[과제를 해결하기 위한 수단]
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 콜라겐 합성 촉진제로서 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 추출물을 포함하는 주름개선, 탄력증진 및 창상치유용 피부 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명자들은 천연에서 자생하는 동식물들을 대상으로 우수한 콜라겐 합성 촉진제를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물에 매우 강력한 콜라겐 합성 촉진 효과가 있음을 밝혀 내고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 피부 조성물은 콜라겐 합성 촉진제로서 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 추출물을 포함하며, 이러한 추출물은 1차 추출물로서 약재로 구입할 수 있는 상륙, 토사자 및 백강잠을 각각 물 또는 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 유기용매로 1차 추출한 후 감압 농축한 다음 동결건조 또는 분무건조하여 제조한다.
본 발명에 사용된 생약재인 상륙, 토사자 및 백강잠은 각각 다음과 같은 특성을 갖는다.
상륙(학명: Phytolacca esculenta V. Houtte; 자리공)은 자리공과(phytolaccaceae; 상륙과)의 다년생 초본으로 근부 및 전초를 약으로 쓰고, 생약명은 상륙(라틴명: Radix phytolaccae esculentae)으로 불려진다. 한국과 일본에서는 Phytolacca esculenta 및 그 동속식물을 같은 기원식물로 사용하고 있으며, 중국에서는 Phytolacca acinosa 및 Phytolacca americana 식물이 같은 기원식물로 사용되고 있다. 약은 그대로 사용하기도 하고, 깨끗이 씻은 상륙편(商陸片)을 솥에 넣고 미초(米醋, 쌀식초)를 가해 삶은 다음 잘라 그늘에서 말린 초상륙을 사용하기도 한다. 상륙은 전통적으로 종기를 없애는데 이용되어 왔으며(본초강목), 이를 이용한 피부염치료제(JP 5246874A)가 연구되어 있고, 상륙에 대한 성분 연구를 통해 피톨라코사이드(phytolaccoside) A, B, C, D, 잘리고닌산(jaligonic acid), 에스쿨렌틴산(esculentic acid), 아메리카닌 A(americanin A), 베타닌(betanin), 이소베타닌(isobetanin) 등의 물질이 보고되어 있다.
토사자(학명: Cuscuta Chinensis Lam.; 갯실새삼, 실새삼)는 메꽃과(Convolvulaceae)의 일년생 덩굴성 초본으로 종자를 약으로 쓰며, 생약명은 토사자(라틴명: Semen Cuscutae)로 불려지고, Cuscuta japonica(새삼)의 종자도 같은 생약으로 사용되고 있다. 약은 그대로 사용하기도 하고, 토사자를 소금물로 축인 다음 가마에서 약한 불로 볶거나(염토사자), 토사자를 술에 하룻밤 담갔다가 햇볕에 말리거나(토사자주침), 껍질을 벗기고 초에 담갔다가 약한 불에서 말려(토사자초침) 사용하기도 한다. 토사자는 전통적으로 강장, 눈과 귀를 밝게 하고(明目, 耳鳴), 태아를 편하게 하는데(安胎) 이용되어 왔으며(원색천연물대사전), 여드름치료 조성물(JP 63104928), 발모촉진 조성물(JP 6209406, C87-067192) 등으로 연구되었고, 토사자에 대한 성분 연구를 통해 p-코우마린산(p-coumaric acid), 클로로제닌산(chlorogenic acid), 쿠스쿠토사이드(cuscutoside) A, B, 등의 물질이 보고되어 있다.
백강잠(학명: Bombyx mori (L.); 가잠)은 누에나방과(Bombycidae 누에과)의 유충에 백강균(Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.)을 접종시킨 유충의 건조충체로서, 이것을 말리거나 석회와 반죽하여 불에 구워 말린 것을 약으로 쓴다. 생약명은 백강잠 또는 강잠(Batyticatus Bombycis, Corpus Bombycis)으로 불려진다. 백강잠은 전통적으로 진경, 진정, 거풍, 소종에 이용되어 왔으며(원색천연물 대사전), 피부염치료제(일본 특개평 5-246874) 등으로 연구되었고, 성분에 대한 연구는 거의 진행되지 않았다.
이러한 생약재 추출물의 제조 방법은 다음과 같다. 우선 생약재로 시판되는 상륙, 토사자 및 백강잠을 구입하여 잘게 분쇄하고, 분쇄물 건조 중량에 대하여 5-20부피의 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산 또는 이들의 혼합물을 첨가하여 환류 냉각기가 달린 추출기에서 40 내지 100℃로 1 내지 5시간 가온추출하거나, 실온에서 1 내지 30일간 침적시켜 추출한다. 추출액에서 잔사를 여과포로 여과한 후 같은 방법으로 1회 이상씩 더 추출하고, 각 단계에서 얻은 추출액을 합하여 감압농축한 후 동결건조 또는 분무건조하여 건조 추출물을 얻는다.
이러한 방법으로 제조된 상륙추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물은 섬유아세포에서 매우 강력한 콜라겐 합성 촉진능을 나타내며, 마우스의 상처부위에 적용하였을 때 매우 우수한 창상치유효과를 나타낸다.
또한, 이러한 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물을 포함한 피부외용 연고나 화장료를 제조할 수 있으며, 피부외용 연고나 화장료 제조시에 포함되는 상륙 추출물, 토사자 추출물 및/또는 백강잠 추출물의 함량은 건조중량으로 0.0001-10.0중량%, 바람직하게는 0.0005-10중량%가 적당하다. 추출물의 함량이 0.0001중량% 미만이면 뚜렷한 효과를 기대할 수 없고, 10중량%를 초과하면 함유량의 증가에 따라 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않는다.
이러한 상륙 추출물, 토사자 추출물 및/또는 백강잠 추출물을 함유한 피부외용 연고나 로션 등의 화장료는 사람의 피부에 도포하였을 때, 피부 주름개선 효과가 매우 우수하며, 어떠한 부작용도 발색하지 않아 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물이 안전하고 효과가 뛰어난 주름개선제임을 알 수 있다.
[실시예]
다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-24
시판되는 생약재를 분쇄하여 얻은 분쇄물 300g을 용매 3ℓ에 첨가하고, 냉각 콘덴서가 달린 환류 추출기에서 3시간 동안 끓여 추출한 다음, 300 메쉬 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 더 추출하였다. 각각의 단계에서 얻어진 추출액을 혼합하고 상온에서 화트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압농축하고 동결건조하여 건조 추출물을 얻었다. 각각의 경우에 사용한 생약재, 용매 및 얻어진 건조 추출물의 건조 중량은 표 1에 나타내었다.
실시예 |
생약재 |
용매 |
건조중량(g) |
1 |
상륙 |
80% 메탄올 |
61 |
2 |
정제수 |
69 |
3 |
85% 에탄올 |
60 |
4 |
70% 아세톤 |
56 |
5 |
50% 에탄올 |
69 |
6 |
60% 메탄올 |
68 |
7 |
포화 노말부탄올 |
52 |
8 |
클로로포름 |
43 |
9 |
토사자 |
80% 메탄올 |
28 |
10 |
정제수 |
21 |
11 |
85% 에탄올 |
30 |
12 |
70% 아세톤 |
33 |
13 |
50% 에탄올 |
24 |
14 |
60% 메탄올 |
24 |
15 |
포화 노말부탄올 |
23 |
16 |
클로로포름 |
19 |
17 |
백강잠 |
80% 메탄올 |
51 |
18 |
정제수 |
65 |
19 |
85% 에탄올 |
48 |
20 |
70% 아세톤 |
43 |
21 |
50% 에탄올 |
57 |
22 |
60% 메탄올 |
58 |
23 |
포화 노말부탄올 |
42 |
24 |
클로로포름 |
35 |
실험예 1 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물의 세포수준에서의 콜라겐 생합성 효과
상기 실시예 1-24에서 얻어진 각 추출물을 인간유래의 섬유아세포 배양액에 첨가하여 세포수준에서의 콜라겐 합성촉진 효과를 실험하였다. 이때 실시예 1-24에서 얻어진 각 추출물들을 최종농도가 0.001w/v%가 되도록 하여 콜라겐 생합성 촉진효과를 측정하였으며, 생합성된 콜라겐의 측정은 Martens(Gut 1992, 33, 1664-1670)의 방법을 응용하였다.
상세한 실험방법은 다음과 같다. 우선, 인간유래의 섬유아세포를 세포배양용 24 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 배지에서 37℃, 5% CO2조건하에서 24시간 동안 배양한 후 PBS(phosphate buffer saline)로 2회 세척하였다. 이러한 방법에 따라 배양된 섬유아세포와 1% FBS를 함유하는 배지에 상기 실시예 1-24에서 얻은 생약 추출물을 0.001%로 처리한 후, 방사선 동위원소로 표지한 아미노산(2,3-3H proline) 2μCi, 아스콜빈산 30㎍/㎖를 첨가하고, 37℃, 5% CO2조건에서 24시간 배양한 후 배양을 종료하였다. 배양 종료 후 상기 세포 및 배양액을 각각 1/2씩 나누어 한쪽 분획에만 콜라게나아제를 처리한 후 TCA(trichloroacetic acid)로 단백질을 침전시켜 두 분획의 방사활성의 차이로부터 생합성된 콜라겐의 양을 측정하였다. 각 시료의 콜라겐 생합성 촉진효과는 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 것을 100%로 하여 콜라겐 증가율로 표 2에 나타내었다. 또한, 실시예의 추출물 대신 Centella asiatica의 80% 메탄올 추출 건조물과 비타민 A인 레티놀(retinol)을 사용하여 같은 방법으로 실험하였으며 이때의 결과를 콜라겐 증가율로 표 2에 나타내었다.
시료 |
생합성된 콜라겐 양(cpm)* |
콜라겐 증가율(%) |
대조군 |
1465±228 |
100 |
실시예 1 |
2755±157 |
215 |
실시예 2 |
2246±244 |
169 |
실시예 3 |
2581±265 |
199 |
실시예 4 |
2664±188 |
207 |
실시예 5 |
2452±291 |
188 |
실시예 6 |
2478±315 |
190 |
실시예 7 |
2549±270 |
196 |
실시예 8 |
2390±358 |
182 |
실시예 9 |
2800±210 |
170 |
실시예 10 |
2383±274 |
148 |
실시예 11 |
3069±214 |
184 |
실시예 12 |
2515±300 |
155 |
실시예 13 |
2479±271 |
153 |
실시예 14 |
2823±273 |
171 |
실시예 15 |
2839±342 |
172 |
실시예 16 |
2679±291 |
163 |
실시예 17 |
3524±228 |
208 |
실시예 18 |
3561±230 |
210 |
실시예 19 |
3094±206 |
185 |
실시예 20 |
3088±254 |
185 |
실시예 21 |
3344±252 |
198 |
실시예 22 |
3471±217 |
205 |
실시예 23 |
3772±220 |
221 |
실시예 24 |
3199±298 |
191 |
Centella asiatica 추출물 |
1992±168 |
124 |
비타민 A(레티놀) |
2837±228 |
172 |
* 반복수: 3
표 2의 결과에서 볼 수 있듯이 실시예 1-24에서 얻어진 각 시료들은 정제되지 않은 추출물임에도 불구하고 매우 강력한 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타냈다. 또한 기존에 섬유아세포의 콜라겐 생합성 촉진효과가 알려진 Centella asiatica의 추출 건조물과 비교하였을 때 우수한 효과가 있음을 확인하였으며, 비타민 A인 레티놀과 비교하였을 때 추출물 상태에서도 유사하거나 우수한 효과를 나타내어 콜라겐 생합성능이 탁월함을 알 수 있었다.
실험예 2 농도에 따른 세포수준에서의 콜라겐 생합성 효과
실험예 1과 같은 방법을 사용하여, 배양된 인간 유래의 섬유아세포에 대하여 실시예 1, 9, 17의 추출물의 농도에 따른 콜라겐 생합성 촉진 효과를 조사하였으며 결과는 표3과 같았다.
시료 |
적용 농도(%) |
생합성된 콜라겐 양(cpm)* |
콜라겐 증가율(%) |
대조군 |
- |
1465±228 |
100 |
실시예 1 |
0.00001 |
1875±237 |
133 |
0.001 |
2755±157 |
215 |
0.1 |
2821±195 |
219 |
실시예 9 |
0.00001 |
2008±188 |
129 |
0.001 |
2800±210 |
170 |
0.1 |
3389±110 |
202 |
실시예 17 |
0.00001 |
2550±331 |
156 |
0.001 |
3524±228 |
208 |
0.1 |
3767±239 |
216 |
Centella asiatica 추출물 |
0.00001 |
1664±416 |
108 |
0.001 |
1992±168 |
124 |
0.1 |
2434±153 |
140 |
비타민 A(레티놀) |
0.00001 |
2189±147 |
138 |
0.001 |
2837±228 |
172 |
0.1 |
929±101 |
72 |
*반복수: 3
표 3의 결과에 나타낸 바와 같이 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물은 배양된 인간유래의 섬유아세포에 대하여 매우 강력한 콜라겐 생합성능을 가지고 있으며, 기존에 효능이 알려진 Centella asiatica 추출물과 비교하였을 때 낮은 농도에서도 매우 높은 효과를 보임을 알 수 있다. 또한 콜라겐 생합성능이 알려져 있는 비타민 A와 비교하였을 때에도 추출물임을 감안하고도 유사하거나 우수한 효능을 나타내었다. 특히 비타민 A의 경우 0.1%의 농도에서 배양세포에 대해 독성을 나타내어, 세포를 사멸시켜 콜라겐 생합성능이 낮게 나타났으나, 본 발명의 추출물의 경우 이러한 현상이 나타나지 않았다.
실험예 3 마우스에 대한 주름 개선 효과
6주령의 헤어리스 마우스를 이용하여 광에 의해 유발된 주름에 대한 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물의 주름개선 효과를 시험하였다. 추출물은 실시예 5, 13, 21에서 제조된 추출물을 10%로 증류수에 녹여 적용하였으며, 시험법은 다음과 같다.
헤어리스 마우스에 태양광선 시뮬레이터(solar simulator)를 이용하여 2MED로 1주일에 3일씩 10주간 조사하여 주름을 형성시키고, 시료를 첨가하지 않은 증류수를 처리한 대조군과 10% 농도의 추출물을 1일 2회 0.5㎖/㎠(건조추출물로 50㎎/㎠)씩 6주간 처리한 군을 대상으로 주름 개선 정도를 정성 판단하였다.
주름개선 정도의 판단은 시료 처리 부위를 육안과 사진 촬영을 통하여 육안 판정하였고, 판정기준은 각각의 추출물 처리군 및 대조군을 시료 처리전과 비교하여 개선없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4단계로 판정하여 표 4에 나타내었다.
시료* |
개선없음 |
약간의 개선 |
중등도의 개선 |
상당한 개선 |
대조군 |
5 |
0 |
0 |
0 |
실시예 5 |
0 |
2 |
2 |
1 |
실시예 13 |
0 |
1 |
1 |
3 |
실시예 21 |
0 |
0 |
4 |
1 |
*각 군의 개체수: 5
표 4의 결과로부터 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물은 헤어리스 마우스의 광에 의해 생성된 주름에 대해 탁월한 개선효과를 갖고 있음을 확인하였다.
실험예 4 래트에 대한 창상치유 효과
5주령의 웅성 래트를 이용하여 절개창에 있어서 상처부위의 재생의 질과 양을 잘 반영하는 장력강도법을 사용하여 창상치유 효과를 시험하였다. 래트의 등부위 털을 제거한 후 메스로 절개하고 절개 부위를 봉합하였다. 실시예 5, 13, 21에서 제조된 추출물을 10%로 증류수에 녹인 후, 매일 1회 0.5㎖/㎠(건조추출물로 50㎎/㎠)씩 6일간 절개 부위에 투여하였다. 6일 후 실험에 이용한 래트를 도살하고 창상 부위의 피부를 적출하여 절창선에 직교하는 폭 1㎝의 피부편을 개체마다 3표본씩 만든 후 장력측정기(Rheometer)로 파열장력을 측정하였다. 측정된 장력강도(Tensil strength, g/㎝)를 재생된 콜라겐 섬유의 강도의 지표로 하여, 결과를 표 5에 나타냈고, 장력강도의 증가율은 시료를 첨가하지 않고 증류수만을 적용한 대조군의 장력강도를 100%로 하여 상대적 강도로 나타내었다.
시료* |
장력강도(g/㎝) |
증가율(%) |
대조군 |
550 |
100 |
실시예 5 |
643 |
117 |
실시예 13 |
654 |
119 |
실시예 21 |
660 |
120 |
*각군의 개체수: 5
표 5의 결과로부터 상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물은 래트에 있어 창상치유 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
제조예 1-5 및 비교예 1
상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물과 표 6에 나타낸 각각의 성분을 표 6에 나타난 비율과 같이 혼합하여 피부 외용 연고를 제조하였다.
1, 2, 3: 각각 실시예 5, 13, 21의 추출물
4: 전체가 100중량%가 되도록 하는 양
제조예 6-10 및 비교예 2
상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물과 표 7에 나타낸 각각의 성분을 표 7에 나타난 비율과 같이 혼합하여 화장료 중 크림을 제조하였다.
1, 2, 3: 각각 실시예 5, 13, 21의 추출물
4: 전체가 100중량%가 되도록 하는 양
제조예 11-15 및 비교예 3
상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물과 표 8에 나타낸 각각의 성분을 표 8에 나타난 비율과 같이 혼합하여 화장료 중 유연화장수를 제조하였다.
1, 2, 3: 각각 실시예 5, 13, 21의 추출물
4: 전체가 100중량%가 되도록 하는 양
제조예 16-20 및 비교예 4
상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물과 표 9에 나타낸 각각의 성분을 표 9에 나타난 비율과 같이 혼합하여 화장료 중 영양화장수를 제조하였다.
1, 2, 3: 각각 실시예 5, 13, 21의 추출물
4: 전체가 100중량%가 되도록 하는 양
제조예 21-25 및 비교예 5
상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물과 표 10에 나타낸 각각의 성분을 표 10에 나타난 비율과 같이 혼합하여 화장료 중 팩을 제조하였다.
1, 2, 3: 각각 실시예 5, 13, 21의 추출물
4: 전체가 100중량%가 되도록 하는 양
제조예 26-30 및 비교예 6
상륙 추출물, 토사자 추출물 및 백강잠 추출물과 표 11에 나타낸 각각의 성분을 표 11에 나타난 비율과 같이 혼합하여 화장료 중 에센스를 제조하였다.
1, 2, 3: 각각 실시예 5, 13, 21의 추출물
4: 전체가 100중량%가 되도록 하는 양
실험예 5
상기 제조예 26-30 및 비교예 6에서 제조한 에센스를 사용하여 건강한 35세에서 50세의 여성을 대상으로 주름개선 효과를 실험하였다.
35세에서 50세까지의 여성 60명을 10명씩 1군-6군의 6개 군으로 구분하고, 1군은 상륙 추출물을 함유한 제조예 26의 에센스를, 2군은 토사자 추출물을 함유한 제조예 27의 에센스를, 3군은 백강잠 추출물을 함유한 제조예 28의 에센스를, 4군은 상륙 추출물과 토사자 추출물을 함께 함유한 제조예 29의 에센스를, 5군은 토사자 추출물과 백강잠 추출물을 함께 함유한 제조예 30의 에센스를, 6군은 추출물이 함유되지 않은 비교예 6의 에센스를 안면부에 1일 2회씩 3개월간 도포하였다. 3개월 후 주름의 개선정도를 피험자의 설문 및 주름의 영상분석을 통해 평가하였다.
피험자의 설문은 주름개선 및 탄력증진에 관하여 사용전과 비교하여 개선없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4단계로 판정하였으며 결과는 표 12 및 표 13에 나타내었다.
주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카(replica)를 채취하고(Xantopern, Bayer), 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전에 대한 주름 밀도에 대한 감소율로 표 14에 나타내었다.
주름개선 효과(사람수)
시료 |
개선없음 |
약간의 개선 |
중등도의 개선 |
상당한 개선 |
제조예 26 |
1 |
1 |
4 |
4 |
제조예 27 |
2 |
2 |
3 |
3 |
제조예 28 |
1 |
1 |
6 |
2 |
제조예 29 |
1 |
1 |
4 |
4 |
제조예 30 |
1 |
- |
6 |
3 |
비교예 6 |
8 |
2 |
- |
- |
탄력증진 효과(사람수)
시료 |
개선없음 |
약간의 개선 |
중등도의 개선 |
상당한 개선 |
제조예 26 |
1 |
2 |
3 |
4 |
제조예 27 |
2 |
1 |
4 |
3 |
제조예 28 |
1 |
3 |
4 |
2 |
제조예 29 |
1 |
2 |
4 |
3 |
제조예 30 |
- |
3 |
5 |
2 |
비교예 6 |
6 |
4 |
- |
- |
표 12와 표 13의 결과로부터 본 발명에 의한 제조예들을 사용한 경우 주름개선 및 피부의 탄력증진 효과가 우수함을 알 수 있으며, 특히 피험자의 80% 이상이 인지가 가능한 정도의 주름 개선 및 탄력 증진의 효과를 말하고 있다.
주름개선 효과(영상분석)
시료 |
주름밀도 감소율(%) |
제조예 26 |
55 |
제조예 27 |
49 |
제조예 28 |
45 |
제조예 29 |
57 |
제조예 30 |
52 |
비교예 6 |
8 |
표 14의 결과로부터 본 발명의 추출물을 첨가한 제조예를 도포한 경우 주름의 밀도가 사용전 보다 45%-57% 정도로 크게 감소하는 것을 알 수 있다.
이와 같은 실험 결과는 본 발명의 추출물이 피부의 도포 외용제로 사용되었을 때 내적 또는 외적 요인에 의해 발생된 주름을 매우 효과적으로 개선해 줄 수 있다는 것을 의미하며, 시험기간 동안 피험자들에게서 부작용이 나타나지 않아 본 발명의 추출물들이 피부에 안전함을 알 수 있었다.