KR20000020518A - 태반 트로포블라스트-특이적 유전자 - Google Patents

Abstract

폴리뉴클레오타이드 분자 Psx 발현은 태반 특히 배형성동안 태반 트로포블라스트 세포층에 제한적이다. Psx의 발현 패턴은 본 발명의 Psx 발현에 의한 래비린틴 트로포블라스트(labyrinthine trophoblast) 층 및 거대 세포(giant cell)와 같은 트로포블라스트 특이적 계통을 검색하는 데에 이용될 수 있다. 나아가 본 발명은 키메릭(chimeric) DNA 구조물, 그 DNA를 함유하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 추정되는 유산촉진제를 확인하기 위한 방법을 제공하고, 외과적 유산에 대한 대안을 줄 수 있다. 본 방법은 다음의 단계를 포함하는 방법으로, Psx에 상응하는 DNA 조절 영역을 분리하고 ; Psx DNA에 시술적으로 연결된 셀 라인(cell line)에서 기능화할 수 있는 구조적 프로모터를 함유하는 첫 번째 키메릭 DNA 구조물과 리포터 유전자(reporter gene)에 시술적으로 연결된 DNA 조절 영역을 함유하는 두 번째 키메릭 DNA 구조물을 지닌 헤테로로거스(heterologous) 셀 라인을 안정하게 형질전환시켜서 ; 최종적으로 화합물의 Psx 억제 활성도를 측정하기 위해 형질전환된 셀 라인이 에세이될 수 있도록 그 화합물을 함유하는 배지에서 형질전환된 셀 라인을 배양하는 것이다. 이 방법은 DNA 분자에 시술적으로 연결된 셀 라인(cell line)에서 기능화할 수 있는 구조적 프로모터를 함유하는 세 번째 DNA 구조물과 형질전환된 세포를 일시적으로 감염시킴으로써 Psx 활성을 억제할 수 있는 DNA 분자를 확인하기 위해 조작되어질 수 있고, 그런 후 DNA 분자의 억제 활성도를 측정하기 위해 에세이되도록 형질전환된 셀 라인을 배양하는 것이다. 게다가, 본 발명은 Psx 폴리펩타이드의 에피토프(epitope)에 특이성을 지니는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생산하기 위한 Psx 폴리펩타이드에 관한 것으로, 임신성 트로포블라스트 질병과 같은 트로포블라스트-특이적 Psx-매개 질병을 진단하는데 이용되어 진다.

Description

태반 트로포블라스트-특이적 유전자

몇가지 임신 중절 방법이 내과 또는 외과적 유산 1) 경관이 성숙되기 전에 하는 수술로 '보통 유산'(ordinary abortion)은 강한 진정제 하에서 진공 흡입함으로써 행해지고, 2) 파라서비칼 블록(paracervical block)으로 개량한 카르만(Karman) 시술 및 3) RU486 및 프로스타글란딘으로 하는 내과적 유산이 있다.

외과적 유산에 대한 대안으로서 내과적 임신 중절(내과적 유산)은 마취제가 필요 없으며 경열상관(cervical laceration) 또는 자궁 천공(uterine perforation)의 위험이 없는 등의 많은 장점을 지니고 있다(Havey et al. 1995). RU486(미페프리스톤 ; mifepristone)은 비-외과적 유산을 위한 유산촉진제(abortifacient) 약물 성분으로서 대표적 예이다(Cadepond et al. 1997). 처음에 임상적으로 스테로이드성 안티프로제스테론이 이용되었다(Cameron et al. 1986 ; Bygdeman and Van Look 1988). 이것은 프로제스테론 수용체에 결합함으로써 작용하는데, 자궁 수준에서 프로제스테론의 영향을 블록킹하여 자궁내막의 괴사 및 탈각을 일으키게 한다. 그러므로, RU486은 인간 초기 임신을 방해하는데 이용될 수 있다. 임신기간이 7∼8주가 경과하게 되면, RU486 단독으로 유산 성공률은 50∼90%가 된다. 그러나 성공률은 RU486과 약간의 프로제스테론 투여로 95∼100%까지 올릴수 있다. 추가적으로, RU486의 임상적 이용은 월경 유도, 늦은 성교 후의 수축, 자궁내 태아 사망 후 분만 유도, 경관 성숙 전의 수술 및 프로제스테론 수용체 양성 유방암의 취급에 이용되어질 수 있다.

비록 본 연구자들이 임신을 효과적이고 안전하게 중절시키는 유산촉진제 약물 성분의 분리에 초점을 맞춘다 하더라도 유산촉진제 약물 성분 단독으로는 완전한 유산을 야기하지는 않는다. 그러므로, 보통 약물성분의 조합이 완전한 유산을 유도하는데 이용된다(Cameron et al. 1986 ; el-Refaey and Templeton 1995). 가능한 유산촉진제 성분을 확인하기 위한 다량의 물질을 스크리닝하는 접근방법은 약물 유산촉진제 성분 단독 또는 다른 성분과의 조합이 더 효과적이며 안전하고 빠르다는 것을 확인하게 한다.

태반은 발생동안 태아를 유지, 자양물 제공 및 외부 환경으로 부터 및 보호해 주어 태아의 생존에 필수적인 것이다(Cross et al. 1994). 비록 기관 장애를 지닌 태아의 경우 생존할 수 있다 하더라도, 대부분의 경우 태반형성의 장애는 태아를 사망으로 이르게 하여 이는 배형성 동안 태반의 중요성을 반영한다. 외관상 태반형성에 작은 장애가 보인다 하더라도 심각한 악영향을 초래할 수 있다. 예를 들면, 인간에 있어서는 혈관 연결내의 비정상으로 산모와 태아 모두의 생존에 치명적인 임신 중독증의 일종인 자간전증(preeclampsia)을 야기하기도 한다(Roberts et al. 1993). 그러한 비정상은 산모와 태아의 건강에 영향을 줄 뿐만 아니라 중요한 사회적 손실이다. 일반적으로, 임신의 질병 진단 및 치료를 위한 접근은 트로포블라스트(trophoblast) 세포에 정확하게 특이적으로 발현되는 마아커 분자들의 수가 적고 그 질병을 이해하기가 어렵기 때문에 제한이 있다.

포유류 배발생동안 트로포블라스트는 분화의 첫 번째 단계이어서, 자궁 환경내에 적합한 배의 착상과 이후의 발생에 필요한 대부분의 외배 조직을 발생하게 한다(Rossant 1986 ; Cross et al. 1994). 이것은 포배(blastocyst)의 포배벽(trophectoderm)으로부터 발생되어 이후 발생에서 성숙된 태반에서 태아의 운명에 중대한 기여를 하게된다. 정상적인 착상과 태반형성에서 인간 트로포블라스트는 두 갈래의 분화를 수행하여 융모(villous)와 융모외(extravillous) 트로포블라스트의 발생을 야기하는 것으로 보인다(Kurman 등. 1984 ; Loke 와 King 1995). 사이토트로포블라스트(cytotrophoblast ; CT)가 매개 트로포블라스트(intermediate trophoblast ; IT)로 분화되어 다핵 매개 트로포블라스트 세포(multinucleated intermediate trophoblastic cells ; MITC)로 분화되는 융모외 트로포블라스트에 의해 나타나는 분화 스펙트럼과 비교하여, 융모 표면에서 CT는 갑자기 신시티오트로포블라스트(syncytiotrophoblast ; ST)로 분화된다. 다양한 형태의 임신성 트로포블라스트 병변(lesion)들은 트로포블라스트 분화의 다른 단계에서 발생하는 병리학적 비정상들을 분리 확인할 수 있다(Lim et al. 1997 ; Horn and Bilek 1997 ; Shin and Kurman 1997).

그러므로, 트로포블라스트-특이적 마아커 유전자의 발견은 트로포블라스트의 분화 단계와 계통의 분자 정밀분석을 촉진시켜 다양한 트로포블라스트 병변에의 접근을 가능케 한다(Mazur and Murman 1994). 게다가, 이들 마아커에 대한 항체들은 다양한 형태의 임신성 트로포블라스트성 질병의 차별화된 진단과 연구에 중대한 가치를 지니게 될 것이다(Losch and Kainz 1996).

성숙된 쥐 태반은 세 개의 트로포블라스트 층, 즉 래비린틴(labyrinthine) 트로포블라스트, 스폰지오트로포블라스트(spongiotrophoblast) 및 거대 세포(giant cell) 층으로 구성되어 있는데, 각각은 형태학적으로 뚜렷이 구별된다(Rossant and Croy 1985 ; Rossant 1995). 이들 특정화된 쥐 트로포블라스트 세포 타입, 래비린틴 트로포블라스트, 스폰지오트로포블라스트 및 거대 세포들은 각각 인간 태반의 신시티오트로포블라스트, 융모 사이토트로포블라스트 및 융모외 사이토트로포블라스트와 상동성이 있다.

본 연구자들은 최근에 밝혀진 신규한 호메오박스-함유 유전자인 Psx를 쥐 수태물로부터 분리하였다(Han et al. 1998). 호메오박스 유전자가 배 발생동안 바디 플랜(body plan)과 같은 세포 운명을 조절하는데 포함되어 있다는 사실은 잘 알려져 있다(De Robertis 1994). 그러므로, 하나의 돌연변이가 바디 플랜의 중요한 변화 및 종양 또는 악성 형질전환에서 발견되는 변형된 호메오박스 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 호메오박스 유전자들은 호메오박스로 알려진 고정된 180 bp 뉴클레오타이드 서열에 의해 특정화되는데, 세 개의 α-나선 구조로 된 60개의 아미노산으로 구성된 DNA 결합 호메오도메인을 암호화한다(Gehring et al. 1994). 이러한 DNA 결합 특성은 표적 유전자 이하를 조절하는 전사 인자로서의 호메오도메인 단백질 기능을 나타낸다. 동물에서는, 대부분의 이들 유전자가 발생, 분화 및 악성 형질전환을 포함하는 복합 유전자의 조화된 발현을 조절하는 것으로 보여진다(McGinnis and Krumlauf 1992).

이 유전자의 발현은 8.5일째 배아기에 태반, 특히 태반의 트로포블라스트 세포층에서 처음으로 검색된다. 그러므로, 이러한 발견들은 Psx가 태반형성의 발생, 특히 트로포블라스트 특이 세포 계통의 발생에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시하는 것이다. 따라서, Psx 유전자와 유전자 생성물은 새로운 트로포블라스트-특이적 및 단계-특이적 마아커로서 유용하고 또한 임신성 트로포블라스트 질병과 같은 트로포블라스트-특이적 Psx-매개 질병을 포함하는 장애의 치료를 위한 치료방법을 발달시키는 데에 유용하다.

도 1은 Psx의 핵산 서열이다. 단백질 서열은 하기 44번째 염기에서 개시제 메티오닌으로 시작됨을 나타낸다. DNA 결합에 관여하는 호메오도메인은 밑줄친 아미노산 150∼209 까지이다.

도 2는 몇가지 공지된 호메오도메인 서열과 Psx 호메오도메인을 비교한 것이다. 줄표(-)는 Psx와 다른 서열들간에서 아미노산 동일성을 지니는 영역을 나타낸 것이다. 백분율은 참고적으로서 Psx 호메오도메인 아미노산 서열과의 동일성의 정도를 나타낸 것이다. 이 서열들의 근원은 Mhox (Cserjesi et al. 1992), S8 (Opstelten et al. 1991), Smox-3 (Webster et al. 1992), GSC (Blumberg et al. 1991), Phox2 (Valarche et al. 1993), Shox (Rao et al. 1997), Rx (Mathers et al. 1997), Pax3 (Goulding et al. 1991) 및 Solurshin (Semina et al. 1996) 이다.

도 3a 와 3b 는 배 발생동안 Psx mRNA 발현 패턴의 노던 블럿 융합 분석을 나타낸 것이다. 전체 RNA를 (A)에서 나타낸 임신기간에 배 및 외배 조직을 포함하는 쥐 수태물로부터 준비하거나 또는 (B)의 13.5일에 전체 수태물, 태아, 태반, 난황낭(yolk sac) 및 자궁으로부터 준비한다. 각 레인은 20㎍의 전체 RNA를 함유한다. 블럿들은 하기 실시예에 기재된대로³²P로 라벨링된 5' end Psx cDNA 프로브로 융합한다. 대조구 패널(아래쪽)은 블러팅 전에 겔의 UV 사진으로, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, 하기 "이티비알" 로 표기)로 염색한 유사한 수준의 18S 와 28S rRNA를 나타낸 것이다. Psx(0.9kb)의 위치는 화살표로 나타내었다.

도 4a 와 도 4b는 다양한 발생 단계에서 태반과 난황낭 내의 Psx mRNA 발현의 노던블럿 융합 분석을 나타낸 것이다. (A)RNA는 10.5 일에서 18.5일을 지나 19.5일의 임신기간에 태반으로부터 준비한다. (B)RNA는 10.5 일에서 18.5일을 지나 19.5일의 임신기간에 난황낭으로부터 준비한다. 각 레인은 10㎍의 전체 RNA를 함유한다. 수태기간을 각 레인의 상단에 나타내었다. Psx(0.9kb)의 위치는 화살표로 나타내었고, 이티비알로 염색된 rRNA(28S 와 18S)의 위치를 나타내었다.

도 5a 와 도 5b는 태아, 펍(pup) 및 성체 조직에서의 Psx mRNA 발현의 노던 블럿 융합분석을 나타낸 것이다. (A) 전체 RNA(10㎍)들은 임신시기의 태반과 태아 및 생후(postnatal) 시기 0.5(p0.5)에 펍으로부터 분리하였다. 19.5일째의 태반을 태생시기(전체 기간)에서 준비하였다. (B) 전체 RNA(20㎍)들은 성체쥐의 다양한 기관으로부터 준비하였다. 18.5일째의 태반을 양성 대조구로써 이용한다. Psx (0.9kb)의 위치는 화살표로 나타내었고, 이티비알로 염색된 rRNA(28S 와 18S)의 위치를 나타내었다.

도 6a에서 도 6g는 안티센스 리보프로브(antisense riboprobe)로 Psx mRNA 발현의 인 시투(In situ) 융합분석을 나타낸 것이다. E 7.5(A), E 8.5(B,C), E 9.5(D, E) 및 E 13.5(F, G)는 각각 쥐 자궁내의 수태물의 새지탈 분획을 나타낸 것이다. (C)와 (G)는 각각 (B)와 (F)의 박스 영역을 크게 확대한 것이다. Psx-특이적 융합 시그날은 코리오닉 엑토덤(chorionic ectoderm ; Ch), 래비린틴 트로포블라스트(labyrinthine trophoblast ; Lb) 및 자이언트 세포(giant cell)에서 검색한다. E 7.5에서는 어느 조직에서도 안티센스 프로브로 융합 시그날을 검색할 수 없었다. De : 데시두아(Decidua), Sp : 스폰지오트로포블라스트(Spongiotrophoblast)를 나타내고, 현미경 배율은 Mag. A, B, D, E 에는 X25, F 에는 X50, C 에는 X125, G 에는 X250을 사용하였다.

도 7은 쥐의 게놈 DNA내의 Psx 연관 서열의 서던블럿 분석을 나타낸 것이다. 쥐 태반에서 분리한 10㎍의 게놈 DNA를 KpnI 와 XbaI 로 분해하고 실시예에 기재된 방법에 따라³²P 로 라벨링된 5' 말단의 Psx 게놈 프로브로 융합한다.

도 8a 와 도 8b 는 쥐 Psx 유전자의 염색체 위치를 나타낸 것이다. (A) 좌측 패널은 염색체에서 FISH 시그날링을 보여준 것이며, 오른쪽 패널은 염색체 X를 확인하기 위해 DAPI 로 염색한 동일한 마이토틱 모습을 나타낸 것이다. (B) FISH 지도의 다이아그램은 프로브 Psx를 위한 결과이다. 각 점은 쥐 염색체 X에 검색된 두 개의 FISH 시그날을 나타낸다.

따라서 본 발명은 Psx 단백질을 암호화시키는 분리된 핵산 분자를 제공하는 것으로, 이때 핵산 분자가 메신저 RNA 분자임을 특징으로 하고, 핵산 분자가 DNA 분자임을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자이다.

한편, DNA 분자는 본 발명에서 발명한 서열을 지니는 cDNA 분자임을 특징으로 하고, 또한 이때 검색할 수 있는 마아커가 라밸링되어 있음을 특징으로 하는 Psx 단백질을 암호화하는 cDNA를 제공한다.

한편, 본 발명의 cDNA 서열을 이용하여 임신성 트로포블라스트 질병과 같은 트로포블라스트-특이적 Psx-매개 질병을 진단하는 방법을 제공하며, 이는 Psx에 상응하는 DNA 조절 영역을 분리하고 ; Psx DNA에 시술적으로 연결된 셀 라인(cell line)에서 기능화할 수 있는 구조적 프로모터를 함유하는 첫 번째 키메릭 DNA 구조물과 리포터 유전자(reporter gene)에 시술적으로 연결된 DNA 조절 영역을 함유하는 두 번째 키메릭 DNA 구조물을 지닌 헤테로로거스(heterologous) 셀 라인을 안정하게 형질전환시켜서 ; 최종적으로 화합물의 Psx 억제 활성도를 측정하기 위해 형질전환된 셀 라인이 에세이될 수 있도록 그 화합물을 함유하는 배지에서 형질전환된 셀 라인을 배양하는 방법을 포함함을 특징으로 하는 진단방법인 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 신규한 cDNA 클론, 지정된 Psx를 제공하여 호메오도메인 서열을 포함하는 상응된 트로포블라스트-특이적 Psx 폴리펩타이드를 암호화 한다. Psx의 발현 패턴은 본 발명의 Psx 발현에 의한 래비린틴 트로포블라스트 층 및 거대 세포와 같은 트로포블라스트 특이적 계통을 검색하는 데에 이용될 수 있다. 나아가 본 발명은 키메릭(chimeric) DNA 구조물, 그 DNA를 함유하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.

더 나아가 본 발명은 추정되는 유산촉진제를 확인하기 위한 방법을 제공하고, 외과적 유산에 대한 대안을 줄 수 있다. 다음의 단계를 포함하는 방법으로, Psx에 상응하는 DNA 조절 영역을 분리하고 ; Psx DNA에 시술적으로 연결된 셀 라인(cell line)에서 기능화할 수 있는 구조적 프로모터를 함유하는 첫 번째 키메릭 DNA 구조물과 리포터 유전자(reporter gene)에 시술적으로 연결된 DNA 조절 영역을 함유하는 두 번째 키메릭 DNA 구조물을 지닌 헤테로로거스(heterologous) 셀 라인을 안정하게 형질전환시켜서 ; 최종적으로 화합물의 Psx 억제 활성도를 측정하기 위해 형질전환된 셀 라인이 에세이될 수 있도록 그 화합물을 함유하는 배지에서 형질전환된 셀 라인을 배양하는 것이다.

이 방법은 DNA 분자에 시술적으로 연결된 셀 라인(cell line)에서 기능화할 수 있는 구조적 프로모터를 함유하는 세 번째 DNA 구조물과 형질전환된 세포를 일시적으로 감염시킴으로써 Psx 활성을 억제할 수 있는 DNA 분자를 확인하기 위해 더욱 조작되어질 수 있고, 그런 후 DNA 분자의 억제 활성도를 측정하기 위해 에세이되도록 형질전환된 셀 라인을 배양하는 것이다.

게다가, 본 발명은 Psx 폴리펩타이드의 에피토프(epitope)에 특이성을 지니는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생산하기 위한 Psx 폴리펩타이드에 관한 것으로, 임신성 트로포블라스트 질병과 같은 트로포블라스트-특이적 Psx-매개 질병을 진단하는데 이용되어 진다.

본 발명자들은 Psx로 언급되는 호메오박스-함유 cDNA 클론을 확인하였다. 이 cDNA는 폴리머레이즈 체인 반응(PCR) 클로닝 방법을 이용한 호메오박스-함유 서열을 위해 13.5일된 전체 수태물로부터 쥐 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인하였다. 노던 블럿 분석과 인 시투(in situ) 융합 실험은 Psx 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현이 8.5일째 배아기 때에 외배 조직, 특히 트로포블라스트 계통인 래비린틴 트로포블라스트 층과 거대세포에서 처음으로 검색된다는 사실을 개시하고 있다. Psx의 발현 패턴은 본 발명의 Psx 발현에 의한 래비린틴 트로포블라스트 층과 거대세포와 같은 트로포블라스트 특이적 계통을 검색하는데 이용될 수 있다. 그러므로, Psx 폴리뉴클레오타이드 분자는 트로포블라스트 특이적 계통의 검색에 유용하다. 샘플(예를 들면, 조직 또는 셀 라인)에서 Psx 폴리뉴클레오타이드 발현의 검색은 그 세포들이 래비린틴 트로포블라스트 또는 거대세포와 같은 트로포블라스트 유도체라는 것을 나타낸다.

Psx 발현을 Psx 폴리뉴클레오타이드 분자를 이용한 융합에 의해 검색한다. 융합하기 위해 이용되는 Psx "프로브"는 라벨링된 전체 길이의 Psx DNA 분자이거나 바람직하게는 상동성이 있는 호메오박스 유전자들 사이의 교차-융합(cross-hybridization)을 피하기 위해 호메오박스 영역이 없이 라벨링된 Psx 절편이다. Psx에 보완적인 프로브를 종래의 방법에 의하여 제조하고, 종래의 인 시투 기술을 이용하여 샘플의 mRNA 또는 DNA에 융합하도록 한다.

공지 기술로 알려져 있는 인 시투 기술은 형광 현미경(fluorescence microscopy) 또는 방사선자기법(autoradiography)에 의해 각각 쉽게 정량될 수 있는 형광물질 및 방사선 라벨링 물질을 이용하여 실시한다. 또다른 라벨링 기술은 비색(colorimetric) 또는 화학루미너센스(chemiluminescent) 시그날로 즉시 정량할 수 있는 효소적 택(tag)을 이용하여 실시할 수 있다. Psx 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현을 배치하기 위한 인 시투 융합 방법을 실시예에 기재하였다. 융합의 강도를 반영되는 조직 세포 내의 Psx 양으로 검색한다.

RNA ("노던")블럿팅을 본 발명의 Psx 폴리뉴클레오타이드 분자를 이용하여 실시한다. 본 발명에 따라, RNA를 몇가지 표준 절차에 의해 조직으로부터 분리한다. RNA를 변성용 겔 전기영동에 투입하고 니트로셀룰로스 또는 다른 서포트 매트릭스(support matrix)에 옮긴다. Psx mRNA를 방사성 또는 비-방사성능으로 라벨링된 Psx 또는 Psx 절편의 융합에 의해 검색할 수 있고, 바람직하게는 당 업자에 의해 인지된 바와 같이 굉장히 가혹한 조건 하에서 검색할 수 있다. 융합의 양을 농도계적(densitometeric) 방법에 의해 정량할 수 있다.

게다가, 중합효소 연쇄반응("PCR")을 샘플내에 Psx DNA 또는 mRNA를 검색하기 위해 이용한다. PCR을 수행하기 위해 한 쌍의 Psx 서열-특이적 프라이머가 이용되는데, 이중 나선의 처음 위치에서 Psx 유전자의 반대편 가닥에 융합하게 된다. 그러한 프라이머는 본 발명에 따라 제공되는 Psx 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 얻는데, 바람직하게는 Psx에 유일한 절편, 예를 들면 Psx 보다 다른 단백질에는 낮은 상동성을 지니는 서열이다. 본 문맥에서 이용되는 두 가지 예의 Psx-특이적 프라이머 서열은 하기 서열을 포함하는데, Psx의 세포내 부위를 암호화한다.

5'- GAA ACT CCT CAA GAC AGC CGC C -3'

5'- CAG CCT ATT CAG AAC ATG TGG GT -3'

그러한 다른 프라이머 쌍들도 또한 선택하여 이용할 수 있다.

개시된 Psx 단백질이 호메오도메인-함유 전사 요소이다. 이들 단백질은 전사적 조절, 발생, 세포 분화 및 종양 형질전환과 관련되어 있다(McGinnis and Krumlauf 1992 ; Gehring et al. 1994). 이들 단백질의 호메오도메인은 DNA-결합에 의한다. 쥐 Psx 단백질의 아미노산 서열을 하기 서열 1에 개시하였다. 호메오박스-특이적 도메인은 아미노산 잔기 150(aa)∼209(aa)를 포함한다.

본 발명에 따르면 Psx 폴리펩타이드를 Maniatis 등이 1989년 Cold Spring Harbor Laboratory에서 네 번째로 발간한 MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL에 의한 재조합 DNA 기술에 의해 제조한다. 클로닝에 특이적으로 적합한 방법과 Psx 폴리뉴클레오타이드 분자를 실시예에 기술하였다. 하기 서열 2의 Psx 폴리뉴클레오타이드 분자를 적절한 발현 벡터로 클로닝하여 원핵생물, 곤충 또는 진핵생물 발현 시스템에서 발현시킬 수 있다.

종래 기술을 이용하여 Psx 단백질을 암호화하는 서열을 쥐 태반 또는 쥐 태반 cDNA 라이브러리로부터 mRNA에서 cDNA로서 수득할 수 있다. mRNA를 PCR에 기초를 둔 기술을 포함하여 이 분야에 잘 알려진 cDNA 클로닝 기술을 이용하여 이중 나선의 DNA로 전환할 수 있다. 이중 나선 DNA의 증폭된 PCR 생성물을 플라스미드와 같은 PCR 생성물을 클로닝에 편리한 시스템을 지니는 벡터로 도입시킨다. 본 발명에 적절한 플라스미드 벡터는 pGEM-T(Promega)이다. 이어서 표준 기술의 방법에 의해 리게이션(ligation)을 수행하고, DNA를 세포로 도입시켜 그 발현으로 원하는 단백질을 생산하게 된다. 원핵생물 숙주 중에서 대장균(E. coli)이 바람직하다. 대조구 서열과 상응되는 바실러스(Bacillus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 가닥과 같은 다른 원핵생물 숙주를 이용할 수 있다.

적절한 진핵생물 숙주로는 효모 및 포유동물 세포를 포함한다. 효모 발현 숙주는 사카로마이세스(Saccharomycces), 클레브실라(Klebsiella), 피키아(Pichia) 및 그와 같은 것들을 포함한다. 발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유류 셀 라인은 공지 분야에 잘 알려져 있으며, American Type Culture Collection (ATCC), 헬라(HeLa) 세포를 포함하여 차이니스 햄스터 오바리(Chines hamster ovary ; CHO) 세포, 코리오카시노마(Choriocarcinoma (BeWo, JAR)) 세포 및 다수의 다른 셀 라인을 포함한다. 또한 포유류 세포를 위한 적당한 프로모터도 공지 분야에 잘 알려져 있으며, 시미안 바이러스(Simian Virus 40 ; SV40), 라우스 사코마 바이러스(Rous sarcoma virus ; RSV), 아데노바이러스(adenovirus ; ADV) 및 보바인 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus ; BPV)와 같은 바이러스 프로모터를 포함한다. 또한 포유류 세포는 터미네이터 서열과 폴리-A(poly-A) 부가 서열이 필요하다. 또한 발현을 증가시키는 증진제(enhancer) 서열을 포함할 수 있고, 유전자의 증폭을 촉진하는 서열이 필요하다(예를 들면, 메토트랙세이트 저항성 유전자). 이들 서열은 적절한 벡터로서 공지 분야에 잘 알려져있다. Sambrook 등이 저술한 Molecular Cloning (A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 중 제16장 "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells"를 보면 잘 알 수 있다.

다른 한편으로 Psx 폴리펩타이드를 상업적으로 이용되는 프로메가(Promega (Madison, WI))의 시험관 내 번역 키트를 이용하여 제조할 수 있다. 이 키트는 Psx mRNA를 발현하기 위해 토끼 망상적혈구 분해물질로부터 유도한 리보솜, 폴리머레이즈, 아미노산등을 포함하는 번역 시스템을 이용한다.

Psx 단백질에 특이적인 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 표준 기술에 따라 제조한다. 폴리클로날 항체를 예를 들면 안티-Psx 항체를 형성하는 토끼와 같은 동물로 그 단백질을 주입시켜 생산한다. A. Johnstone 과 R. Thorpe 가 1982년에 옥스포드 Blackwell Scientific Publications에서 출간한 Immunochemistry In Practice를 보면 잘 나타나 있다. 본 발명의 Psx 단백질에 특이적인 모노클로날 항체를 공지된 방법에 따라 제조하였다(Choi et al. 1995). 이 과정은 Psx 폴리펩타이드로 감작 또는 주사된 동물의 임파구(lymphocyte)를 분리하고, 이를 하이브리도마(hybridoma)를 생산하기 위해 골수종(myeloma) 세포로 융합하고, 그 후 Psx 폴리펩타이드에 특이적 결합을 보이거나 선택적으로 결합하는 "안티-Psx 항체"의 생산을 위한 하이브리도마들을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 본 발명의 안티-Psx 항체는 Psx 단백질을 생산하는 트로포블라스트 세포와 같은 세포들을 검색하기 위해 이용한다.

본 발명의 항체들은 또한 표준 기술(Shin and Kurman 1997 ; Fisher et al. 1998) 에 따라 임신성 트로포블라스트 종양(gestational reophoblastic tumors ; GTTs), 인베시브 몰(invesive mole ; IM), 코리오카시노마(Choriocarcinoma) 및 태반 국소적 트로포블라스트 종양(placental site trophoblastic tumor ; PSTT)과 같은 임신성 트로포블라스트 질병인 Psx-매개의 트로포블라스트 질병의 진단의 보조자로서 이용될 수 있다. "Psx-매개된" 이라는 용어는 Psx 생산의 불완전한 전사적 또는 번역적 측면에 의해 매개된 질병 또는 상태를 의미한다. 바람직한 면역 염색법으로, 환자로부터 외배 조직의 생검(biopsy)을 수득하여 포르말린에 고정시켜 파라핀 또는 다른 적당한 물질에 끼워두어 안정화시킨다. 그후 조직을 얇게 썬다. 얇게 썰어진 생검을 1차 안티-Psx 항체, 바람직하게는 폴리클로날 항체를 이용하여 Psx 면역반응성을 분석하고, 이어서 두 번째 첨가에 의해 안티-Psx 항체에 결합할 수 있는 라벨링된 항체를 검색한다. 바람직한 항체는 염소 안티-래빗 IgG으로 이를 호오스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase ; HRP)와 같은 효소로 검색되도록 라벨링한다. 다른 한편으로, 생검 조직을 균질화하고 난 후, Psx에 특이적인 1차 항체와 안티-Psx 항체에 결합할 수 있는 2차 검색 가능한 라벨링된 항체를 이용하여 면역에세이를 실시한다. 방사성 동위원소, 효소 및 형광물질 마아커를 포함한 다양한 라벨들이 이 방법에서 사용될 수 있다. Psx 면역반응성의 결여는 그러한 질병을 암시하는 것이다.

임신성 트로포블라스트 질병은 다른 한편으로 환자로부터 조직 샘플을 수득하고 그로부터 DNA를 분리함으로써 진단할 수 있다. Psx를 암호화하는 유전자를 예를 들면, PCR 기술을 이용하여 분리하고, 이어서 그 유전자를 시퀀싱한다. 그 후, 분리된 Psx 유전자의 서열을 정상 태반의 대조구 그룹에서 분리한 Psx 유전자의 핵산 서열과 비교한다.

또한 Psx DNA (예를 들면, Psx 활성을 지니는 단백질을 암호화하는 DNA 분자)를 치료학적 유산촉진제를 확인하기 위한 방법에 이용하여 외과에 대책을 제공해 줄 수 있다. 본 출원인은 태반 트로포블라스트에 있는 Psx의 발현이 태반 세포의 최종 분화에서 결정적인 요인이어서, 그러한 발현이 결여된 트로포블라스트 세포들은 완전한 태반형성을 수행하지 않을 것이라 믿고 있는데, 예를 들면 배형성 동안 배 발생을 위한 완전한 기능을 수행할 수 없어서 결국 유산 또는 배의 죽음에 까지 이르게 된다는 것이다. Psx는 쥐의 X 염색체에 위치해 있고, 이는 X 염색체-연관 유전자가 외배 조직의 발생을 특이하게 조절한다는 가설(Shao and Takagi 1990)에 동의하는 것이다. 추가로, 게놈 서던 블럿 분석은 Psx가 쥐 게놈에서 단일 카피라는 사실을 나타낸다. 나아가 이 데이터는 태반 트로포블라스트에서 Psx 발현의 중요성을 지지하는 것이다.

본 발명의 이러한 실시태양에 따라 억제 활성을 지니는 것으로 추정되는 호르몬과 같은 비-핵산 화합물을 테스트하는 것은 Psx 단백질에 상응하는 증진제 또는 프로모터와 같은 DNA 조절 영역을 분리하는 것이다. 이것은 전형적으로 전체 게놈 DNA 또는 PCR 기술에 의해 제조한다. 분리된 영역을 루시퍼레이즈(luciferase)와 같은 리포터 유전자의 상부에 클로닝한 후, 그 리포터 유전자에 클론된 조절 영역의 전사적 조절을 수행한다. 셀 라인을 Psx DNA에 기술적으로 연결된 셀 라인 내 구조적 프로모터 기능을 포함하는 두 번째 키메릭 구조체를 따라 제조된 구조체와 안정적으로 형질전환한다. 바람직한 구조적 프로모터는 SV40 프로모터이다. 구조적 프로모터-Psx 유전자 키메릭 구조는 분리되어진 DNA 조절 영역-리포터 유전자 구조를 함유하는 동일한 벡터 또는 다른 벡터에 포함될 수 있다. 그 후 상기 형질전환된 셀 라인을 Psx 억제 활성을 지니는 것으로 추정되는 화합물을 함유하는 배지내에서 적절한 상태하에서 배양한다. 화합물의 억제 활성은 리포터 유전자의 발현량에 의해 결정된다.

Psx 억제 활성을 지니는 것으로 추정되는 핵산 화합물로 본 발명의 실시태양을 수행하는 것은 상기 기재된 안정하게 형질전환된 헤테로로거스(heterologous) 셀 라인을 관심있는 핵산에 기술적으로 연결된 셀 라인에서 기능을 수행할 수 있는 구조적 프로모터를 함유하는 세 번째 키메릭 구조체를 순간적으로 전이시키기 위한 것이다. 약 3∼4일의 적정한 배양기간 후에, 배양된 세포들을 상기와 동일한 방법으로 Psx 억제 활성을 에세이한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1) 동물 및 배의 준비

ICR 쥐(대한 실험 동물 연구 센터, 한국)들을 성체조직과 마찬가지로 다양한 발생단계에서 전체 수태물, 배 및 외배 조직의 분리를 위해 이용한다. 질전(copulation plug)의 존재를 기본으로 0.5일의 배아기(E 0.5)로서 지정된 임신 기간을 한밤중에 교미가 발생한 날을 합산한다.

(실시예 2) 쥐 수태산물 cDNA 라이브러리의 구축

폴리(A)⁺RNA를 조작자의 과정에 따라 13.5일째 배 및 외배 조직을 포함하여 쥐 수태산물로부터 추출한 전체 RNA 로부터 올리고텍스 mRNA 키트(Oligotex mRNA kit)(QIAGEN, 독일)를 이용하여 정제한다. 폴리(A)⁺RNA를 ZAP 익스프레스 cDNA 합성 키트 (ZAP Express cDNA synthesis kit)(Stratagene, 미국)를 이용하여 이중 나선의 cDNA 로 전환한다. 그후, cDNA를 EcoRI 및 XhoI으로 분해된 ZAP 익스프레스 벡터 (Stratagene)에 연결하고 기가팩 Ⅱ 골드(Gigapack II Gold)(Stratagene)람다 바이러스 외부 단백질과 융합시킨다.

(실시예 3) 호메오박스-함유 cDNA 절편의 PCR 증폭

쥐 수태물 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 호메오박스 서열을 증폭하기 위한 주형으로서 이용한다. 고도로 고정된 호메오도메인 나선 3을 암호화하는 서열에 상호 보완하는 변성 올리고뉴클레오타이드 5'-CCA(C/T)TTGGC(C/T)CTTCG(A/G)TT (A/C)(G/T)(A/G)(A/G)AACCA-3'를 GenBank 및 EMBL 데이터베이스로부터 선택된 호메오도메인 DNA 서열 쌍과의 비교 분석에 기초하여 디자인한다. 이를 3' 프라이머로 이용한다. ZAP 익스프레스 벡터에 있는 통상의 T3 프로모터 프라이머를 PCR을 위한 5' 프라이머로 이용한다. 증폭 반응은 pH 8.3인 10mM 의 Tris-HCl, 50mM의 KCl, 2.5mM의 MgCl₂, 0.2mM의 각 dNTP, 1μM의 각 프라이머 (Bioneer, 한국), 2.5 유니트의 Taq DNA 폴리머레이즈 (Promega, Madison, 미국) 및 50㎕ 최종 부피에서 약 10⁸플라크-형성 박테리오파아지를 함유하는 2㎕의 cDNA 라이브러리 상등액을 포함한다. 샘플을 두 단계의 PCR로 증폭한다. 1차 샘플을 94℃에서 5분간 변성시켜 35회 증폭하는데, 각 증폭 사이클은 94℃에서 1분, 48℃에서 2분 및 72℃에서 1분으로 실시한다. PCR 생성물은 최종적으로 72℃에서 5분간 연장시켜 둔다. 2차 증폭을 위해 5㎕의 1차 PCR 생성물을 주형으로 이용한다. 2차 증폭을 30회 수행하는데, 각 사이클은 94℃에서 1분, 56℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 실시한다. 최종 증폭 사이클 후에, PCR 생성물을 72℃에서 5분간 둔다. 이 PCR 생성물을 pGEM-T 벡터(Promega)로 클로닝한다. 야기된 형질전환체의 삽입물을 시퀀스하여 그들이 함유하고 있는 호메오박스 서열을 BLAST 패밀리프로그램을 이용하여 분리한다(Benson et al., 1997). 쥐 수태물 cDNA 라이브러리를 프로브로서 PCR-증폭된 cDNA를 이용하여 스크리닝한다.

(실시예 4) Psx 클론의 분리

쥐 수태물 cDNA 라이브러리(1×10⁶플라크)를 플레이트마다 5×10⁴플라크의 밀도로 플레이트하고 라벨링된 PCR 생성물로 스크리닝한다. 프로브는 랜덤 라벨링 키트(random labeling kit)(Boehringer, Manheim, 독일)를 이용하여 [α-³²P]dCTP로 라벨링한다. 필터(Hybond-N, Amersham International, Buckingham shire, UK)는 60℃에서 2시간동안 6×SSC, 5×Denhardts solution, 0.5% SDS 및 0.2 mg/ml의 변성된 연어의 정충 DNA를 함유한 버퍼에서 미리 융합시킨다. 융합은 프로브를 함유하는 동일한 수용액에서 60℃로 밤새 처리해둔다. 필터를 다음과 같이 60℃에서 세척하는데, 30분동안 2×SSC에서 1번, 2×SSC/0.1% SDS에서 각각 10분동안 2번, 10분동안 0.1×SSC에서 1번 실시한다. X-선 필름을 증감지(intensifying screen) 사이의 필터에 노출한다. 프로브에 융합된 양성 클론들을 조작자의 방법에 따라 생체내 절삭(ZAP 익스프레스 클로닝 키트, Stratagene)에 의한 파아지미드(phagemid) 플라스미드로서 재생한다.

(실시예 5) DNA 서열의 분석

서브클로닝된 PCR 생성물과 cDNA 클론들을 Taq 또는 T7 DNA 폴리머레이즈 및 형광 카보시아닌 염색(fluorescent carbocyanine dye ; Cy5)(Pharmacia Biotech)을 이용하여 시쿼네이즈 Ⅱ 키트(Amersham/United States Biochemical) 또는 ALFexpress DNA 시퀀서 (Pharmacia Biotech)의 매뉴얼로 서열을 분석한다. 컴퓨터-보조 서열 분석은 DNASIS 프로그램(Hitachi Software, San Bruno, CA)을 이용한다.

(실시예 6) RNA 제조와 노던블럿 분석

전체 RNA를 RNeasy 토탈 RNA 분리 키트(RNeasy Total RNA Isolation Kit)(QIAGEN, Hilden, Germany) 또는 LiCl/유레아 방법(Hogan et al., 1994)을 이용하여 다양한 쥐 발생 단계에 있는 전체 수태물, 태아 및 외배 조직 그리고 전체 펍(pup)과 성체 조직으로부터 준비한다. 10∼20㎍의 전체 RNA를 1×MOPS 버퍼 (20 mM MOPS, 8 mM 소디움 아세테이트, 1 mM EDTA), 50 중량%의 비이온화 포름아마이드 및 2.2 M 의 포름알데하이드에 65℃에서 15분간 변성시키고, 2.2 M 의 포름알데하이드와 1×MOPS 버퍼가 함유된 1% 아가로오즈 겔에 전기영동하여 분획화한다. RNA를 10×SSC에서 Hybond-N 막에 모세관으로 블러팅한다. 이후 동일한 융합 전 버퍼에서 적어도 60℃에서 2시간 동안 cDNA 라이브러리를 방치한 후 , 필터를 신선한 QuikHyb 버퍼 (Stratagene)에 프로브를 넣고 60℃에서 하룻밤 융합시킨다. 최종 세척을 65℃에서 다음과 같이, 20분동안 2×SSC에서 1번, 1×SSC/0.1% SDS에서 각각 20분동안 3번, 20분동안 0.2×SSC/0.1% SDS 에서 1번 실시한다. 프로브 DNA는 Psx cDNA 클론을 주형으로 이용하여 PCR로 제조한다. 호메오도메인 서열이 없는 이 cDNA 절편을 Psx-특이적 프라이머를 이용하여 증폭한다. PCR 생성물을 pGEM-T 벡터 (Promega)로 서브클론하고 서열 분석에 의해 확인한다.

(실시예 7) 인 시투(In situ) 융합

임신한 ICR 쥐를 펜토바비탈 소디움(50mg/kg)으로 복강내를 마취하고, 수태물을 포스페이트 버퍼의 식염수 (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 및 1.4 mM KH₂PO₄를 함유함)에서 4% 파라포름알데하이드로 4℃, 10분동안 심장의 생체내 환류에 의해 고정한다. 수태물을 절삭하고 3시간동안 동일한 고정액에 담그어둔다. 조직을 알코올의 농도구배에 따라 수화시킨 후, 파라플라스트(Paraplast)에 끼운다. 조직 단편을 6㎛로 자르고 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 고정한다. Psx cDNA의 438bp N-터미날 절편을 pGEM-T 벡터로 클로닝한다. Psx 유전자에 특이적인 센스 및 안티센스 프로브들을 cDNA 클론의 나열 후 T7 및 SP6 RNA 폴리머레이즈와 디그옥시제닌-11-UTP (digoxigenin-11-UTP ; Boehringer Mannheirn)를 이용하여 합성한다. 조직화학적 인 시투 융합을 위한 과정을 이미 개시한 바와 같이 수행한다(Ahn et al. 1996). 간결히 설명하면, 단편을 재수화시키고, 프로테이네이즈 K를 처리하고, 다시 고정, 아세틸화, 수화 및 건조시킨다. 그 후, 융합 전 수용액 [50% 이온이 소실된 포름아마이드, 50 mM Tris (하이드록시메틸) 아미노메탄 (Tris) 하이드로클로라이드 (pH 7.6), 25 mM EDTA (pH 8.0), 20 mM NaCl, 0.25 mg/ml 효모 tRNA 및 2.5X Denhardt's solution (100X=0.05% Ficoll, 0.05% 폴리비닐피롤리돈 및 0.05% 소 혈청 알부민)]을 절편에 사용하고, 이를 5℃에서 4시간동안 습기찬 챔버에 둔다. 슬라이드를 말리고, 디그옥시제닌-11-UTP (digoxigenin-11-UTP)가 라벨링된 센스 또는 안티센스 cDNA 프로브를 함유하는 융합 버퍼 [50% 이온이 소실된 포름아마이드, 20mM Tris.HCl (pH 7.6), 1mM EDTA (pH 8.0), 0.3 M NaCl, 0.5mg/ml 효모 tRNA, 1X Denhardt's solution 및 10% 덱스트란 설페이트]에 사용한다. 단편을 파라필름(Parafilm)으로 덮고 50℃에서 습기찬 챔버에 하룻밤 둔다. 융합 후, 슬라이드를 실온에서 30분 동안 2X SSC (1X SSC 는 0.15 M NaCl 과 0.015 M 소디움 사이트레이트이고, pH 7.0)에서 세척하고, 37℃에서 30분동안 RNase A (50ug/ml)를 처리한다. 단편을 최종적으로 50℃에서 0.1X SSC에 세척한다. 융합 시그날을 비색반응에서 안티-디그옥시제닌-알칼라인 포스페이트 콘쥬게이트로 검색한다.

(실시예 8) 게놈 DNA와 서던 블럿 분석의 제조

게놈 DNA를 조작된 Blin 과 Stafford 방법 (Sambrook et al. 1989)에 의해 쥐 태반 조직으로부터 준비한다. 10㎍의 게놈 DNA를 XbaI 또는 KpnI로 절단하고 1% 아가로오즈 겔에서 전기영동한다. DNA를 조작자의 지시에 따라 Hybond-N 막 (Amersham)에서 블러팅한다. 융합은 60℃에서 QuikHyb 수용액 (Stratagene)에서 수행한다. 하룻밤 융합하고 난 후, DNA 필터를 cDNA 라이브러리 스크리닝에서 개시된 바와 같이 세척한다. 서던 블럿에서 프로브의 효율을 증가시키기 위해 프로브 DNA를 주형으로 쥐 게놈 DNA를 이용한 PCR에 의해 제조한다. 이 게놈 DNA 절편은 호메오도메인 영역을 함유하지 않으며 Psx-특이적 프라이머를 이용하여 증폭한다. PCR 생성물의 PCR 증폭과 서브클로닝은 노던 블럿 분석에서 개시한 바와 같이 행한다.

(실시예 9) 플루오레슨스 인 시투 하이브리디제이션 (Fluorescence in Situ Hybridization ; FISH) 염색지도

임파구를 수컷 쥐의 비장으로부터 분리하고, 15% 소 태아 혈청, 3㎍/ml 콘카나발린 A (concanavalin A), 10㎍/ml 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 및 5×10^-5M 머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640에서 37℃로 배양한다. 44시간 후, 배양된 임파구를 추가로 14시간동안 0.18 mg/ml BrdU를 처리한다. 동시의 세포들을 세척하고 2.5㎍/ml의 티미다임(thymidime)으로 MEM에서 37℃, 4시간동안 재배양한다. 염색체 슬라이드를 인간 염색체 제조에서 사용했던 종래의 방법(하이포토닉 처리, 고정 및 건조)에 의해 제조한다. 3.4kb Psx 게놈 프로브를 BRL BioNick 라벨링 키트를 이용하여 15℃에서 1시간동안 dATP로 바이오티닐레이트(biotinylate)한다. FISH 검색과정은 Heng 과 Tsui 방법 (1993)에 따라 수행한다. 간단히, 슬라이드를 55℃에서 1시간동안 굽는다. RNase A를 처리한 후, 슬라이드를 에탄올로 탈수하여 70% 포름아마이드, 2X SSC에서 70℃ 2분동안 변성시킨다. 바이오티닐화된 프로브를 50% 포름아마이드, 10% 덱스트란 설페이트 및 쥐 cot I DNA로 구성된 융합 수용액에서 75℃, 5분동안 변성시키고, 37℃에서 15분 동안 전 융합시킨다. 그 프로브를 변성된 슬라이드에 올려 놓는다. 하룻밤 융합시킨 후, 슬라이드를 공지된 방법(Heng et al. 1992)을 사용하여 증폭한 바와 같이 세척하고 검색한다. FISH 시그날과 염색체 밴드를 지닌 FISH 염색 지도 데이터는 DAPI 염색체 밴드를 지닌 FISH 시그날과 포개어 확인한다(Heng and Tsui 1993).

(실시예 10) Psx 단백질의 발생과 분리

Psx 단백질의 아미노산 1-247, 아미노산 1-149 (N-터미날) 및 아미노산 150-247 (C-터미날)을 암호화하는 DNA 절편을 클로닝하여 발생된 세 가지 다른 박테리아 발현 플라스미드를 인-프레임(in-frame) 글루타티오닉-S-트랜스퍼레이즈(glutathionic-S-transferase) 코딩 서열 E.coli BL21 배양물을 함유하는 발현벡터 pGEX-4T1으로 형질전환시켜 생장시킨다. 융합 단백질을 글루타티온-흡착 크로마토그래피로 분리한다. 몇몇 실험에서 Psx 단백질은 트롬빈(thrombin)을 처리하여 글루타티오닉-S-트랜스퍼레이즈를 절단한다 (16장, "Protein Expression" Ausubel 등의., Current Protocol In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1997).

(결론)

Psx를 위한 cDNA 클론의 분리

배 발생에서 일어나는 추가적인 호메오박스 유전자를 분리하기 위해 쥐 수태물 cDNA 라이브러리를 PCR로 스크리닝하였다. 0.7kb PCR 생성물을 PCR에 바탕을 둔 스크리닝에 의해 수득한다. 뉴클레오타이드 서열 분석에서 0.7kb의 클론은 신규한 호메오박스 서열을 함유함을 볼 수 있었다. 그 후 이 클론들은 전체 길이의 cDNA를 수득하기 위해 쥐 수태물 cDNA 라이브러리 스크리닝에 이용된다. 4개의 독립된 클론을 수득한다. 서열분석으로 모든 클론들은 다른 5개의 연장되 부분을 지니고 동일 선상에 존재함이 드러났다. 가장 큰 cDNA 클론은 28,132 Da의 분자량의 247 아미노산 폴리펩타이드(서열 2)을 암호화하기로 예정되어 있는 메이저 오픈 리딩 프레임(major open reading frame)을 지닌 877bp 삽입체를 지닌다. 오픈 리딩 프레임은 이어서 폴리-A 테일에서 종결하는 72bp의 비번역 영역이 존재한다. 추정되는 폴리아데닐레이션 시그날 서열 (AATAAA)은 폴리아데닐레이션 부위에서 상부 17bp 위치에 존재한다. 추론된 단백질의 아미노산 서열은 그 cDNA의 사이즈가 노던 블럿에서 계산된 mRNA의 것과 비슷하기 때문에 전체 길이를 예측할 수 있다.

서열 분석

컴퓨터-보조 연구의 NCBI 데이터베이스는 호메오도메인(아미노산 150-209)(서열 1)을 함유하는 Psx의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. Psx 호메오도메인은 다른 호메오도메인 서열과 비교하여 넓게 퍼져있다. 그러나, 가장 잘 맞는 Psx 호메오도메인은 Mhox (50%), S8 (48%), Smox-3 (48%), GSC (47%), Phox2 (45%), Shox (45%), Rx (43%) 및 Solurshin (40%)(도 1B)와 같이 쌍을 이룬형태의 호메오도메인 단백질이다. 한 클래스(class)에 있는 호메오박스 유전자는 보통 그 호메오도메인과 60% 이상의 교차 동일성을 갖는다 (Kappen et al. 1993; Burglin 1994). 그러므로, Psx는 새로운 클래스의 호메오박스 유전자의 원형(prototype)이 된다. Psx 호메오도메인은 모든 고등 진핵생물의 전형적인 호메오도메인에서 볼 수 있는 4개의 불변 아미노산 잔기중의 하나가 고도로 비정상적인 아미노산 치환체를 함유한다(Scott et al. 1989). 단일의 치환체는 51번 위치에서 아스파라진 대신에 메티오닌이 치환되어 있다. Pem (Rayle 1991), Cc Aβ1-1, Aβ4-1 (Kues et al. 1992) 및 Sc Aαz (Stankis et al. 1992)과 같은 몇몇 전형적인 호메오박스 유전자 단백질은 이들 호메오도메인 위치에서 이소류신, 아스파테이트 또는 알라닌 잔기를 지닌다. 당 업자의 지식으로 Psx는 이 위치에서 메티오닌을 지니는 것으로 보고된 첫 번째 포유류 호메오도메인 단백질이다. 51번 위치에 있는 아미노산은 쌍을 이룬 클래스 호메오도메인 및 다른 호메오도메인에서 직접적으로 DNA와 접하여 포함되어 있다(Kissinger et al. 1990 ; Wilson et al. 1995). 51번 위치에 있는 메티오닌은 더 많이 연구할 가치가 있다.

Psx 호메오도메인은 또한 50번 위치에서 아르기닌을 지닌다. 대부분의 호메오도메인은 이 위치에서 글루타민을 지니고, 한편 전형적인 쌍을 이룬 클래스의 호메오도메인은 보통 이 위치에서 세린 잔기를 가지며 이는 쌍을 이룬 호메오박스 유전자의 특징이다. 몇몇 쌍을 이루는 호메오박스 유전자는 50번 위치에서 라이신을 암호화한다. 오직 인간 Atbf1 (Morinaga et al. 1991) 과 Drosophila zfh-2 (Fortini et al. 1991) 의 징크-핑거 (Zinc-finger ; ZF) 클래스 호메오박스 유전자 2개만이 이 위치에서 아르기닌 잔기를 지니는 것으로 보고되어 있다. 50번 위치는 호메오도메인에 다른 중요한 DNA 결합 특성을 제공하는 것으로 보인다(Treisman et al. 1992를 리뷰해 보면 알 수 있다). Psx 호메오도메인의 고정된 위치에서 비정상적인 아미노산 잔기는 이들 아미노산이 이 도메인의 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

노던 블럿 분석

배 발생동안과 성체 조직에서 Psx의 발현 패턴은 호메오박스 영역이 없는 Psx-특이적 cDNA 프로브를 이용하여 노던 블럿 융합을 함으로써 분석한다. Psx가발현되기 시작한 개체발생 단계를 결정하기 위해 전체 RNA를 4.5일부터 18.5일을 거쳐 19.5일까지의 쥐 임신기간에서 배 및 외배 조직을 포함하는 전체 수태물로부터 준비한다. 약 0.9kb의 전사체(transcript)가 8.5일의 배아기때에 처음 검색되서 발생동안 계속 발현된다(도 3a). 약 13.5일 이후 발현의 점차적인 감소는 아마도 발생동안 배의 크기가 증가하는 것과 관련이 있는 것으로 보인다. Psx의 배 조직 분포는 13.5일 째의 배 및 외배 조직을 이용하여 조사한다. 전사체는 외배조직, 주로 태반에서 검색하고, 태아와 자궁에서는 검색되지 않고 난황낭(yolk sac)에서는 희미한 밴드가 검색되는데, 이는 Psx가 태반과 난황낭에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다 (도 3b). 13.5일째의 배 및 외배 조직을 포함하는 전체 수태물을 양성 대조구(control)로 이용한다. 시그날의 강도는 전체 수태물에서 보다 태반에서 더 강하다. 이는 발생동안 배의 크기가 커지기 때문에 시그날이 점차적으로 감소된다는 사실을 나타낸다(도 3a).

태반과 난황낭은 배를 둘러싸고 보호하며 모태와 대사물의 교환을 제공한다. 특히, 태반은 모태의 면역 시스템에 의해 태아의 침해를 막고 호르몬의 분비를 통해 모태와 태아의 생리기능을 모두 조절하게 한다(Cross et al. 1994).

본 발명자들은 임신기간의 다른 단계에서도 태반과 난황낭내에서의 Psx 발현 패턴을 조사하였다. 전사체는 전체 기간동안 양쪽 조직내에서 잔존하였다(도 4a 및 도 4b). Psx mRNA가 태반에서는 계속적이고 고도로 발현되는 반면(도 4a), 난황낭에서는 점차로 감소한다(도 4b).

Psx 전사체의 발현을 또한 배 및 성체 조직에서도 조사하였다. Psx mRNA가 17.5 일 및 18.5일째의 태아에서는 검색되지 않았고, 생후(postnatal) 0.5일째에 새로 태어난 펍(pup) 및 재발생 기관을 포함한 성체조직에서도 검색되지 않았다(도 5a 및 도 5b). 성체조직은 뇌, 하악선(submandibular gland), 심장, 폐, 흉선, 간, 비장, 위, 창자, 신장, 근육, 정소, 스크로탈 색(scrotal sac), 부고환(epididymis), 자궁 및 난소을 이용하였다. 18.5일째 태반을 양성 대조구로서 이용하였다.

이들 발현 데이터는 Psx가 외배 조직 특히 태반에서 중요한 기능을 한다는 것을 제시한다. 이 발현은 외배 조직에 고도로 제한적이기 때문에 태반형성의 연구를 위한 유용한 마아커가 될 수 있다. Psx는 다른 배 또는 성체 조직을 제외한 태반 및 난황낭과 같은 외배 조직에서 발현되는 새로운 멤버의 쥐 호메오박스 유전자이다. T-임파종 세포에서 미리 분리된 쥐 호메오박스 유전자 Pem은 태반과 난황낭에서 발현될 뿐만 아니라 성체 조직, 정소 및 부고환에서도 검색되어진다 (Wilkinson et al. 1990 ; Maiti et al. 1996). 최근에 인간 호메오박스 유전자 HB24, MSX2 및 GAX를 태반과 같은 외배 조직에서 검색하였다(Quinn et al. 1997). 그들은 원래 T-임파구, 난소의 난황낭 종양 및 배로부터 분리하였다(각각 Deguchi et al. 1991 ; Suzuki et al. 1993 ; Grigoriou et al. 1995). 쥐의 MSX2 및 GAX, Mox2의 쥐 상동물 모두는 발생하는 척수와 지절(limbs)에서 발현되고, 발생하는 체절 및 경절 유도체에서도 발현된다(Davidson et al. 1991 ; Gunther et al. 1994 ; Candia et al. 1992). 추가적으로, 신규한 멤버의 호메오박스 유전자의 디스탈리스(Distal-less) 과인 DLX4를 인간 태반 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다(Quinn et al. 1997). 그러나, 이 발현 패턴은 보고되어 있지 않다. Psx mRNA를 위해 여기에 개시한 핵심 관측은 임신 기간동안 이용된 과정에 따라 태반에서 고도로 제한적이고 강하게 발현된다는 것이다.

RNA 인 시투 융합 분석

본 발명자들은 나아가 인 시투 융합 분석에 의해 배발생동안 외배 조직내에서 Psx 발현의 위치를 조사하였다. 센스 및 안티센스 Psx 프로브를 E 7.0 및 E 13.5 사이의 자궁내에서 6㎛ 두께의 조직 단편의 배와 융합하였다(도 6). 조사한 어느 단계에서도 센스 프로브를 지닌 특별한 융합 시그날이 관찰되지 않았다(도 6). E 8.5에서 Psx 전사체는 거대세포와 코리오닉 엑토덤(chorionic ectoderm)에서 처음 검색된다(도 6b 및 도 6c). 이것은 그 시그날이 8.5일째 배아기에서 처음 검색된 노던 블럿 야기물과 일관된다(도 3a). E 9.5 및 E 13.5에서 Psx 전사체를 거대세포와 래비린틴 트로포블라스트 층에 제한하였다(도 6d∼도 6g). 이들 데이터는 코리오닉 엑토덤이 래비린틴 트로포블라스트 층의 전구물질이라는 사실을 분명히 나타낸다. 트로포블라스트 세포 층에서 Psx의 제한적이고도 구조적인 발현은 Psx가 트로포블라스트 세포의 최종 분화에서 결정적 기능을 한다는 것을 제시하고, 그러한 발현의 결핍은 트로포블라스트 세포를 완전한 태반형성화를 수행하지 못하게 되어 예를 들면, 배형성동안 배의 발생을 위한 완전한 기능을 수행할 수 없게되어 결국 유산 또는 배의 사망을 야기하게 된다. 추가적으로, Psx는 트로포블라스트-특이적 계통의 연구를 위한 새로운 분자 마아커로 유용할 것이다. 인 시투 분석은 노던 블럿에 의한 난황낭에서의 Psx mRNA 검색이 거대 세포를 지닌 난황낭 샘플의 불완전한 절개와 오염으로부터 야기된다는 것을 나타낸다.

서던 블럿 분석

게놈 서던 블럿은 교차 융합을 피하기 위해 호메오도메인 영역을 함유하지 않는 프로브 DNA를 이용하고, Psx 는 쥐 게놈에서 단일 카피임이 나타낸다(도 7). 프로브 DNA 내 KpnI 위치의 존재가 KpnI로 분해된 DNA에서 유사한 크기의 두 밴드를 야기시키고, 이는 한 개의 인트론(intron)을 함유한다. 인트론 내에서 KpnI 위치의 존재는 서열 및 제한 효소 분석에 의해 결정된다.

염색체 할당

사용된 조건 하에서, 융합 효율은 프로브에 66%이다(100이 유사분열의 개수이면, 그 중 66이 한 염색체에서 시그날을 나타낸다). DAPI 밴딩이 특이적 염색체를 확인하기 위해 이용되기 때문에 프로브 및 쥐 염색체 X 로부터 시그날간의 할당을 얻게 되었다(도 8a). 상세한 위치는 10개 사진의 요약을 바탕으로 A 영역을 더욱 상세히 결정하였다(도 8b). 사용된 조건하에서 다른 양성 위치를 검색할 수 없으므로 이 유전자를 염색체 X에 지도화하였다.

본 발명의 효과는 최근에 밝혀진 신규한 호메오박스-함유 유전자인 Psx를 쥐 수태물로부터 분리하였다. 대부분의 호메오박스 유전자는 배 발생동안 바디 플랜(body plan)과 같은 세포 운명을 조절하는 기능을 포함한다. 그러므로, 바디 플랜의 중요한 변화 및 종양 또는 악성 형질전환에서 발견되는 어떤 종류의 돌연변이가 변형된 호메오박스 유전자의 발현에 의해 유도될 수 있다. 호메오박스 유전자들은 호메오박스로 알려진 고정된 180 bp 뉴클레오타이드 서열에 의해 특정화되는데, 세 개의 α-나선 구조로 된 60개의 아미노산으로 구성된 DNA 결합 호메오도메인을 암호화한다. 이러한 DNA 결합 특성은 표적 유전자 이하를 조절하는 전사 인자로서의 호메오도메인 단백질 기능을 나타낸다. 동물에서는, 대부분의 이들 유전자가 발생, 분화 및 악성 형질전환을 포함하는 복합 유전자의 조화된 발현을 조절하는 것이다.

Claims (7)

1. Psx 단백질을 암호화시키는 분리된 핵산 분자
2. 제 1항에 있어서, 핵산 분자가 메신저 RNA 분자임을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자
3. 제 1항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자임을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자
4. 제 3항의 DNA 분자는 하기 서열을 지니는 cDNA 분자임을 특징으로 하는 Psx 단백질을 암호화하는 cDNA

   (서열)
5. 제 4항에 있어서, 검색할 수 있는 마아커가 라벨링되어 있음을 특징으로 하는 Psx 단백질을 암호화하는 cDNA
6. 제 4항의 cDNA 서열을 이용하여 임신성 트로포블라스트 질병과 같은 트로포블라스트-특이적 Psx-매개 질병을 진단하는 방법
7. 제 6항에 있어서, 진단 방법은 Psx에 상응하는 DNA 조절 영역을 분리하고 ; Psx DNA에 시술적으로 연결된 셀 라인(cell line)에서 기능화할 수 있는 구조적 프로모터를 함유하는 첫 번째 키메릭 DNA 구조물과 리포터 유전자(reporter gene)에 시술적으로 연결된 DNA 조절 영역을 함유하는 두 번째 키메릭 DNA 구조물을 지닌 헤테로로거스(heterologous) 셀 라인을 안정하게 형질전환시켜서 ; 최종적으로 화합물의 Psx 억제 활성도를 측정하기 위해 형질전환된 셀 라인이 에세이될 수 있도록 그 화합물을 함유하는 배지에서 형질전환된 셀 라인을 배양하는 방법을 포함함을 특징으로 하는 진단방법