KR20000029982A

KR20000029982A - 바실러스서브틸리스에서유래된피타아제,상기피타아제를암호하는유전자,이의생성방법및용도

Info

Publication number: KR20000029982A
Application number: KR1019997001239A
Authority: KR
Inventors: 아파잘라흐티주하; 헤이키넨페카; 케로뷰오쟌네; 로레우스마르코; 몰간앤드류; 누르미넨패이비; 시카넨오스모
Original assignee: 핀피즈 인터내셔날 리미티드
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 2000-05-25
Also published as: CN1228120A; GB9616957D0; WO1998006856A1; PL331587A1; GB2316082A; NZ334235A; AU724094B2; BR9713463A; EP0920519A1; KR100489286B1; RU2227159C2; US20050026268A1; JP2001505408A; AU4118197A; CA2263792A1

Abstract

본 발명은 단백질 mg당 적어도 20U의 고유 활성도를 갖는 피타아제 또는 이의 기능적 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 피타아제를 암호하는 핵산에 관한 것이며, 피타아제의 생산 방법 및 농업 및 식품과 동물 사료의 처리 과정 에 이용할 수 있는 피타아제의 용도에 관한 것이다.

Description

바실러스 서브틸리스에서 유래된 피타아제, 상기 피타아제를 암호하는 유전자, 이의 생성 방법 및 용도 {PHYTASE FROM BACILLUS SUBTILIS, GENE ENCODING SAID PHYTASE, METHOD FOR ITS PRODUCTION AND USE}

인은 성장을 위한 필수 요소이다. 식품과 동물 사료에 들어있는 인의 상당량은 인산염의 형태로 피테이트(phytate: myo-inositol hexakisphosphate)라는 공유 결합된 분자 속에 존재한다. 피테이트 자체는 소화가 잘 안되며, 인산염은 대부분 동물의 소장에서 흡수되기 때문에, 피테이트 속에 갇혀 동물의 소장에서 이용되지 못하는 인산염은 흡수되지 않고, 소화관을 통과하여 분비된다. 이렇게 분비된 인은 땅과 수질의 생태적 부담을 증가시키게 된다. 또한, 피테이트는 여러 필수 무기물과 킬레이트 화합물을 만들어, 소화관에서 해당 무기물의 흡수를 방지 또는 저해하기 때문에, 식품과 동물 사료의 영양가를 감소시킨다.

피테이트가 소화가 잘 안되는 것과 관련하여, 또 다른 문제는 동물 사료에 무기 인삼염을 첨가해 주어야 하기 때문에 사료 비용이 증가한다는 것이다.

피테이트는 피타아제라는 효소에 의해 전환되는데, 피타아제는 피테이트가 이노시콜과 무기 인산염으로 가수분해되는 것을 촉매한다. 피타아제는 밀기울 및 식물 종자에서 발견되며, 이스트, 곰팡이, 박테리아 등의 다양한 미생물이 이를 생산한다고 알려져 있다.

공지된 곰팡이 피타아제 중에, Aspergillus terreus phytase는 Yamada 등(Arg. Biol. Chem., 32(10) (1968), 1275-1282)에 의해 균일하게 정제되었고, 최적 pH는 pH4.5, pH4.5에서 최적 온도는 약 70℃이고, pH4.5일 때 30 내지 60℃의 온도에서 안정한 상태라고 개시되었다. 그러나, 상기 효소는 중성 pH, 특히 pH7.0에서 완전 불활성화되었다.

H.J. Ullah 및 D.M. Gibson(Preparative Biochemistry, 17(1) (1987), 63-91)에 의해 분리되어 개시된 Aspergillus ficuum 피타아제는 최적 pH가 두 군데로 pH2.2 및 pH5.0-5.5이고, 최적 온도는 pH5.0에서 약 58℃이며, pH5.0일 때 68℃ 온도까지 안정한 상태라고 알려져있다. 그러나, Aspergillus terreus 피타아제와 마찬가지로, Aspergillus ficuum 피타아제는 pH7.0에서 불활성화된다.

Aspergillus terreus에서 피타아제를 암호하는 DNA 서열(EP 684 313) 및 Aspergillus ficuum(EP 420 358) 및 Aspergillus niger var. awamori(Piddington et al., (1993) Gene, 133, 55-62)에서의 피타아제 암호 DNA 서열은 개시되었고, 재조합으로 발현되었다.

피타아제는 또한 Bacillus subtilis 등의 박테리아에서도 발견됨이 공지되었다 (V.K. Powar 및 V. Jagannathan, (1982) J. Bacteriology, 151 (3), 1102-1108) 및 (M. Shimizu, (1992) Biosci. Biotech. Biochem., 56 (8), 1266-1269, 일본 특허 출원 6-38745).

Shimizu에 의해 개시된 Bacillus subtilis 피타아제는 SDS-PAGE에 의해 균일하게 정제되었고, 분자량은 36 내지 38kD으로 알려져있다. 이 효소는 0.1M 말레인산, 2mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 구성되는 검사용액 37℃에서 측정했을 때 최적 pH는 pH6.0 내지 6.5이고, 37℃에서 0.1 M Tris-HCl 완충용액, 2mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 구성되는 용액에서 측정했을 때, 최적 pH는 pH7.0인 것으로 알려졌다. 이 피타아제의 최적 온도는 60℃이고, 앞서 언급한 Tris-HCl 완충액을 포함하는 검사용액에서 15분간 인큐베이션했을 때 50℃까지 안정한 상태였다. 상기 Tris-HCl 함유 용액 속의 정제된 Bacillus subtilis의 고유 활성도는 단백질 mg 당 8.7 U인 것으로 보고되었다. 피타아제 1 유니트(U)는 측정 조건 하에서 일분 당 무기 인산염(Pi) 1μmol을 방출하기 위한 효소의 양을 의미한다. 이 정의는 명세서 전체에 적용된다.

Powar 등은 분자량 36.5kD의 Bacillus subtilis에서 분리한 피테이트 특이적 포스포타제 제제(phytate specific phosphatase preparation)를 개시하였다. SDS-PAGE에 의해 정제되고, 두 종류의 피타아제 동질효소(isozyme)를 포함하는 것으로 알려진 이 효소 제제는 30℃에서 0.1M Tris-HCl 완충용액, 0.5mM CaCl₂, 0.34mM 소디움 피테이트로 이루어지는 검사용액에서 측정했을 때, 최적 pH가 pH7.0 내지 7.5임이 개시되었다. 이 피타아제 동질효소 혼합물은 60℃에서 최대 활성도를 나타냈으며, 70℃까지 안정한 상태를 유지했다. 이 정제된 효소의 고유 활성도는 상기 검사용액에서 단백질mg 당 8.5-9.0U인 것으로 보고되었다. 또한, Powar 등은 이 정제된 동질효소 혼합물에서는 가수분해 작용이 일어나, 활성도가 저하되는 결과를 가져왔다고 보고하였다.

Bacillus 피타아제의 아미노산 서열 및 이를 암호하는 핵산은 현재까지 알려지지 않았다.

식품과 사료 처리 과정 중 피테이트를 소화가능한 인산염으로 효소적으로 전환하기 위하여, 천연 또는 재조합된 피타아제를 식품 및 사료에 첨가한다는 아이디어는 개시되었다. JP-A-6-38745에서 정제된 천연 Bacillus subtilis 피타아제를 식품과 사료의 처리 공정에 사용하는 용도가 개시되었다. 또한, EP 420 358 및 EP 684 313은 동물 사료에 Aspergillus 피타아제를 사용하는 용도를 개시하고 있다.

더 나아가, 동물의 소화관에서 피타아제의 효소 작용이 일어날 수 있도록 하기 위하여, 이미 처리된 동물 사료에 피타아제를 첨가하는 것이 제안되었다.

그러나, 상기 언급한 Aspergillus 피타아제는 식품이나 동물 사료가 처리되는 온도 및 pH(일반적으로 65 내지 95℃, pH5.5 내지 7.5) 및 단위동물(monogastric animals) 소장 내의 pH(일반적으로 37 내지 41℃, pH5.5 내지 7.5)에서 불활성화되거나 활성도가 상당히 저하된다.

또한, 상기 조건에서는 상기 Bacillus 피타아제의 고유 활성도 및 이에 따른 상대 활성도가 매우 낮다.

식품 처리 과정 및 동물의 소화관 내에서의 온도 및 pH의 차이를 감안할 때, 식품, 사료의 처리 과정 및 소화관 내에서 소화되는 동안 피타아제의 효과를 최대로 하고, 피테이트 함유 동물 사료를 사용함으로써 발생하는 환경적인 인 부담을 감소시키기 위하여, 식품 및 동물 사료의 처리 온도 및/또는 pH와 동물 소화관의 온도 및/또는 pH에서 상대 활성도와 고유 활성도가 높은 피타아제가 바람직하다.

더 나아가, 이와 같은 식품 및 동물 사료를 경제적으로 생산하기 위하여, 상기 조건을 만족시키는 피타아제를 대량으로 생산하는 방법이 바람직하다.

본 발명의 목적은 높은 고유 활성도를 가지고, 식품 및 동물 사료의 처리 공정 중 높은 상대 활성도로 기능할 수 있으며/있거나 동물의 소화관에서 높은 상대 활성도로 기능할 수 있는 피타아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 의한 피타아제를 암호하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 피타아제의 생산 방법 및 상기 피타아제를 상기 동물에 전달하는 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적들은 다음 상세한 설명에 제시되어 있다.

본 발명은 피타아제(phytase), 피타아제를 암호하는 핵산, 피타아제 생산 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

도 1은 피타아제 정제(단계)에서의 SDS-PAGE 젤을 나타낸다.

도 2는 정제된 피타아제의 등전 포커싱 젤을 나타낸다.

도 3은 온도를 달리했을 때, 피타아제의 활성에 pH가 미치는 영향을 나타낸다.

도 4는 정해진 완충 용액에서 피타아제의 온도 활성도 특성에 pH가 미치는 영향을 나타낸다.

도 5는 온도를 달리한 밀기울 추출물에서의 피타아제의 활성도 특성에 pH가 미치는 영향을 나타낸다.

도 6은 밀기울 추출물에서 피타아제의 온도 활성도 특성에 pH가 미치는 영향을 나타낸다.

도 7은 사료 처리 공정 및 소화시의 pH 및 온도에서 피타아제의 상대적 활성도를 나타낸다.

도 8은 아미노산 서열로 부터 얻은 탐침자를 사용하여 B. subtilis 피타아제를 암호하는 유전자를 PCR로 증폭한 결과를 나타낸다.

도 9는 B. subtilis 피타아제 유전자의 구조를 나타낸다.

본 발명을 하기의 실시예를 통해 더 자세하게 설명한다.

본 발명은 피타아제 또는 피타아제의 기능을 갖는 유도체에 관한 것으로, 100mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 고유 활성도를 측정했을 때, 고유 활성도가 적어도 단백질 mg 당 20U인 것을 특징으로 하는 피타아제 또는 이의 기능적 유도체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 의한 피타아제는 상기 조건에서 적어도 단백질 mg당 29U의 고유 활성도를 갖고, 더욱 바람직하게는 적어도 단백질 mg당 80U, 가장 바람직하게는 단백질 mg당 적어도 88U의 고유 활성도를 갖는다.

바람직한 실시예에서, 상기 피타아제는 37℃, 30분간 100mM 말레인산-Tris, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 인큐베이션하였을 때, 최적 pH가 적어도 pH6.5이거나, 37℃, 30분간 밀기울 추출물, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액 또는 100mM Tris-HCL, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 인큐베이션하였을 때, 최적 pH가 적어도 pH7.0이다.

피타아제는 식품 또는 사료 처리 과정 및 동물 소화관에서 상대적으로 높은 활성도를 가짐으로써, 양 조건 하에서 활발한 효소 기능을 보이는 것이 유리하다. 본 발명에 의한 피타아제는 상기 동물의 소화관, 바람직하게는 소낭 및/또는 소장에서의 활성도와 비교했을 때, 식품 또는 사료 처리 과정 중의 활성도가 바람직하게는 30%이거나 그 이상이며, 더욱 바람직하게는 35%이거나 그 이상이고, 가장 바람직하게는 37%이거나 그 이상이다.

또한, 상기 피타아제는 동물의 소장에서 발견되는 소화 효소의 존재 하에 기능할 수 있는 것이 바람직하다. 동물 소장에서 발견되는 효소에는 트립신, 키모트립신, 리파제 등의 췌장 효소가 포함된다.

본 발명은 상기 특징 중 하나 또는 그 이상을 갖는 피타아제에 관한 것이다.

본 발명에 의한 피타아제는 미생물에서 얻을 수 있으며, 이 미생물은 바람직하게는 Bacillus 균주이고, 더욱 바람직하게는 Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens로 이루어지는 군에서 선택되는 Bacillus 균주이며, 가장 바람직하게는 스코트랜드 소재 National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Ltd.(NCIMB)에 1996년 8월 1일 NCIMB-40819번으로 기탁된 Bacillus subtilis 균주 B13이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명에 의한 피타아제는 서열 ID 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적인 유도체를 포함한다. 명세서 전체를 걸쳐 피타아제와 관련하여 "이의 기능적인 유도체"란 본 발명에 의한 피타아제의 기능적인 특성을 갖는 피타아제 유도체를 의미한다. 피타아제의 기능적인 유도체는 본 발명에 의한 피타아제의 일반적인 특성을 갖는 것으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 손실, 교체 또는 첨가된 천연, 합성 또는 재조합에 의한 펩티드나 펩티드 단편, 돌연변이체나 변이형을 모두 포괄한다.

본 발명은 또한 상기 특성 중 하나 또는 그 이상의 특징을 갖는 피타아제를 암호하는 분리된 핵산 또는 이의 기능적인 유도체에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 핵산은 서열ID 번호1에 따른 DNA나 이의 기능적 유도체를 포함하거나, 서열ID 번호1에 따른 DNA나 이의 기능적 유도체와 하이브리다이즈(hybridise)된다.

본 발명은 피타아제 또는 이의 기능적 유도체를 암호하는 분리한 핵산에 관한 것으로, 상기 핵산은 서열ID 번호1에 의한 DNA나 이의 기능적 유도체와 하이브리다이즈되고, 100mM 말레인산-Tris, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 37℃에서 30분간 고유 활성도를 측정했을 때 활성도가 단백질 mg당 적어도 10U이고, 최적 pH가 pH5.0이거나 그 이상인 것을 특징으로 한다. .

상기 핵산은 바람직하게는 DNA 분자이다. 명세서 전체를 걸쳐 핵산과 관련하여 "이의 기능적인 유도체"란 피타아제를 암호하는 핵산의 기능적인 특성을 갖는 핵산의 유도체를 의미한다. 본 발명에 의한 피타아제를 암호하는 핵산의 기능적인 유도체는 본 발명에 의한 특징을 갖는 피타아제를 암호하고, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 손실, 교체 또는 첨가된 천연, 합성 또는 재조합에 의한 펩티드나 펩티드 단편, 돌연변이체나 변이형을 모두 포괄한다. 본 발명에 의한 피타아제를 암호하는 핵산 변형체에는 대립 유전자 및 해당 분야에서 공지된 유전 암호의 변성에 의한 변형체가 포함된다. 본 발명에 의한 피타아제를 암호하는 핵산의 돌연변이에는 site-directed 돌연변이 유발 기술(Botstein, D., Shortle, D., 1985, Science 229: 1193-1201, Myers, R.M., Lerman, L.S., Maniatis, T., 1985, Science 229: 242-247 등에서 개시됨), error-prone PCR(일예로, Leung, D.W., Chen, E., Goeddel, D.V., 1989, Technique 1: 11-15; Eckert, K.A., Kunkel, T.A., 1991, PCR Methods Applic. 1: 17-24; Cadwell, R.C., Joyce, G.F., 1992, PCR Methods Applic. 2: 28-33), 및/또는 이 분야에서 공지된 화학적으로 유도하는 돌연변이 유발 기술(일예로, Elander, R.P 'Microbial screening, Selection and Strain Improvement' in Basic Biotechnology, J. Bu'lock and B. Kristiansen Eds., Academic Press, New York, 1987, 217)에 의해 생성된 돌연변이체가 포함된다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 핵산의 생산 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기한 핵산을 포함하는 탐침을 표준 조건 하에, 상기 핵산을 포함하는 것으로 추정되는 표본에 하이브리다이즈시켜, 상기 핵산을 회수하는 것을 특징으로 한다. 상기 하이브리다이제이션을 위한 탐침을 이용하는 표준 테크닉에는 Southern blotting(일예로, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 및 PCR 및 RT-PCR(일예로, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. Eds., Academic Press New York, 1990)이 포함된다. 표준 하이브리다이제이션 조건은 Southern blotting에서는 바람직하게는 하루 밤동안 6 x SSC, 0.5% SDS, 50℃처리 또는 이와 동일한 효과를 가져오는 조건이며, PCR의 경우는 5mM Mg²⁺, Tag 효소, 2분간 95℃ 프리멜팅 (premelting), 및 20초간 92℃에서 멜팅(melting) 30주기, 30초간 50℃에서의 서냉복원, 1분간 72℃에서 신장(extension) 또는 이와 동일한 기능을 갖는 조건이다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 DNA 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 바람직하게는 상기 DNA 분자가 상기 DNA 서열로부터 피타아제를 발현시킬 수 있는 조절 서열(regulatory sequences)과 기능적으로 연결된 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 DNA 분자는 상기 피타아제가 분비될 수 있게하는 선도 서열을 포함한다. 상기 조절 서열에는 원핵 또는 진핵 조절 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에 의한 피타아제가 세포내에서 발현되는가 또는 분비되는가에 따라, 본 발명에 의한 DNA 서열 또는 벡터는 처리를 거쳐 본 발명에 의한 피타아제의 성숙된 형태가 천연의 피타아제 신호 서열 또는 Bacillus나 기타 원핵 또는 진핵 생물에서 기능할 수 있는 신호 서열이 존재하거나 존재하지 않고도 발현되도록 할 수 있다. 상기 신호 서열을 완전히 제거하거나 부분적으로 제거함으로써 발현이 이루어지도록 할 수도 있다.

본 발명은 또한 상기한 핵산 또는 벡터에 의해 변환된 원핵 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 E.coli, Bacillus sp., Lactobacillus, Lactococcus로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 상기한 핵산 또는 벡터에 의해 변환된 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 Aspergillus sp., Humicola sp., Pichia sp., Trichoderma sp. Saccharomyces sp. 및 콩, 옥수수, 평지(rapeseed) 등의 식물로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 재조합 피타아제 제조 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 언급된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 적합한 조건에서 배양하여 상기 피타아제를 얻는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 피타아제의 바람직한 실시예에 의해 상기 방법에 따른 피타아제를 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 피타아제를 생산할 수 있는 박테리아 세포 또는 포자를 선생물적(probiotic) 또는 직접적으로 섭취하는 미생물 제품으로 사용하는 용도에 관한 것이다. 상기 용도에 관한 바람직한 실시예에서는 본 발명에 의한 피타아제-생산 Bacillus sp. 및 Lactobacillus sp.가 이용되었다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 피타아제를 식품 또는 동물 사료에 사용하는 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의한 피타아제를 함유하는 식품 또는 동물 사료에 관한 것이다. 상기 식품이나 동물 사료에는 소화관, 바람직하게는 상기 동물의 소낭 및/또는 소장에서 활성을 가지는 피타아제가 첨가제로써 포함되며, 상기 동물은 바람직하게는 가금류를 포함하는 조류, 소, 양 등의 반추류, 돼지, 물고기, 새우를 포함하는 수중 동물로 이루어지는 군에서 선택된다. 또한, 상기 첨가제는 식품 또는 사료 처리 공정 중 활성을 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명에 의한 피타아제를 발현할 수 있는 원핵 세포 또는 포자를 포함하는 식품 또는 동물 사료에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 식품 또는 동물 사료의 생산 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 식품 또는 동물 사료와 본 발명에 의한 피타아제가 혼합된 것을 특징으로 한다. 상기 피타아제는 처리 전에 건조물(dry product)로서 첨가되거나, 처리 전후에 액상으로 첨가된다. 이 효소를 가루분의 형태로 이용할 때는, 액상으로 희석한 후 곡물 가루 등의 건조한 운반체(dry carrier)와 함께 제공한다.

본 발명은 또한 식품 또는 동물 사료의 생산 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 식품 또는 동물 사료에 본 발명에 의한 피타아제를 발현할 수 있는 원핵 세포 및/또는 포자가 첨가된 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 이노시톨 및 무기 인산염의 생성에서, 본 발명에 의한 피타아제를 보조적인 포스파타제를 제공하거나 제공하지 않은 가운데 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 동물 분뇨에서 인 수준을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 동물 사료에 함유된 피테이트를 효과적으로 전환할 수 있는 양으로 본 발명에 의한 동물 사료를 제공하는 것을 특징으로 한다.

정의

본 명세서에서 "피타아제"는 피테이트의 가수분해를 촉매하고 무기 인산염을 방출시키는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.

본 명세서에서 피타아제의 고유 활성도는 피타아제를 포함하는 용액 속의 단백질 mg 당 유니트(U)로써 정의되며, 상기 피타아제는 SDS-PAGE에 의해 단일 띠로 검출할 수 있다. 1 유니트는 상기 효소를 100mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 37℃, 30분간 인큐베이션하였을 때, 1분당 무기 인산염 1μmol을 방출하기 위해 필요한 효소의 양이다.

본 명세서에서 피타아제의 상대 활성도는 상기 효소의 최적 온도 및/또는 pH에서의 효소 활성도와 비교했을 때, 주어진 온도 및/또는 pH에서의 효소 활성도를 의미한다.

실시예 1

본 연구를 위하여 스코틀랜드 NCIMB에 NCIBM-40819로 기탁된 Bacillus subilis B 13가 이용되었다.

배지

피타아제를 생산하기 위한 있어 접종물을 성장시키기 위해 리터당 NaCl 10g, 트립톤 10g, 이스트 추출물 5g을 포함하는 루리아 배지(Luria medium)를 사용하였다.

밀기울 추출물을 효소 생산 배지로 사용하였고, 이 배지는 다음과 같이 준비하였다. 밀기울 100그램에 물 1000ml에 넣고, 60분간 121℃에서 오토클래이브 (autoclave)하여 추출물을 얻었다. 무명천 6겹에 이 추출물을 통과시켜 여과한 후, 물을 첨가하여 추출물의 부피가 1리터가 되도록 하였다. 이 추출물에 (NH₄)₂SO₄0.4g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.2g, 캐시톤(casitone) 10g, KH₂PO₄0.5g, K₂HPO₄0.4g을 가하였다. 이 추출물의 최종 pH는 6.5였다. 이 추출물 베이스를 120℃, 15분간 오토클래이브하였다. 접종 전에 5% CaCl₂(여과로 살균됨)를 가하여 최종 농도가 0.2%가 되게하였다.

효소의 생산

0.2% CaCl₂을 첨가한 루리아 배지 상에서 응고된 스톡(stock)으로부터 접종물을 성장시킨다. 최초의 접종원은 회전식 쉐이커(rotatory shaker) 내에서 30℃, 24시간 동안 성장시켰다. 밀기울 추출물 배지에서 연속 10% 접종을 사용하여 배양균을 측정하였다. 효소 생산을 위하여 5리터 배치를 밀기울 배지에서 30℃, 91시간 동안 세게 흔들어 주면서 성장시켰다.

단백질 측정

Bovine Serum Albumin을 표준으로 사용하여, 제조자의 권고에 따라 Bio-Rad Protein Microassay Procedure에 의해 단백질 농도를 측정하였다.

피타아제의 정제

별도의 언급이 없는한 모든 정제 단계는 0 내지 4℃에서 실시되었다. 30분간 7000 x g의 원심분리로 박테리아를 펠릿트(pellet)로 만들었다. 모아진 상등액의 부피를 측정하고, CaCl₂를 가하여 최종 농도가 1mM가 되게하였다. 냉각(-20℃) 에탄올 3부피를 상등액에 계속 교반하면서 가하고, 효소를 침전시켰다. 45분간 교반하고, 하루 밤 동안 침전 시켰다. 침전물을 1800 x g 원심분리로 20분간 모은다. 모아진 침전물을 냉각(-20℃) 에탄올로 일회 세척하고, 다시 냉각(-20℃) 아세톤으로 세척한다. 질소 가스를 유입시켜 잉여 아세톤을 침전물에서 기화시킨 후, 냉동 건조(lyophilisation)로 마무리 건조하였다.

건조된 침전물을 1mM CaCl₂이 첨가된 pH7.5, 100mM Tris-HCl 용액 300ml에서 용해시켰다. 이 용액에 황산암모늄을 천천히 계속 저어주면서 가하여 65%로 포화상태가 되게한다. 용액을 하루 밤 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 4℃에서 9000 x g으로 원심분리하여 청징한 후, 황산암모늄을 첨가하여 85% 포화 용액이 만들어지게 하였다. 이 용액을 다시 하루 밤동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이전과 동일하게 원심분리하여 침전물을 모은 후, 1mM CaCl₂이 첨가된 pH7.5, 100mM Tris-HCl 용액에서 용해시켰다. 효소 제재의 분액을 -20℃에서 저장하였다. 이 효소제제를 실험에 사용할 때는, PD-10(Pharmacia) 젤 여과 칼럼을 사용하여 원하는 정해진 완충 용액으로 젤여과시켰다. 피타아제의 정제 단계를 표1에 제시하였다.

표1: 정제된 피타아제의 고유 활성도

분자량 및 등전점

상기와 같이 정제된 피타아제의 분자량은 제작자의 권고사항에 따라 Pharmacia Low Molecular Weight Electrophoresis Calibration Kit를 표준으로 하고, SDS 8-25% 구배 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(PhastGelSDS-page)을 사용하여 Pharmacia Phast 전기영동기에서 측정되었다. 등전점은 Pharmacia IEF Calibration Kit를 표준으로 하여 PhastGel IEF 3-9 등전 포커싱 젤을 사용하여 같은 시스템에 따라 결정하였다.

B 13 피타아제의 분자량은 SDS-PAGE로 측정했을 때, 43,000이었다(도 1). B 13 피타아제의 등전 pH는 pH6.5였다(도 2).

기질 특이성

피타아제의 기질 특이성(0.1M Tris-HCl, pH7.5에서)은 각 효소의 표준 활성도 측정 검사를 이용하여 측정되었다. 피트산(phytic acid) 외에 β-글리세로인산염(β-glycerophosphate), D-글루코스-6-인산염(D-glucose-6-phosphate), p-니트로페닐인산염(p-nitrophenylphosphate), ATP, ADP, AMP, 과당(fructose), 1,6-이인산염(1,6-diphosphate), 3-인글리세르산(3-phosphoglyceric acid), bis-(p-니트로페닐)포스페이트(bis-(p-nitrophenyl)phosphate), α,β-메틸린아데노신-5¹-이인산염

(α,β-methyleneadenosine-5¹-diphosphate)이 대체 기질로 사용되었다. 기질 특이성 분석 결과를 표2에 나타내었다.

표2: 피타아제의 기질 특이성

효소 측정 검사

별도의 언급이 없는한, 피타아제의 활성도는 효소 제제 150μl를 2mM 소디움 피테이트 600μl와 함께 1mM CaCl₂가 첨가된 100mM Tris-HCl 완충용액 pH7.5 속에서 37℃, 30분간 인큐베이션하여 측정한다. 인큐베이션 후, 5% 트리클로로아세트산 (trichloroacetic acid) 750μl를 첨가하여 이 반응을 중단시켰다. 칼라 시약(5.5% 설폰산 속에 용해된 1.5% 몰리브덴산 암모늄 4 부피 및 2.7% 황산제일철 1 부피: Shimizu, M., 1992; Biosci. Biotech. Biochem., 56:1266-1269). 효소 활성도 1 유니트는 측정 조건에서 일분 동안 무기인산염 1μmol을 방출하기 위한 효소의 양을 나타낸다. 고유 활성도는 단백질 mg 당 효소 활성도 유니트로 나타낸다. 상기의 방식으로 정제된 피타아제의 특성을 표3에 나타내었다.

표3: 피타아제의 특성

특성	피타아제
분자량	43,000
등전점	6.5
37℃에서의 최적 pH	7.5
최적 온도	55℃(pH7.1)

pH 및 온도 활성도 특성

정해진 완충용액 및 밀기울 추출물에서 피타아제의 온도 및 pH 활성도 특성을 분석하였다. 측정 검사에서 사용된 효소 농도는 37℃ 최적 조건 하에서 30분 동안 인큐베이션할 때, 직선적인 오르토인산염 방출을 나타내었다.

사용된 정해진 완충용액은 100mM 글리신 pH3.0, 100mM 숙신산염(succinate) pH5.0, 100 mM Tris-말린산염(maleate) pH5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 100mM Tris-HCl pH7.5, 8, 9이다. 모든 완충용액에는 2mM 소디움 피테이트 및 1mM CaCl₂가 첨가되었다. 효소 측정 검사는 이 완충용액에서 37, 45, 55, 65, 75℃의 온도에서 실시되었다. 완충용액 600μl를 해당 온도로 조정하고, 효소 제제 150μl를 첨가함으로써 효소 반응을 시작시켰다. 30분간 인큐베이션한 후, 반응을 중단시키고 방출된 무기 오르토인산염을 상기 방법으로 측정하였다. 효소 측정 검사는 두번씩 실시하였다. 반응 혼합액 속의 실제 pH는 각 측정 검사의 시작과 마지막에 측정하였다. 단백질 농도는 앞에서 기술한 방법으로 측정하였고, 다양한 pH와 온도에서 효소의 고유 활성도를 측정하였다.

밀기울 50g을 증류수 500ml에 용해시키고, 120℃에서 60분간 오토클래이브하여 밀기울 추출물을 준비하였다. 이 추출물을 무명천을 통과시켜 여과한 후, 증류수를 사용하여 부피 500ml가 되게 조정한 후, 15000rpm에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 모았다. 상등액의 분액을 pH3.0, 5.5, 7.0, 8.0, 9.0으로 조정하고, 증류수 속에서 1:10으로 희석하고 2mM 소디움 피테이트와 1mM CaCl₂를 첨가하였다. pH가 조정된 밀기울 추출물 600μl를 원하는 온도로 조정하고(37, 55, 75℃), 효소 제제 150μl를 첨가함으로써 효소 반응을 시작시켰다. 30분간 인큐베이션한 후, 반응을 중단시키고 방출된 무기 오르토인산염을 상기 방법으로 측정하였다. 효소 측정 검사는 두번씩 실시하였다. 반응 혼합액 속의 실제 pH는 각 측정 검사의 시작과 마지막에 측정하였다.

피타아제 활성도에 pH가 미치는 영향

정해진 완충용액 및 pH를 조정한 밀기울 추출물을 사용하여 pH3.0 내지 8.5의 범위에서 피타아제의 상대 활성도를 조사하였다. 완충용액의 pH뿐만 아니라 완충용액의 산 조성도 피타아제 상대 활성도에 영향을 미쳤다. 해당 pH범위 내의 4종류의 정해진 완충용액 또는 HCl이나 NaOH를 첨가하여 pH농도를 조절한 밀기울 추출물이 사용되었다. 첨가된 효소가 반응 혼합물의 pH에 영향을 미치기 때문에, 30분 인큐베이션 처음과 마지막에 각 측정 혼합액의 실제 pH를 측정하였다. 반응이 진행되는 동안의 pH 변화는 미미했다. 실제 반응 pH를 사용하여 pH 활성도 특성을 결정하였다.

도 3a에서 3e는 37내지 75℃ 범위 내의 5군데 온도 지점에서 정해진 완충용액 속의 B 13 피타아제의 pH 활성도를 나타낸다. 반응 온도에 관계없이, 피타아제는 pH7.5에서 가장 높은 피타아제 활성도를 나타내었다.

동물 합성 사료의 pH는 pH5.5 내지 7.5인 것이 대부분이다.

피타아제의 최적 온도는 55℃였다. 상기 정해진 완충 용액에서 pH가 피타아제의 온도 활성도 특성에 미치는 영향을 도 4에 나타내었다.

정해진 완충용액과 비교했을 때, 밀기울 추출물은 식품 및 사료에 가장 가까운 환경을 제공할 것이다. 37, 55, 75℃에서 피타아제의 pH 활성도 특성을 측정하였다. 밀기울 추출물 속에서 이 효소의 활성은 정해진 완충용액에서의 활성도에 비교할 때, 두배로 증가했다(도 5a에서 5c). 활성의 특성은 정해진 완충용액에서의 특성과 다르지 않았다(도 6).

도 7은 구이용 영계(broiler chicken)의 소화 과정 및 사료 제조에서의 pH와 온도 조건에서 두 피타아제의 상대 활성도를 나타낸다. 여기 제시된 데이타는 위에서 언급한 실험을 통해 얻었다(도 5a에서 5c).

실시예2: 피타아제를 암호하는 유전자의 클로닝

N-터미널 서열

SDS-PAGE로 정제한 B. subtilis B 13 피타아제의 N-터미널 서열을 Edman degradation을 사용하는 Perkin-Elmer Precice Sequencing System으로 알아내었다. 25개의 아미노산 길이의 N-터미널 서열을 얻었다. 더 자세한 아미노산 서열 정보를 얻기 위하여, 내부 펩티드(internal peptide)를 얻고자 정제된 피타아제를 LysC효소로 분해하여, 분해산물을 RP-HPLC로 정제하였다. 또, RP-HPLC정제 후 알킬화된 피타아제를 LysC로 분해하였다. 알킬화되지 않고, RP-HPLC로 정제된 피타아제 펩티드도 같은 시스템으로 서열을 확인하였다. 피타아제의 알킬화는 설퍼 브리지(sulphur bridges)가 존재하는 가를 알아보기 위하여 행해졌다. 알킬화된 것과 알킬화되지 않은 피타아제 LysC 분해 RP-HPLC 크로마토그램에 차이가 없어, 피타아제는 설퍼 브리지를 갖지 않은 것으로 나타났다.

19개의 정제된 펩티드 서열을 확인한 결과, 14개의 펩티드는 서로 다른 서열을 가지며(5개 내지 32개의 아미노산) 총 227개 아미노산이 포함되어 있었다.

피타아제의 N-터미널 서열에 해당하는 서열을 포함해, 모든 펩티드 서열을 표4에 나타내었다. 이 펩티드의 분자량을 질량분석계를 사용하여 측정하고, 계산한 분자량과 비교하였다.

표4: N-터미널 아미노산 서열로 얻어진 펩티드

PCR에 의한 피타아제 암호 서열 확인

이 펩티드 서열에 기초하여, PCR을 위한 탐침자를 설계하였다(표 5 참조). 모든 PCR은 PTC-255 DNA Engine 및 Perkin-Elmer Taq polymerase를 사용하여 실시하였다.

표 5 최적 조건 하에서 한 단편만을 생산하게 하는 PCR 탐침자

Sambrook 등에 의한 방법으로 분리한 B. subtilis B 13 DNA를 주형으로 하고, 이 탐침자를 사용하여, PCR 조건을 최적으로 하기 위하여 서냉복원 온도를 달리하고(45, 50, 55, 60℃), 마그네슘 농도를 달리하여(1.25, 2.5, 5, 10mM) PCR을 실시하였다. 다음 단계를 포함하는 PCR 방법이 선택되었다: 2분간 94℃에서 프리멜팅하고, 20초간 92℃ 멜팅 30주기, 30초간 50℃ 서냉복원, 마그네슘 농도 5mM에서 60초간 72℃에서 신장(extension). 표5에 나타낸 탐침자는 최적 조건에서 하나의 단편만을 증폭하였다. 증폭된 PCR 단편을 도 8에 나타내었다.

가장 긴 PCR 단편(탐침자 6465, 6470으로 증폭됨)을 PCR 2.1 벡터(Invitrogen Corp., Inc., San Diego, USA)에 클로닝하고, Sanger Dideoxy 방법을 사용하여 서열을 조사하였다. 그 결과, 본 발명에 의한 피타아제의 부분적인 DNA 서열(정확한 길이는 989bp)을 알 수 있었다.

피타아제 유전자의 PCR 산물의 제한 효소 분석

이 PCR 단편이 피타아제 단편이라는 것을 확인하기 위하여, 가장 짧은 PCR 단편을 약 100bp길이의 단편 두개로 절단하는 제한효소 Hinf I가 사용되었다. Hinf I로 절단된 단편들은 N-터미널 말단에서 부터 같은 길이의 단편이었다. 또한, PCR 단편을 EcoRI로 절단하였다. EcoR I로 절단된 가장 긴 피타아제 PCR 단편 두개는 도 9에 제시된 바를 확인해준다.

피타아제 유전자의 피타아제의 Southern blot 분석

Sambrook(1989) 등에 의해 개시된 방법에 따라, B. subtilis B 13으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 사용된 제한 효소는 Boehringer-Mannheim 제한효소이다. B. subtilis B 13 DNA를 EcoRI로 부분적으로 절단하고, 단편들을 아가로스 젤에서 분리하였다. 분리된 단편을 Southern blotting하여 나일론 막에 이동시켰다. 예상되는 피타아제 유전자를 포함하는 단편의 대략적인 크기를 결정하기 위하여, 32P-표지된 N-터미널 올리고뉴클레오티드 탐침,

으로 나일론 막을 Southern-Hybridize 하였다. Southern-Hybridisation 결과, 도 9에 제시한 유전자의 구조와 일치하는 약 1700bp 및 1000bp의 두개의 띠가 나타났다.

B. subtilis B 13 게놈 라이브러리 스크리닝

부분적으로 EcoR I로 절단된 게놈 B. subtilis B 13 DNA를 제조자의 권장사항에 따라, Stratagene Lambda Zap II/EcoRI/CIAP Cloning kit를 사용하여 Lambda Zap II.으로 클로닝하였다. 디곡시게닌(digoxigenin)으로 표지한 상기 가장 긴 PCR 단편(989 bp)을 하이브리다이제이션 탐침(hybridisation probe)으로 사용하여, 제조자의 권장 사항에 따라 Boehringe-Mannheim EasyToHyb hybridisation kit로 Lambda Zap II 라이브러리를 스크리닝하였다. XL-1 Blue MRF' 숙주 세포에 lambda Zap II B. subtilis B 13 게놈 라이브러리 파지 100 000 pfu's을 감염시켰다. 감염된 세포를 LB 아가 배양접시(LB agar plate)상에서 TOP 아가로스를 가지고 평판배양하였다. 형성된 용균반을 나일론 막으로 이동시킨 후, 989 bp 디곡시게닌으로 표지된 하이브리다이제이션 탐침으로 스크리닝하였다. 서너개의 강한 양성 클론이 확인되었다. 이 양성 용균반을 코어(core)하고 이를 사용하여 두번째 하이브리다이제이션을 실시하였다. 양성 용균반은 두번째 하이브리다이제이션에서도 양성을 유지하였고, 이를 코어하고 헬퍼 파지를 가지고 절단하여 pBluescript SK(-) 파지미드(phagemid)를 얻었다. 얻어진 파지미드로 E. coli 숙주세포를 형질전환하고, 제제로부터 얻은 DNA를 이용하여 삽입DNA 및 DNA서열을 분석하였다.

피타아제를 암호하는 유전자의 DNA 서열 결정

피타아제를 암호하는 DNA 서열 및 추론된 아미노산 서열이 서열ID번호 1에 나타나있다. 서열 ID 번호 1의 아미노산 서열에서 추측되는 피타아제의 분자량은 프리-단백질(pre-protein)의 경우 ca. 41,900달톤, 성숙 단백질(mature protein)((신호 서열이 제외됨)의 경우 ca. 39,000달톤이다. 이는 SDS-PAGE로 얻은 피타아제의 분자량과 일치한다(도 1).

성숙 단백질의 N-터미널은 서열 ID 번호1의 아미노산 번호 30(Leu-30)에 해당한다.

실시예3: E. coli에서의 재조합 피타아제 발현

성숙 단백질의 DNA 코딩을 벡터 pQE-30, pQE-60에 클로닝하기 위한 제한 부위를 또한 포함하는 탐침자를 사용하여 PCR에 의해 확대하였다(Qiagen, Chatsworth, CA, USA). 각 경우의 5'탐침자는 Mfe I 부위(Eco RI와 compatible)을 암호하고, 리보솜 결합 부위 및 성숙 단백질의 아미노 말단을 암호하였다. pQE-30을 위한 3'탐침자는 천연 단백질의 종결 코돈의 하류에서 하이브리다이즈하고, 클로닝을 위한 Sal I부위를 하이브리다이즈했다. 이에 따른 PCR 생성물을 Eco RI/Sal I로 절단된 pQE-30에 클로닝하였다. 이 생성물은 아미노 말단에 추가적인 메티오닌 잔기를 가진 성숙 천연 산물과 동일한 단백질을 생성할 것이다.

pQE-30, pQE-60에 클로닝하기 위한 5'탐침자

pQE-30을 위한 3'탐침자

pQE-60을 위해 사용된 3' 탐침자는 이 단백질의 C-말단을 암호했고(종결 코돈은 제외), Bgl II 클로닝 부위를 암호했다. 이 벡타 서열은 발현된 단백질 정제를 촉진하기 위한 히스티딘 꼬리(histidine tag)를 암호하는 뉴클레오디드를 제공한다. 이 PCR 생성물을을 Eco RI/Bgl II로 절단된 pQE-60에 클로닝하였다. 이 생성물에서 발현된 효소는 제조자의 지시에 따라(Qiagen) Ni-NTA수지를 사용하여 세포 여액(lysate)으로부터 정제해낼 수 있다.

pQE-60을 위한 3'탐침자

상기 생성물은 발현 숙주 M15/pREP4 세포 계통(cell line)(Quiagen)에 형질전환되었다. M15/pREP4 세포 계통은 표준 방법을 사용하여 형질 전환되었다(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harboe, New York, 1989). 이 세포 계통은 lac 억제 단백질을 발현하는 플라스미드(pREP4)를 포함한다. 이는 코딩영역(open reading frame)의 상류에 두개의 lac 억제 인식 서열을 갖는 pQE-30, pQE-60에서 발현 생성물을 강하게 억제하도록 할 수 있게한다. 이 벡터는 파지 T5 프로모터를 사용하는데, 이는 E. coli RNA polymerase에 의해 효율적으로 인식된다. 이 생성물을 앰피실린(ampicillin), 메티실린(methicillin), 카나마이신(kanamycin)을 첨가한 LB 배지에서 37℃로 하루 밤 동안 성장시켰다. 하루 밤 동안 배양한 것을 신선한 배지에서 1:30으로 희석하고 OD₆₀₀0.8로 성장시켰다. 이 시점에서 이들은 1.5mM IPTG로 induce되었다. 세시간 더 성장시킨 후, 세포를 수거, 세정한 후, 고주파음에 의한 분해(sonication)로 분해하였다. 원심분리로 여액의 찌꺼기를 제거하였다. 찌꺼기가 제거된 여액의 분획을 효소 활성도 측정을 행하였다. 측정은 반응 완충 용액(100mM Tris-100mM 말린산염, pH7, 1mM CaCl₂, 2mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액)에서 30분간 42℃에서 실시되었다. 실험 결과를 표6에 나타내었다.

표6

생성체	에세이	백그라운드	차이
pQE	0.044	0.007	0.037
pQE-30	0.259	0.002	0.257
pQE-60	1.160	0.004	1.156

서열 리스트

(1) 일반 사항

(i) 출원인:

(A) 이름: 핀피즈 인터내셔날 리미티드

(B) 거리: 피.오.박스 777

(C) 도시: 말보로우

(D) 주: 윌트셔

(E) 국가: 영국

(F) 우편번호: SN8 1XN

(ii) 발명 명칭: 피타아제, 상기 피타아제를 암호하는 유전자, 이의 생산 방법 및 용도

(iii) 서열 갯수: 2

(iv) 컴퓨터 읽기 형태:

(A) 매체 종류: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

(2) 서열 ID 번호 1에 대한 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이: 1290 염기쌍

(B) 타입: 핵산

(C) 선형태(strandedness): 이중

(D) 토폴로지(topology): 선형

(ii) 분자 타입: DNA(게놈)

(vi) 유래:

(A) 생명체: Bacillus subtilis

(B) 균주: B13

(ix) 특성:

(A) 이름/KEY: CDS

(B) 위치(LOCATION): 91..1239

(xi) 서열 ID 번호 1의 서열:

(2) 서열 ID 번호 2의 정보

(i) 서열 특징

(A) 길이: 383개 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(D) 토폴로지(topology): 선형

(ii) 분자 타입: DNA(게놈)

(xi) 서열 ID 번호 1의 서열:

식품 및 사료 속에 소화가 잘 안되는 피테이트의 형태로 들어있는 인이 이용가능한 형태가 되도록 하는 피타아제 효소를 식품 및 사료에 제공함으로써, 식품 및 동물 사료의 영양가를 높이고, 사료 비용을 낮추며, 소화되지 않고 분비된 인으로 인한 환경적인 부담을 감소시킨다. 식품 및 동물 사료의 처리 공정에 이용할 수 있다.

Claims

피타아제 또는 이의 기능적 유도체로, 100mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 고유 활성도를 측정했을 때, 고유 활성도가 적어도 단백질 mg 당 20U인 것을 특징으로 하는 피타아제 또는 이의 기능적 유도체.
제 1항에 있어서, 상기 피타아제를 100mM 말레인산, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 37℃, 30분간 인큐베이션하였을 때, 상기 피타아제의 최적 pH가 pH6.5 또는 그 이상이거나, 상기 피타아제를 100mM Tris-HCl, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 37℃, 30분간 인큐베이션하거나, 밀기울 추출물, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에서 37℃, 30분간 인큐베이션하여 최적 pH를 측정했을 때, 최적 pH가 pH7.0 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 피타아제.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 피타아제가 동물 소장에서 발견되는 소화 효소의 존재 하에서도 기능할 수 있는 것을 특징으로 하는 피타아제.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 식품 또는 사료 처리 공정 중 상기 피타아제의 상대 활성도가, 동물의 소화관에서의 상기 피타아제의 활성도와 비교했을 때 30%이거나 그 이상인 것을 특징으로 하는 피타아제.
제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피타아제는 미생물로부터 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 피타아제.
제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 Bacillus 균주인 것을 특징으로 하는 피타아제.
제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Bacillus 균주는 Bacillus subtilis 및 Bacillus amyloliquefaciens로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피타아제.
제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Bacillus 균주가 스코트랜드 소재 National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Ltd.(NCIMB)에 1996년 8월 1일 NCIMB-40819번으로 기탁된 Bacillus subtilis 균주 BS 13인 것을 특징으로 하는 피타아제.
제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피타아제는 서열 ID 번호 1의 아미노산 또는 이의 기능적인 유도체을 포함하는 것을 특징으로 하는 피타아제.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 의한 피타아제를 암호하는 분리된 핵산 또는 이의 기능적 유도체.
제 10항에 있어서, 상기 핵산이 서열 ID 번호 1의 DNA 서열 또는 이의 기능적인 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 10항에 있어서, 상기 핵산이 서열 ID 번호 1의 DNA 서열 또는 이의 기능적인 유도체에 하이브리다이즈되는 것을 특징으로 하는 핵산.
피타아제를 암호하는 분리된 핵산으로, 상기 핵산이 서열 ID 번호 1의 DNA에 하이브리다이즈되고, 37℃의 100mM 말레인산-Tris, 1mM CaCl₂, 1.6mM 소디움 피테이트로 이루어지는 용액에 30분 둔 후, 측정한 고유 활성도가 적어도 단백질 g당 10U이고, 최적 pH가 pH5.0인 피타아제를 암호하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제 10항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산.
제 14항에 의한 DNA 분자를 포함하는 벡터.
제 15항에 있어서, 상기 DNA 분자가 상기 DNA분자로부터 피타아제를 발현할 수 있는 조절 서열에 기능적으로 연결된 것을 특징으로 하는 벡터.
제 16항에 있어서, 상기 DNA분자에 상기 피타아제를 분비하도록 할 수 있는 선도 서열이 포함되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 10항 내지 17항 중 어느 한 항에 의한 핵산 또는 벡터에 의해 형질 전환된 원핵 숙주 세포.
제 18항에 있어서, 상기 숙주 세포가 E.coli, Bacillus sp., Lactobacillus sp. 및 Lactococcus sp.로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 원핵 숙주 세포.
제 10항 내지 17항 중 어느 한 항에 의한 핵산 또는 벡터에 의해 형질 전환된 진핵 숙주 세포나 생물체.
제 20항에 있어서, 상기 숙주 세포가 Aspergillus sp., Humicola sp., Pichia sp., Trichoderma sp., Saccharomyces sp. 및 콩, 옥수수, 평지 등의 식물로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포나 생물체.
재조합에 의한 피타아제 제조 방법으로, 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 의한 숙주 세포나 생물체가 적합한 조건에서 배양 또는 증식되어 상기 피타아제를 회수한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 의한 피타아제를 식품 또는 동물 사료에 사용하는 용도.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 의한 피타아제를 포함하는 식품 또는 동물 사료.
제 24항에 있어서, 상기 식품 또는 동물 사료에 상기 동물의 소화관에서 활성을 갖는 첨가제로써 피타아제가 포함되는 것을 특징으로 하는 식품 또는 동물 사료.
제 24항에 있어서, 상기 식품 또는 동물 사료에 식품 또는 사료 처리 공정에서 활성을 갖는 첨가제로써 피타아제가 포함되는 것을 특징으로 하는 식품 또는 동물 사료.
제 24항 내지 26항에 의한 식품 또는 동물 사료의 생산 방법으로, 상기 피타아제가 상기 식품 또는 동물 사료에 액상으로 스프레이되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항 내지 26항에 의한 식품 또는 동물 사료의 생산 방법으로, 상기 피타아제가 상기 식품 또는 동물 사료에 건조 제품으로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항 내지 26항에 의한 동물 사료를 가금류를 포함하는 조류, 소ㆍ양을 포함하는 반추류, 돼지, 물고기ㆍ새우를 포함하는 수중 동물로 이루어지는 군에서 선택되는 동물에 사용하는 용도.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 의한 피타아제를 이노시톨, 무기 인산염 및 인산화된 중간체를 생성하는데 사용하는 용도.
동물 분뇨 속의 피테이트 수준을 저하시키기 위한 방법으로, 제 24항 내지 26항에 의한 동물 사료를 상기 사료에 포함된 피테이트를 전환시킬 수 있는 용량으로 동물에 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 의한 피타아제를 암호하는 핵산 제조 방법으로, 상기 핵산을 포함하는 것으로 추정되는 표본에 제 10항 내지 13항의 어느 한 항에 의한 핵산을 포함하는 탐침을 하이브리다이즈시켜, 상기 핵산을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 의한 피타아제를 발현시킬 수 있는 원핵 세포 또는 포자를 선생물(probiotic) 또는 직접적으로 섭취하는 미생물로 사용하는 용도.
제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 의한 피타아제를 발현할 수 있는 원핵 세포 또는 포자를 포함하는 식품 또는 동물 사료.
식품 또는 동물 사료 제조 방법으로, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 의한 피타아제를 발현 할 수 있는 원핵 세포 및/또는 포자가 상기 식품 또는 동물 사료에 첨가된 것을 특징으로 하는 방법.