HU225489B1 - Method of purifying thrombin-like protease enzymes obtained from snake venom - Google Patents
Method of purifying thrombin-like protease enzymes obtained from snake venom Download PDFInfo
- Publication number
- HU225489B1 HU225489B1 HU9900505A HUP9900505A HU225489B1 HU 225489 B1 HU225489 B1 HU 225489B1 HU 9900505 A HU9900505 A HU 9900505A HU P9900505 A HUP9900505 A HU P9900505A HU 225489 B1 HU225489 B1 HU 225489B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- chromatography
- glass
- thrombin
- purification
- column
- Prior art date
Links
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims description 10
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title claims description 3
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 title description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 18
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 7
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 claims 1
- 238000003989 weak cation exchange chromatography Methods 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 241000271532 Crotalus Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N Agmatine Natural products NCCCCNC(N)=N QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 description 1
- 101000772006 Bombus ignitus Venom serine protease Bi-VSP Proteins 0.000 description 1
- 241000271064 Calloselasma rhodostoma Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P agmatinium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCCC[NH3+] QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 108010086755 crotalase Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
- C12N9/6418—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals from snakes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgyát kígyómérgekből származó trombinszerű proteázok tisztítására szolgáló eljárás képezi.
Ilyen proteázok például a batroxobin, krotaláz és különösen az ankrod. Ez utóbbi véralvadásgátló (antikoaguláns) hatású, amelyet az Agkistrodon rhodostoma nevű kígyó mérgéből állítottak elő (Merck-lndex 1989, Nr. 664). A kígyóméregből történő előállítására eddig már számos eljárást írtak le (GB-PS 1,094,301; GB-PS 1,177,506; GB-PS 1,293,793; US-PS 3,743,722; US-PS 3,879,369; DE-OS 2,428,955; DE-OS 2,734,427 számú szabadalmi iratokban). Ezek az eljárások lényegében kromatográfiás lépéseken alapulnak, és az ankrodot különböző kitermeléssel és különböző tisztasággal eredményezik.
A kígyóméregből mindeddig nem sikerült az ankrodot igen tiszta állapotban előállítani. Minden esetben csupán olyan enzimkeveréket különítettek el, amelynek az arkrod képezte a főkomponensét, amely az előállítási eljárástól függően többé vagy kevésbé szennyezett volt idegen proteinekkel.
Sikerült kidolgoznunk egy olyan eljárást, amely lehetővé teszi, hogy kígyómérgekből trombinszerű proteázokat igen tiszta formában állítsunk elő.
A találmány tárgya eljárás kígyómérgekből trombinszerű proteázok tisztítására, amely abból áll, hogy
a) egy proteáznyersterméket affinitáskromatográfiával vagy bázisos ioncserélőn végzett kromatográfiával előtisztítunk, és
b) az így kapott trombinszerű enzimek frakcióját gyenge kationcserélőn végzett kromatográfiával vagy a bázisos tartományban üvegre történő adszorpcióval elválasztjuk, és
c) a b) tisztítási lépés főkomponensét gélkromatográfiával vagy a savas tartományban üvegen végzett kromatográfiával tisztítjuk, és amely eljárás a b) vagy a c) tisztítási lépések legalább egyikében üvegen végzett adszorpciós vagy kromatográfiás lépést tartalmaz.
A találmány szerinti eljárással kígyómérgekből trombinszerű proteázok 95-100% tisztaságban állíthatók elő.
Célszerű az eljárást úgy végezni, hogy a b) tisztítási lépésben üvegen végzett adszorpciót, a c) lépésben pedig gélkromatográfiát végzünk.
A találmány különösen előnyös kivitelezési módja, ha mind a b), mind pedig a c) tisztítási lépéseket üvegen végzett adszorpcióval, illetve kromatográfiával hajtjuk végre.
Az affinitáskromatográfiával végzett előtisztítás oszloptöltetei közül különösen megfelelő az agmatin-, arginin- és a heparin-Sepharose.
Az előtisztítási lépésben bázisos ioncserélőként különösen alkalmasak a DEAE-cellulóz és a DEAE-Sepharose.
Az ioncserélő kromatográfiában különösen megfelelő pufferoldatok a trisz-foszfát- és a nátrium-foszfátpufferoldat.
Az ioncserélő kromatográfiát 5-9, előnyösen 6-8,5 pH-értékek között végezzük.
Az előtisztítás során a nyers enzimből az idegen proteinek 70-80%-át és egyéb komponenseket is el lehet távolítani.
Amennyiben a tisztítás második lépésében kationcserélőt alkalmazunk, úgy a következő gyenge kationcserélők jönnek számításba: CM-Sepharose, pH-érték 5-9; és AMBERLITE CG50, pH-érték 5-9 közötti.
Az üvegen végzett kromatográfia azt jelenti, hogy az ankrodot és a rokon trombinszerű enzimeket, valamint az erősen bázisos proteázokat 7,5-9,0, előnyösen 8,0-8,5 pH-értékek között üvegmátrixra kötjük. Ekkor a 60%-nyi, elsősorban savas idegen proteinek nem kötődnek meg, és kiegyensúlyozó pufferoldattal (előnyösen trisz-puffer-, illetve nátrium-foszfát-pufferoldattal) az oszlopról lemosódnak. Az ankrodot frakcionált módon 90%-nál nagyobb tisztaságban eluáljuk az üvegről, miközben a puffer ionerősségét konyhasó hozzáadásával 0,3-1,0 M értékűre növeljük.
A második tisztítási lépésben tehát az enzimet 90%-ig terjedő tisztaságúra dúsítjuk.
A c) tisztítási lépésben alkalmazott gélkromatográfia céljára szóba jöhetnek a következő anyagok: SEPHACRIL S-100HR, SUPERDEX, SEPHADEX, ULTROGEL és SUPEROSE.
Amennyiben a c) tisztítási lépésben az üvegen végzett kromatográfia mellett döntünk, úgy a savas 4-6 pH-jú tartományban az ankrodoldat bázikus idegen proteinjei adszorbeálódnak az üvegen, ugyanakkor az ankrodot az oszlopról a kiegyensúlyozó pufferoldattal 95%-ot messze meghaladó tisztaságban közvetlenül lehet eluálni. A pufferoldat ionerősségét só, például konyhasó hozzáadásával lehet szabályozni.
Az új eljárás különösen alkalmas az ankrod tiszta formában történő előállítására, amelyet ezen tisztítási eljárás eredményeként jóval 95% fölötti tisztasággal kapunk.
1. példa
a) Előtisztítás
Malajziai csörgőkígyótól származó 3 g szárított kígyómérget feloldunk 50 ml trisz(hidroxi-metil)-aminometán(trisz)-foszfát-pufferoldatban, amely 8,5 pH-jú, az oldhatatlan sejtalkotórészeket lecentrifugáljuk, majd a tiszta, sárga oldatot 1,6 cm átmérőjű, 30 cm hosszúságú DEAE-SEPHAROSE-FF (Pharmacia cégtől) töltetet tartalmazó oszlopra visszük fel. A méreg trombinszerű enzimjeit, valamint a savas karakterű proteineket a mátrixhoz kötjük. A kromatográfiát 150-200 ml/óra átfolyási sebességgel végezzük. Az oszlopot szobahőmérsékleten körülbelül 300 ml kiegyensúlyozó pufferoldattal (8,5 pH-jú 10 mM TRISZ-foszfát-pufferoldat) mossuk addig, amíg az eluátum 280 nm-nél mért abszorbciójának értéke (A280 nm) θ.5 alá csökken, majd a mosást 400 ml 35 mM TRISZ-foszfát-pufferoldattal folytatjuk (ennek pH-ja 6,0), amíg az eluátum 280 nm-nél mért A-értéke 0,4-nél kisebb lesz; ezalatt az idegen proteinek mintegy 70-80%-a (a kiindulási oldat 280 nm-nél mért optikai sűrűségére vonatkoztatva) eluálódik. Az ankrodot tartalmazó főfrakciót 85%-os kitermeléssel 150-200 ml 150 mM TRISZ-foszfát-pufferoldattal pH 6,0-en eluáljuk.
HU 225 489 Β1
b) Fő tisztítási lépés
Az ankrodot tartalmazó eluátumot egy 10 000 dalton névleges elválasztási hatású membránon át végzett ultraszűréssel 20 ml térfogatra betöményítjük, majd 100 mM TRISZ-foszfát-pufferoldattal, pH-ja 8,0, átpufferoljuk. Az oldatot 1,6 cm átmérőjű, 15 cm magas BIORAN-CGP Glas (Schott cég; pórusátmérő: 25-35 nm; szemcseméret: 30-60 pm) töltetű oszlopra visszük fel. Az oszlopot szobahőmérsékleten 300 ml 100 mM TRISZ-foszfát-pufferoldattal mossuk (pH-ja 8,0), majd az idegen proteinek mintegy 60%-át (a felvitt oldat 280 nm-nél mért optikai sűrűségére vonatkoztatva) 250 ml/óra átfolyási sebességgel az oszlopról eluáljuk.
Az elúciót 100 mM TRISZ-foszfát-pufferoldattal 8,0 pH-értékre pufferolt 0,5 M nátrium-klorid-oldattal végezzük. Az eluátumot automatikusan 10 ml-es frakciókban szedjük. A trombinszerű enzimeket a csúcsot és ahhoz csatlakozó farokszerű tartományokat magukban foglaló frakciókban eluáljuk. Abból a célból, hogy a főkomponenst (amely az ankrodnak felel meg) olyan formában kapjuk meg, amely legfeljebb 5% trombinszerű mellékkomponenst tartalmaz, a főcsúcstól a farokszerű tartományba történő átmenet egyes frakcióit mind azok specifikus fibrinogenázaktivitása, mind pedig azok összetétele szempontjából megvizsgáljuk fordított fázisú HPLC-technikával. Azokat a frakciókat, amelyek specifikus aktivitása az 1700 U/OD280 nm θΓ_ féknél nagyobb, ugyanakkor a HPLC vizsgálat szerint 10%-nál kevesebb mellékkomponenst tartalmaznak, egyesítjük a főfrakcióval (ezek mennyisége mintegy 80 ml). A főkomponenst BIORAN-oszlopon végzett tisztítás után 96% tisztaságban, 72%-os kitermeléssel kapjuk meg.
c) Finomtisztítás
Az ankrod főkomponenst tartalmazó eluátumot YM 10 jelű membránon (Amicon cég terméke) végzett ultraszűréssel 2 ml térfogatra betöményítjük, majd ezt a koncentrátumot 1,6 cm átmérőjű, 85 cm magasságú SEPHARYL S-100 HR töltetű oszlopra visszük fel. Előzőleg az oszlopot 6,9 pH-jú 100 mM nátrium-klorid-oldatból és 100 mM nátrium-foszfát-oldatból álló pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. Ezzel a gélkromatográfiával az ankrodtól elválasztjuk a maradék proteázokat és a TRISZ-t. Ennek a lépésnek a kitermelése mintegy 90%.
2. példa
a) Előtisztítás
A malajziai csörgőkígyótól származó 2,1 g szárított kígyómérget feloldunk 50 ml 8,5 pH-jú 35 mM TRISZ-foszfát-pufferoldatban, az oldhatatlan sejtalkotórészeket lecentrifugáljuk, majd a tiszta, sárga oldatot egy olyan kromatográfiás oszlopra visszük fel, amely 1,6 cm átmérőjű, 30 cm magasságig DEAE-SEPHAROSE-FF töltetet (Pharmacia cég) tartalmaz, és amelyet előzőleg a fent említett pufferoldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot szobahőmérsékleten 600 ml egyensúlyozó pufferoldattal mossuk, amíg a 280 nm-nél mért A-érték (A280 nm) 0,2-nél kisebb lesz, ezáltal az idegen proteinek mintegy 70%-át (a kiindulási oldat 280 nm-nél mért optikai sűrűségéhez viszonyítva) eluáljuk. A főfrakciót 90-100%-os kitermeléssel
200-250 ml 6,0 pH-jú 150 mM TRISZ-foszfát-pufferoldattal eluáljuk.
b) Fő tisztítási lépés
Az eluátumot az 1. példában leírt módon 20 ml térfogatra betöményítjük, majd egy 8,5 pH-jú 50 mM nátrium-foszfát-pufferoldattal átpufferoljuk. Az oldatot 1,6 cm átmérőjű, 15 cm magasságú BIORAN-CPGüvegoszlopra (pórusátmérő: 25-35 nm; szemcseméret: 30-60 pm) visszük fel. Az oszlopot szobahőmérsékleten 300 ml 8,5 pH-jú 50 mM nátrium-foszfát-pufferoldattal mossuk, majd 250 ml/óra átfolyási sebességgel eluáljuk az oszlopról az idegen proteinek mintegy 60%-át (a felvitt oldat 280 nm-nél mért optikai sűrűségére vonatkoztatva).
A trombinszerű enzimek eluálását 50 mM nátriumfoszfát-oldattal pH 8,0-re pufferolt 1 M nátrium-klorid-oldattal végezzük. 150 ml pufferoldattal a felvitt enzimegységek mintegy 80%-át eluáljuk.
c) Finomtisztítás
Az eluátumot a fentebb leírtak szerint 20 ml térfogatra betöményítjük, majd 5,0 pH-jú 50 mM nátrium-foszfát-pufferoldattal átpufferoljuk. Ezt az oldatot felvisszük egy 1,6 cm átmérőjű, 15 cm magasságig BIORAN-CPG-üveggel töltött oszlopra; a töltet pórusátmérője 90-110 nm, szemcsemérete 30-60 pm. 5,0 pH-nál csak a bázisos proteinek és a mellékkomponensek kötődnek a BIORAN-üvegtöltethez, míg az ankrod főkomponens a kiegyensúlyozó pufferoldattal közel 100%-os tisztaságban és mintegy 80-90%-os kitermeléssel (a felvitt egységekre vonatkoztatva) eluálható az oszlopról.
3. példa
a), b) Elő- és fő tisztítási lépések
A malajziai csörgőkígyótól származó 2,1 g szárított kígyómérget a 2. példában leírtakkal analóg módon előfrakcionálunk DEAE-SEPHAROSE oszlopon, majd az eluátumot az 1. példában leírtakkal analóg módon 20 ml térfogatra betöményítjük, végül 6,2 pH-jú 40 mM TRISZ-foszfát-pufferoldattal átpufferoljuk. Ezt az oldatot azután felvisszük egy olyan kromatográfiás oszlopra, amelynek átmérője 1,6 cm, és mintegy 20 cm magasságig fel van töltve CM-SEPHAROSE-FF (Pharmacia cég) töltettel, és amelyet előzőleg a fenti pufferoldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot szobahőmérsékleten 300 ml egyensúlyozó pufferoldattal mossuk, majd 250 ml/óra átfolyási sebességgel az idegen proteinek mintegy 60%-át (a felvitt oldat 280 nm-nél mért optikai sűrűségére vonatkoztatva) eluáljuk az oszlopról.
A trombinszerű enzimeket a 2. példában leírtakkal analóg módon, 50 mM nátrium-foszfát-pufferoldattal 8,0 pH-ra átpufferolt 1 M nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. 150 ml pufferoldattal a felvitt trombinszerű enzimegységek mintegy 80%-át tudjuk eluálni.
c) Finomtisztítás
Az ankrod finomtisztítását a 2. példában leírtakkal analóg módon végezzük BIORAN-CPG-üveg töltetű (pórusátmérő: körülbelül 100 nm; szemcseméret: 30-60 pm) oszlopon 5,0 pH-jú 50 mM foszfátpufferol3
HU 225 489 Β1 dattal. Az ankrodot 95%-ot meghaladó tisztaságban és a felvitt egységekre vonatkoztatott mintegy 85%-os kitermeléssel eluáljuk az oszlopról.
Claims (3)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás trombinszerű proteázok tisztítására kígyómérgekből, azzal jellemezve, hogya) egy proteáznyersterméket affinitáskromatográfia vagy egy bázisos ioncserélőn végzett kromatográfia segítségével előtisztítunk,b) az így kapott, trombinszerű enzimeket tartalmazó frakciót gyenge kationcserélőn végzett kromatográfiával vagy bázisos körülmények között, üvegen végzett adszorpcióval elválasztjuk,c) a b) lépésből származó főkomponenst gélkromatográfiával vagy savas körülmények között, üvegen5 végzett kromatográfiával tisztítjuk, ahol a b) és c) lépések közül legalább az egyikben az elválasztást üvegen végzett kromatográfiával hajtjuk végre.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,10 hogy a tisztítás a b) lépésben üvegen végzett adszorpcióval és a c) lépésben gélkromatográfiával történik.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítás a b) és c) lépésekben üvegen végzett kromatográfiával történik.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19607210A DE19607210A1 (de) | 1996-02-26 | 1996-02-26 | Verfahren zur Reinigung von thrombinähnlichen Proteasen aus Schlangengiften |
| PCT/EP1997/000755 WO1997032015A1 (de) | 1996-02-26 | 1997-02-18 | Verfahren zur reinigung von thrombinähnlichen proteasen aus schlangengiften |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9900505A2 HUP9900505A2 (hu) | 1999-06-28 |
| HUP9900505A3 HUP9900505A3 (en) | 2001-03-28 |
| HU225489B1 true HU225489B1 (en) | 2006-12-28 |
Family
ID=7786490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9900505A HU225489B1 (en) | 1996-02-26 | 1997-02-18 | Method of purifying thrombin-like protease enzymes obtained from snake venom |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6200791B1 (hu) |
| EP (1) | EP0883684B1 (hu) |
| JP (1) | JP3817269B2 (hu) |
| KR (1) | KR100493835B1 (hu) |
| CN (1) | CN1188517C (hu) |
| AR (1) | AR005995A1 (hu) |
| AT (1) | ATE283350T1 (hu) |
| AU (1) | AU711650B2 (hu) |
| BG (1) | BG64875B1 (hu) |
| BR (1) | BR9707738A (hu) |
| CO (1) | CO4771158A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ292482B6 (hu) |
| DE (2) | DE19607210A1 (hu) |
| ES (1) | ES2233997T3 (hu) |
| HK (1) | HK1017380A1 (hu) |
| HR (1) | HRP970108B1 (hu) |
| HU (1) | HU225489B1 (hu) |
| ID (1) | ID16046A (hu) |
| IL (1) | IL125395A (hu) |
| MX (1) | MX9806304A (hu) |
| MY (1) | MY130458A (hu) |
| NO (1) | NO319561B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ331120A (hu) |
| PL (1) | PL186211B1 (hu) |
| PT (1) | PT883684E (hu) |
| RU (1) | RU2186849C2 (hu) |
| SK (1) | SK284874B6 (hu) |
| TR (1) | TR199801668T2 (hu) |
| TW (1) | TW505696B (hu) |
| UA (1) | UA46831C2 (hu) |
| WO (1) | WO1997032015A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA971597B (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1102173C (zh) * | 1999-03-26 | 2003-02-26 | 福建医科大学 | 蕲蛇酶及其生产工艺 |
| US20030219431A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-11-27 | Empire Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of neuronal and neurological damage associated with spinal cord injury |
| EP2043767B1 (en) | 2006-07-14 | 2020-03-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Adsorptive membranes for trapping viruses |
| CN103160486A (zh) * | 2013-04-02 | 2013-06-19 | 黑龙江迪龙制药有限公司 | 一种猪凝血酶的制备方法 |
| CN109929020A (zh) * | 2017-12-15 | 2019-06-25 | 浙江京新药业股份有限公司 | 一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品 |
| CN108559740B (zh) * | 2018-05-12 | 2021-05-18 | 吉林天衡康泰生物技术有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备方法和治疗急性脑梗的应用 |
| CN109652398B (zh) * | 2018-12-29 | 2021-07-20 | 上海太阳生物技术有限公司 | 凝血因子ⅹ激活剂rvv-ⅹ的制备方法及制得的rvv-ⅹ |
| CN110016471B (zh) * | 2019-04-10 | 2020-10-02 | 北京博康宁生物医药科技有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备和纯化方法及其组合物 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1094301A (en) * | 1964-02-21 | 1967-12-06 | Nat Res Dev | Improvements relating to anticoagulants |
| GB1177506A (en) * | 1964-02-21 | 1970-01-14 | Nat Res Dev | Improvements relating to Anticoagulants. |
| GB1293793A (en) | 1969-04-28 | 1972-10-25 | Chrysler United Kingdom Ltd Fo | Improvements in or relating to valves |
| US3743722A (en) * | 1971-07-14 | 1973-07-03 | Abbott Lab | Anti-coagulant isolation |
| US3879369A (en) | 1972-05-12 | 1975-04-22 | Abbott Lab | Anti-coagulant isolation from malayan pit viper using affinity chromatography |
| GB1472574A (en) | 1973-09-03 | 1977-05-04 | Biochimici Fargal Pharmasint S | Process for the extraction of components having anticoagulant activity -in vivo- from snake venoms and related products |
| NL7605805A (nl) * | 1976-05-28 | 1977-11-30 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| CH626917A5 (hu) | 1976-08-17 | 1981-12-15 | Pentapharm Ag | |
| JPS5569595A (en) * | 1978-11-20 | 1980-05-26 | Suguru Abe | Novel substance having fibrinolytic activity, remedy for thrombotic embolic disease comprising it, and its preparation |
| EP0328256A1 (en) * | 1988-01-21 | 1989-08-16 | Owens-Corning Fiberglas Corporation | Glass fibers coated with agarose for use as column packing or chromatographic media for bioseparations |
| US5712117A (en) * | 1995-02-08 | 1998-01-27 | Zymogenetics, Inc. | Cytoplasmic antiproteinase-2 and coding sequences |
-
1996
- 1996-02-26 DE DE19607210A patent/DE19607210A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-02-18 AT AT97903312T patent/ATE283350T1/de active
- 1997-02-18 NZ NZ331120A patent/NZ331120A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 EP EP97903312A patent/EP0883684B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 SK SK1132-98A patent/SK284874B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 TR TR1998/01668T patent/TR199801668T2/xx unknown
- 1997-02-18 AU AU17913/97A patent/AU711650B2/en not_active Ceased
- 1997-02-18 DE DE59712093T patent/DE59712093D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 UA UA98094992A patent/UA46831C2/uk unknown
- 1997-02-18 MX MX9806304A patent/MX9806304A/es unknown
- 1997-02-18 KR KR10-1998-0706648A patent/KR100493835B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 US US09/125,374 patent/US6200791B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 PL PL97328568A patent/PL186211B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 ES ES97903312T patent/ES2233997T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 JP JP53055397A patent/JP3817269B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 HU HU9900505A patent/HU225489B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 IL IL12539597A patent/IL125395A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 WO PCT/EP1997/000755 patent/WO1997032015A1/de active IP Right Grant
- 1997-02-18 CN CNB971925852A patent/CN1188517C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-18 RU RU98117870/13A patent/RU2186849C2/ru active
- 1997-02-18 PT PT97903312T patent/PT883684E/pt unknown
- 1997-02-18 CZ CZ19982697A patent/CZ292482B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-18 BR BR9707738A patent/BR9707738A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-21 TW TW086102111A patent/TW505696B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 ID IDP970561A patent/ID16046A/id unknown
- 1997-02-24 MY MYPI97000700A patent/MY130458A/en unknown
- 1997-02-25 AR ARP970100755A patent/AR005995A1/es active IP Right Grant
- 1997-02-25 ZA ZA971597A patent/ZA971597B/xx unknown
- 1997-02-25 CO CO97010013A patent/CO4771158A1/es unknown
- 1997-02-26 HR HR970108A patent/HRP970108B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-07-31 BG BG102663A patent/BG64875B1/bg unknown
- 1998-08-25 NO NO19983893A patent/NO319561B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-06-10 HK HK99102524A patent/HK1017380A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4748156A (en) | Thrombin-binding substance and process for preparing the same | |
| JPS6253147B2 (hu) | ||
| US3743722A (en) | Anti-coagulant isolation | |
| HU225489B1 (en) | Method of purifying thrombin-like protease enzymes obtained from snake venom | |
| US4259447A (en) | Process for the production of urokinase in pure condition | |
| US3879369A (en) | Anti-coagulant isolation from malayan pit viper using affinity chromatography | |
| US4137127A (en) | Process for the preparation of thrombin-like enzymes from snake venoms | |
| US5445958A (en) | Process for purifying blood clotting factors | |
| CA2247016C (en) | Purification of thrombin-like proteases from snake venoms | |
| US4027012A (en) | Process for the extraction of components having anticoagulant activity "in vivo" from snake venoms and products obtained | |
| US3711376A (en) | Coagulants | |
| US3819605A (en) | Anticoagulant isolation from pit viper using a modified agarose bed and eluting with a benzamidine solution | |
| CN109652398B (zh) | 凝血因子ⅹ激活剂rvv-ⅹ的制备方法及制得的rvv-ⅹ | |
| US4308204A (en) | Process for preparing the third component of the complement from human blood plasma | |
| Mitra et al. | Application of immobilized heparins for isolation of human antithrombin III | |
| US4729957A (en) | Process for manufacture of L-asparaginase from erwinia chrysanthemi | |
| EP0358274B1 (en) | Method for purifying tissue plasminogen activator | |
| EP0226473A2 (en) | Process for manufacture of L-asparaginase from erwinia carotovora | |
| KR960005729B1 (ko) | 안티트롬빈-iii의 제조방법 | |
| JPH0219400A (ja) | トロンビンまたはプロトロンビンの製造方法 | |
| JPS597694B2 (ja) | 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法 | |
| Jacques et al. | Purification and Characterization of a β-lactam-Resistant Penicillin-Binding Protein from Enterococcus hirae (Streptococcus faecium) | |
| JPH11287792A (ja) | インターロイキン６レセプターの精製法 | |
| HU188729B (en) | Process for increasing the stereoselectivity of the attachment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FH91 | Appointment of a representative |
Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): S.B.G. & K. BUDAPEST NEMZETKOEZI SZABADALMI IRODA, HU Representative=s name: DR.LANG TIVADARNE S.B.G.& K.SZABADALMI UEGYVIV, HU |
|
| FH92 | Termination of representative |
Representative=s name: S.B.G. & K. BUDAPEST NEMZETKOEZI SZABADALMI IR, HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |