KR20000019867A

KR20000019867A - 골쇄보 추출물을 포함하는 경조직 재생촉진제 조성물

Info

Publication number: KR20000019867A
Application number: KR1019980038181A
Authority: KR
Inventors: 김성진; 박준봉; 박건구; 권영혁; 정세영
Original assignee: 정세영; 박건구; 김성진; 권영혁; 박준봉
Priority date: 1998-09-16
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2000-04-15

Abstract

본 발명은 골쇄보 추출물을 포함하는 경조직 재생촉진제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 치료제는, 조골세포 및 치주인대세포의 증식을 촉진시키고 상기 세포들의 알칼리 포스파타제 활성을 증가시킴으로써 경조직 재생 및 증식 촉진효과를 나타낼 뿐만 아니라 경조직으로서 기능을 다 할 수 있는 형태의 즉 충분한 경도를 갖는 경조직을 형성시킬 수 있는 골쇄보 추출물을 포함한다.

따라서 본 발명의 치료제는 생약의 하나인 골쇄보로부터 얻은 추출물을 포함하는 천연유래 약물로서, 부작용을 보이지 않으면서 탁월한 경조직 재생 및 증식 효과를 갖고 있기 때문에 골조송증, 치주질환 등과 같이 경조직 재생 및 증식과 관련된 질환의 예방 및 치료를 목적으로 기존의 치료제에 대체하여 안심하고 사용할 수 있는 경조직 재생촉진제 조성물을 제공한다.

Description

골쇄보 추출물을 포함하는 경조직 재생촉진제 조성물

본 발명은 골쇄보 추출물을 포함하는 경조직 재생 촉진제에 관한 것이다.

인체에 존재하는 경조직은 크게 뼈와 치아로 분류된다. 이와 같은 경조직에 문제가 생겨 발생하는 대표적인 질환으로는 골조송증과 치주질환이 있다.

골조송증(osteoporosis)은 일명 골다공증으로 알려져 있는 질환으로서 총골량이 감소하고 뼈에 구멍이 생겨서 약한 충격에 의해서도 뼈가 쉽게 부서지거나 휘어져버리는 증상을 보인다. 골조송증은 노인층에서 흔히 발견되며 대퇴골 골절, 척추골절 등의 골절원인이 되고 있다. 미국의 경우 1985년도의 골조송증에 의한 골절이 130만 건이 발생하였고, 이에 70억 달러의 의료비가 지출되었다. 이 질환은 폐경기, 노화, 갑상선이나 부갑상선의 기능항진, 만성신부전 및 부신피질 호르몬의 투여에 의하여 발생된다. 가장 흔한 것은 여성의 폐경기 이후 에스트로겐 (estrogen)의 감소에 의한 것이다.

골조직은 2/3가 무기물이고, 1/3이 유기물질로 구성되어 있고, 전자는 주로 인산칼슘 (Calcium Phosphate)이고, 후자는 주로 콜라겐 (collagen)이 주성분이다. 골조직에는 조골세포 (Osteoblast), 파골세포 (Osteoclast), 골세포 (Osteocytes)등이 골형성 및 재흡수(resorption)에 관여하고 있다. 이중 골을 재생하는데 결정적인 역할을 하는 것이 조골세포이다. 조골세포는 생성되는 골의 표면에 위치하며, 골 형성에 필요한 콜라겐 섬유(collagen fiber) 등을 합성 분비한다. 또한 조골세포의 세포막에는 중성 및 알칼리성 포스파타제(phosphatase)가 많이 분포하고 있으며, 이들에 의하여 PO₄ ^-3/Ca⁺²가 침착되어 뼈의 석회화(calcification)가 이루어진다. 즉 뼈의 재생이 진행되는 것이다. 이러한 사실은 조골세포의 수가 많으면 뼈의 재생이 빨리 진행되므로 골조송증이 유발되지 않으며 조골세포의 수를 증가시킴으로써 골조송증을 치료할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 실험예에서 사용된 백서의 두개관 세포(Rat Calvarial Cell)는 쥐의 두개골에서 분리한 조골세포로서 뼈의 생성작용 연구에 일반적으로 사용되는 세포이다.

실제로 골형성을 촉진시키는 많은 물질들의 작용기전이 조골세포의 증식을 유도하는 것임이 알려져 있다. 예를 들면 성장호르몬 (GH, 즉 growth hormon), 유사 인슐린 성장인자 I (IGF-I, 즉 insulin like growth factor I), 변형 성장인자 베타 (TGF-beta, 즉 transforming growth factor beta) 등은 조골세포의 증식을 촉진시켜 뼈의 성장을 촉진하는 성장인자이다. 골조송증에 치료효과가 있는 에스트로겐도 조골세포의 증식을 촉진한다고 알려져 있다.

한편 알코올 중독증 환자의 경우 뼈가 쉽게 부서지는 것은 알코올이 조골세포의 증식을 억제하기 때문이며, 노인에 있어서 뼈에 관련된 질환도 적어도 부분적으로는 조골세포의 증식이 감소됨으로써 발생된다. 글루코코르티코이드 호르몬(glucocorticoid hormone)은 천식 치료시 투여하는 물질인데 이것도 조골세포의 증식을 억제하여 골조송증을 유발한다.

현재 골조송증 치료를 위해 임상에서 사용되고 있는 약물로는 에스트로겐, 이프리플라본(Ipriflavone, 즉 7-isopropoxy isoflavone), 비스포스포네이트 (Bisphosphonate), 비타민 K₂, 칼슘 제제, 비타민 D, 칼시토닌 등이 있다. 에스트로젠, 비스포스포네이트, 칼시토닌 및 비타민 K₂등은 골의 분해를 억제하며, 칼슘제제와 비타민D는 혈 중 칼슘농도를 증가시킴으로서 골조송증 치료 효과를 나타낸다. 가장 최근에 천연물에서 분리하여 개발된 이프리플라본은 콩의 주성분인 isoflavone의 합성유도체로서 골아세포의 증식과 분화를 촉진하며, 콜라겐합성과 석회화 결절의 생성을 증가시킨다.

이들 약물은 여러 가지 부작용을 나타내는데, 먼저 에스트로겐 제제는 발진, 자궁 부정기 출혈, 하복부통, 황달, 오심, 구토, 전신 권태감, 체중증가 등이 나타나며, 난소종대 환자 등에 대하여는 금기이다. 비스포스포네이트 (예를들어 상품명Palmidronate)는 가장 흔히 발생하는 부작용으로 발열이 있으며, 파젯씨병 환자에게서 권태감, 투여부위의 혈전성 정맥염, 저인산혈증 등을 유발시킨다. 또한 투여 초기에는 골통증이 나타나며, 경구 투여시는 용량의존적 오심, 복통 등이 발생한다. 그외에도 일시적인 백혈구 감소증이 일어난다. 칼시토닌 (Elcatonin 및 Salcatonin 포함)은 일반적으로 쇼크 등을 일으킬 수 있으므로 투여 전에 충분히 문진해야 하며 사전에 피내 반응을 실시하는 것이 바람직하다. 또한 과민반응이 나타날 수 있으며 안면홍조, 열감, 흉부 압박감, 오심, 구토, 식욕부진, 설사, 구갈, 현기증, 저나트륨혈증, 소양감, 천식발작, 빈뇨, 부종 등도 발현한다. 비타민 K₂의 부작용으로는 복부 불쾌감이 있다. 이프리플라본은 부작용으로 복부 불쾌감이 가장 빈번히 발생하며, 식욕부진, 오심, 구토, 설사, 발진, 소양 등이 발생한다.

따라서 이와 같은 기존 약물의 단점을 보완하기 위하여 상대적으로 부작용의 발현이 적다고 생각되는 천연물 유래 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.

치주질환은 세균에 의한 염증발생으로 치은조직과 치조골의 소실이 초래되어 결과적으로 치아가 발거되는 질환이며 진행정도에 따라 단계적인 치료법이 이용된다. 시술원리는 원인제거, 질환에 이환된 연·경조직삭제 및 조직 재생을 도모하는 방법이 적용된다. 치주조직의 이상적 치유는 치아와 치조골을 연결하는 치주인대 재형성이 필요하며 외과적인 시술이 요구된다. 이러한 치유과정에서 가장 중요한 사항은 치주인대세포의 치면에의 우선부착과 함께 연이어 조골세포의 증식이다. 치주인대세포는 조골세포와 유사한 생화학적 특성을 가지며, 조골세포와 치근을 덮는 골조직인 시멘트질 (cemetum)로 분화가 되는 다기능성 세포이다. 즉 치주인대세포는 분화되어 경조직을 형성하게 된다. 따라서 세포가 치주인대를 재형성하는데 영향을 미칠 수 있는 미세환경의 개선을 위한 외과적 시술도 중요하지만 치주인대세포 및 조골세포의 증식능 및 활성을 증가시킬 수 있는 방법의 개발은 무엇보다도 중요하다. 최근 이러한 관점에서 새로운 약물의 개발이 활발히 시도되고 있다.

먼저, 수종의 폴리펩타이드 성장인자 (polypeptide growth factor)가 인 비트로 (in vitro) 상에서 그 효과가 입증되고 있으나 아직 안정성에 문제가 해결되지 않아 임상적용에는 문제점이 있다. 또한 그 추출과정이 복잡하고 장시간이 소요되며 고가이어서 임상적용이 불가능한 상태이다. 현재까지 국내외에서 치주치료제로서 개발된 천연물 유래 약물로는 옥수수(Zea Mays L.) 추출물이 유일하며 상품명 인사돌 등으로 시판되고 있다. 기전은 밝혀져 있지 않고 단지 임상적인 자료에 의거하여 적용되고 있다. 일본에서는 금은화(金銀花)와 연교(蓮翹)의 추출물을 국소약물송달법으로 치주질환 처치에 사용된 바 있으며 인 비트로 상에서 치은섬유아세포에 대한 효과를 보고한 바 있다. 또한 골무꽃 뿌리 (Scutelariae Radix)는 소염작용 및 해열작용이 있는 것으로 보고되었고 퀘르시트린 (Quercitrin)의 항염증 작용이 보고되기도 하여 천연물의 약리작용 규명이 계속되고 있다.

최근 골무꽃 뿌리 (Scutelariae Radix), 센텔라 아시아티카 (Centella asiatica) 등이 상피증식과 치주인대세포의 활성을 증가시킨다는 보고가 있었고, 홍삼 사포닌이 배양치주인대세포의 성장과 분화에 관한 연구에서 세포증식과 석회화 결절형성을 증가시키며 알카리성 포스파타제 (alkaline phosphatase)의 활성도도 증가시킨다는 보고가 있었으며, 대조 (Zizyphus Fructus)는 치은섬유아세포와 치주인대세포에 대해 유의할만한 화학주성효과가 있는 것이 밝혀져 있다. 또한 마그놀롤 (Magnolol)과 히노키올 (Hinokiol)이 염증매개물질인 사이토카인 (Cytokine) 생성억제효과가 있는 것으로 밝혀지기도 했다.

그러나 현재 치주질환에 탁월한 효과를 나타내는 약물로서 개발된 것은 없으며 더욱이 최근에 이르러 국내외적으로 인체에 위해함이 없이 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약물 개발에 관심이 증가되고 있는 실정이다. 치주질환 치료를 목적으로 지금까지 연구되어온 것들은 염증치유 및 염증반응 억제, 치주인대세포증식, 또는 치은세포증식 효과를 나타내는 물질들에 한정되어 있으며 조골세포의 증식능 및 활성을 증가시킴으로써 치주질환을 치료하고자 하는 시도는 없었다.

본 발명자들은 조골세포 증식 및 분화효과를 나타내어 골조송증 및 치주질환과 같은 경조직 관련 질환에 부작용 없이 적용할 수 있는 약물을 개발하고자 여러가지 천연물 추출물 중에서 조골세포 증식 및 분화효과를 나타내는 물질에 관하여 많은 연구와 노력을 한 결과, 골쇄보로부터 얻은 추출물이 조골세포 증식과 분화효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

골쇄보 (Drynaria fortunei J. Sm.)는 중국 남부의 나무나 돌위에서 자라며 뿌리줄기에 헤스페리딘 (Hesperidine), 25~35%의 농마가 있다. 민간에서는 진통 및 항염증 약으로 타박상, 골절, 요통, 치통 등에 복용한다. (육창수 외 12인, 현대 생약학, 서울, 학창사, 24~128, 1993).

본 발명의 목적은 골쇄보 추출물을 포함하는 경조직 재생촉진제 조성물을 제공하는 것으로서 골조송증, 치주질환 등과 같은 경조직 재생 및 증식과 관련된 질환을 치료하는데 사용함을 목적으로 한다.

본 발명의 골쇄보추출물은 다음과 같은 생약추출 방법에 따라 추출될 수 있다:

골쇄보를 추출용매에 넣고 50~120℃에서 5~24시간 동안 가온한다. 이 추출액을 40~60℃로 냉각시키고 여과하여 상등액을 취한다. 이와 같은 추출 및 여과조작을 1회 이상 반복하여 상등액을 합하고 용매를 증발시켜 농축한다. 바람직하게는 가온을 수욕조에서 80~100℃로 온탕하는 방법을 이용한다.

또는 골쇄보를 추출용매에 넣고 상온 또는 4℃ 에서 5~7일간 냉침하고 여과하여 상등액을 취한다. 이와 같은 추출 및 여과조작을 1회 이상 반복하여 상등액을 합하고 용매를 증발시켜 농축한다.

위와 같은 두가지 추출방법에서 바람직하게는 골쇄보를 작은 크기로 분쇄하여 사용할 수 있으며 추출용매의 바람직한 예로서는 50~100%의 메탄올 수용액이 있다. 추출 및 여과조작은 3회 반복하는 것이 바람직하며, 농축액은 건조하여 분말상태로 얻을 수도 있다.

본 발명에 따르는 경조직 재생촉진제 조성물은 조골세포 및 치주인대세포의 증식을 촉진시키고 상기 세포들의 알칼리 포스파타제 활성을 증가시킴으로써 경조직 재생 및 증식 촉진효과를 나타낼 뿐만 아니라 경조직으로서 기능을 다 할 수 있는 형태의 즉 충분한 경도를 갖는 경조직을 형성시킬 수 있는 골쇄보 추출물을 포함하며, 따라서 경조직 재생 또는 경조직 증식의 감소 현상과 관련이 있는 여러가지 질환에 대한 직접 또는 보조 치료제로서 사용할 수 있다. 적용할 수 있는 질환으로는 골조송증, 치주질환 등이 있다. 또한 본 발명의 치료제를 치약첨가제 또는 가글링용액에 첨가함으로써 치주질환 예방 목적으로 사용할 수 있으며 부란성 알껍질의 강화 목적으로 사용할 수도 있다.

본 발명에 따르는 경조직 재생촉진제 조성물은 상기의 골쇄보 추출물만으로 구성될 수 있으며 또한 기타의 약효성분 및 약제학적 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 예를 들어 본 발명의 치료제를 치주질환에 사용할 경우 항염증 효과를 갖는 약물을 함께 포함시켜 투여하면 보다 탁월한 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따르는 경조직 재생촉진제 조성물은 임상적으로 투여시에 약제학적으로 허용되는 불활성담체와 골쇄보 추출물을 배합하여 경구 또는 비경구 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태의 약제학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적으로 적합하게 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 불활성 담체는 고체이거나 액체일 수 있으며 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 붕해제로 작용할 수 있는 물질 중의 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.

경조직 재생 또는 증식 관련 질환 치료 목적으로 사용됨에 있어서 본 발명의 골쇄보 추출물을 포함하는 경조직 재생촉진제 조성물은 초기에는 하루에 골쇄보 추출물을 체중 kg당 건조분말로서 0.01~0.10 g의 투여량이 바람직하다. 그러나 투여량은 환자의 필요정도, 치료되어야할 상태의 정도, 그리고 사용될 화합물에 따라 변할 수 있다.

이하 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 설명하나 이들 실시예에만 한정하는 것은 아니다. 단, 본 명세서 및 실시예에 기재된 %는 용량%를 의미한다.

실시예 1

골쇄보 100 g을 80% 메탄올 (메탄올:물=4:1) 500ml에 넣고 환류 냉각기를 장치한 후 95~100℃ 수욕조에서 12시간 동안 온탕하였다. 이 추출액을 약 50℃정도로 냉각시키고 여러 겹의 거즈로 여과하여 상등액을 취하였다. 이와 같은 추출 및 여과 조작을 3번 반복하여 상등액을 합하고 회전증발장치(rotary evaportor)를 이용하여 감압 하에서 메탄올을 완전히 증발시켜 농축하였다. 이를 소량의 증류수에 용해하였다.

실시예 2

실시예 1에서 최종적으로 얻은 골쇄보 추출물 용액을 -80℃에서 얼린 후 동결건조하여 분말로 얻었다.

실시예 3

골쇄보 100 g을 작은 크기로 분쇄하여 80% 메탄올 (메탄올:물=4:1) 500ml에 넣고 4℃에서 7일간 냉침한 후 여러 겹의 거즈로 여과하여 상등액을 취하였다. 이와 같은 추출 및 여과 조작을 3번 반복하여 상등액을 합하고 회전증발장치(rotary evaportor)를 이용하여 감압 하에서 메탄올을 완전히 증발시켜 농축하였다. 이를 소량의 증류수에 용해하였다.

실시예 4

실시예 3에서 최종적으로 얻은 골쇄보 추출물 용액을 -80℃에서 얼린 후 동결건조하여 분말로 얻었다.

제제의 제조예 1 : 정제

실시예 2의 골쇄보 추출물 5.0 ㎎

락토오스 BP 150.0 ㎎

전분 BP 30.0 ㎎

전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0 ㎎

스테아르산 마그네슘 1.0 ㎎

실시예 2의 골쇄보 추출물을 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후, 적합한 용적의 정제수를 첨가하고 분말로 과립화시켰다. 과립을 건조시킨 후 스테아르산마그네슘과 혼합하고 압착하여 정제를 얻었다.

제제의 제조예 2 : 캡슐제

실시예 2의 골쇄보 추출물 5.0 ㎎

전분 1500 100.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 1.0 ㎎

실시예 2의 골쇄보 추출물을 체질하고 부형제와 혼합한 후, 젤라틴 캡슐중에 충전하여 캡슐을 수득하였다.

제제의 제조예 3 : 시럽제

실시예 2의 골쇄보 추출물 5.0 g

백당 637.5 g

카르복시메칠셀룰로오스나트륨 2.0 g

메칠파라벤 0.28 g

프로필파라벤 0.12 g

에탄올 20 ㎖

먼저 정제수 500 ㎖에 백당을 용해시켰다. 카르복시메칠셀룰로오스나트륨는 따로 정제수 400 ㎖에 용해시키고 상기 용액과 혼합하였다. 여기에 메칠파라벤과 프로필파라벤을 가하여 용해시킨 후 에탄올을 가하고 정제수를 더 가하여 1000 ㎖로 하였다. 여기에 체질한 실시예 2의 골쇄보 추출물을 현탁시켜, 시럽제를 얻었다.

제제의 제조예 4 : 파스타제 (치약)

실시예 2의 골쇄보 추출물 50.0 g

옥수수 전분 50.0 g

백색 바셀린 100.0 g

먼저 실시예 2의 골쇄보 추출물과 옥수수 전분을 체질하고 백색 바셀린에 가하여 전질을 균등해질 때까지 연화하여 파스타제를 얻었다.

제제의 제조예 5 : 가글링 용액

실시예 1의 골쇄보 추출물 10.0 g (건조분말의 중량으로서)

박하수 50.0 ㎖

정제수 가함 전량 1000.0 ㎖

먼저 실시예 1의 골쇄보 추출물을 정제수에 용해하고, 이것에 박하수 및 정제수를 가해서 전량으로 한 후 여과하여 가글링 용액을 얻었다.

실험예 1: 백서 두개관 세포의 증식 촉진효과

실시예 1에서 얻은 골쇄보 추출물이 조골세포의 증식속도에 미치는 영향을 확인하기 위하여 백서의 두개관 세포(rat calvaria cell)를 이용하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

먼저 다음의 방법으로 백서의 두개관 세포를 배양하였다. 무게 100 g 전후의 백서에 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium) (Tokyo Industrial Chem., Japan)을 복강내 주사하여 마취시킨 후 70 % 알콜용액으로 두피를 세척하여 소독하고 두경부를 탈락시켜 희생시켰다. 외과용 가위로 하악을 상악골에서 분리하고 두피를 박리하였다. 노출된 두개관을 분리하고 연조직을 완전히 제거한 후 세절하여 200 U/㎖의 페니실린(penicillin)(Gibco, USA)과 200 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)(Gibco, USA)이 첨가된 둘베코의 미니멈 엣센셜 배양액 (Dullbeco's Minimum Essential Medium, 즉 DMEM)(Gibco, USA)에 5회 세척하였다. 이것을 다시 세절한 다음 35 ㎜ 세포 배양접시에 고르게 분산시켰다. 여기에 초기배양액인 20%의 우태아 혈청 (Fetal Bovine Serum, 즉 FBS), 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM을 넣고 37℃ 및 습도 100%의 5% CO₂공기혼합배양기 (Vision, Korea)에서 배양하였다. 2세대가 경과된 후 계대배양액인 10% FBS, 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM으로 3일 간격으로 배양액을 교환하면서 밀생될 때까지 배양하였다.

상기의 배양액 0.5 ㎖(백서 두개관 세포 1×10⁴개를 함유)를 24 웰(well) 배양접시(Corning Co., USA)에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 세포가 배양접시 바닥에 완전히 부착된 상태를 확인한 후 상층액을 제거하였다. 세포 배양접시를 대조군과 실험군으로 나누어 대조군에는 약물을 주입하지 않고 실험군에는 골쇄보 추출물을, 골쇄보로서 1 ㎍/㎖의 최종 농도가 되도록 각각의 배양접시에 주입하였다. 대조군과 실험군은 계대배양액을 사용하여 배양하였다. 배양 2일째와 14일째에 각각의 배양접시에서 배양액을 버리고 인산완충된-생리식염수(PBS, 즉 phosphate buferred saline)로 세척하고 0.05% 트립신(trypsin)/0.02% 이디티에이(EDTA)(Gibco, USA)로 처리한 후 세포를 배양접시로부터 완전히 분리 수거하여 트리판 블루(trypan blue)로 염색하고 도립현미경 (Olympus Co. Japan) 상에서 혈구세포측정기를 이용하여 세포수를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 1과 같았다.

골쇄보 추출물의 백서 두개관 세포 증식에 대한 영향.

	세포수 (×10,000 세포/㎖)
	세포배양 2일째	세포배양 9일째
대조군	3.6±0.212	17.2±0.448
골쇄보 추출물^*	4.2±0.141	20.5±1.425

^*배지 중 골쇄보 추출물의 농도는 1 ㎍/㎖이다.

약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 실험결과를 분석하여 본 바 실시예 1에서 얻은 골쇄보 추출물은 단기(세포배양 2일) 및 장기(세포배양 9일) 투여 두 경우 모두에 있어서 백서 두개관 세포의 증식을 증가시킴을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명에 따르는 골쇄보추출물을 포함하는 치료제가 탁월한 조골세포 증식효과를 갖음을 알 수 있다.

실험예 2: 백서 두개관 세포를 이용한 알칼리성 포스파타제 활성 증가효과 실험

골쇄보 추출물이 백서의 두개관 세포가 갖고 있는 알칼리성 포스파타제의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

실시예 1에서와 동일한 방법으로 백서의 두개관으로부터 세포를 채취하고 배양하였다. 초기 밀생상태의 백서 두개관 세포에 트립신(trypsin)처리하여 그 수를 측정한 후 24 웰 조직배양 접시(well tissue culture plates)(Corning, USA)에 각 웰당 1×10⁵개의 세포를 접종하고 대조군에는 계대배양액으로 하여 배양하였으며, 실험군에는 골쇄보 추출물을, 골쇄보로서 1 ㎍/㎖의 최종 농도가 되도록 배지에 주입하고 배양 2일째와 14일째에 배양액을 버리고 인산완충된-생리식염수로 3회 세척한 다음 세포층에 라이시스(lysis) 완충액 (0.02% Nonident P-40)을 1 ㎖ 첨가하여 30초간 초음파 분쇄기 (Ultrasonic Dismembrator Model-300, Fisher사, 미국)로 분쇄한 다음 300 ㎕를 취하여 알칼리성 포스파타제의 활성을 측정하였다.

알칼리성 포스파타제 활성의 측정은 베쎄이(Bessay) 등의 방법과 버쉬(Burch) 등의 방법을 참고로 하여 다음과 같이 실시하였다. 표준용액으로는 파라니트로페놀(paranitrophenol)을 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤 1N NaOH를 넣어 반응을 중단시켰다. 이것을 410 ㎚에서 분광광도계(Shimatsu사, 일본)로 흡광도를 측정하고 그 단위를 nmol/30min/㎎ protein, 즉 IU로 하여 알칼리성 포스파타제의 활성치를 나타내었다.

골쇄보 추출물의 백서 두개관 세포의 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 영향.

	세포배양 3일째의 알칼리성 포스파타제의 활성 (IU)
대조군	3.346±0.200
골쇄보 추출물^*	8.428±0.353

^*배지 중 골쇄보 추출물의 농도는 6 ㎍/㎖이다.

약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 실험결과를 분석하여 본 바 실시예 1에서 얻은 골쇄보 추출물이 백서 두개관 세포의 알칼리성 포스파타제 활성을 현저히 증가시킴을 확인할 수 있었다. 알칼리성 포스파타제는 조골세포의 세포막에 존재하며 PO₄ ^-3/Ca⁺²를 침착시킴으로써 경조직의 석회화 즉 경조직으로의 기능을 다 할 수 있는 형태로 만들어지는데 결정적인 역할을 하는 효소이다. 따라서 실험예 1에서 확인한 바와 같이 골쇄보 추출물이 조골세포 증식효과를 갖고 있을 뿐만 아니라, 경조직의 석회화를 촉진시킴으로서 경조직으로서의 기능을 다하는데 큰 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

실험예 3: 사람의 치주 인대 세포의 증식 촉진효과

골쇄보 추출물이 사람의 치주 인대 세포(human periodontal ligament cell) 증식속도에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

먼저 다음의 방법으로 사람의 치주 인대세포를 배양하였다. 교정치료 목적으로 내원한 환자의 제 1 소구치를 발거하여 200 unit/㎖의 페니실린, 200 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 그리고 1 ㎍/㎖의 암포테리신 B가 첨가된 DMEM으로 구성된 생검 배지로 4회 세척하였다. 치근 시작점에서 중앙으로 1/3되는 지점에서 치주 인대 조직을 수술도로 절취하여 직경 35 mm의 배양 접시에 고르게 분포시킨 다음 100 unit/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙도마이신 및 0.5 ㎍/㎖의 암포테리신 B가 포함된 DMEM과 10% FBS로 구성된 배양액을 넣고 37℃ 및 100% 습도의 5% CO₂공기혼합 배양기에서 배양하였다. 치주 인대 세포가 조직절편으로부터 증식되어 밀생할 때까지 3일 간격으로 배양액을 교환하면서 배양하여 접시를 완전히 덮는 단층이 형성되면 0.05% 트립신/0.02% EDTA를 처리하여 배양접시로부터 세포를 박리하고 1:3의 비율로 계대배양하여 5~7세대의 세포를 본 실험에 사용하였다.

상기의 배양액 0.5 ㎖(사람이 치주 인대세포 1×10⁴개를 함유)를 24 웰 배양접시에 넣고 실험예 1과 동일한 방법으로 세포증식 속도를 측정하였다. 실험결과는 표 3에 나타내었다.

골쇄보 추출물의 사람의 치주 인대 세포 증식에 대한 영향.

	세포수 (×10,000 세포/㎖)
	세포배양 2일째	세포배양 5일째
대조군	6.63±0.252	11.75±0.988
골쇄보 추출물^*	9.37±0.218	12.98±1.495

^*배지 중 골쇄보 추출물의 농도는 6 ㎍/㎖이다.

약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 실험결과를 분석하여 본 바 장기투여시(세포배양 5일)에는 표준편차가 커서 실험 데이타간에 유의성있는 차이를 발견할 수 없었으나 단기투여시(세포배양 2일)에는 실시예 1에서 얻은 골쇄보 추출물이 치주인대세포의 증식을 상당히 촉진시킴을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 경조직 재생촉진제 조성물은 치주인대세포의 증식을 유도함으로써, 소실된 치주인대세포의 재생 효과를 나타낼 수 있다.

실험예 4: 사람의 치주 인대 세포를 이용한 알칼리성 포스파타제 활성 증가효과 실험

골쇄보 추출물이 사람의 치주 인대 세포가 갖고 있는 알칼리성 포스파타제의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

실시예 3에서와 동일한 방법으로 사람의 치주 인대세포로부터 세포를 채취하고 배양하였다. 초기 밀생상태의 사람의 치주 인대세포에 트립신(trypsin)처리하여 실시예 2와 동일한 방법으로 알칼리성 포스파타제의 활성을 측정하였다. 그 결과는 표 4와 같았다.

골쇄보 추출물의 치주 인대 세포의 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 영향.

	알칼리성 포스파타제의 활성 (IU)
	세포배양 3일째	세포배양 7일째
대조군	1.414±0.496	1.984±0.123
골쇄보 추출물^*	1.982±0.238	2.774±0.202

^*배지 중 골쇄보 추출물의 농도는 6 ㎍/㎖이다.

약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 실험결과를 분석하여 본 바 실시예 1에서 얻은 골쇄보 추출물이 치주인대세포의 알칼리성 포스파타제 활성을 상당히 증가시킴을 확인할 수 있었다. 치주 인대 세포는 분화되어 조골세포가 된다. 따라서 본 발명의 경조직 재생촉진제 조성물은 알칼리성 포스파타제의 활성을 증가시킴으로써 치주 인대 세포의 조골세포로의 분화를 촉진시켜 골재생 촉진효과를 나타내게 된다.

본 발명의 치료제는 조골세포의 증식을 촉진시키고 경조직의 석회화를 촉진시킴으로써 경조직 증식 및 재생 촉진효과를 나타낼 뿐만 아니라 경조직으로서 기능을 다 할 수 있는 형태의 즉 충분한 경도를 갖는 경조직을 형성시킨다.

또한 본 발명의 치료제는 조골세포 증식 작용이 탁월하므로 알껍질을 강화할 목적으로 사용되는 부란성 가축의 사료 첨가제로서 이용될 수도 있다.

Claims

골쇄보 추출물을 유효성분으로 포함하는 경조직 재생촉진제 조성물.
제 1항에 있어서, 골쇄보 추출물이 골쇄보를 추출용매에 넣고 50~100℃에서 5~24시간 동안 온탕하여 얻은 추출액을 40~60℃로 냉각시켜 여과한 다음, 상등액을 증발농축시킨 농축액임을 특징으로 하는 경조직 재생촉진제 조성물.
제 1항에 있어서, 골쇄보 추출물이 골쇄보를 추출용매에 넣고 50~100℃에서 5~24시간 동안 온탕하여 얻은 추출액을 40~60℃로 냉각시켜 여과한 다음, 상등액을 증발 농축시킨 후 건조시켜 얻은 분말임을 특징으로 하는 경조직 재생촉진제 조성물.
제 1항에 있어서, 골쇄보 추출물이 골쇄보를 추출용매에 넣고 상온 또는 4℃ 에서 5~7일간 냉침시켜 여과한 다음, 상등액을 증발농축시킨 농축액임을 특징으로 하는 경조직 재생촉진제 조성물.
제 1항에 있어서, 골쇄보 추출물이 골쇄보를 추출용매에 넣고 상온 또는 4℃ 에서 5~7일간 냉침시켜 여과한 다음, 상등액을 증발농축시킨 후 건조시켜 얻은 분말임을 특징으로 하는 경조직 재생촉진제 조성물.
제 2항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 추출용매가 50~100% 메탄올 수용액임을 특징으로 하는 경조직 재생촉진제 조성물.