KR20000017598A

KR20000017598A - 안티트롬빈 Ⅲ-β를 포함하는 약제학적 제제

Info

Publication number: KR20000017598A
Application number: KR1019990035909A
Authority: KR
Inventors: 뢰미쉬위르겐; 포이쓰너안네테; 슈타우쓰하랄트
Original assignee: 모저 하., 라우페 하. 페.; 첸테온 파르마 게엠베하
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2000-03-25
Also published as: JP2000103744A; CA2281055A1; EP0995446A2; AU4476399A; EP0995446A3; DE19839337A1

Abstract

본 발명은, 안티트롬빈 Ⅲ의 β-이소 형태만을 함유하거나 안티트롬빈 Ⅲ의 α-이소 형태와 β-이소 형태와의 혼합물을 함유하는, 안티트롬빈 Ⅲ의 비경구 투여용 약제학적 제제에 관한 것이다. 이들은 안티트롬빈 Ⅲ의 β-이소 형태의 결핍으로 야기되는 증상을 치료하는 데 사용할 수 있으며, 바람직하게는 혈전 합병증, 또는 염증 반응과 관련된 질환의 치료 및 예방에 사용할 수 있다.

Description

안티트롬빈 Ⅲ-β를 포함하는 약제학적 제제{Antithrombin Ⅲ-β-comprising pharmaceutical preparation}

본 발명은 안티트롬빔 Ⅲ-β의 비경구 투여용 약제학적 제제에 관한 것이다.

안티트롬빔 Ⅲ(AT Ⅲ)은 가장 중요한 혈장 억제제 중의 하나이다. AT Ⅲ은 세린 프로테아제 억제제 부류에 속하며, 이들의 "표적 프로테아제"는 공유결합에 근사한 착화합물을 형성한다. 이러한 착화합물은 생리학적 조건하에서 매우 안정하며, 원칙적으로 혈액순환으로부터 신속하게 제거된다. AT Ⅲ과 프로테아제 사이의 반응은 헤파린에 의해 크게 가속되며, AT Ⅲ은 글리코스아미노글리칸 그룹에 속하는 헤파린과의 회합에 순응하는 약간의 변화를 겪으며, 프로테아제와의 가속 반응에 도입될 수 있다. 이들 방법들은, 특히 세포 표면에 대해, 예를 들면, 헤파란설페이트 형태의 글리코스아미노글리칸을 함유하는 세포 표면에 대해 생리학적으로 일익을 담당하여, 세포 및 조직의 단백질 분해 활성이 과도하게 증대되지 않도록 세포 및 조직을 보호한다.

그러나, 혈장 응집 및 이의 조절은 추가의 중요한 의미를 가진다. 건강한 상태에서, 글리코아미노글리칸은 전혀 순환하지 않거나 미량만이 순환하므로, 이러한 과정은 안티트롬본 Ⅲ이 진행성, 즉 헤파린-독립성이어서 억제 활성이 매우 느리다는 특징에 의해 측정된다. 이는, 후속적인 응괴 형성의 과도한 활성화를 피하면서 상처의 봉합을 보장하는 데 유용하다.

AT Ⅲ의 조절 기능은 특히 혈장 수준이 감소될 때 특히 명백하며, 이러한 감소 현상은 다수의 질환의 진행 도중 관찰될 수 있으며, 예를 들면, 전염성 혈관 내 응고(DIC)의 경우 특히 많이 관찰된다. 심지어 상응하는 혈장 농도가 70% 이하로 떨어지는 경우조차 치사율의 급격한 증가와 연관이 있다. 응혈 과정이 두드러지면 혈관의 혈전성 폐색이 일어나며, 이로 인해 기관 부전이 발생한다. 따라서, 사람 혈장의 AT Ⅲ 농축물의 투여는 매우 유용하며, 특히 선천성 또는 후천성 결핍 질환의 경우 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.

상술한 병리생리학적 과정을 상쇄시키기 위하여, AT Ⅲ 농축물로 치환하는 방법 이외에도, 때로는 헤파린을 투여하여 탁월한 단백질 분해능을 통상의 수준으로 감소시킬 수 있다. 그러나, 이는 AT Ⅲ이 충분히 존재하는 경우에만 성공적일 수 있다. 그러나, 헤파린의 투여는 출혈 위험의 증대와 연관이 있어 투여량이 많을수록 응혈을 조절하기가 더 어려워지므로, 응고 촉진 과정과 응고 방지 과정 사이의 균형을 계속 유지시켜줘야만 한다.

AT Ⅲ에 의한 트롬빈 및 활성화 인자 X 및 IX와 같은 응혈 프로테아제의 억제가 특히 본원에서 중요하다. 진행성 억제 특성의 강화는 지혈의 조절에 기여하지만, 출혈 경향을 크게 높히지 않으므로 상당히 개선된 것으로 간주된다. 또한, 이는 염증 반응에 적용되며, 트롬빈 및 FXa가 모두 응혈과 염증 반응 사이를 연관시키는 것으로 간주된다. 이들 인자를 적절하게 억제하면 양 시스템 모두에 영향을 미칠 수 있다.

AT Ⅲ은 혈장 내에서 약 150mg/ℓ의 농도로 순환한다. AT Ⅲ의 약 90 내지 95%는 분자 내에 4군데 위치에서 글리코실화된다. 이러한 이소 형태를 AT Ⅲ-α라고 한다. 그러나, β-이소 형태만이 3군데의 글리코실화 위치를 갖는다. 이들 2가지 이소 형태를 비교하면, AT Ⅲ-α의 탄수화물 쇄 중의 하나는 AT Ⅲ의 헤파린 결합 영역의 주변에 편중되지만, β-이소 형태에는 부재하는 것으로 밝혀졌다. 결국, β-이소 형태의 헤파린에 대한 친화성 증가도 이로부터 유래한다. 내막내 조직에 대한 연구 결과, AT Ⅲ-β가 거기에, 추측컨대 노출된 글리코스아미노글리칸에 결합되어 있음을 발견하였다. 그러나, 지금까지는, 상이한 글리코실화가 혈장성 과정의 진행성 억제에 대해 영향을 미치는지의 여부는 알려져 있지 않다.

놀랍게도, 안티트롬빈 Ⅲ의 β-이소 형태는, α-이소 형태에 비해, 헤파린의 부재하에 활성화된 응집 인자 F X 및 F IX의 단백질 분해 활성을 더 잘 억제하는 것으로 밝혀졌다.

도 1a 및 1b는 AT Ⅲ-β의 트롬빈 억제 활성이 AT Ⅲ-α보다 우수함을 나타내는 도면이다.

도 2a 및 2b는 AT Ⅲ-β의 F IXa 억제 활성이 AT Ⅲ-α보다 우수함을 나타내는 도면이다.

도 3a 및 3b는 AT Ⅲ-β의 F Xa 억제 활성이 AT Ⅲ-α보다 우수함을 나타내는 도면이다.

도 4a 및 4b는 AT Ⅲ-β의 플라스민 억제 활성이 AT Ⅲ-α보다 우수함을 나타내는 도면이다.

도 5는 AT Ⅲ-β 함량이 증가할수록 F IXa 억제 활성이 증가함을 나타내는 도면이다.

그러므로, 본 발명은 안티트롬빈 Ⅲ의 β-이소 형태만을 함유하는, 안티트롬빈 Ⅲ의 비경구 투여용 약제학적 제제에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 안티트롬빈 Ⅲ의 α-이소 형태 및 β-이소 형태의 혼합물을 함유하며, β-이소 형태가 안티트롬빈 총량의 15중량% 이상을 구성하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 안티트롬빈 Ⅲ의 두 가지 이소 형태의 제조방법과 이들의 억제 특성은 실시예 1에서 보다 상세하게 설명하였다.

β-이소 형태의 억제 능력의 현저한(적절한) 증가로 인해, 안티트롬빈 Ⅲ의 β-이소 형태만을 함유하거나 β-이소 형태를 안티트롬빈 총량의 15중량% 이상의 양으로 함유하는 비경구 투여용 약제학적 제제를 사용함으로써 선천적 또는 후천적 AT Ⅲ-β 결핍증을 앓는 환자로부터 병인을 제거할 수 있다. 두 가지 이소 형태의 혼합물을 투여하는 것이 AT Ⅲ β 결핍증에 유용한데, 그 이유는 이러한 약제학적 제제가 천연 AT Ⅲ 농축물에 비해 더 높은 함량의 β-이소 형태의 안티트롬빈을 갖고 있기 때문이다.

본 발명은 순수한 β-이소 형태의 안티트롬빈 Ⅲ 또는 β-이소 형태의 함량이 15중량% 이상인 안티트롬빈 Ⅲ 이외에도, 추가로 글리코스아미노글리칸, 특히 헤파린을 함유하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 이러한 형태의 제제를 사용하면, β-이소 형태의 안티트롬빈의 억제 반응이 크게 촉진된다.

순수한 형태로서 또는 AT Ⅲ 농축물의 구성분으로서의 β-이소 형태는 AT Ⅲ 형장 농도의 명백한 감소를 나타내지 않는 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 이는, 예를 들면, 다리 정맥 혈전증, 심경색 예방, 재혈전증 예방 및 패혈성 질환(예: 패혈증 또는 패혈증 쇽크)의 경우일 수 있다. 활성화된 응혈 인자 X 또는 IX에 대한 억제 작용의 증가로 인해 안티트롬빈의 순수한 β-이소 형태와 β-이소 형태가 풍부한 안티트롬빈 농축물의 투여가 유용해진다. β-이소 형태의 안티트롬빈을 함유하는 약제학적 제제의 투여는 실제적으로 출혈 경향이 증가되는 위험을 수반하지 않는다. 활성화된 응혈 인자 IX 및 X의 억제 효과가 더 높으면 소염 효과를 수반하여, 이러한 증상의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에 따르는 약제학적 제제는 주사 또는 주입용일 수 있다. 일반적으로, 별도 포장된 용매와 함께 주사병 속의 건조한 물질로서 시판된다. 주사병 속의 1회 투여용 활성 화합물의 양은 일반적으로 250 내지 2500 I.E.이다. 동결건조된 용액의 제형에 따라, 사용된 용매는 물(주사용) 또는 링겔 락테이트 용액이거나, 나트륨 시트레이트, 글루코즈, 나트륨 모노하이드로겐포스페이트, 사람 알부민(혈장으로부터 채취, 재조합 또는 유전자 전이 수단에 의해 제조)을 포함하는 하나 이상의 아미노산을 함유할 수 있는 수성 등장액, 또는 혈장 대체 주사액(예: Haemacel^R)이다. 안티트롬빈 Ⅲ-β는 경구적으로 투여될 약체 제제 형태로 공급될 수 있다. 헤파린 또는 기타 글리코스아미노글리칸의 동시 투여시, 이의 투여량이 500I.U/hr을 초과해서는 안된다.

본 발명은 다음 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이다.

실시예 1

안티트롬빈 Ⅲ-α 및 안티트롬빈 Ⅲ-β는 헤파린 프락토겔(Fractogel^R)에 대한 AT Ⅲ 농축물 키베르닌(Kybernin^R) P[제조원: 독일 마르부르크 소재의 첸테온 파르마 게엠베하]의 흡수와 단계적인 용출을 통해 수득된다. 이때, 헤파린에 대해 다양한 친화도를 갖는 이소 형태가 분리를 위해 사용되며, AT Ⅲ-α는 비교적 낮은 염 농도에서 용출되고, AT Ⅲ-β는 비교적 높은 염 온도에서 용출된다. 이들 이소 형태는 특히 이들의 상이한 주행 거동 및 밴드 패턴에 의해, 그리고 SDS-PAGE 및 등전성 포커싱에 의해 특징지워진다. 이들 제제는 매우 높은 순도를 특징으로 한다. 단백질 농축물은 케달(Kjeldahl) 방법에 의해 측정된다.

이들 두 이소 형태의 억제능을 평가하기 위해, 혈장으로부터 분리되고 고도로 농축된 억제제 이소 형태(케달에 따르는 총 단백질 함량을 기준으로 함)를 갖는 활성화 인자들을 헤파린의 부재 또는 존재(AT Ⅲ 150μg당 2IU)하에 처리하고, 프로테아제의 나머지 아미노 분해 활성을 유색 펩티드 기질의 조력하에 광도계로 측정한다.

이를 위해, 인자 II(트롬빈), F IX, F X 및 플라스미노겐(플라스민)의 활성화된 형태가 사용된다. 유색 기질(3mM)은 스웨덴 소재의 크로모제닉스 (Chromogenix) AB로부터 구입한다.

프로테아제	공급원	실험 농도(IU/ML)	유색 기질
사람-α-트롬빈	첸테온(Centeon)	0.5IU/ml	S 2238
FlXa	ERL(UK)	2㎍/ml	S 2238
Fxa	스타고(Stago)/베링거(Boehringer)(독일)	0.05IU/ml	S 2765
플라스민	첸테온	0.1CTA/ml	S 2251
S 2238: H-D-Phe-Pip-Arg-pNA x 2HClS 2288: H-D-Ile-Pro-Arg-pNA x 2HClS 2765: Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA x 2HClS 2251: H-D-Val-Leu-Lys-pNA x 2HCl

파트 A

시험 뱃취 :

AT Ⅲ-α 또는 AT Ⅲ-β 50μl

완충액 100μl

프로테아제(표 1 참조) 50μl

유색 기질 50μl

헤파린을 함유하는 뱃취의 경우, 당해 혼합물은 유색 기질을 첨가하기 전에 실온에서 10분 동안 배양시킨다. 405nm에서의 흡광도 변화를 시간 경과에 따라 기록한다. 억제율(%)은 억제되지 않은 뱃취와 대비하여 정량화한다. 프로테아제 활성이 50% 억제되는 AT Ⅲ-α 및 AT Ⅲ-β의 농도를 측정하고 IC50 수치로 표현한다(표 2).

	AT Ⅲ-α	AT Ⅲ-β
	헤파린 비함유	헤파린 함유	헤파린 비함유	헤파린 함유
트롬빈	220	1.5	200	0.8
FXa	500	5.0	240	3.0
FlXa	490	10.0	175	7.0
플라스민	900	55.0	900	45.0

결과 :

예측한 바와 같이, 모든 억제 반응은 헤파린의 존재하에 강하게 촉진되며 IC50 수치를 크게 감소시킨다. 양쪽 이소 형태 사이의 차이는 시험의 가변성의 범주로 인해 분명하지 않지만(도 1b, 2b, 3b 및 4b 참조), 트롬빈에 비해 F IXa 및 F Xa는 β-이소 형태의 억제능이 더 높은 것으로 밝혀졌다.

α-이소 형태에 비해, 인자 2 및 3에 의해 대략 감소되는 AT Ⅲ-β 농도는 F Xa 및 F IXa의 50% 억제를 위해 필요하다(도 1a, 2a, 3a 및 4a 참조).

파트 B

보다 강력한 AT Ⅲ-β의 억제능이 다음 실험에 의해 강화되며, 실시예 1A에 따라 변형된 형태로 수행된다.

시험 뱃취에서 사용되는 AT Ⅲ의 전체 농도는 일정하게 유지되지만(100/250/500μg/ml), AT Ⅲ-β의 함량은 증가된다.

도 5는 F IXa 활성이 AT Ⅲ-β 함량이 증가할수록 더 억제됨을 도시한다. 절대 AT Ⅲ의 곡선은 상응하게 평행하다.

실시예 2

AT Ⅲ의 두가지 이소 형태가 혈장 재침전에 미치는 영향은 응집측정계의 조력하에 쉬니트거(Schinitiger) 및 그로스(Gross)에 따라 측정한다. 이를 위해, 안티트롬빈 Ⅲ을 전혀 함유하지 않는 AT Ⅲ 결핍 혈장을 과량의 AT Ⅲ-α 또는 AT Ⅲ-β와 이미다졸 완충액 100μl로 처리하고, 1분 동안 37℃에서 배양한 다음, 염화칼슘 100μl(25mM)를 첨가함으로써 반응을 다시 개시한다.

결과:

AT Ⅲ의 두 가지 이소 형태 모두의 농도를 증가시키면 이들의 재침전시간이 연장되며, AT Ⅲ-β가 더 오래 연장된다(표 3).

본 발명의 안티트롬빈 Ⅱ-β를 포함하는 약제학적 제제는 안티트롬빈 Ⅲ의 β-이소 형태의 결핍으로 야기되는 증상을 치료하는 데 사용할 수 있으며, 바람직하게는 혈전 합병증, 또는 염증 반응과 관련된 질환의 치료 및 예방에 사용할 수 있다.

Claims

안티트롬빈 Ⅲ의 β-이소 형태만을 함유하는, 안티트롬빈 Ⅲ의 비경구 투여용 약제학적 제제.
제1항에 있어서, 안티트롬빈 Ⅲ의 α-이소 형태와 β-이소 형태와의 혼합물을 함유하며, β-이소 형태가 안티트롬빈 총량의 15중량% 이하를 구성하는 약제학적 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 글리코스아미노글리칸을 추가의 활성 화합물로서 함유하는 약제학적 제제.
제3항에 있어서, 헤파린을 글리코스아미노글리칸으로서 함유하는 약제학적 제제.
안티트롬빈 Ⅲ의 β-이소 형태의 결핍으로 야기되는 증상을 치료하기 위한, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 약제학적 제제의 용도.
혈전성 합병증, 패혈증 또는 염증 반응과 관련된 질환의 치료 및 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따르는 약제학적 제제의 용도.