KR20000035139A

KR20000035139A - 모세관 전기영동장치, 샘플 플레이트 및 시료 주입방법

Info

Publication number: KR20000035139A
Application number: KR1019990047957A
Authority: KR
Inventors: 하야시자키요시히데; 나카무라신; 하자마마코토; 후지와케히데시
Original assignee: 아리마 아키도; 리까가쿠 켄큐쇼; 니시오카 요시아키; 시마쯔 코퍼레이션
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-11-01
Publication date: 2000-06-26
Also published as: US6517696B1; EP0999443A2; KR20060088516A; CA2287709A1; US20040217004A1; US7195698B2; EP0999443A3

Abstract

샘플 플레이트(100)의 전극판(104)이 전기영동장치의 본체 위에 설치되는 한편, 플러그(106)가 고전압 라인 접속 구멍(107) 내부에 삽입되어 고압 분배 케이블에 접속된다. 기저판(101)의 각각의 우물부는, 우물부 안내부재(103)의 관통공 내부에 삽입되고, 전극판(104)의 공동부(105) 내부에 더 가압장착되어 맞물림으로써, 기저판(101)을 전극판(104)에 고정시킨다. 그후, 시료가 기저판(101)의 각각의 우물부(102) 내부에 주입되고, 영동 전압을 인가하여 시료를 모세관 컬럼 내부에 전기영동적으로 주입하기 위해, 모세관 컬럼의 일단이 각각의 우물부(102) 내부에 침적된다.

Description

모세관 전기영동장치, 샘플 플레이트 및 시료 주입방법{CAPILLARY ELECTROPHORETIC APPARATUS, SAMPLE PLATE AND SAMPLE INJECTION METHOD}

본 발명은, 모세관 컬럼의 일단에 주입된 시료를 전기영동으로 분리하는 모세관 전기영동부와, 모세관 컬럼의 적당한 위치에서 모세관 칼럼 내부에서 분리된 각각의 성분을 검출하는 검출수단을 구비한 모세관 전기영동장치에 관한 것으로, 특히 모세관 칼럼 내부에 대한 시료 주입에 특징을 갖는 방법 및 장치에 관한 것이다.

단일 모세관 컬럼을 구비한 전기영동장치 이외에, 모세관 전기영동장치는, 복수의 시료를 차례로 복수의 모세관 컬럼 내부에 주입하고, 모든 모세관 컬럼에 있는 시료를 동시에 전기영동으로 분리하는 복수의 모세관 컬럼을 포함하는 다중 모세관 어레이 영동부(migration part)와, 다중 모세관 어레이 영동부에 있는 모세관 컬럼을 빛으로 주사하여, 조사된 부분에 있는 시료에 의한 흡광도, 또는 시료로부터의 형광도를 측정하는 광학 측정부를 구비한 다중 모세관 영동장치를 갖는다.

상기한 모세관 컬럼은, 영동용 겔로 충전된 것과 충전되지 않은 것을 포함한다.

이 모세관 전기영동장치는, 단백질의 분리와, DNA에 대한 서열의 결정에 응용된다. DNA에 대한 서열 결정에 적용하였을 때, 모세관 전기영동장치는, 생거 반응(Sanger's reaction)을 이용하여, 형광 물질로 프라이머(primer) 또는 터미네이터(terminator)를 라벨링하여 제조된 DNA 단편 시료를 전기영동으로 분리하고, 영동과정 동안 DNA 단편 시료로부터의 형광을 검출하여, 염기 서열을 결정한다.

이때, 인체의 게놈과 같은 길이가 긴 염기 서열을 갖는 DNA에 대한 서열 결정을 위해서는 높은 감도, 고속 및 높은 처리능력을 갖는 DNA 시퀀서(sequencer)가 필요하다. 한가지 방법으로서, 평판형 슬랩 겔(slab gel)을 사용하는 대신에 복수의 모세관 컬럼을 배치하여 제조된 다중 모세관 DNA 시퀀서가 제안되어 있다. 이와 같은 모세관 컬럼을 사용하면, 슬랩 겔이 비해, 시료를 용이하게 취급하거나 주입할 수 있을 뿐 아니라, 시료가 고속으로 영동할 수 있으며 높은 감도로 검출될 수 있다. 고전압이 슬랩 겔에 인가되면, 주울 열에 의한 영향으로 인해 대역이 분산되거나 온도 구배가 발생한다. 그러나, 모세관 컬럼은, 고전압을 인가하여 고속 영동을 수행하더라도, 이와 같은 문제를 일으키지 않으며, 적은 대역 분산을 갖고 높은 감도로 검출을 수행할 수 있다.

모세관 전기영동에 있어서는, 시료가 압력하에서 또는 전압의 인가를 받으면서 모세관 컬럼 내부에 주입된다. 장치 구조의 단순함과, 작동의 용이함과, 파라미터의 우수한 제어가능성으로 인해, 시료를 전기영동적으로 주입하는 방법이 일반적으로 광범위하게 사용된다.

시료를 모세관 컬럼 내부에 주입하는 방법과 관련하여, 후속된 영동 분리시의 영동 분리도(migrational separability)가 열화되지 않아야 하며, 시료의 주입이 더 간편해야만 한다.

모세관 컬럼이 겔로 충전되거나 아니거나에 관계없이, 모세관 컬럼의 일단은 준비된 시료 내부에 침적되어야 하고, 타단은 버퍼 용액에 침적되어야 하며, 백금선과 같은 전극이 시료 내부의 모세관 컬럼의 단부 부근에 침적되어야 한다. 전기영동 시료 주입시에 각각의 모세관 컬럼의 단부 부근에 전극을 지지하는 구조에 있어서는, 전기영동을 동시에 수행하기 위해 어레이의 형태로 복수의 모세관 컬럼을 총괄적으로 배치하는 다중 모세관 전기영동 장치의 경우에 시료 입을 위한 전극 구조가 복잡하게 된다. 시료 주입 용기 내부에 포함된 시료 내부에 모세관 컬럼의 일단을 침적하고, 전압 등을 인가함으로써 주입을 수행한 후에, 모세관 컬럼의 일단을 영동용 버퍼를 포함하는 저장조 내부로 이동한다. 따라서, 시료 주입과 영동의 개시 사이의 조작이 귀찮으며, 이러한 조작이 자동화된다면 간편할 것이다.

단일 모세관 컬럼과 다중 모세관 전기영동장치를 포함하는 양자의 전기영동장치에 있어서, 시료 주입법에 의존하여, 겔로 충전된 모세관 전기영동에 있어서 영동 분리도가 열화될 수 있다. 시료를 전기영동적으로 주입하는 경우에, 전압 인가를 시작할 때 소정의 고전압이 수초 내에 인가되며, 도 4에 도시된 것과 같은 종래의 전압 인가법에 있어서는 전압 인가를 종료하였을 때 수초 내에 고전압이 제로값이 된다. 도 4를 참조하면, 종축은 전압(kV)을 나타내고 횡축은 시간(초)을 나타낸다. 이 예에 있어서는, 7.6kV의 전압이 30초 동안 인가된다. 그러나, 고전압이 모세관 컬럼에 인가되는 경우에는, 열 발생 등에 의해 모세관 컬럼의 일단에 놓인 겔에 상당한 스트레스가 작용하여, 모세관 컬럼 내부로의 시료의 주입을 방해함으로써, 영동 분리시에 분리가능한 염기의 수가 제한된다는 악영향을 초래한다. 더구나, 고전압이 갑자기 인가되는 경우에, 전기삼투(electroosmosis) 흐름으로 인해 겔이 모세관 컬럼의 단부로부터 강제로 배출될 수 있다. 강제로 배출된 겔이 손상되면, 영동 분리상태가 불리하게 열화된다.

슬랩 겔 전기영동에 있어서는, 겔 매트릭스 내부에 수용될 수 없는 크기를 갖는 주형(template) DNA와 같은 큰 분자(거대분자라 칭한다)는 겔 매트릭스 부분에 들어가지 않고 겔 매트릭스 부분에 대한 입구에 잔류한다. 슬랩 겔 전기영동에 있어서 전기장의 구동력에 의해 거대분자를 움직이는 힘이 분리부에 가해지더라도, 분리부는 그것의 충분한 용적으로 인해 이 힘에 대항하는 충분한 저항을 가지므로, 거의 문제가 되지 않는다. 또한, 모세관 전기영동에 있어서, 거대분자는 겔 매트릭스 부분에 들어가지 않고, 겔 매트릭스 부분에 대한 입구에 잔류한다(이 현상을 막힘(clogging)이라 칭한다). 모세관 전기영동은 다음과 같은 특징을 갖는다: 1) 분리 매질의 용적이 매우 작다. 2) 분리 매질에 대한 물질이 아크릴아미드 겔과 같이 강하지 않으며, 점성 폴리머 용액이다. 3) 단위 길이당 전기장 세기가 크다. 따라서, 전기장의 구동력에 의해 거대분자를 움직이는 힘이 크며, 이 힘에 저항하는 저항이 작다. 따라서, 막힘이 발생하여, 분리 패턴의 열화를 일으킨다.

DNA 서열 결정에 있어서는, 시료 내부의 거대분자가 주형 DNA이므로, 막힘에 의해 발생된 전술한 문제점을 해경하기 위해서는, 시료를 모세관 컬럼 내부에 주입하기 전에 주형 DNA를 제거해야만 한다. 이때, 화학적 전처리에 의해 주형 DNA를 제거할 수 있다. 예를 들면, 생거 방법에 의해 DNA 단편 시료를 준비할 때, 시료를 준비한 다음 효소 반응에 의해 또는 항원-항체 반응에 의해 주형으로부터 DNA 단편 시료를 분리하기 위해 항원 또는 항체가 프라이머에 결합된다. 그러나, 이와 같은 화학적 전처리는 귀찮으며 많은 인력과 시간을 필요로 한다.

결국, 본 발명의 제 1 목적은, 시료의 주입을 단순화한 다중 모세관 전기영동장치를 제공함에 있다.

본 발명의 제 2 목적은, 모세관 전기영동장치와 관련하여, 영동 분리도의 열화를 억제하는 시료 주입방법과 장치를 제공함에 있다.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 샘플 플레이트에 사용된 기저판의 일례를 나타낸 개략적 사시도이고,

도 1b는 도 1a의 Z-Z선에 따른 단면도이며,

도 2a는 본 발명에 따른 샘플 플레이트를 나타낸 개략적 사시도이고,

도 2b는 도 2a의 Y-Y선에 따른 단면도이며,

도 3은 본 발명의 실시예의 샘플 플레이트를 사용하여 시료 주입을 수행하는 다중 모세관 전기영동장치의 일 실시예를 나타낸 개략적 사시도이고,

도 4는 종래기술에 따라 모세관 전기영동장치 내부에 시료 주입시에 인가된 전압과 시간의 예를 나타낸 것으로, 종축 및 횡축은 각각 전압(kV) 및 시간(초)을 나타내며,

도 5는 본 발명의 EH 다른 실시예에 따른 다중 모세관 전기영동장치를 나타낸 개략적 사시도이고,

도 6은 본 실시예의 인가 전압 제어부에 의해 제어된 시료 주입시 인가된 전압과 시간의 예를 나타낸 것으로, 종축 및 횡축은 각각 전압(kV) 및 시간(초)을 나타내며,

도 7a는 단일 모세관 컬럼과 관련하여 막힘 현상을 일으키는 분리 패턴의 열화를 방지하는 일 실시예의 시료 주입시의 동작을 나타낸 개념도이고,

도 7b는 후속된 영동 분리를 나타낸 개념도이며,

도 8은 본 실시예에 있어서 시료를 주입하는 또 다른 방법을 나타낸 개략도이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명 *

100 : 샘플 플레이트 101 : 기저판

102 : 우물부 103 : 우물부 안내부재

104 : 전극판 105 : 공동부

106 : 플러그 107 : 고전압 라인 접속 구멍

다중 모세관 전기영동장치의 시료 주입을 간단하게 하기 위한 제 1 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 특수한 샘플 플레이트가 사용된다. 이 샘플 플레이트는, 서로 평행하게 돌출된 개방된 바닥부를 갖는 우물부(well)로서 형성된 1개 또는 복수의 구멍을 포함하는 일회용 절연 수지 기저판과, 가압장착된(press-fitted) 복수의 우물부의 바닥부를 수납하여 기저판을 고정시키기 위해 기저판의 배치에 의해 이루어진 우물부의 2차원적 배치에 대응하는 위치에 형성된 우물부보다 더 작은 크기를 갖는 복수의 공동부를 포함하는 도전성 금속제의 전극판을 구비한다. 상기한 기저판의 우물부는 전극판의 공동부에 가압장착되고 고정되어, 시료를 수용하기 위한 공간을 형성하며, 시료가 각각 우물부 내부로 주입된다.

이와 같은 기저판은 일회용이므로 오염을 방지할 수 있다. 기저판은 단지 한 개의 우물부, 또는 서로 정렬된 "n" 개의 우물부, 또는 "n"개의 행 및 "m"개의 열로 2차원적으로 배치된 우물부를 구비할 수 있다. 이러한 기저판을 형성하기 위한 재료는, 일회용을 고려하여, 화학적 저항성과 뛰어난 성형성을 갖는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌과 같은 범용 엔지니어링 플라스틱으로 제조하는 것이 적합하다.

이와 같은 샘플 플레이트를 사용하면, 복잡한 전극 배선 구조를 사용하지 않고도 복수의 우물부에 해당 전압 인가가 가능하게 된다. 특히, 다수의 모세관 컬럼을 갖는 다중 모세관 어레이를 사용하는 전기영동장치의 모세관 컬럼 내부에의 시료 주입이 간단해진다.

이와 같은 샘플 플레이트를 사용하는 본 발명에 따른 다중 모세관 전기영동장치에 있어서, 2차원적으로 배치된 모세관 컬럼의 단부는 다중 모세관 어레이 영동부의 시료 주입측의 하부에 설치되고, 시료를 저장하는 2차원적으로 배치된 우물부와 모든 모세관 컬럼에 전압을 인가하기 위해 영동 버퍼 용액을 저장하는 영동 저장조를 갖는 전술한 샘플 플레이트는 모세관 컬럼 단부의 배치와 일치하여 모세관 컬럼 단부의 아래에 배치되며, 샘플 플레이트와 영동 저장조는 이들 중에서 한 개를 절환하여 모세관 컬럼 단부와 접촉되도록 하기 위해 움직일 수 있다.

다중 모세관 전기영동장치에 있어서, 복수의 시료는 모세관 컬럼으로의 시료 주입시에 전극판에 고정된 샘플 플레이트의 우물부 내부로 주입되고, 각각의 모세관 컬럼의 단부를 우물부에 저장된 시료 내부에 침적시키기 위해 샘플 플레이트가 이동기구에 의해 움직인다. 그후, 샘플 플레이트의 전극판과 모세관 컬럼의 다른 단부 사이에 전압이 인가되고, 시료가 전기영동적으로 모세관 컬럼 내부에 주입된다. 시료 주입 후에, 샘플 플레이트를 이동기구에 의해 모세관 컬럼의 단부로부터 분리하고, 모세관 컬럼의 단부를 영동 저장조 내부에 함유된 버퍼 용액 내부에 침적시킨다. 그후, 모세관 컬럼의 양 단부에 있는 저장조 내부의 버퍼 용액 사이에 전압을 인가함으로써, 영동을 수행한다. 따라서, 모세관 컬럼으로의 시료 주입으로부터 영동에 이르는 조작이 자동적으로 수행된다.

이에 따라, 시료 주입을 위한 본 발명에 따른 전술한 샘플 플레이트를 사용하며 샘플 플레이트 또는 영동 저장조를 절환하고 모세관 컬럼의 단부와 접촉시키는 이동기구를 구비한 다중 모세관 전기영동장치가 모세관 컬럼 내부로의 시료 주입의 조작과 영동을 자동적으로 수행할 수 있다.

영동 분리도의 열화를 억제하기 위한 제 2 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 방법은, 전압을 인가하면서 모세관 컬럼 내부로의 시료의 주입시에 전압 인가를 제어하여, 전압 인가를 개시할 때 전압을 서서히 상승시키고, 전압 인가를 종료하였을 때 전압을 서서히 하강시키도록 구성된다. 한 개의 장치로서, 전술한 방식으로 전압 인가를 제어하는 인가 전압 제어부가 제공된다.

따라서, 모세관 컬럼의 단부에 놓인 겔의 스트레스를 돌발적인 열 발생과 감소를 억제함으로써 줄일 수 있다. 더구나, 큰 전기삼투 흐름의 발생을 억제하여, 겔이 모세관 컬럼의 단부로부터 강제로 배출되는 것을 방지할 수 있다. 그 결과, 영동 분리도를 향상시킬 수 있다.

상기한 제 2 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 또 다른 방법은, 시료와 모세관 컬럼의 단부 사이에 예비 분리용 분리 캐리어를 설치하고, 예비 분리 캐리어를 통해 모세관 컬럼 내부에 시료를 주입하여, 전기영동을 개시하기 전에 예비 분리 캐리어를 제거하는 방법이다.

상기한 시료 주입 방법을 수행하기 위한 본 발명에 따른 모세관 전기영동장치는, 예비 분리 캐리어가 삽입된 모세관 컬럼의 일단과 시료 사이에 위치하도록, 예비 분리용 분리 캐리어와 시료를 저장하는 예비 분리부를 구비한다.

상기한 예비 분리부가 설치된 시료 주입 방법에 있어서, 시료가 모세관 컬럼의 단부를 향해 움직이기 시작하도록 예비 분리시에 전압이 인가된다. 이때, 시료 내부에 포함된 거대분자도 모세관 컬럼의 단부를 향해 움직이기 시작하며, 예비 분리 캐리어에 막힘 현상을 일으킨다. 이와 동시에, 거대분자 이외의 시료 내부에 함유된 분석 타겟은 예비 분리 캐리어를 통과하여, 모세관 컬럼의 단부를 향해 움직인다. 분석 타겟이 모세관 컬럼에 유입되면, 예비 분리 캐리어를 제거한 후, 분석 타겟을 분리한다. 이에 따라, 예비 분리의 단계에서 모세관 컬럼 내부에 충전된 분리 캐리어 내부에 수용될 수 없는 거대분자가 제거된다. 이로 인해, 분리 분석물 내부에는 어떠한 거대분자도 존재하지 않으며, 분리 패턴이 열화되는 것을 방지하여 막힘이 일어나는 것을 방지할 수 있다.

본 발명의 전술한 목적, 특징부, 발명내용과 이점은, 첨부도면을 참조하여 주어지는 본 발명의 이하의 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.

(실시예)

도 1a 내지 도 3은 다중 모세관 전기영동장치에 있어서 시료 주입을 간편하게 하는 제 1 목적을 달성하는 본 발명의 일 실시예를 나타낸 것이다.

도 1a는 본 발명에서 사용되는 실시예에 따른 샘플 플레이트(100) 내부의 기저판(101)을 나타낸 개략도이다. 도 1b는 도 1a의 Z-Z선에 따른 단면도이다. 기저판(101)은 그 전체가 얇은 플라스틱 재료로 이루어지고, 개방된 바닥부를 갖는 복수의 구명으로 이루어진 우물부(102)가 규칙적인 간격으로 그것의 평탄한 표면 상에 배치된다. 각각의 우물부(102)는 전극판(104)과 접촉하는 얇은 바닥부와, 모세관 컬럼을 수용하는 두꺼운 상부를 갖는다. 개방된 바닥부와 개방된 상부의 크기는 각각 0.7mm 내지 2mm과 4mm 내지 4.5mm이다. 따라서, 시료를 저장하기 위해 후술하는 것과 같이 개방된 바닥부가 전극판(104)과 인접할 때, 시료의 양이 적더라도 높이를 상승시킬 수 있는 한편, 모세관 컬럼을 용이하게 우물부(102) 내부에 저장된 시료 내부로 안내할 수 있다.

도 2a는 본 실시예에 따른 샘플 플레이트(100)를 나타낸 사시도이다. 도 2b는 도 2a의 Y-Y선에 따른 단면도이다.

전극판(104)은 높은 기계적 강도를 갖는 스테인레스 스틸과 같은 도전성 재료로 이루어지고, 수직 및 수평으로 배치된 공동부(105)가 그것의 평탄한 표면에 형성된다. 또한, 복수의 기저판(101)이 전극판(104)의 표면에 배치된다. 이때, 공동부(105)의 배치는, 전극판(104)의 표면에 배치된 기저판(101)의 우물부(102)의 2차원적 배치와 일치한다. 각각의 우물부의 바닥부를 가압장착하여 각각의 공동부(105) 내부에 맞물림으로써, 각각의 기저판(101)을 고정시키기 위해, 각각의 공동부(105)의 크기가 각각의 우물부(102)의 바닥부의 외부 크기보다 약간 작다. 전기영동장치의 본체에 설치된 플러그(106)를 통해 고전압 전원과 접속되도록 하기 위해 영동 고전압 라인 접속 구멍(107)이 전극판(104)의 바닥부에 형성된다. 우물부(102)를 전극판(104)의 공동부(105) 내부로 안내하는 우물부 안내부재(103)가 전극판(104)의 표면에 고정되고, 복수의 관통공이 공동부(105)에 대응하는 위치에 형성된다. 이때, 우물부 안내부재(103)는 도전체 또는 절연체와 같은 임의의 재료로 이루어질 수 있다. 상기한 기저판(101), 우물부 안내부재(103) 및 전극판(104)은 샘플 플레이트(100)를 구성한다.

사용 후에, 전극판(104)을 기저판(101)으로부터 떼어낸다. 기저판(101)은 한번 사용한 후에 폐기되는 반면에, 전극판(104)과 우물부 안내부재(103)는 반복적으로 사용된다. 전극판(104)은 재사용을 위해 세척한다. 특히, 시료와 접촉하는 부위를 갖는 공동부(105)는 재사용을 위해 반드시 세척해야 한다.

분리 매질로서 폴리아크릴아미드 겔, 선형 아크릴아미드 겔 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 겔로 충전된 복수의 모세관 컬럼을 갖는 겔 전기영동장치 뿐만 아니라, 겔이 충전되지 않은 모세관 컬럼 내부에서 자유 영동을 수행하는 모세관 존 전기영동장치(capillary zone eletrophoretic apparatus)에서도 사용될 수 있는 샘플 플레이트(100)는 그것이 복수의 모세관 컬럼을 사용하는 한 임의의 전기영동장치에 적용가능하다.

도 3은 샘플 플레이트(100)를 사용하여 시료 주입을 수행한 후에, 시료의 영동 분리를 수행하는 다중 모세관 전기영동장치의 일 실시예를 나타낸 것이다.

한쌍의 저장조 100 및 120은 각각 버퍼 용액 112 및 122를 저장하며, 버퍼 용액 112 및 122 내부에는 전극 130 및 132가 각각 설치된다. 이때, 샘플 플레이트(100)는 도 2에 도시된 것과 같다. 시료는 샘플 플레이트(100)의 각각의 우물부(102) 내부에 주입되고, 고압 분배 케이블이 플러그(106)에 접속된다.

배선이 절환될 수 있도록, 고전압 절환부(136)가 저장조 110과 샘플 플레이트(100)를 절환가능하게 접속하며, 고전압 전원(134)이 고전압 절환부(136)와 다른 저장조(120) 내부에 설치된 전극(132) 사이에 접속된다. 상기한 고전압 전원(134)은, 시료 주입 및 영동에 대한 인가 전압과 시간을 제어하는 인가 전압 제어부(미도시)와 접속된다.

모세관 어레이(2)의 한 개의 모세관 컬럼 단부(2a)는 시료 주입시에 차례로 샘플 플레이트(100)의 각각의 우물부(1020 내부에 삽입되는 한편, 모세관 어레이(2)의 한 개의 단부(2a)가 버퍼 용액 112 내부에 침적되도록, 저장도 110이 절환되어 샘플 플레이트(100)의 위치에 배치된다. 모세관 어레이(2)의 다른 단부(2b)는 다른 저장조 120 내부에 있는 버퍼 용액 122 내부에 침적된다. 다른 단부(2b)에는, 흡광도 또는 형광도에 의해 시료를 검출하는 광학 측정부(10)로부터 발생된 측정광 또는 여기광으로 조사되는 검출부(2c)가 설치된다.

상기한 모세관 어레이(2)는 한 개의 단부(2a)의 측면에 샘플 플레이트(100)의 우물부(102)의 배치와 대응하는 2차원적 배치를 갖는 한편, 모세관 컬럼의 배치 표면이 측정광 또는 여기광으로 수직으로 조사되도록, 복수의 모세관 컬럼이 검출부(2c) 상에서 서로 정렬된다.

모세관 어레이(2)를 형성하는 각각의 모세관 컬럼은 석영 유리 또는 붕소규산염 유리(예를 들면, 파이렉스)로 이루어지며, 200 내지 300 ㎛의 외경과 75 내지 100 ㎛의 내경을 갖는다. 상기한 모세관 컬럼의 외주연은, 자외선 내지 근적외선 영역의 여기광에 의해 형광을 발생하지 않거나 형광 측정을 방해하지 않을 정도로 형광을 발생하는 SiO₂와 같은 비형광 물질로 이루어진 필름으로 피복하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 검출부(2c)에는 필름을 제거하지 않을 수 있다. 모세관 컬럼이 형광을 발생하는 수지 필름을 갖는 경우에, 이 필름은 검출부(2c)로부터 제거된다. 이때, 복수의 이와 같은 모세관 컬럼이 모세관 어레이(2) 내부에 배치된다.

상기한 모세관 컬럼은, 분리 매질의 겔로서 폴리아크릴아미드 겔, 선형 아크릴아미드 겔 또는 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 겔로 충전되다. 말단의 염기를 변화시키면서 FAM, JOE, TAMRA, ROX, R6G, R-110 등으로부터 선택된 4가지 형태의 형광 물질에 의해 라벨링되거나, 서로 다른 비율로 적어도 2가지 형태의 형광 물질에 의해 4가지 형태로 라벨링된 4가지 형태의 DNA 단편을 포함하는 시료가 각각 모세관 컬럼 내부에 주입되며 동시에 전기영동으로 분리된다.

샘플 플레이트(100)와 저장조 110은, 그것들 중 한 개가 선택적으로 도 3에 폭이 넓은 화살표로 표시된 것과 같이 모세관 어레이(2)의 한 개의 단부(2a)와 접촉하도록, 절환되어 이동기구(도 3에는 미도시)에 의해 배치된다.

상기한 우물부(102)는, 이미 처리된 시료를 저장할 뿐 아니라, 시료를 우물부(102)를 통해 PCR(polymerase chain reaction)법에 의해 처리한 다음, 모세관 어레이(2)의 한 개의 모세관 컬럼 단부(2a)를 우물부(102) 내부에 저장된 시료 내부에 삽입함으로써 시료 주입이 수행될 수 있도록 사용될 수도 있다. 상기한 PCR법은 단지 1개의 DNA 타겟 부분을 두드러지게 증폭하는 방법이다. PCR법에 있어서, 프라이머가 DNA의 시료에 가해지고, 이중 나선의 DNA를 단일 사슬로 분해하기 위해 온도를 상승한다. 그후, 온도를 하강하여 프라이머틀 DNA 사슬과 경합시키고, 온도를 약간 상승하여 DNA를 합성하며, 온도를 더 상승하여 단일 나선의 DNA를 형성한다. 온도를 위로 아래로 변경하는 조작을 반복함으로써, DNA의 소정 부분을 대량으로 증폭/합성한다.

도 2a에 도시된 샘플 플레이트(100)의 전극판(104)은 전기영동장치의 본체 위에 설치하는 한편, 플러그(106)를 고전압 라인 접속 구멍(10＆)에 삽입하여 고압 분배 케이블과 접속한다. 기저판의 우물부(102)를 우물부 안내부재(103)의 관통공 내부로 삽입하고, 기저판(101)의 공동부(105) 내부로 더 가압장착하고 맞물리도록 하여, 기저판(101)을 전극판(104)에 고정시킨다. 그후, 시료를 기저판(101)의 우물부(102) 내부로 주입한다. 필요한 경우에, 시료가 전극판(104)과 접촉하도록 원심 기포제거(centrifugal defoaming)를 약하게 수행한다.

시료 주입시에, 모세관 어레이(2)의 한 개의 단부의 측면에 있는 모세관 컬럼 단부(2a)를 차례로 샘플 플레이트(100)의 우물부(102) 내부에 저장된 시료에 침적하는 한편, 모세관 컬럼의 다른 단부를 모두 저장조(102)에 저장된 버퍼 용액 122에 침적시킨다. 시료를 모세관 컬럼 내부에 주입하기 위해, 전극판(104)을 통해 고전압이 모든 우물부(102)로 동시에 인가된다.

시료의 주입 후에, 고전압 인가를 일시적으로 중단하고, 이동기구가 샘플 플레이트(100)와 저장조(110)를 움직임으로써, 시료측에 있는 모세관 컬럼 단부(모세관 어레이(2)의 한 개의 모세관 컬럼 단부(2a)의 측면)를 저장조 110에 저장된 버퍼 용액 112에 침적시킨다. 그후, 저장조 110과 120 사이에 고전압을 인가하여, 전기영동 분리를 수행한다. 고전압 라인을 전극판(104)에 접속하기 위해, 고전압 전원(136)과 접속된 판 스프링 등을 샘플 플레이트(100)를 고정시키기 위해 특정한 위치에 설치함으로써, 샘플 플레이트(100)를 고정시킬 때 판 스프링이 전극판(104)과 접촉될 수 있도록 한다. 모세관 어레이(2)의 한 개의 모세관 컬럼 단부(2a)를 수직으로 움직이기 위해 이동기구가 샘플 플레이트(100)와 저장조 110을 수평면에서 이동시킬 수 있다.

이때, 샘플 플레이트(100)의 우물부(102)의 개수는 모세관 컬럼의 개수에 따라 임의의 설정될 수 있다.

도 5는 영동 분리도의 열화를 억제하는 제 2 목적을 달성하기 위한 본 발명이 적용되는 모세관 전기영동장치의 일 실시예를 나타낸 개략적 사시도이다. 비록, 다중 모세관 전기영동장치가 도시되어 있지만, 본 발명은 단일 모세관 컬럼을 구비한 모세관 전기영동장치에도 적용가능하다.

절연 물질로 이루어진 샘플 플레이트(100a)는 평탄한 표면과, 이것과 접속된 접속부(106a)를 구비한다. 복수의 우물부(102a)가 규칙적인 간격으로 샘플 플레이트(100a)의 표면에 수직 및 수평으로 배치된다. 우물부(102a)는 바닥이 닿는 구멍이며, 바닥으로부터 기저판 표면을 통해 접속부(106a)에 이르는 개별적인 전극 패턴이 각각의 우물부(102a) 위에 형성된다. 시료는 샘플 플레이트(100a)의 각각의 우물부(102a) 내부로 주입되고, 고압 분배 케이블이 접속부(106a)에 접속된다.

샘플 플레이트(100a) 이외의 이와 같은 전기영동장치의 구조는 도 3에 도시된 모세관 전기영동장치의 구조와 동일하므로, 반복 설명을 생략한다. 시료 주입 및 영동에 대한 인가된 전압 및 시간을 조절하기 위해 고전압 전원(134)과 접속된 인가전압 제어부(138)는 마이크로컴퓨터 등으로 구현된다.

모세관 어레이(2)의 한 개의 모세관 컬럼 단부(2a)는 시료 주입시에 샘플 플레이트(100a)의 각각의 우물부(102a) 내부에 차례로 삽입되는 한편, 한 개의 모세관 컬럼 단부(2a)가 버퍼 용액 112 내부에 침적되도록, 시료 주입 후에 샘플 플레이트(100a)와 저장조 110이 절환된다. 모세관 어레이(2)의 다른 단부(2b)는, 다른 저장조(120)에 저장된 버퍼 용액 122에 침적된다.

이하, 이와 같은 실시예의 동작을 설명한다.

시료를 각각 샘플 플레이트(100a)의 우물부(102a) 내부에 주입한다. 그후, 모세관 어레이(2)의 한 개의 모세관 컬럼 단부(2a)를 샘플 플레이트(100a)의 우물부(102a) 내부에 저장된 시효 내부에 차례로 침적시키는 한편, 모세관 어레이(2)의 다른 단부(2b) 전체를 저장조 120에 저장된 버퍼 용액 122 내부에 침적시킨다. 우물부(102a)를 고전압 절환부(136), 접속부(106a) 및 전극 패턴을 통해 고전압 전원(134)과 접속한다. 시료를 모세관 컬럼 내부로 주입하기 위해, 고전압 전원(134)에 의해 우물부(102a)와 버퍼 용액 122 사이에 고전압을 인가한다. 이때, 인가 전압 제어부(138)는 인가 전압과 시간을 제어한다.

도 6은 시료 주입시에 인가된 전압과 인가 전압 제어부(138)에 의해 제어된 시간의 예를 나타낸 것이다. 횡축 및 종축은 각각 전압(kV)과 시간(초)을 나타낸다. 인가 전압 제어부(138)는, 고전압 전원(134)을 제어하여, 시료 주입의 개시로부터 15초의 경과 후에 7.6kV에 도달하도록 전압을 서서히 상승시킨다. 그후, 15초 동안 7.6V의 전압을 인가한다. 그후, 15초에 걸쳐 전압은 7.6V에서 0V까지 하강시키고, 시료 주입시의 전압 인가를 종료한다. 이때, 인가 전압과 시간의 곱의 적분값(경사 라인 부분의 면적)은, 도 4에 도시된 인가 전압과 시간의 곱의 적분값(경사 라인 부분의 면적)과 동일하다. 인가 전압과 시간은 시료의 형태 또는 장치의 형태에 따라 변하므로, 그것의 적분값은 시료의 형태 또는 장치의 형태에 따라 변화한다.

모세관 컬럼 내부의 겔에 있어서의 갑작스러운 열 발생과 감소는, 전술한 방법으로 인가 전압과 시간을 제어하여 억제함으로써, 모세관 컬럼 단부에 위치한 겔에 대한 스트레스를 완화할 수 있다. 더구나, 큰 전기삼투의 발생을 억제할 수 있으며, 겔이 모세관 컬럼 단부로부터 강제로 배출되는 것을 방지할 수 있다. 더욱이, 고전압의 갑작스러운 인가로부터 발생되는 전류의 오버슈트(overshoot)를 억제할 수도 있다. 시료의 주입 후에, 이동기구가 샘플 플레이트(100a)와 저장조 110을 움직임으로써, 시료의 측면에 있는 모세관 어레이(2)의 한 개의 단부(2a)를 저장조 110에 저장된 버퍼 용액 112에 침적시킨다. 그후, 저장조 110과 120 사이에 고전압을 인가하여, 전기영동 분리를 수행한다. 이때, 영동을 위한 전원 전압은 30 kV이고, 전류 밀도는 10 내지 30mA이다. 전술한 방식으로 시료를 모세관 컬럼 내부에 주입함으로써, 일반적으로 약 100개의 염기인 영동 분리도를 200 내지 300개의 염기로 향상시킬 수 있다.

서로 다른 조건에서 전기영동을 동시에 수행하기 위해 각각의 우물부 상에 개별적인 전극 패턴을 설치함으로써, 독립적인 전압이 각각의 우물부에 인가될 수 있도록, 상기한 저장조 110은 샘플 플레이트(100a)와 유사한 버퍼 용액을 저장하는 복수의 우물부를 구비할 수 있다.

도 7a는 단일 모세관 컬럼과 관련하여 막힘 현상을 일으키는 분리 패턴의 열화를 방지하는 일 실시예의 시료 주입시의 동작을 나타낸 개념도이다. 본 실시예가 적용되는 모세관 전기영동장치는 도 5에 도시된 것에 제안되지 않으며, 도 3에 도시된 다중 모세관 전기영동장치 또는 이와 다른 모세관 전기영동장치가 사용될 수 있다. 이하의 설명은, 일례로서 도 5에 도시된 다중 모세관 전기영동장치를 참조하여 주어질 것이다.

상기한 샘플 플레이트(100a)는 시료 주입부로서의 기능을 수행하는 예비 분리부를 구성한다. 필터 페이퍼에 의해 흡착된 유체 겔(예비 분리용 분리 캐리어)(203)과 시료(105)는, 겔(203)이 모세관 컬럼(2)과 시료(205) 사이에 위치하도록, 에비 분리부(100a)의 각각의 우물부(102a) 내부에 포함된다. 예비 분리부(100A) 상에는 배선 패턴이 형성되고, 전극(107a)이 각각의 우물부(102a) 내부에 삽입되는 한편, 전극(107a)기 접속부(106a)를 통해 고압 분배 케이블에 접속된다. 비록, 상기한 전극(107a)은 배선으로 도시되어 있지만, 예비 분리부(100a)의 표면으로부터 우물부(102a)로 연장되는 박막 패턴으로도 형성된다.

모세관 어레이를 형성하는 모세관 컬럼(2)은, 겔(203)과 동일한 유체 겔(분리 캐리어)(201)로 충전된다. 모세관 컬럼(2)의 일단(2a)은 시료 주입시에 예비 분리부(100a)의 각각의 우물부(102a) 내부에 삽입된 후, 시료 주입 후에 저장고 110에 저장된 버퍼 용액 112 내부에 침적된다. 모세관 컬럼(2)의 타단(2b)은 다른 저장조 120 내부에 저장된 버퍼 용액 122에 침적되고, 흡광도 또는 형광도에 의해 시료(205)를 검출하는 광학 측정부(10)로부터 발생된 측정광 또는 여기광을 사용하여 조사된다.

상기한 겔 201 및 203은, 2% HEC(hydroxyethyl cellulose: Polyscience Co., Ltd.(U.S.A.)제)와 7M 요소 또는 x1TBE(tris borate buffer)를 함유하는 유체 겔에 의해 제조될 수 있다. 본 실시예에 있어서, 상기한 겔 201 및 203은 동일하지만, 반드시 동일한 필요는 없다.

이하, 도 5, 도 7a 및 도 7b를 참조하여 본 실시예의 동작을 설명한다.

시료 주입시에, 모세관 컬럼의 일단(2a)이 차례로 우물부(102a) 내부에 저장된 겔(203) 내부에 침적되는 한편, 모세관 컬럼의 타단(2b)이 모두 저장조 120에 저장된 버퍼 용액 122에 침적된다. 전기영동용 고전압 전원(134)에 의해 각각의 우물부(102a)와 저장조 120 사이에 고전압을 인가하기 위해, 고전압 절환부(136)가 예비 분리부(100a)에 접속된다(도 7a).

각각의 시료(205) 내부에 포함된 DNA와 같은 분석 타겟이 각각의 모세관 컬럼(2)을 향해 움직이기 시작한다. 이때, 주형 DNA와 같은 거대분자가 동시에 움직이기 시작하지만, 겔(203)이 매트릭스에는 들어갈 수 없어 막힘 현상을 일으키며, 겔(203)과 시료(205) 사이의 경계면에 잔류한다. 이와 동시에, 분석 타겟이 겔(203)을 통과하고, 모세관 컬럼(2) 내부에 있는 겔(201)을 향해 움직이며, 시료(205)가 주입된다.

분석 대상물을 주입한 후, 고전압 인가를 일시적으로 중단하고, 이동기구가 예비 분리부(100a)와 저장조 110을 움직임으로써, 시료(205)의 측면에 있는 모세관 컬럼(2)의 일단(2a)을 저장조 110에 저장된 버퍼 용액 112 내부로 침적시킨다. 그후, 저장조 110과 120 사이에 고전압이 인가되어, 전기영동 분리를 수행한다(도 7b). 이때, 주입된 시료(105)는 거대분자를 포함하지 않으므로, 막힘에 의해 분리 패턴의 열화가 일어나지 않는다. 모세관 컬럼(2) 내부로의 시료 주입에 대한 전압과 영동용의 전원 전압은 예를 들면 30kV이며, 전류 밀도는 10 내지 30mA이다.

도 8은 본 실시예에 있어서 또 다른 시료 주입방법을 나타낸 개략도이다. 일반적으로, 시료는 액체 상태로 준비된다. 따라서, 시료와 겔(203)을 함유하는 수용액(109)이 우물부(102a) 내부에서 층을 이룬다. 겔(203)은 수용액(109)보다 높은 밀도를 가지므로, 수용액(109)이 상부층으로 층을 이룰 수 있다.

모세관 어레이(2)의 한 개의 모세관 컬럼 단부(2a)가 겔(203) 내부에 삽입되고, 시료 주입용 전압이 인가되어, 수용액(109)에 함유된 시료 내부의 거대분자가 막힘 현상을 초래하여 수용액(109)과 겔(203) 사이의 계면에 잔류하는 한편, 분석 대상물이 겔(203)을 통과하여 모세관 컬럼 내부에 주입된다.

이때, 예비 분리부(100A)의 우물부의 개수는 모세관 컬럼의 개수에 따라 임의로 설정될 수 있다.

또한, 전술한 동작의 자동 실행을 가능하도록 하는 것도 바람직하다.

모세관 컬럼이 겔로 충전되어 있는 경우에, 도 6 내지 도 8을 참조하여 설명한 시료 주입 방법은 도 2a에 도시된 샘플 플레이트를 사용하는 도 3에 도시된 모세관 전기영동장치에도 적용가능하다.

본 발명에 따른 다중 모세관 전기영동장치는, 시료의 주입을 간단하게 수행할 수 있으며, 본 발명에 따르면, 모세관 전기영동장치와 관련하여, 영동 분리도의 열화를 억제할 수 있다.

본 발명을 상세히 설명하고 예시하였지만, 상기한 내용은 본 발명을 예시하고 단지 예를 들기 위해 주어진 것이며, 본 발명의 사상 및 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되므로, 전술한 발명내용은 본 발명을 제한하기 위해 주어진 것이 아니라는 것은 자명하다.

Claims

서로 평행하게 돌출된 개방된 바닥부를 갖는 우물부로서 형성된 1개 또는 복수의 구멍을 포함하는 일회용 절연 수지 기저판과,

가압장착된 복수의 우물부의 바닥부를 수납하여 기저판을 고정시키기 위해 기저판에 의해 형성된 우물부의 2차원적 배치에 대응하는 위치에 형성된 우물부보다 더 작은 크기를 갖는 복수의 공동부를 포함하는 도전성 금속제의 전극판을 구비한 것을 특징으로 하는 샘플 플레이트.
제 1 항에 있어서,

상기 기저판은 서로 정렬된 복수의 우물부를 포함하는 스트립 형태의 기저판이고, 복수의 기저판이 서로 정렬되어, 복수의 우물부로 이루어진 2차원적 배치를 형성하는 것을 특징으로 하는 샘플 플레이트.
제 1 항에 있어서,

상기 기저판과 전극판 사이에 배치되고, 전극판의 공동부에 대응하는 위치에 복수의 관통공을 갖는 우물부 안내부재를 더 구비한 것을 특징으로 하는 샘플 플레이트.
복수의 모세관 컬럼을 포함하고, 복수의 시료가 차례로 복수의 모세관 컬럼 내부에 주입되어 모든 모세관 컬럼 내부에서 동시에 전기영동으로 분리되도록, 시료 주입측에 대해 하향으로 향하는 2차원적으로 배치된 모세관 컬럼 단부를 갖는 다중 모세관 어레이 영동부와,

상기 다중 모세관 어레이 영동부에 있는 모세관 컬럼을 빛으로 조사하여, 시료에 의한 흡광도, 또는 조사된 부분의 시료로부터의 형광도를 측정하는 광학 측정부와,

복수의 모세관 컬럼 단부의 배치에 대응하여 2차원적으로 배치된 복수의 시료를 저장하는 복수의 우물부를 포함하는 시료 주입측에 있는 다중 모세관 어레이 영동부의 모세관 컬럼 단부 아래에 배치되고, 서로 평행하게 돌출된 개방된 바닥부를 갖는 일회용 절연 수지 기저판과, 가압장착된 복수의 우물부의 바닥부를 수납하여 기저판을 고정시키기 위해 기저판의 배치에 의해 형성된 우물부의 2차원적 배치에 대응하는 위치에 형성된 우물부보다 더 작은 크기를 갖는 복수의 공동부를 포함하는 도전성 금속제의 전극판을 구비한 샘플 플레이트와,

모든 모세관 컬럼에 대해 전압을 인가하기 위해 영동 버퍼 용액을 저장하는 영동 저장조를 구비하고,

상기 샘플 플레이트와 상기 영동 저장조는, 이들 중 한 개를 절환하여 사이 모세관 컬럼 단부와 접촉하도록 하기 위해 이동가능하게 구성된 것을 특징으로 하는 다중 모세관 전기영동장치.
분리 캐리어의 겔로 충전된 모세관 컬럼을 사용하는 모세관 전기영동장치에서, 시료를 모세관 컬럼 내부에 주입하는 시료 주입방법에 있어서,

전압 인가로 모세관 컬럼 내부에 시료를 주입시에 전압 인가를 개시할 때 전압을 서서히 상승시키도록 시료 주입용 고전압 인가를 제어하고, 전압 인가를 종료하였을 때 전압을 서서히 하강시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 주입방법.
제 5 항에 있어서,

인가 전압과 시간의 곱의 적분값을, 전압 인가의 개시부터 종료시까지 시료 주입 전압을 일정하게 유지할 때의 인가 전압과 시간의 곱의 적분값과 동일하게 설정하는 것을 특징으로 하는 시료 주입방법.
분리 캐리어의 겔로 충전된 모세관 컬럼의 일단에 시료를 주입하고, 전기영동에 의해 주입된 시료를 분리하는 영동부와,

상기 영동부에 있는 모세관 컬럼을 빛으로 조사하여, 시료에 의한 흡광도 또는 조사된 부분에 있는 시료로부터의 형광도를 측정하는 광학 측정부와,

전원으로부터 전압을 인가할 때 모세관 컬럼에 대한 전원으로부터의 전압 인가를 제어하고, 시료를 모세관 컬럼에 주입하여, 전압 인가를 개시할 때 전압을 서서히 상승시키고, 전압 인가를 종료시에 전압을 서서히 하강시키는 인가 전압 제어부를 구비한 것을 특징으로 하는 모세관 전기영동장치.
제 7 항에 있어서,

상기 영동부는, 복수의 시료가 차례로 모세관 컬럼 내부에 주입되고 모든 모세관 컬럼에서 동시에 전기영동으로 분리되도록 배치된 복수의 모세관 컬럼을 포함하는 다중 모세관 어레이 영동부인 것을 특징으로 하는 전기영동장치.
분리 캐리어의 겔로 충전된 모세관 컬럼의 일단에 주입된 시료를 전기영동으로 분리하는 영동부와, 모세관 컬럼의 적절한 부분에 있는 모세관 컬럼에서 분리된 각각의 성분을 검출하는 검출수단을 구비한 모세관 전기영동장치에 대한 시료 주입방법에 있어서, 시료와 모세관 컬럼 시료 주입 단부 사이에 예비 분리용 예비 분리 매질을 제공하고, 예비 분리 매질을 통해 모세관 컬럼 내부로 시료를 주입하여, 전기영동의 개시 전에 예비 분리 매질을 제거하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 주입방법.
분리 매질의 겔로 충전된 모세관 컬럼의 일단에 주입된 시료를 전기영동으로 분리하는 영동부와,

모세관 컬럼의 적절한 위치에 있는 모세관 컬럼 내부에서 분리된 각각의 성분을 검출하는 검출수단과,

예비 분리 매질이 모세관 컬럼의 시료 주입 단부와 시료 사이에 놓이도록, 예비 분리용 예비 분리 매질과 시료를 저장하는 예비 분리부를 구비한 것을 특징으로 하는 모세관 전기영동장치.
제 10 항에 있어서,

상기 예비 분리부는 예비 분리 매질로서 유체 겔을 포함하고, 상기 시료는 필터 매체에 의해 흡착된 상태에서 예비 분리 매질 내부에 설치되는 것을 특징으로 하는 전기영동장치.
제 10 항에 있어서,

상기 예비 분리부는, 예비 분리 매질로서 유체 겔을 포함하고, 시료를 함유하는 수용액이 상부 층을 형성하고 예비 분리 매질이 하부 층을 형성하도록, 층이 형성되며, 모세관 컬럼의 시료 주입 단부가 예비 분리 매질 내부에 삽입되는 것을 특징으로 하는 전기영동장치.
제 10 항에 있어서,

상기 영동부는, 복수의 시료가 모세관 컬럼 내부에 차례로 삽입되고 모든 모세관 컬럼에서 전기영동으로 분리되도록 배치된 복수의 모세관 컬럼을 포함하는 다중 모세관 어레이 영동부인 것을 특징으로 하는 전기영동장치.