37℃에서 옮긴다. 배지는 원심분리하여 박테리아를 펠렛화시키고, 배양 여과물은 제거한다. 박테리아 펠렛은 인산완충염에 10㎎/㎖의 농도(1010M. vaccae/㎖)로 재현탁을 시킨다. 세포 현탁액은 그 다음 120℃에서 15분간 증기멸균을 한다. 배양 여과물은 0.45 μM 필터를 통과시켜 멸균병에 옮긴다.
냉동건조된, 지질을 제거하고, 글리코실화를 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)
지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 준비하기 위하여, 증기멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 원심분리하여 펠렛화시키고, 펠렛은 물로 세척을 한 후에, 다시 원심분리하여 모으고 냉동건조를 한다. 이와 같은 냉동 건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 한 방울은 따라 분류하여 동결전조된 미코박테리움 바카이라 한다. 실험에서 사용을 할 경우에 이는 원하는 농도로 PBS에 다시 현탁을 시킨다. 냉동-건조된 미코박테리움 바카이는 실온에서 60분간 클로로포름/메탄올(2:1)로 추출한 다음 추출을 1회 이상 반복한다. 클로로포름/메탄올 추출로부터 잔류물은 2시간동안 재환류를 시키면서 50% 에탄올로 추가 추출을 한다. 모아진 50% 에탄올 추출물을 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질의 원료로 한다(하기 참조). 50% 에탄올 추출물에서 남은 잔류물은 냉동건조를 시키고 무게를 잰다. 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 양은 이용된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 시작 중량(젖은 상태)의 11.1%와 등가이다. 바이오검사를 위하여, 지질이 제거된 그리고 글리코실화되지 않은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(DD-M. vaccae; 이는 또한 도 8과 9에서 지질이 제거된 미코박테리움 바카이로도 칭함)는 초음파분쇄에 의해 인산-완충 염에 재현탁을 시키고, 증기면균으로 살균을 한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질
상기와 같이 모아진 50% 에탄올 추출물은 회전 증발시켜 건조시키고, 물에 다시 용해시키고, 냉동-건조를 한다. 회수된 당지질의 양은 이용된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 시작 중량(젖은 상태)의 1.2%에 해당한다. 바이오검사를 위해 당지질은 인산완충염에 용해시킨다.
대식세포로부터 인터루킨-12의 생산
하기에서 설명을 하는 것과 같이, 전체 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 구성원은 대식세포에서 인터루킨-12(IL-12)의 생산을 자극하는 것으로 나타났는데, IL-12는 Th1 반응에 중요한 성분이다. C57BL/6J 쥐 집단에 DIFCO 티오글리콜레이트을 복막으로 주사하고, 3일 후에, 복막의 대식세포를 수득하고, 3시간동안 인터페론-감마가 있는 세포 배양물에 둔다. 배양 배지는 교체하고, 다양한 농도의 열에 의해 죽은 온전한 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 동결건조한 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-M. vaccae(도 8에서 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로도 칭함), 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 첨가한다. 37℃에서 3일간 추가 배양을 한 후에, 배양 상청액에 대식세포에 의해 생산된 IL-12가 있는지를 검사한다. 도 8에서 볼 수 있는 것과 같이, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 대식세포로부터 IL-12의 생산을 자극하는 것으로 나타났다.
도 9A, B, C에는 별도의 실험으로부터의 데이터를 나타내었는데, 이때 C57BL/6 쥐(도 9A), BALB/C 쥐(도 9B), C3H/HeJ 쥐(도 9C)에는 복막으로 DIFCO 티오글리콜레이트를 제공하고, 3일 후에, 복막 대식세포를 수득하여, 이를 3시간동안 인터페론-감마가 있는 배양물에 둔다. 배양 배지는 교체하고, 다양한 농도의 미코박테리움 바카이 재조합 단백질 GVc-3(GV-3), GVc4P(GV 4P), GVc-7 (GV7), GV-23, GV 27, 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-M. vaccae(도 9A, B, C에서 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 명명함), 미코박테리움 바카이 당지질 또는 리포폴리사카라이드를 첨가한다. 37℃에서 3일간 배양을 한 후에, 배양 상청액에는 대식세포에 의해 생산되는 IL-12가 존재하는 지에 대해 검사를 한다. 도 9A, B, C에서 볼 수 있는 것과 같이, 재조합 단백질 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 준비물은 대식세포로부터 IL-12의 생산을 자극한다.
실시예 11
원숭이(cynomologous)의 결핵에 미코박테리움 바카이로 피하 경로를 통하여 면역주사를 한 효과
본 실시예에서는 살아있는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)의 도전전에 원숭이에서 피하로 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 면역 주사한 효과를 설명한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae)(ATCC Number 15483)는 37℃에서 멸균 Medium 90 (이스트 추출물, 2.5g/ℓ; 트립톤, 5g/ℓ; 포도당, 1g/ℓ)에 배양을 한다. 세포는 원심분리에 의해 수득을 하고, 포도당이 첨가된 Middlebrook 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에서 하룻동안 37℃에서 배양을 한다. 배지는 원심분리하여 박테리아를 펠렛화시키고, 배양 여과물을 제거한다. 박테리아 펠렛은 10㎎/㎖ 농도에서 인산 완충염에 재현탁을 시켜 ㎖당 1010M. vaccae 이 되도록 한다. 세포 현탁액은 120℃에서 15분간 증기멸균한다. 배양 여과물은 0.45μM 필터를 통하여 멸균 병에 넣는다.
이 연구에서는 원숭이(cynomolgous) 세 집단이 포함되는데, 각 집단은 2마리 원숭이를 포함한다. 각 집단의 원숭이는 열에 의해 죽은 온전한 미코박테리움 마카이(M. vaccae)으로 면역주사를 하고, 한 집단은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 면역주사를 하고, 기준 집단에는 면역주사를 하지 않았다. 표 7에는 각 집단 원숭이에게 면역주사에 이용된 조성물, 이뮤노겐 양 및 투여 경로를 제공한다.
피하 면역주사 경로의 비교
집단번호 원숭이 ID 번호 항원양 투여경로
1(기준) S3101-E 0 -
3144-B 0 -
2(열로 죽인 M. vaccae로 면역주사) 4080-B 500㎍ 경피
3586-B 500㎍ 경피
3(배양여과물로 면역주사) 3564-B 100㎍ 경피
3815-B 100㎍ 경피
면역 주사를 하기 전에, 모든 원숭이의 무게(Wt kgs), 체온(temp)을 재고, 혈액 샘플을 취하여, 적혈구 침전 속도(ESR mm/hr) 및 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)에서 준비한 정제 단백질(PPD)로 in vitro 도전에 대한 임파구 증식(LPA)를 결정한다. 면역주사후 33일 후에, 이와 같은 측정을 반복한다. 34일째에, 모든 원숭이는 동일한 양의 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 이용하여 제 2 면역주사를 맞는다. 62일째에, 체중, 체온, ESR, PPD에 대한 LPA를 측정을 하고, 모든 원숭이는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) Erdman 균주 103 CFU로 감염을 시킨다. 감염 후 28일에, 체중, 체온, ESR, PPD에 대한 LPA을 모든 원숭이에서 측정을 하고, 폐는 X-레이 사진을 찍어, 살아있는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)의 감염에 의해 결핵이 개시되었는 지를 결정한다.
도 8A, B, C에서 볼 수 있는 것과 같이, 기준 집단의 원숭이에서는 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)로 감염을 시킨 후에 28일경에 폐 결핵의 징후가 나타났다. 500㎍ 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 2회 약량으로 피하를 통하여 면역주사를 맞은 원숭이의 경우에 감염이 있은 지 84일 후에도 임상적인 질환은 나타나지 않았다. 100㎍ 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 피하를 통하여 면역 주사를 맞은 원숭이에서는 임상적인 질환이 개시되는 것이 지연되었다.
기준 원숭이
ID# Days Wt.Kgs Temp. ESR Mm/hr LPA PPD 10㎍ LPA PPD 1㎍ X-Ray
S3101E 0 2.17 37.0 0 0.47 1.1 Negative
34 1.88 37.3 ND 0.85 1.4 ND
62 2.02 36.0 ND 1.3 1.5 ND
⇒ Time of Infection
28 2.09 38.0 2 1.3 3.7 Positive
56 1.92 37.2 20 5.6 9.1 Positive
84 1.81 37.5 8 4.7 5.6 Positive
ID# Days Wt.Kgs Temp. ESR Mm/hr LPA PPD 10㎍ LPA PPD 1㎍ X-Ray
3144-B 0 2.05 36.7 0 0.87 1.8 Negative
34 1.86 37.6 ND 2.2 1.4 ND
62 1.87 36.5 ND 1.6 1.6 ND
⇒ Time of Infection
28 2.10 38.0 0 12 8.7 Positive
56 1.96 37.6 0 29.6 21.1 Positive
84 1.82 37.3 4 45.3 23.4 Positive
ND = Not Done
열에 의해 죽은 온전한 미코박테리움 바카이(500㎍)를 피하로 면역주사한 원숭이
ID# Days Wt.Kgs Temp. ESR Mm/hr LPA PPD 10㎍ LPA PPD 1㎍ X-Ray
4080-B 0 2.05 37.1 1 1.1 0.77 Negative
34 1.97 38.0 ND 1.7 1.4 ND
62 2.09 36.7 ND 1.5 1.5 ND
⇒ Time of Infection
28 2.15 37.6 0 2.6 2.1 Negative
56 2.17 37.6 0 8.2 7.6 Negative
84 2.25 37.3 0 3.8 2.8 Negative
ID# Days Wt.Kgs Temp. ESR Mm/hr LPA PPD 10㎍ LPA PPD 1㎍ X-Ray
3586-B 0 2.29 37.0 0 1.1 1.4 Negative
34 2.22 38.0 ND 1.9 1.6 ND
62 2.39 36.0 ND 1.3 1.6 ND
⇒ Time of Infection
28 2.31 38.2 0 3.2 2.6 Negative
56 2.32 37.2 0 7.8 4.2 Negative
84 2.81 37.4 0 3.4 1.8 Negative
ND = Not Done
열에 의해 죽은 온전한 미코박테리움 바카이(100㎍)를 피하로 면역주사한 원숭이
ID# Days Wt.Kgs Temp. ESR Mm/hr LPA PPD 10㎍ LPA PPD 1㎍ X-Ray
3564-B 0 2.40 37.2 0 1.4 1.4 Negative
34 2.42 38.1 ND 3.3 2.7 ND
62 2.31 37.1 ND 3.1 3.4 ND
⇒ Time of Infection
28 2.41 38.6 13 24 13.6 Negative
56 2.38 38.6 0 12.7 12.0 Negative
84 2.41 38.6 2 21.1 11.8 Positive
ID# Days Wt.Kgs Temp. ESR Mm/hr LPA PPD 10㎍ LPA PPD 1㎍ X-Ray
3815-B 0 2.31 36.3 0 1.0 1.4 Negative
34 2.36 38.2 ND 1.9 2.0 ND
62 2.36 36.4 ND 3.7 2.8 ND
⇒ Time of Infection
28 2.45 37.8 0 2.1 3.3 Negative
56 2.28 37.3 4 8.0 5.6 Negative
84 2.32 37.4 0 1.9 2.2 Positive
ND = Not Done
본 발명은 설명을 위하여 실시예를 통하여 설명을 하였으나, 이의 변화, 수정등이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고도 가능하기 때문에, 본 발명은 청구범위에 국한한다.
서열표 리스트
(1)일반정보
(i)출원인;
(ii) 발명의 명칭; Compounds and Methods for treatment and diagnosis of Mycobacterial Infections
(iii) 서열의 수; 141
(iv) 서신 주소
(A) 주소; Russell McVeagh West-Walker
(B) 거리; The Todd Building, Cnr Brandon Street ＆ Lambton Quay
(C) 도시; Wellington
(D) 주;
(E) 나라; New Zealand
(F) 우편코드;
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A)매체형태; 디스크
(B)컴퓨터;IBM 호환성
(C)작동시스템; DOS
(D)소프트웨어; Wordperfect 5.2
(vi) 현재 출원 자료
(A) 출원번호;
(B) 출원일;
(C) 분류
(vii) 우선 출원 자료
(A) 출원 번호;
(B) 출원일;
(viii) 대리인 정보
(A) 이름; Bennett, Michael Roy
(B) 등록번호;
(C) 문서 번호; 22238/MRB
(ix) 통신정보
(A) 전화번호; 64 4 499 9058
(B) 펙스번호; 64 4 499 9306
(C) 텔렉스;
(2)서열 1에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 25 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 1
(2)서열 2에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 10개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 2
(2)서열 3에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 11개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 3
(2)서열 4에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 21개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 4
(2)서열 5에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 29개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 5
(2)서열 6에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 21개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 6
(2)서열 7에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 11개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 7
(2)서열 8에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 14 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 8
(2)서열 9에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 16개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 9
(2)서열 10에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 9개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 10
(2)서열 11에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 14개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 12...12
(D)다른 정보: 잔기는 Glu 또는 Ile가 될 수 있음.
(xi)서열 11
(2)서열 12에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 11개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 12
(2)서열 13에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 21 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 13
(2)서열 14에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 14
(2)서열 15에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 2...2
(D)다른 정보: 잔기는 Gly 또는 Ala가 될 수 있음.
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 15...15
(D)다른 정보: 잔기는 Pro 또는 Ala가 될 수 있음.
(xi)서열 15
(2)서열 16에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 16
(2)서열 17에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 25개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 17
(2)서열 18에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 25개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 15...15
(D)다른 정보: 잔기는 Ala 또는 Arg가 될 수 있음.
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 23...23
(D)다른 정보: 잔기는 Val 또는 Leu가 될 수 있음.
(xi)서열 18
(2)서열 19에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 8개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 19
(2)서열 20에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 25개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 20
(2)서열 21에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 21
(2)서열 22에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 22
(2)서열 23에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 19개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 23
(2)서열 24에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 24
(2)서열 25에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 14개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 25
(2)서열 26에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 16...16
(D)다른 정보: 잔기는 Ser 또는 Val가 될 수 있음.
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 17...17
(D)다른 정보: 잔기는 Gln 또는 Val가 될 수 있음.
(xi)서열 26
(2)서열 27에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 14개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 4...4
(D)다른 정보: 잔기는 Tyr 또는 pro가 될 수 있음.
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 8...8
(D)다른 정보: 잔기는 Val 또는 Gly가 될 수 있음.
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 9...9
(D)다른 정보: 잔기는 Ile 또는 Tyr가 될 수 있음.
(xi)서열 27
(2)서열 28에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산p
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 28
(2)서열 29에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 16개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 2...2
(D)다른 정보: 잔기는 Leu 또는 Pro가 될 수 있음.
(xi)서열 29
(2)서열 30에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 330개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 30
(2)서열 31에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 327개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 31
(2)서열 32에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 338개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 32
(2)서열 33에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 325개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 33
(2)서열 34에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 338개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 34
(2)서열 35에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 323개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 35
(2)서열 36에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 333개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 36
(2)서열 37에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 340개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 37
(2)서열 38에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형
(xi)서열 38
(2)서열 39에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형
(xi)서열 39
(2)서열 40에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 1211bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 40
(2)서열 41에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 485bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 41
(2)서열 42에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 1052bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 42
(2)서열 43에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 326개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 43
(2)서열 44에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 161개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 44
(2)서열 45에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 334개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 45
(2)서열 46에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 795bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 46
(2)서열 47에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 142개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 47
(2)서열 48에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 300bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 48
(2)서열 49에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 563bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 49
(2)서열 50에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 434bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 50
(2)서열 51에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 438bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 51
(2)서열 52에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 87개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 52
(2)서열 53에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 175개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 53
(2)서열 54에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 144개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 54
(2)서열 55에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 145개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 55
(2)서열 56에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 10개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 1...1
(D)다른 정보: 잔기는 Gly 또는 Ile, Leu가 될 수 있음.
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 2...2
(D)다른 정보: 잔기는 Ile, Leu 또는 Gly가 될 수 있음.
(xi)서열 56
(2)서열 57에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 8개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 7...7
(D)다른 정보: 잔기는 Ile 또는 Leu가 될 수 있음.
(xi)서열 57
(2)서열 58에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 11개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(ix) 특징;
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 4...4
(D)다른 정보: 잔기는 Gln 또는 Gly가 될 수 있음.
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치: 5...5
(D)다른 정보: 잔기는 Gly 또는 Gln가 될 수 있음.
(xi)서열 58
(2)서열 59에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 34개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 59
(2)서열 60에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형
(xi)서열 60
(2)서열 61에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 것
(xi)서열 61
(2)서열 62에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 313bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 62
(2)서열 63에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 18개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 63
(2)서열 64에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 25개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 64
(2)서열 65에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 26개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 65
(2)서열 66에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 32bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른형태
(xi)서열 66
(2)서열 67에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 32bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른형태
(xi)서열 67
(2)서열 68에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 30bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 68
(2)서열 69에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 26bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 69
(2)서열 70에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 161아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 70
(2)서열 71에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 33bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 71
(2)서열 72에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 32bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 72
(2)서열 73에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 73
(2)서열 74에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 825bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 74
(2)서열 75에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 273개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 75
(2)서열 76에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 10개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 76
(2)서열 77에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 337bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 77
(2)서열 78에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 112개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 78
(2)서열 79에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 360bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 79
(2)서열 80에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 120개 아미노산
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 80
(2)서열 81에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 43bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른형태
(xi)서열 81
(2)서열 82에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 43bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 82
(2)서열 83에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 20bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 83
(2)서열 84에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 31bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 84
(2)서열 85에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 31bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 85
(2)서열 86에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 238bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; DNA(게놈)
(xi)서열 86
(2)서열 87에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 79개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 87
(2)서열 88에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 1518bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 88
(2)서열 89에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 376개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi) 서열 89
(2)서열 90에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 33bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 90
(2)서열 91에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 31bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; DNA
(xi)서열 91
(2)서열 92에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 323bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 DNA
(xi)서열 92
(2)서열 93에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 1341bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 DNA
(xi)서열 93
(2)서열 94에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 393개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 94
(2)서열 95에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 22bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 95
(2)서열 96에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 21bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 96
(2)서열 97에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 861bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 DNA
(xi)서열 97
(2)서열 98에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 259개 아미노산
(B)형태;아미노산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 98
(2)서열 99에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 277bp
(B)형태;핵산
(C)가닥;단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 DNA
(xi)서열 99
(2)서열 100에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 92개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 100
(2)서열 101 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 12개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(ix)특징
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치; 1...1
(D)다른 정보; 잔기는 Glu 또는 Pro가 될 수 있음.
(A)이름/키; 다른 것
(B)위치; 2...2
(D)다른 정보; 잔기는 Pro 또는 Glu가 될 수 있음.
(xi)서열 101
(2)서열 102 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 24개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 102
(2)서열 103 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 23개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 103
(2)서열 104 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 104
(2)서열 105 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 9개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 105
(2)서열 106 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 485bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 106
(2)서열 107 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 501bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 107
(2)서열 108 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 180bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 108
(2)서열 109 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 166개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 109
(2)서열 110 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 74개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 110
(2)서열 111 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 503bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 111
(2)서열 112 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 167개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 112
(2)서열 113 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 1569bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 113
(2)서열 114 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 523개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 114
(2)서열 115 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 647bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 115
(2)서열 116 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 927bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 116
(2)서열 117 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 215개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 117
(2)서열 118 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 309개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 118
(2)서열 119 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 162bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 119
(2)서열 120 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 1366bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 120
(2)서열 121 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 455개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 121
(2)서열 122 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 898bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 122
(2)서열 123 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 1259bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 123
(2)서열 124 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 299개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 124
(2)서열 125 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 419개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 125
(2)서열 126 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 27bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 126
(2)서열 127 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 26bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 127
(2)서열 128 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 33bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 128
(2)서열 129 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 32bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 129
(2)서열 130 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 27bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 130
(2)서열 131 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 27bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 다른 형태
(xi)서열 131
(2)서열 132 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 844bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 131
(2)서열 133 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 742bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 133
(2)서열 134 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 282개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 134
(2)서열 135 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 247개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 135
(2)서열 136 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 45bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 136
(2)서열 137 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 340bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 137
(2)서열 138 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 235bp
(B)형태; 핵산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 게놈 cDNA
(xi)서열 138
(2)서열 139 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 15개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 139
(2)서열 140 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 113개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 140
(2)서열 141 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 73개 아미노산
(B)형태; 아미노산
(C)가닥; 단일가닥
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 141

Claims (49)

  1. 가용성 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 또는 이의 변이체의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 이때 항원은 미코박테리움에 이미 노출된 환자에게서 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 이때 항원은
    (a) 서열 1-4, 9-16, 18-21, 23, 25,, 26, 28, 29, 44, 45, 47, 52-55, 63, 64, 70, 75, 89, 94, 98, 100-105, 109, 110, 112, 121, 124, 125, 134, 135, 140, 141 ;
    (b) 컴퓨터 연산 BLSATP에 의해 계산을 하였을 경우에, 서열 1-4, 9-16, 18-21, 23, 25,, 26, 28, 29, 44, 45, 47, 52-55, 63, 64, 70, 75, 89, 94, 98, 100-105, 109, 110, 112, 121, 124, 125, 134, 135, 140, 141의 서열에 적어도 99% 상동인 서열에서 선택된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 이때 항원은
    (a) 서열 40-42, 46, 48-51, 74, 88, 93, 97. 99, 106-108, 111, 120, 122, 123, 132, 133, 136-138;
    (b) 서열 40-42, 46, 48-51, 74, 88, 93, 97. 99, 106-108, 111, 120, 122, 123, 132, 133, 136-138에 상보적인 서열;
    (c) 컴퓨터 연산 FASTA에 의해 계산을 하였을 경우에, (a)서열 또는 (B)서열에 적어도 99% 상동인 서열에서 선택된 DNA 분자에 의해 인코드되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제 1 항 내지 3항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  5. 제 4 항에 따른 DNA 분자로 구성된 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제 5 항에 따른 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  7. 제 6 항에 있어서, 숙주 세포는 대장균(E. coli), 미코박테리움(Mycobacteria), 곤충, 이스트 및 포유류 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  8. 제 1 항 내지 3 항중 어느 한 항에 따르는 두 개 이상의 폴리펩티드로 구성된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제 1 항 내지 3 항중 어느 한 항에 따르는 한 개 이상의 폴리펩티드와 제약학적 수용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  10. 제 4 항에 따르는 DNA 분자와 제약학적 수용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  11. 배양물에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포에 의해 분비되는 하나이상의 성분과 제약학적 수용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  12. 제 8 항에 따르는 융합 단백질과 제약학적 수용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따르는 하나 이상의 폴리펩티드와 비-특정 면역 반응 증폭물질로 구성된 것을 특징으로 하는 백신.
  14. 제 4 항에 따르는 DNA 분자와 비-특정 면역 반응 증폭물질로 구성된 것을 특징으로 하는 백신.
  15. 배양물에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포에 의해 분비되는 하나이상의 성분과 비-특정 면역 반응 증폭물질로 구성된 것을 특징으로 하는 백신.
  16. 제 8 항에 따르는 D융합 단백질과 비-특정 면역 반응 증폭물질로 구성된 것을 특징으로 하는 백신.
  17. 제 13 내지 16항중 어느 한항에 있어서, 비-특정 면역 반응 증폭물질은 어쥬번트인 것을 특징으로 하는 백신.
  18. 제 13 내지 16항중 어느 한항에 있어서, 비-특정 면역 반응 증폭물질은 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포인 것을 특징으로 하는 백신.
  19. 제 13 내지 16항중 어느 한항에 있어서, 비-특정 면역 반응 증폭물질은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 배양 여과물인 것을 특징으로 하는 백신.
  20. 환자에서 보호 면역성을 유도하는 방법에 있어서, 제9항 내지 12항중 어느 한 항에 따르는 제약학적 조성물을 환자에 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 환자에서 보호 면역성을 유도하는 방법에 있어서, 제13항 내지 19항중 어느 한 항에 따르는 백신을 환자에 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 환자에서 미코박테리움(mycobacterial) 감염을 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 제1항-제3항에 따른 하나이상의 폴리펩티드를 환자의 피부세포와 접촉을 시키고;
    (b) 환자의 피부에 면역 반응을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 면역 반응은 경결(硬結)인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 진단 키트에 있어서,
    (a)제1항 내지 제3항중 어느 한항에 따른 폴리펩티드;
    (b)환자의 피부 세포에 폴리펩티드를 접촉시키는 장치로 구성된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  25. 생물학적 샘플에서 미코박테리움 감염을 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 따른 폴리펩티드와 생물학적 샘플을 접촉을 시키고;
    (b)폴리펩티드중 적어도 한 개에 결합하는 항체가 샘플안에 존재하는 지를 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, (a)단계에는 38kD 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tunerculosis) 항원과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계가 추가로 구성되고; (b)단계에는 38kD 미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tunerculosis) 항원에 결합하는 항체가 샘플에 존재하는 지를 감지하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 폴리펩티드는 고형 서포트에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 생물학적 샘플은 전체 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 오줌에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 생물학적 샘플에서 미코박테리움 감염을 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 따른 폴리펩티드에 결합을 할 수 있는 결합제와 생물학적 샘플을 접촉을 시키고;
    (b)결합제에 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드가 샘플안에 존재하는 지를 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 결합제는 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 결합제는 다클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 진단 키트에 있어서,
    (a)제1항 내지 제3항중 어느 한항에 따른 적어도 한 개의 폴리펩티드;
    (b)감지 시약으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  33. 제 32 항에 있어서, 폴리펩티드는 고형 서포트에 고정된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  34. 제 32 항에 있어서, 감지 시약은 결합제에 공액된 리포터 기로 구성되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  35. 제 34 항에 있어서, 결합제는 항-이뮤노글로블린, 단백질 G, 단백질 A, 렉틴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  36. 제 34 항에 있어서, 리포터 기는 방사능동위원소, 형광기, 발광기, 효소, 바이오틴 및 염료 물질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  37. 제 1 항 내지 제 3항에 따른 폴리펩티드에 결합을 하는 것을 특징으로 하는 단클론항체.
  38. 제 1 항 내지 제 3항에 따른 폴리펩티드에 결합을 하는 것을 특징으로 하는 단클론항체.
  39. 항원에 대한 비-특정 면역 반응을 강화하는 방법에 있어서,
    (a) 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포;
    (b) 글리코실화안된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 그리고
    (c) 지질 및 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포에서 선택된 성분을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 항원에 대한 비-특정 면역 반응을 강화하는 방법에 있어서, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포의 배양 여과물을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  41. (a) 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포;
    (b) 글리코실화안된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 그리고
    (c) 지질 및 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포에서 선택된 조성물.
  42. 환자에서 보호 면역성을 유도하는 방법에 있어서, 제 41항에 따르는 조성물을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  43. (a) 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포;
    (b) 글리코실화안된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 그리고
    (c) 지질 및 글리코실을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포에서 선택된 성분과 비-특정 면역 반응 증폭제로 구성된 것을 특징으로 하는 백신.
  44. 환자에서 보호 면역성을 유도하는 방법에 있어서, 제 43항에 따르는 백신을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 항원에 대한 비-특정 면역 반응을 강화하는 방법에 있어서, 항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드를 투여하고, 이때 항원에는
    (a) 서열 114, 117, 118;
    (b) 서열 114, 117, 118에 적어도 97% 상동성을 가지는 서열에서 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드로 된 백신에 있어서, 이때 항원에는
    (a) 서열 114, 117, 118;
    (b) 서열 114, 117, 118에 적어도 97% 상동성을 가지는 서열에서 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  47. (a) 서열 114, 118;
    (b) 서열 114, 118에 적어도 97% 상동성을 가지는 서열에서 선택된 아미노산 서열을 필수적으로 가지는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 면역학적으로 반응성이 있는 것을 특징으로 하는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 단편.
  48. 미코박테리움 감염에 대해 보호 면역성을 강화시키는 방법에 있어서, 항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드를 투여하고, 이때 항원에는
    (a) 서열 114, 117, 118;
    (b) 서열 114, 117, 118에 적어도 97% 상동성을 가지는 서열에서 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 면역원 부분으로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 항원에는
    (a) 서열 114, 117, 118;
    (b) 서열 114, 117, 118에 적어도 97% 상동성을 가지는 서열에서 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
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