KR19990087247A - 뱀 독액으로부터 수득되는 트롬빈 유사 프로테아제 효소의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뱀 독액으로부터 트롬빈 유사 프로테아제를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 3단계의 크로마토그래피에 의해 불순물로부터 프로테아제를 단리하는 것으로 이루어진다.
Description
본 발명은 뱀 독액으로부터 트로빈 유사 프로테아제를 정제하는 방법에 관한 것이다.
상기 프로테아제의 예는 바트록소빈, 크로탈라제, 특히 안크로드이다. 안크로드는 뱀 악키스트로돈 로도스토마 (Agkistrodon rhodostoma)의 독액으로부터 단리되는 항응고제이다 (Merck Index 1989, No. 664). 뱀 독액으로부터 안크로드를 제조하는 많은 방법이 문헌에 기재되어 있다 (영국 특허 제1,094,301호, 영국 특허 제1,177,506호, 영국 특허 제1,293,793호, 미국 특허 제3,743,722호, 미국 특허 제3,879,369호, 독일 특허 공개 제2,428,955호, 독일 특허 공개 제2,734,427호). 이들 방법은 필수적으로 크로마토그래피 단계를 기초로 하고 있고, 안크로드를 상이한 수율 및 순도로 수득한다.
뱀 독액으로부터 고순도의 안크로드를 제조하는 것은 지금까지 성공하지 못하였다. 제조 방법에 따라 항상 약간의 외부 단백질로 오염된 채로 효소와 주성분으로서의 안크로드의 혼합물이 단리되었다.
본 발명자들은 뱀 독액으로부터 트로빈 유사 프로테아제를 고순도의 형태로 제조하는 방법을 발견하였다.
본 발명은 a) 친화도 크로마토그래피 또는 염기성 이온 교환기에 대한 크로마토그래피에 의해 프로테아제 조 생성물을 예비 정제하는 단계, b) 단계 a)에서 수득한 트롬빈 유사 효소를 함유하는 분획을 약한 양이온 교환기에 대해 크로마토그래피시키거나 유리에 흡착시켜 염기성 범위 내로 분리하는 단계, 및 c) 단계 b)로부터의 주성분을 산성 범위 내로 겔 크로마토그래피시키거나 또는 유리에 대한 크로마토그래피에 의해 주성분을 정제하는 단계로 이루어지되, 상기 단계 b) 및 c) 중 하나 이상의 단계가 유리에 대한 흡착 또는 크로마토그래피에 의한 분리를 포함하는, 뱀 독액으로부터 트롬빈 유사 프로테아제를 정제하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 뱀 독액으로부터 정제된 순도 95 내지 100%의 트롬빈 유사 프로테아제에 관한 것이다.
단계 b)는 유리에 대한 흡착에 의한 정제를 수행하고, 단계 c)는 겔 크로마토그래피에 의해 실시되는 것이 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 단계 b 및 단계 c 모두에서 정제는 유리에 대한 흡착 또는 크로마토그래피에 의해 수행된다.
아그마틴-세파로스, 아르기닌-세파로스 또는 헤파린-세파로스가 친화도 크로마토그래피에 의한 정제에 특히 적합하다.
예비 정제에 적합한 염기성 이온 교환기는 특히 DEAE-셀룰로스 및 DEAE-세파로스이다.
이온 교환 크로마토그래피에 대해 언급할 수 있는 완충액은 특히 트리스-포스페이트 및 인산나트륨 완충액이다.
이온 교환 크로마토그래피는 5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 8.5의 pH에서 수행된다.
예비 정제 동안, 약 70 내지 80%의 외부 단백질 및 다른 성분이 조 효소로부터 제거된다.
정제의 제2 단계가 이온 교환기를 사용하여 수행되는 경우, 적합한 양이온 교환기는 CM-SEPHAROSE (pH 5-9) 및 AMBERLITE CG50 (pH 5-9)와 같은 약산성 교환기이다.
유리에 대한 크로마토그래피는 안크로드 및 관련 트롬빈 유사 효소, 및 강염기성 프로테아제가 7.5 내지 9.0, 바람직하게는 8.0 내지 8.5의 pH에서 유리 매트릭스에 결합된다는 것을 의미한다. 약 60%의 특히 산성인 외부 단백질이 평형 완충액(바람직하게는 트리스-포스페이트 또는 인산나트륨 온충액)에 의해 비결합된 형태로 칼럼으로부터 세척된다. 안크로드는 염화나트륨의 첨가에 의해 완충액의 이온 강도를 0.3 내지 1.0 M까지 증가시킴으로써 90% 이상의 순도로 유리로부터 분획화되어 용출된다.
제2 정제 단계에서, 효소는 약 90%까지 농축된다.
정제 단계 c)로서의 겔 크로마토그래피에 적합한 겔은 특히 SEPHACRYL S-100HR, SUPERDEX, SEPHADEX, ULTROGEL 및 SUPEROSE이다.
유리에 대한 크로마토그래피가 상기 정제 단계 c)에 선택되는 경우, 4 내지 6의 산성 pH 범위에서 염기성 외부 단백질은 안크로드 용액으로부터 유리 표면에 흡착되고, 안크로드는 평형 완충액 중에서 95% 이상의 순도로 칼럼으로부터 직접 용출될 수 있다. 완충액의 바람직한 이온 강도는 염화나트륨과 같은 염의 첨가에 의해 조절될 수 있다.
본 발명의 신규 방법은 안크로드를 순수한 형태로 제조하는데 특히 적합하고, 상기 정제 방법에 따르면 95% 이상의 순도로 안크로드를 수득할 수 있다.
실시예 1
a. 예비 정제
말레이지아 피트(pit) 살모사의 건조된 독액 3 g을 pH 8.5의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(TRIS)-포스페이트 완충액 50 ml 중에 용해시키고, 독액의 불용성 세포 성분을 원심분리시켜 제거한 후, 황색 용액을 직경이 1.6 cm이고 DEAE-SEPHAROSE-FF (Pharmacia)가 30 cm의 높이로 충전된 크로마토그래피 칼럼에 적용하였다. 독액의 트롬빈 유사 프로테아제 및 산성 특성을 갖는 단백질이 매트릭스에 결합하였다. 크로마토그래피는 150 내지 200 ml/h의 유속에서 수행하였다. 용출액의 A280mm[sic] 값이 0.5 미만으로 떨어질 때까지 칼럼을 실온에서 평형 완충액 (10 mM TRIS-포스페이트 완충액, pH 8.5) 약 300 ml로 세척하고, 용출액의 A280mm[sic] 값이 0.4 미만이 될 때까지 칼럼을 35 mM TRIS-포스페이트 완충액 (pH 6.0) 400 ml로 추가 세척하여 약 70 내지 80%(출발 용액의 280 nm에서의 광학 밀도를 기준으로)의 외부 단백질을 용출시켰다. 안크로드를 함유하는 주 분획을 150 mM TRIS-포스페이트 완충액 (pH 6.0) 150 내지 200 ml 중에 85%의 수율로 용출시켰다.
b) 주 정제
안크로드를 함유하는 용출액을 명목상 분리 한계가 10,000 달톤인 멤브레인에 대한 한외여과에 의해 20 ml까지 농축시킨 후, 100 mM TRIS-포스페이트 완충액 (pH 8.0)을 사용하여 재완충시켰다. 이 용액을 직경이 1.6 cm이고 BIORAN-CPG 유리 (Schott, 세공 직경: 25 - 35 nm, 입자 크기: 30 - 60 ㎛)가 15 cm의 높이로 충전된 칼럼에 적용하였다. 실온에서 칼럼을 250 ml/h의 유속으로 100 mM TRIS-포스페이트 완충액 (pH 8.0) 300 ml로 세척하여 약 60% (280 nm에서 적용된 물질의 광학 밀도를 기준으로)의 외부 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다.
용출을 위해 100 mM TRIS-포스페이트를 사용하여 pH 8.0까지 완충된 0.5 M 염화나트륨 용액을 사용하였다. 용출액은 약 10 ml 분획으로 자동적으로 수거되었다. 트롬빈 유사 효소는 후속 테일링(tailing) 범위를 갖는 1개의 피크로 용출되었다. 트롬빈 유사 2차 성분을 5% 이하로 함유하는 형태로 주성분 (안크로드에 상응함)을 수득하기 위해서, 주피크에서 테일링 범위로의 전환부에서 각각의 분획에 대하여 피브리노게나제 비활성 및 조성을 역상 HPLC에 의해 조사하였다. 비활성이 1700 U/OD280nm보다 크고 HPLC에서의 2차 성분을 10% 미만 함유하는 분획만을 주 피크 (약 80 ml)과 합하였다. BIORAN 칼럼으로부터 주 성분을 96%의 순도 및 72%의 수율로 수득하였다.
c. 미정제
주성분 안크로드를 함유하는 용출액을 YM 10 멤브레인 (Amicon)에 대한 한외여과에 의해 2 ml까지 농축하고, 수득된 농축물을 직경이 1.6 cm이고 SEPHARYL S-100 HR이 85 cm의 높이로 충전된 칼럼에 적용하였다. 100 mM 염화나트륨 및 100 mM 인산나트륨의 완충액 (pH 6.9)을 사용하여 칼럼을 미리 평형화시켰다. 잔류 프로테아제 및 TRIS를 상기 겔 크로마토그래피에 의해 안크로드로부터 분리하였다. 이 단계에서의 수율은 약 90%이었다.
실시예 2
a. 예비 정제
말레이지아 피트 독사의 건조된 독액 2.1 g을 pH 8.5의 35 mM TRIS-포스페이트 완충액 50 ml 중에 용해시키고, 독액의 불용성 세포 성분을 원심분리시켜 제거한 후, 맑은 황색 용액을 직경이 1.6 cm이고 DEAE-SEPHAROSE-FF (Pharmacia)가 30 cm의 높이로 충전된 크로마토그래피 칼럼에 적용하고, 상기 완충액으로 평형화시켰다. 용출액의 A280mm[sic] 값이 0.2 미만일 때까지 칼럼을 실온에서 평형 완충액 600 ml로 세척하여 약 70% (출발 용액의 280 nm에서의 광학 밀도를 기준으로)의 외부 단백질을 용출시켰다. 주 분획물을 150 mM TRIS-포스페이트 완충액 (pH 6.0) 200 내지 250 ml을 사용하여 90 내지 100%의 수율로 용출시켰다.
b) 주 정제
용출액을 실시예 1에서와 같이 20 ml까지 농축시킨 후, 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 재완충시켰다. 이 용액을 BIORAN-CPG 유리 칼럼 (직경 1.6 cm, 높이 15 cm, 세공 직경: 25 - 35 nm, 입자 크기: 30 - 60 ㎛)에 적용하였다. 실온에서 칼럼을 250 ml/h의 유속으로 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 8.5) 300 ml로 세척하여 약 60% (280 nm에서 적용된 물질의 광학 밀도를 기준으로)의 외부 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다.
트롬빈 유사 효소의 용출을 위해, 50 mM 인산나트륨을 사용하여 pH 8.0까지 완충된 1 M 염화나트륨 용액을 사용하였다. 완충액 150 ml을 사용하여 적용된 효소 단위의 약 80%를 용출시켰다.
c. 미정제
용출액을 상기한 바와 같이 20 ml까지 농축하고, 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 5.0)을 사용하여 재완충시켰다. 이 용액을 직경이 1.6 cm이고 BIORAN-CPG 유리(세공 직경: 90 - 110 nm, 입자 크기: 30 - 60 ㎛)가 15 cm의 높이로 충전된 칼럼에 적용하였다. pH 5.0에서, 염기성 단백질 및 2차 성분만이 BIORAN 유리에 결합하고, 주 성분인 안크로드는 평형화 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 약 100%의 순도로서 약 80 - 90%의 수율(적용된 단위를 기준으로)로 용출시켰다.
실시예 3
a, b. 예비 및 주 정제
말레이지아 피트 살모사의 건조된 독액 2.1 g을 실시예 2와 유사한 방법으로 DEAE-SEPHAROSE 상에서 예비분획화시키고, 용출액을 실시예 1과 유사한 방법으로 20 ml까지 농축시킨 후, 40 mM TRIS-포스페이트 완충액 (pH 6.2)을 사용하여 재완충시켰다. 이 용액을 직경이 1.6 cm이고 CM-SEPHAROSE-FF (Pharmacia)가 20 cm의 높이로 충전된 크로마토그래피 칼럼에 적용하고, 상기 완충액으로 평형화시켰다. 실온에서 칼럼을 250 ml/h의 유속으로 평형 완충액 300 ml로 세척하여 약 60% (280 nm에서 적용된 물질의 광학 밀도를 기준으로)의 외부 단백질을 칼럼으로부터 용출시켰다.
트롬빈 유사 효소의 용출을 위해, 실시예 2와 유사하게 50 mM 인산나트륨을 사용하여 pH 8.0까지 완충된 1 M 염화나트륨 용액을 사용하였다. 완충액 150 ml을 사용하여 적용된 트롬빈 유사 효소 단위의 약 80%를 용출시켰다.
c. 미정제
안크로드의 미정제는 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 5.0)을 사용하여 BIORAN-CPG 유리 (세공 직경 약 100 nm, 입자 크기: 30 - 60 ㎛) 상에서 실시예 2와 유사한 방법으로 수행하였다. 안크로드는 칼럼으로부터 95% 이상의 순도로서 약 85%의 수율(적용된 단위를 기준으로)로 용출되었다.
Claims (4)
- a) 친화도 크로마토그래피 또는 염기성 이온 교환기에 대한 크로마토그래피에 의해 프로테아제 조 생성물을 예비 정제하는 단계, b) 단계 a)에서 수득한 트롬빈 유사 효소를 함유하는 분획을 약한 양이온 교환기에 대해 크로마토그래피시키거나 유리에 흡착시켜 염기성 범위 내로 분리하는 단계, 및 c) 단계 b)로부터의 주성분을 겔 크로마토그래피시키거나 또는 유리에 대한 크로마토그래피에 의해 산성 범위 내로 주성분을 정제하는 단계로 이루어지되, 상기 단계 b) 및 c) 중 하나 이상의 단계가 유리에 대한 크로마토그래피에 의한 분리를 포함하는, 뱀 독액으로부터 트롬빈 유사 프로테아제를 정제하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 b)에서의 정제가 유리에 대한 흡착에 의해 수행되고, 단계 c)에서의 정제가 겔 크로마토그래피에 의해 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 b) 및 c)에서의 정제가 유리에 대한 크로마토그래피에 의해 수행되는 것인 방법.
- 순도 95% 이상의 천연 안크로드.
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