ES2233997T3 - Procedimiento para la purificacion de proteasas similares a la trombina procedentes de venenos de serpientes. - Google Patents
Procedimiento para la purificacion de proteasas similares a la trombina procedentes de venenos de serpientes.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN METODO DE PURIFICACION DE PROTEASAS SIMILARES A LA TROMBINA DE VENENOS DE SERPIENTE QUE CONSISTE EN QUE LAS PROTEASAS SE LIBERAN DE IMPUREZAS EN TRES PASOS CROMATOGRAFICOS.
Description
Procedimiento para la purificación de proteasas
similares a la trombina procedentes de venenos de serpientes.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación de proteasas similares a la
trombina procedentes de venenos de serpiente.
Ejemplos de tales proteasas son batroxobina,
crotalasa y especialmente ancrod. Esta última es un anticoagulante,
que se aísla a partir del veneno de la serpiente Agkistrodon
rhodostoma (Índice Merck, 1989, nº 664). Para su producción a
partir de veneno de serpientes, se han descrito ya una variedad de
métodos (patente de GB 1.094.301, patente de GB 1.177.506, patente
de GB 1.293.793, patente de los EE.UU. 3.743.722, patente de los
EE.UU. 3.879.369, publicación para información de solicitud de
patente alemana 2.428.955, publicación para información de solicitud
de patente alemana 2.734.427). Estos procedimientos se basan
esencialmente en etapas cromatográficas y proporcionan el ancrod con
diferentes rendimientos y pureza.
Hasta el momento no se ha conseguido la
producción de ancrod sumamente puro a partir de veneno de serpiente.
Siempre se ha aislado una mezcla de enzimas con ancrod como
componente principal, que estaba contaminado con más o menos
proteínas extrañas según la producción.
Ahora se ha encontrado una vía para producir
proteasas similares a la trombina a partir de venenos de serpiente
en forma sumamente pura.
Es objeto de la invención un procedimiento para
la purificación de proteasas similares a la trombina procedentes de
venenos de serpientes, que se basa en que
- a.
- se somete un producto bruto de proteasa a una purificación previa mediante cromatografía de afinidad o cromatografía con un intercambiador de iones básico,
- b.
- se somete la fracción con las enzimas similares a la trombina así obtenida a una cromatografía con un intercambiador de cationes débil o se separa mediante adsorción sobre vidrio en el intervalo básico y
- c.
- se somete el componente principal de la etapa b a una cromatografía en gel o se purifica mediante cromatografía en vidrio en el intervalo ácido,
en el que sin embargo al menos una
de las etapas b y c comprende una separación mediante adsorción o
cromatografía en
vidrio.
Para la etapa b, se aconseja llevar a cabo la
purificación mediante adsorción en vidrio y para la etapa c, con
ayuda de cromatografía en gel.
En una forma de realización especialmente
preferida de la invención, tanto en la etapa b como en la etapa c se
purifica mediante adsorción o cromatografía en vidrio.
Para la purificación previa mediante
cromatografía de afinidad, son adecuadas especialmente agmatina,
arginina o heparina-sefarosa.
Como intercambiadores de iones básicos son
adecuados para la purificación previa especialmente
DEAE-celulosa y DEAE-sefarosa.
Para la cromatografía de intercambio iónico,
deben mencionarse como tampón especialmente tampón
Tris-fosfato y fosfato de sodio.
La cromatografía de intercambio iónico se lleva a
cabo a un valor de pH de 5-9, preferiblemente de
6-8,5.
En la purificación previa, se separa
aproximadamente el 70-80% de proteínas extrañas y
otros componentes de la enzima bruta.
Si se lleva a cabo la segunda etapa (b) de la
purificación con un intercambiador de cationes, entonces se
consideran los siguientes intercambiadores débilmente ácidos:
CM-SEPHAROSE, valor de pH 5-9 y
AMBERLITE CG50, pH
5-9.
5-9.
Cromatografía en vidrio significa que se unen el
ancrod y las enzimas similares a la trombina emparentadas, así como
proteasas fuertemente básicas para valores de pH de
7,5-9,0, preferiblemente 8,0-8,5 a
la matriz de vidrio. Aproximadamente el 60% de proteínas extrañas,
sobre todo ácidas, salen de la columna no unidas mediante lavado con
el tampón de equilibrio (preferiblemente tampón
Tris-fosfato o fosfato de sodio). El ancrod se eluye
del vidrio de manera fraccionada en una pureza superior al 90%,
mientras se aumenta la fuerza iónica del tampón a
0,3-1,0 M mediante la adición de sal común.
En la segunda etapa de purificación (b) se
concentra la enzima hasta aproximadamente el 90%.
Para la cromatografía en gel, como etapa de
purificación c se consideran especialmente: SEPHACRYL
S-100HR, SUPERDEX, SEPHADEX,
ULTRO-GEL y SUPEROSE.
Si para esta etapa de purificación c se elige la
cromatografía en vidrio, entonces se adsorben proteínas extrañas
básicas de la solución de ancrod en el intervalo de pH ácido de
4-6 en la superficie de vidrio, mientras que el
ancrod puede eluirse de la columna con una pureza muy superior al
95% directamente en el tampón de equilibrio. La fuerza iónica
deseada del tampón puede regularse mediante la adición de una sal,
tal como sal común.
El nuevo procedimiento es adecuado muy
especialmente para la obtención en estado puro de ancrod, que se
produce tras este procedimiento de purificación en una pureza
considerablemente superior al 95%.
Se disolvieron 3 g de veneno seco de serpiente
mocasín de Malasia en 50 ml de tampón
Tris-(hidroximetil)-aminometano
(TRIS)-fosfato, pH 8,5, se eliminaron mediante
centrifugación los componentes celulares insolubles del veneno y la
solución clara, amarilla se aplicó sobre una columna de
cromatografía que presentaba un diámetro de 1,6 cm y que se llenó
hasta una altura de 30 cm con
DEAE-SEPHAROSE-FF (empresa
Pharmacia). Las enzimas similares a la trombina del veneno, así como
las proteínas con carácter ácido se unieron a la matriz. Se llevó a
cabo la cromatografía con una velocidad de flujo de
150-200 ml/h. Mediante lavado de la columna a
temperatura ambiente con aproximadamente 300 ml de tampón de
equilibrio (tampón TRIS-fosfato 10 mM, pH 8,5) hasta
que el valor A_{280mm} del eluato descendió por debajo de 0,5 y
lavado adicional con 400 ml de tampón TRIS-fosfato
35 mM, pH 6,0 hasta que el valor A_{280mm} del eluato era <
0,4, se eluyó aproximadamente el 70-80% de las
proteínas extrañas (referido a la densidad óptica de la solución de
partida a 280 nm). La fracción principal con ancrod se eluyó con un
rendimiento del 85% en 150-200 ml de tampón
TRIS-fosfato 150 mM, pH 6,0.
El eluato que contenía el ancrod se concentró
hasta 20 ml mediante ultrafiltración en una membrana con un límite
de separación nominal de 10.000 Dalton y se tamponó con un tampón
TRIS-fosfato 100 mM, pH 8,0. Esta solución se aplicó
sobre una columna que tenía un diámetro de 1,6 cm y que se llenó
hasta una altura de 15 cm con vidrio BIORAN-CPG
(empresa Schott, diámetro de poro: 25-35 nm, tamaño
de grano: 30-60 \mum). Mediante lavado de la
columna a temperatura ambiente con 300 ml del tampón
TRIS-fosfato 100 mM, pH 8,0 y con una velocidad de
flujo de 250 ml por hora, se eluyó de la columna aproximadamente el
60% de las proteínas extrañas (referido a la densidad óptica de la
capa a 280 nm).
Para la elución, se utilizó una solución de
cloruro de sodio 0,5 M que se tamponó con
TRIS-fosfato 100 mM hasta un valor de pH de 8,0. El
eluato se recogió automáticamente en fracciones de aproximadamente
10 ml. Las enzimas similares a la trombina se eluyeron en un pico
con zona de colas adyacente. Para obtener el componente principal
(correspondiente a ancrod) en una forma que contenga como máximo el
5% de componentes secundarios similares a la trombina, se
investigaron las fracciones individuales para determinar tanto su
actividad fibrinogenasa específica como también su composición
mediante HPLC de fase invertida durante la transición del pico
principal a la zona de colas. Se unieron al pico principal sólo las
fracciones que poseían una actividad específica superior a 1700
U/DO_{280nm} y que presentaron menos del 10% de componentes
secundarios en la HPLC (aproximadamente 80 ml). Se obtuvo el
componente principal con una pureza del 96% y un rendimiento del 72%
de la columna de BIORAN.
Se concentró hasta 2 ml el eluato con el
componente principal ancrod mediante ultrafiltración en una membrana
YM 10 (empresa Amicon) y el concentrado obtenido se aplicó sobre una
columna que tenía un diámetro de 1,6 cm y que se llenó hasta una
altura de 85 cm con SEPHARYL S-100 HR. La columna se
equilibró anteriormente con un tampón de cloruro de sodio 100 mM y
fosfato de sodio 100 mM, que presentaba un valor de pH de 6,9. Con
esta cromatografía en gel se separaron las proteasas restantes, así
como TRIS de ancrod. El rendimiento para esta etapa fue de
aproximadamente el 90%.
Se disolvieron 2,1 g de veneno seco de serpiente
mocasín de Malasia en 50 ml de tampón TRIS-fosfato
35 mM, pH 8,5, se eliminaron mediante centrifugación los componentes
celulares insolubles del veneno y la solución clara, amarilla se
aplicó sobre una columna de cromatografía que presentaba un diámetro
de 1,6 cm, que se llenó hasta una altura de 30 cm con
DEAE-SEPHAROSE-FF (empresa
Pharmacia) y se equilibró con el tampón anteriormente mencionado.
Mediante lavado de la columna a temperatura ambiente con 600 ml de
tampón de equilibrio hasta que el valor A_{280} del eluato era
< 0,2, se eluyó aproximadamente el 70% de las proteínas extrañas
(referido a la densidad óptica de la solución de partida a 280 nm).
La fracción principal se eluyó con un rendimiento del
90-100% con 200-250 ml de tampón
TRIS-fosfato 150 mM, pH 6,0.
El eluato se concentró como en el ejemplo 1 hasta
20 ml y se tamponó con un tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 8,5.
Esta solución se aplicó sobre la columna de vidrio
BIORAN-CPG (diámetro: 1,6 cm, altura: 15 cm,
diámetro de poro: 25-35 nm, tamaño de grano:
30-60 \mum). Mediante lavado de la columna a
temperatura ambiente con 300 ml del tampón fosfato de sodio 50 mM,
pH 8,5 y con una velocidad de flujo de 250 ml por hora, se eluyó de
la columna aproximadamente el 60% de las proteínas extrañas
(referido a la densidad óptica de la capa a 280 nm).
Para la elución de las enzimas similares a la
trombina se utilizó una solución de cloruro de sodio 1 M que se
había tamponado con fosfato de sodio 50 mM hasta un valor de pH de
8,0. Se eluyó aproximadamente el 80% de las unidades de enzima
aplicadas con 150 ml de tampón.
El eluato se concentró como anteriormente hasta
20 ml y se tamponó con un tampón fosfato de sodio 50 mM que
presentaba un valor de pH de 5,0. Esta solución se aplicó sobre una
columna que también tenía un diámetro de 1,6 cm y que se llenó hasta
una altura de 15 cm con vidrio BIORAN-CPG, que
poseía sin embargo un diámetro de poro de 90-110 nm
y un tamaño de grano de 30-60 \mum. A pH 5,0, se
unieron sólo las proteínas básicas, así como los componentes
secundarios al vidrio BIORAN, mientras que se eluyó de la columna el
componente principal ancrod con el tampón de equilibrio en una
pureza de casi el 100% y con aproximadamente un rendimiento del
80-90% (referido a las unidades aplicadas).
Se fraccionaron previamente 2,1 g de veneno seco
de serpiente mocasín de Malasia de manera análoga al ejemplo 2 en
DEAE-SEPHAROSE, se concentró el eluato de manera
análoga al ejemplo 1 hasta 20 ml y se tamponó con un tampón
TRIS-fosfato 40 mM, pH 6,2. Esta solución se aplicó
sobre una columna de cromatografía, que presentaba un diámetro de
1,6 cm, que se llenó hasta una altura de 20 cm con
CM-SEPHAROSE-FF (empresa Pharmacia)
y que se equilibró con el tampón anteriormente mencionado. Mediante
lavado de la columna a temperatura ambiente con 300 ml del tampón de
equilibrio y con una velocidad de flujo de 250 ml/h, se eluyó de la
columna aproximadamente el 60% de las proteínas extrañas (referido a
la densidad óptica de la capa a 280 nm).
Para la elución de las enzimas similares a la
trombina se utilizó, de manera análoga al ejemplo 2, una solución de
cloruro de sodio 1 M que se había tamponado con fosfato de sodio 50
mM hasta un valor de pH de 8,0. Se eluyó aproximadamente el 80% de
las unidades de las enzimas similares a la trombina aplicadas con
150 ml de tampón.
La purificación fina de ancrod se llevó a cabo de
manera análoga al ejemplo 2 en vidrio BIORAN-CPG
(diámetro de poro de aproximadamente 100 nm; tamaño de grano:
30-60 \mum) con un tampón fosfato 50 mM, pH 5,0.
Se eluyó el ancrod de la columna en una pureza superior al 95% y con
un rendimiento de aproximadamente el 85% (referido a las unidades
aplicadas).
Claims (3)
1. Procedimiento para la purificación de
proteasas similares a la trombina procedentes de venenos de
serpientes, caracterizado porque
- a.
- se somete un producto bruto de proteasa a una purificación previa mediante cromatografía de afinidad o cromatografía con un intercambiador de iones básico,
- b.
- se somete la fracción con las enzimas similares a la trombina así obtenida a una cromatografía con un intercambiador de cationes débil o se separa mediante adsorción en vidrio en el intervalo básico y
- c.
- se somete el componente principal de la etapa b a una cromatografía en gel o se purifica mediante cromatografía en vidrio en el intervalo ácido,
en el que sin embargo al menos una
de las etapas b y c comprende una separación mediante cromatografía
en
vidrio.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la purificación tiene lugar mediante
adsorción en vidrio en la etapa b y la etapa c se lleva a cabo
mediante cromatografía en gel.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizada porque la purificación tiene lugar en las
etapas b y c mediante cromatografía en vidrio.
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