KR19990066331A

KR19990066331A - 패랭이 rip 유전자를 이용한 웅성불임 식물의 생산

Info

Publication number: KR19990066331A
Application number: KR1019980002178A
Authority: KR
Inventors: 김병동; 조화진
Original assignee: 김병동
Priority date: 1998-01-24
Filing date: 1998-01-24
Publication date: 1999-08-16
Also published as: KR100271097B1

Abstract

본 발명은 패랭이(Dianthus Sinensis L.)로부터 리보솜 불활성 단백질(RIP) 유전자를 분리 동정하고 이를 이용하여 웅성불임 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 패랭이의 RIP 유전자를 플라스미드 벡터에 도입하여 수정된 pTA29-3'ΔDsRIP(pMTA2913) 유전자로부터 담배에서 웅성 불임 식물을 발현하므로서 웅성불임 식물 생산에 유용한 정보를 제공한다.

Description

패랭이 ＲＩＰ 유전자를 이용한 웅성불임 식물의 생산

본 발명은 패랭이(Dianthus sinensis L.)로부터 리보솜-불활성 단백질(RIP) 유전자를 분리 동정하고 이를 이용하여 웅성불임 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

리보솜-불활성 단백질은 처음에 Ricinus communis 와 Abrus precatorius의 종자로부터 분리된 독소, ricin, arbin으로 알려졌다. 1887에 dixon은 처음으로 castor beans의 주된 독성이 단백질이라는 것을 의심하였다. 그후 Stillmark는 ricin 이라고 이름을 붙인 단백질을 정제하였고, 그 독성을 agglutinating erythrocytes의 성질 때문이라 하였다 (Barbieri et al., 1993). 1960년대 후반에 Lin 등(1970)은 이러한 독소는 보통에서보다 암세포에 대해 더 독성을 나타낸다고 보고하였다. 이러한 보고후에, RIP의 이중 사슬구조를 정의하는 많은 작업들이 있었고, 단백질 합성에 대한 저해활성을 명확히 하였다. 정의된 typeⅠ RIP의 첫 번째 단일 사슬은 미국자리공 항바이러스성의 단백질(PAP)이었다. 이것은 TMV의 감염 전달을 막는 PHYTOLACCA americana 잎 추출물의 주된 활성제로서 분리되었고(Wyatt et al., 1969; Obrig et al., 1973), eukaryotic 단백질 합성을 저해하는 spring 잎으로부터 정제되었다 (Irvin, 1975). Endo와 Tsurugi (1987)는 이러한 단백질의 RNA N-glycosidase 활성을 발견함으로써 RIP의 활성 메카니즘을 명확히 하였다.

리보솜-불활성 단백질은 널리 분포하는 것으로, 식물계에서 어쩌면 편재하는 것처럼 보인다. 다양한 RIP는 17족을 덮는 약 50종의 식물들로부터 묘사되었다. (Caryophyllaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Liliaceae, Phytolaccaceae, Gramineae, Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Portulacaceae, Asparagaceae, Nyctaginaceae, Fabaceae, Viscaceae, Passifloraceae, Caprifoliaceae, Leguminoseae, Loranthaceae). 몇몇 족들은 Caryophyllales보다 우선하는 족과 Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Poaceae같은 많은 RIP-생산종을 포함한다. 생태학적으로 RIP-생산 식물들은 종류가 다르며, 잡초류나, 열대 나무들, 봄의 일년생 식물, 사막 선인장류 그리고 특정 기생물들에서 발견된다. RIP는 배유, 신선한 열매, 뿌리, 잎, 껍질, 유액을 포함하는 대부분의 식물 세포와 조직에서 검출되었다. RIP는 동정되고 monocotyledonae와 dicotyledonae로부터 정제되었다. 번역 단백질 저해 활성은 monocotyledonae에 속하는 테스트된 52종으로부터 18종이 검출되었다. 그리고, 시험된 292 dicotyledonae로부터 122종이 검출되었다(Grasso and Shepherd, 1978; Gasperi-Campani et al., 1985; Stripe and Barbieri, 1986; Barbieri et al., 1993;).

이제까지 정제된 RIP의 대부분은 하나의 사슬 typeⅠ RIP과 유사하나, 서로 동일하지는 않으며 동식물의 다른 부분에서 발견되었다. 그래서, 한가지 typeⅠ RIP보다 더 많이 증명되었고, Phytolacca americana(Irvin, 1975; Irvin et al., 1980; Barbieri et al., 1982; Houston et al., 1983)와 Saponaria officinalis (Stripe et al., 1981; Fabbrini et al., 1997)의 잎과 뿌리, 종자로부터 정제되었다. RIP를 포함하고 있는 대부분의 종은 Sambucus ebulus (dwarf elder)를 제외한 type l 또는 typeⅡ의 type RIP를 가진다. 흥미롭게도 dwarf elder의 잎은 typeⅠ와 typeⅡ RIP를 동시에 생산한다(Benito et al., 1995).

RIP은 잎, 뿌리, 열매 그리고 종자를 포함하는 모든 식물조직에서 발견된다. 그리고 다른 유기체들은 같은 식물체에서 RIP를 생산한다 (Gasperi-Campani et al., 1985; Barbieri et al., 1993). Dianthus caryophyllus로부터 분리된 Dianthin 30은 씨를 포함하는 식물을 통해서 발견되었다. 그러나 dianthin 32는 단지 잎과 성장하고 있는 어린가지에서만 발견되었다. Dianthins은 어린 잎에서보다 1~3%의 추출이 가능한 단백질을 나타내는 오래된 잎에서 훨씬 농도가 높다(Reisbig and Bruland, 1983). RIP는 렉틴 활성을 가진 B-chain과 폴리펩타이드 사슬의 존재 또는 부재에 의존하는 두 개의 분류로 나뉠수 있다. 단일 사슬 폴리펩티드로 구성되어 있는 type l은 typeⅡ RIP보다 다양하고 그들의 대부분은 glycoprotein이다. 이중-사슬 typeⅡ RIP은 분자 질량이 대략 60,000 or 120,000인 둘 또는 네 개의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있다. 그 사슬중 하나가 RNA N-glycosidase 활성을 가진 A 사슬(촉매의 영역)이고 하나는 갈락토오스 특정 결합 활성을 가진 B 사슬(세포 결합 영역)이다. TypeⅡ RIP는 세포와 표면 galactosides간의 상호작용에 의해 세포와 결합한다. 그리고 다음에 나오는 internalization과 cytosol로의 A 사슬의 전달은 세포의 죽음을 야기한다. 왜냐하면, 그 세포는 결합되어 있고, 갈락토오스-특정 렉틴 영역의 활성을 허락하기 때문이고 typeⅡ RIP는 손상되지 않은 세포에 대해서 typeⅠ보다 훨씬더 독성이 강하기 때문이다.

세포 파괴의 유전자의 발현을 조절하기 위한 조직-특정 프로모터를 사용하는 유전자의 제거는 특정한 세포를 죽이는데 효과적인 기술이다. 제거 기술은 번식력과 질병저항의 조절에 대한 것과 같은 보다 응용된 조사 (Goldman et al., 1994; Strittmatter et al., 1995)에 대해서와 마찬가지로 세포 상호 작용에 대하여 세포를 조사하는데 도움이 된다(Day et al., 1995). 세포 파괴 유전자는 세포내에서 발현되었을 때 세포의 죽음을 야기할 수 있는 단백질을 암호화 한다. 많은 다양한 단백질들이 세포의 죽음을 야기할 수 있고, 몇몇은 diphtheria toxin A (DTA), exotoxin A, RNase T1 그리고 barnase를 포함하는 식물과 동물내에서 유전자의 제거에 사용된다. DTA와 exotoxin A 모두 NAD⁺-dependent ADP-ribosylation of elongation factor-2를 야기하고 번역을 저해한다. Ricin A toxin 또한 28S ribosomal RNA의 depurination을 촉매화함으로써 단백질 합성을 저해한다. Barnase와 RNase T₁은 RNase 활성을 가지고 있고 세포내에서 RNA의 퇴화에 의해서 단백질 합성을 방해한다(Day and Irish, 1997). 동물들에서, ricin A는 유전자의 제거에 사용되는 유력한 독소이다(Moffat et al., 1992) 그러나 식물세포내에서 독성효과를 가진다는 것이 증명되지 않았다(Day and Irish, 1997). Ricin A 사슬은 temperature-sensitive 그리고 cold-sensitive 돌연변이를 생산하기 위해 이스트에서 돌연변이 된다. 하나의 cold-sensitive 돌연변이는 눈-특정 sev enhancer의 조절하에서 발현될 때 Drosophila내 눈 세포의 temperature-dependent 제거를 생산한다(Moffat et al., 1992). 효율적인 유전자 제거에 대하여, cytotoxic 유전자의 공간적이고 일시적인 발현을 조절하기 위해 적당한 프로모터를 갖는 것은 중요한 것이다. 유전자의 제거에 대한 조직-특정 프로모터의 사용이 가지고 있는 한가지 문제점은 발현의 기초 수준이 모든 세포를 죽이는데 여전히 충분하다는 것이다(Stritmatter et al., 1996). 그럼에도 불구하고, 많은 식물 프로모터들은 엄밀한 공간적이고 일시적인 속성을 가지고 있고 꽃밥, 종자, 주두 그리고 floral meristematic 조직들에서 특별하게 cytotoxic 유전자 발현을 조절하는데 성공적으로 사용된다 (Mariani et al., 1990; Czako et al., 1992; Goldman et al., 1994; Day et al., 1995).

혼성화 변종의 생산을 통하여 농작 식물의 개선은 식물 개량의 중요한 목적이다. 타고난 라인간의 잡종들은 종종 높은 수율과 질병에 대한 증가된 저항성 그리고 그 모체의 라인과 비교하여 다양한 환경에서 증가된 성능을 가진을 가진 자손이 된다. 이것은 혼성화 생장력이라고 명명되고 농업에서 중요한 역할을 한다. 커다란 범위의 혼성화 종자의 생산은 자극적인 것이다. 왜냐하면 많은 농작물들이 같은 식물에 대하여 하나의 꽃 내에서 또는 분리된 꽃들에서 웅성 그리고 자성 재생의 기관, 수술 그리고 암술을 가지고 있다. 이 배열은 높은 수준의 자화수분이 되고 성취하기에 어려운 타고난 레인사이에서 커다란 범위의 지정된 crosses를 만든다. 이종교배가 혼성화 종자를 생산하기위해 일어난다는 것을 보증하기 위해, 종축은 하나의 모체 라인으로부터 수공으로 또는 기계적으로 제거되었고, 자화수분을 방해하는 천연 자화불친화성을 사용하였고 또는 꽃가루 발달을 분열시키는 웅성 불임 돌연변이를 개발하였다. 높은 식물에서 웅성-번식력은 얼마간의 조정된 진화 events를 필요로 한다; ⅰ) 무성의 분열조직으로부터 구조적인 웅성 기관의 동화, ⅱ) 꽃밥에서 반수의 생식체의 진화, ⅲ) 자성 재생성 기관에 대한 웅성 생식체의 release 그리고 마지막으로 ⅳ) 획득 fertilization에 대한 웅성 그리고 자성 생식체의 상호간 인식. 어떤 웅성 생산을 혼란시키는 돌연변이는 웅성 불임을 야기한다. microsporogenesis의 정상적인 생산에 실패한 많은 수의 자발적인 웅성 불임 돌연변이체들이 있다. 토마토 돌연변이체 msll내에서, tapetal 붕괴는 너무 이른 것이고, 그래서 tapetal 세포들과 자발적인 조직들 모두 영향을 받았다. 웅성-불임의 변종은 구조적인 웅성 번식력을 pertub하는 돌연변이에서 발견될 수 있다. Arabidopsis에서, homeotic 돌연변이 pistillata는 윤생체 둘 그리고 셋을 감소시키고, 생산되는 식물은 기능적으로 웅성 불임이고 자성 번식이다(Bowman et al., 1989). 웅성 불임의 유전적 바탕은 또한 다양하다. 핵의 유전자, 핵 또는 유전적 웅성 불임에 의해 조절되는 웅성 불임은 첫째로 (GMS) 많은 농작물에서 공통적으로 일어난다. 유사하게, 웅성 불임은 cytoplasmic 유전자, 주로 미토콘드리아에 의해 조절되고, cytoplasmic 웅성 불임(CMS)은 많은 종에서 알려져 있다(Frankel and Galan, 1977; Kaul, 1988).

tapetum은 tetrad 단계의 microsporogenesis에서 발달된 꽃밥벽의 가장 깊은 부분의 층을 포함하는 세포들의 단일 층으로 구성되어 있다. tapetum sporogenous 조직을 둘러싸고 있고 발달하는 꽃가루 모세포에 대해서 영양물의 source를 공급한다. tapetum이 tetrad 벽의 용해에 영향을 미치는 칼로스를 가수분해하는 callase를 생산한다는 것 또한 보고된 바 있다. post-meiotic 기간동안 sporopollenin, pollenkit 물질들 그리고 tryphine들은 붕괴된 tapetum으로부터 released되었고 released된 소포자의 외벽에 퇴적되었다(Mascarenhas, 1990). 이 조직, tapetum에서 어떠한 교번도 웅성 재생 작용제에 대하여 기능을 나타내지 못해서 불임의 원인이 되었다.

가장 널리 알려진 웅성 불임 라인들이 자연적인 발생이라고 할지라도, 웅성 불임은 방사선, 화학적 처리, 원형질체 용해 그리고 유전작 조작에 의해 또한 유도될 수 있다. 웅성 불임을 얻기 위해 재조합 DNA 기술을 사용한 몇가지 접근이 시작되었다. 성공적인 웅성 불임 식물을 만들기 위한 첫 번째 연구는 담배와 Mariani 등에 의해 tapetum 특정 프로모터의 조절하에서 chimaeric 리보누클레아제 유전자에 의한 oilseed 평씨에서 웅성 불임을 유도한 것이었다(1990). 그것들은 1.5-kb TA29 유전자 조절 단편을 tapetal 세포 계통을 선택적으로 파괴하기 위해 두가지 다양한 리보누클레아제와 융합하였다. 10％의 TA29-RNase T1 transformant (2/20)와 92％의 TA29-barnase transformant (106/115)는 pollen으로 shed 하지 못했다. 이 웅성 불임 식물은 웅성 불임으로 복원될 수 있다. 이것은 chimeric tapetal-cell-specific 리보누클레아제-저해제, baster와 변형될수 있는 웅성 다산 식물과 교차에 의해서 얻어졌다(Mariani et al., 1992). Worrall 등(1992)은 locule내에서 callase 활성이 나타나기에 앞서 tapetum로부터 수정된 β-1,3-glucanase의 분비를 조작함으로써 담배 식물을 생산하였다. 형질전환 식물의 tapetum 세포에서, microsporocyte callase wall은 감소된 웅성 다산을 나타내는 형질전환체에 의해서 조기에 퇴화되었다. Pseudomonas aeruginosa exotoxin A은 또한 웅성 불임을 유도하는데 사용되었다(Koning et al., 1992). 앞서 언급한 실험외에도, 유전적 조절에 의해 웅성 불임을 유도하는 것에 대한 몇몇 시도들이 있었다(Denis et al., 1993; Tsuchiya et al., 1995; Zhan et al., 1996). 최근에, 무독성 화합물 N-acetyl-_L-phosphinothricin (N-ac-Pt)에 기초한 유도할 수 있는 웅성 불임에 대한 계가 개발되었다. E. coli,N-acetyl-_L-ornithine deacetylase의 argE 유전 산물은 cytotoxic compound L-phosphinothricin (Pt)에 대한N-ac-Pt로 전환되었다. TA29 프로모터-argE construct를 소유하는 transgenic 식물에서, N-ac-Pt의 적용은 웅성 불임 식물이 되는 empty 꽃밥을 유도한다. 그러나, N-ac-Pt 처리를 하지 않으면 식물들은 완전히 다산이 된다(Kriete et al., 1996)

본 발명의 목적은 상기 종래기술을 감안하여 안출한 것으로 패랭이로부터 RIP 유전자를 분리 동정하고 이를 이용하여 웅성불임 식물을 대량 생산하는데 있다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 리보솜 불활성 단백질을 생산하는 식물을 동정하고 패랭이로부터 RIP 유전자의 cDNA를 클로닝한 다음 패랭이 RIP 유전자의 발현을 분석하RH 게놈에서 패랭이 RIP 유전자의 유기조직을 추정하여 E. coli 내의 패랭이 RIP 유전자의 발현을 관찰한 다음 수정된 패랭이 RIP 유전자를 사용하여 웅성불임을 유도하였다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 상세히 설명한다.

도 1은 패랭이 잎으로부터 얻은 가공하지 않은 추출물의 CMC-Sepharose 크로마토그래피를 나타낸 것으로, 도 1a는 260nm에서 흡광도, NaCl 농도, TMV 감염의 저해율을 나타내며 도 1b는 34에서 49까지 분획의 SDS-PAGE 패턴, 도 1c는 바이러스 감염에 대한 local legion을 나타낸다.

도 2는 PCR에 의한 패랭이 RIP의 전기영동과 서던 블럿 분석을 나타낸 것으로, Lane 1, 2, 3은 프라이머 1과 2를 사용하여 증폭된 PCR 산물이고, Lane 4, 5, 6, 7, 8은 프라이머 1과 Xba1-프라이머 어댑터를 사용하여 증폭된 PCR 산물을 나타낸다.

도 3은 패랭이 RIP 유전자의 서던 블럿 분석을 나타낸 것으로, 잎 게놈 DNA 20㎍은 다양한 제한 효소로 소화되었고 0.8% 아가로스 겔상에서 분리되어 나일론 막으로 전달되었으며 막은 [α-³²P]가 표지된 패랭이 RIP 클론 DsPCRIP5으로 혼성화되었다.

도 4는 패랭이의 여러 조직으로부터 추출된 총 RNA의 노던 블럿 분석을 나타낸 것으로, 막은 [α-³²P]로 표지된 패랭이 RIP 클론 DsPCRIP5로 혼성화 되었다.

도 5는 패랭이의 잎 cDNA 라이브러리로부터 분리한 포지티브 cDNA 클론의 크기를 나타낸 것으로, 도 5a는 universal 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭된 포지티브 cDNA 클론을 전기영동한 것이고 도 5b는 RIP 클론 DsPCRIP5이 혼성화된 것을 전기영동한 것이다.

도 6은 cDNA 클론의 cross-hybridization을 나타낸 것으로, 도 6a는 cDS302클론의 작은 단편이고 도 6b는 cDS302클론의 큰 단편이며, cDS203 클론의 5'-UTR을 포함하는 5'-부위는 같은 막에서 프로브로 사용된 것을 나타낸다.

도 7은 cDS203, cDS1202와 cDS2401의 완전한 염기서열의 multiple alignment를 나타낸 것으로 시작코돈 ATG, 종결코돈 TGA은 bold face로 나타내었고, shaded bar는 이 클론들에서 다른 잔기를 나타내고 RIP의 추정 활성부위는 박스로 처리하였다. 3' 말단의 숫자는 클론된 poly(A) tail에서 나타나는 A 잔기의 수이다.

도 8은 cDS203, cDS1202 및 cDS2401의 유도된 아미노산 서열을 다른 RIP 유전자와 비교한 것으로, shaded bar는 RIP의 N-글루코시다아제 활성에 대한 기본 잔기, 박스는 이 효소의 추정 활성 부위에 대한 부위를 포함하고 Asterisk는 패랭이로부터 분리된 RIP cDNA 클론들에서 다른 잔기를 나타내며, 추정되는 N-말단과 C-말단 시그널 펩타이드는 굵은 글씨로, N-glucosylation 시그널은 화살표로 나타내었다.

도 9a는 PCR에 의하여 5' 및/또는 3'말단이 제거된 패랭이 RIP 유전자 클론의 구축을 나타낸 것이며, 도 9b는 PCR 산물을 아가로즈 겔상에서 전기영동시킨 것으로 Lane 1은 P₁과 P₄(DsRIP), Lane 2는 P₁과 P₃(3'ΔDsRIP), Lane 3은 P₂과 P₅(5'ΔDsRIP), Lane 4은 P₂과 P₃(5',3'ΔDsRIP)의 산물에 관한 것이다.

도 10은 E. coli PQE 벡터내에서 수정된 cDS1202 클론 DsRIP, 5'ΔDsRIP, 3'ΔDsRIP, 5',3'ΔDsRIP의 발현에 대한 벡터 구축을 나타낸 것이다.

도 11은 pQE 발현벡터에 삽입된 수정된 cDS1202 클론을 포함하는 E. coli 세포의 성장 분석을 나타낸 것으로, 배양물의 O.D.₆₀₀은 IPTG 유도후 0, 60, 120, 180, 240분에서 측정되었다.

도 12a는 담배잎으로부터 pTA29 프로모터 부분의 PCR 증폭 결과이며 도 12b는 클론된 프로모터의 염기서열을 나타낸 것으로, 상자안의 염기서열은 프로모터 부위를 증폭시키는데 사용된 프라이머 서열을 나타낸 것이다.

도 13은 패랭이 RIP 유전자를 사용한 웅성불임 식물 생산용 벡터 구축을 나타낸 것이다.

도 14는 pMTA2914/LBA4404, pMTA2913/LBA4404, pMTA2924/LBA4404, pMTA2923/LBA4404 및 pMTA29gus/LBA4404로 형질전환된 담배식물의 재분화를 나타낸 것으로, 접종된 담배 잎 디스크로부터 얻어진 신초(a), 온실내 토양으로 이동(b), 전체식물의 정상적 성장(c)을 나타낸 것이다.

도 15는 웅성불임 담배식물의 꽃을 나타낸 것으로, 도 15a는 형질전환된 식물과 대조구 식물을, 도 15b는 내부 웅성 및 자성 윤생체를 노출시키기 위해 이 꽃으로부터 corollas의 반을 제거한 것을 나타내고, 도 15c는 이것을 확대한 것이다.

도 16은 정상의 꽃(a)과 Δ3'DsRIP를 발현한 형질전환된 담배식물의 웅성불임 꽃(b)에서 얻은 꽃밥의 해부 현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 17은 형질전환되지 않은 담배식물로부터 얻어진 열매 캡슐과 종자와 pMTA2913을 발현한 형질전환된 것을 비교한 것이다.

도 18은 형질전환된 웅성불임 pMTA2913의 서던 블럿 분석을 나타낸 것으로, Lane 1은 형질전환되지 않은 담배 식물이고, Lane 2~10은 pTA29-3'ΔDsRIP(pMTA2913)를 포함하는 형질전환된 식물을 나타낸다.

세균성 균주와 배양 배지

Escherichia coli 균주 JM109는 일반적인 형질전환에 대해 사용되었고 host 세포로서 플라스미드를 증폭하였다. XL1-Blue MRF'와 SOLR 균주들은 박테리오파지의 감염과 번식 그리고 생체내에서 재조합 phagemid의 절단에 대해 각각 사용되었다. E. coli M15 균주는 pQE 발현 벡터의 표현에 대해 사용되었다. Agrobacterium tumefaciens 균주 LBA4404는 식물 형질전환에 사용되었다. E. coli 균주들은 37℃, 실험목적에 부합하는 12.5 ㎍/㎖ tetracycline, 50 ㎍/㎖ kanamycin 또는 50 ㎍/㎖ ampicillin으로 보충된 LB 배지에서 배양하였다. M15 세포들은 37℃ 100㎍/㎖ ampicillin과 25㎍/㎖ kanamycincells로 보충된 LB 배지에서 배양하였다. 형질전환에 대해 사용된 JM109 host 균주는 M9 최소 배지에서 얻어졌다. Agrobacterium 균주는 28℃ YEP 배지에서 배양되었다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 당업자가 용이하게 실시할 수 있도록 실시예에 의거 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 제한되지 아니한다.

실시예 1. 패랭이의 잎으로부터 얻은 가공하지 않은 추출물의 CM-Sepharose 칼럼 크로마토그래피

50g의 패랭이(Dianthus sinensis) 잎들은 LN₂와 함께 고운 분말로 분쇄하고, 300 ㎖ of 1× extraction buffer (0.14 M NaCl, 5 mM sodium phosphate pH 7.2, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 14 mM β-mercaptoethanol)로 균질화되었다. 추출물은 6층의 cheese colth를 통과하면서 걸러졌다. 그리고 10,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상청액은 6층의 Miracloth를 통과하면서 걸러졌고, 천연의 추출물은 5 ℓ of 5 mM sodium phosphate buffer (pH 6.6)에 대하여 투석되었다. 그리고 투석동안 생긴 침전물을 제거하기 위하여 원심분리하였다. 상청액은 버퍼의 3가지 변화를 가진 5 ℓ of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.6)에 대해 다시 투석되었다. 투석된 추출물은 침전물을 제거하기 위해 위에서 설명한 방법대로 원심분리 되었다. 상청액은 (20-cm×1.6-cm, BIO-RAD) of CM-sepharose fast flow column chromatography의 칼럼에 적용되었다. 칼럼은 ＞ 200 ㎖ of 1× column buffer (5 mM sodium phosphate pH 6.6)로 12시간동안 base line을 조절하기 위해 씻었다. 흡수된 물질들은 1× column buffer. Fractions (1 ㎖)에서 100 mM linear gradient of 0∼0.5 M NaCl로 용리되었고 수집하였다. 1 ㎖ Fraction들은 흡광도 A₂₈₀에서 Bradford 방법으로 측정되었다.

실험결과, CM-Sepharose 이온 교환 크로마토그래피는 패랭이로부터 항바이러스성 단백질의 정제에 사용되었다. 잎 추출물은 투석되었고 칼럼에 직접적으로 적용되었다. 칼럼은 칼럼 워싱 버퍼를 가지고 씻었고 단백질은 칼럼 버퍼내에서 linear gradient의 NaCl로 용리되었다 (도 1a). 분획은 수집되었고 SDS-PAGE상에서 분석되었다 (도 1b) 그리고 N. glutinosa에서 TMV 감염에 대한 항바이러스성 활성에 대하여 분석되었다. 세 개의 일련의 단편들은 11개 튜브에 결합되었고, 각 튜브들은 저해활성에 대해 분석되었다. #5에서 #11까지 결합된 분획들은 90% 이상의 저해활성을 나타낸다 (도 1c). 저해활성에 대한 주된 피크가 없으나, 대신에 가능한 항바이러스성 단백질이 넓은 범위의 salt gradient로부터 얻어졌다. 상기 실험은 바이러스 감염의 가능한 저해제를 포함하는 패랭이를 명확히 보여준다.

실험예 1. PCR에 의한 패랭이로부터 RIP 유전자의 동정

패랭이가 그 게놈에 리보솜 불활성 단백질(RIP)을 포함한다는 것을 확인하기 위해, 프라이머들은 누클레오티드, dianthin 30과 saporin의 아미노산 서열로부터 설계되었다. PCR 반응은 패랭이의 잎들로부터 추출된 총 RNA에 대해 Xba1-primer adaptor를 annealing 함으로써 합성된 첫 번째 strand cDNA인 게노믹 DNA와 패랭이 잎의 cDNA를 사용하여 수행되었다. D. caryophyllus는 대조구로 사용되었다. PCR 조건은 다음과 같다; 35개 cycles의 denaturation (94℃, 1 minute), annealing (55℃, 1 minute) 그리고 polymerization (72℃, 2 minutes). 거의 870bp의 DNA 단편은 PCR에서 패랭이 잎 cDNA를 사용하여 증폭될수 있음을 예상할 수 있다. 증폭된 DNA 단편의 예상되는 크기는 약한 "background" 산물을 포함하는 곳에서 조차도 아가로스겔 전기영동후에 관찰되었다(도 2a). 같은 겔은 blotted되고 재증폭된 870bp DNA 단편과 혼성화되었다 (도 2b). 870 bp DNA 단편의 동일성을 확인하기 위해, 클로닝되었고 dideoxy-chain termination 방법으로 시퀀싱되었다. 서열 상동 분석으로부터 얻은 결과, 870bp DNA 단편은 diathin 30과 saporin 유전자와 80% 상동, 그리고 PAP 유전자는 50~60% 상동으로 나타났다. 이 단편은 DsPCRIP5로 명명하였다.

실험예 2. 패랭이 RIP 유전자의 서던 블롯 분석

총 게놈 DNA는 패랭이 잎으로부터 추출되었고 제한 효소, Bam HⅠ, BglⅡ, Eco RⅠ, HindⅢ, ScaⅠ 과 DraⅠ로 소화되었다. Bam HⅠ과 BglⅡ의 절단 부위는 클론된 RIP cDNAs에 존재하고 다른 네가지 효소들은 패랭이 RIP 유전자의 5'과 3'의 옆부위를 소화시킨다. 소화된 게놈 DNA는 각 well에서 적하되는 optimal volume에 농축되었고 0.8% 아가로스겔에 대해 30 V 에서 48 시간이상 전기영동함으로써 분리되었다. 전기영동후, 겔은 증류수로 헹구었고 0.25 N HCl에서 15분간 실온에서 depurinated되었다. 그후 겔은 0.4 N NaOH에서 90분간 실온에서 흔들어 주어 침지시켰다. 변성 DNAs는 0.4 N NaOH transfer buffer을 이용하여 Hybond N^＋nylon membrane (Amersham)으로 이동하였다. 이동의 마지막에서 membrane은 membrane washing buffer (0.2 M Tris-HCl, pH 7.5, 2X SSC)으로 헹구었고 58℃에서 4시간동안 high salt hybridization buffer (5XSSC, 70 mM Na₂HPO₄, 30 mM Na₂HPO₄, 2.5 mM EDTA, 0.6% SDS adjusted to pH 7.2)를 가지고 prehybridized하였다. membrane은 같은 완충용액에서 58℃ 24시간동안 [α-³²P]dCTP labelled DsRIP로 혼성화되었다. 혼성화 후, membrane 은 40℃에서 30분간 2X SSC/0.1% SDS로, 63℃에서 60분간 2X SSC, 0.1% SDS로, 50℃에서 60분간 0.5X SSC, 0.1% SDS로, 마지막으로 63℃에서 30분간 0.5X SSC, 0.1% SDS로 연속적으로 씻어주었다. 각 씻는 조건 단계에서, membrane은 X-ray film으로 접하게 되었다.

프로브로서³²P-labelled DsPCRIP5를 사용하는 패랭이 게놈 DNA의 서던 블롯 분석 실험결과, 도 3과 같이 혼성 밴드들은 Eco RⅠ, HindⅢ, ScaⅠ, DraⅠ, BglⅡ 및 BamHⅠ로 소화되어 각 레인에서 검출되었다. 표지된 DsPCRIP5 프로브는 제한 효소에 따라 1~4 단편과 혼성화되었다. 4개 단편들은 DraⅠ에서 혼성화되고 단 하나의 단편이 Eco RⅠ 소화에서 혼성화되었다.

실험예 3. 다른 조직으로부터 패랭이의 노던 블럿 분석

RNA 시료들을 Sambrook 등의 방법에 따라 formaldehyde와 formamide로 처리하였다. 총 RNA는 0.67 M formaldehyde를 포함하는 1.0% 아가로스겔에서 전기영동시키고 Hybond N^＋nylon membrane으로 전달하였다. 막은 0.1% SDS, 5X Denhardt's solution, 6X SSC and 100 ㎍/㎖ sheared내에서 42℃로 18시간동안 혼성화하고 50% formamide를 포함하는 herring sperm DNA를 변성시켰다. DNA 프로브는 random primer labelling method을 사용하여 [α-³²P]dCTP로써 DsRIP에 표지하였다. 막은 2X SSC에서 2번, 0.1% SDS에서 42℃로 15분간, 그리고 0.5X SSC에서 한번, 0.1% SDS에서 52℃로 10분간 계속 교반하면서 씻었다. 막은 -70℃에서 X-ray 필름에 노출시켰다.

실험결과, RIP mRNA는 프로브로서 DsPCRIP5로 혼성화되었을 때 단지 패랭이의 잎조직으로부터 검출되었다 (도 4). 같은 잎조직의 위치에서 낮은 background signal이 뿌리와 줄기에서도 검출되었다. 이실험으로부터 다른 RIP로서 패랭이 RIP 유전자의 발현은 조직- 특이성이고 잎조직에서 보다 우세함이 확실하다.

실시예 2. 패랭이 RIP 유전자의 cDNA 클로닝

실험예 1. 패랭이의 잎 cDNA 라이브러리로부터 분리한 포지티브 클론의 분석

패랭이의 잎 cDNA 라이브러리를 구축하기 위해, 2.65 ㎎ 의 총 RNA가 10 g 의 패랭이 잎으로부터 준비되었다. 10 ㎍ 의 mRNA는 2.65 ㎎ 의 총 RNA로부터 정제되었고, 5 ㎍ 의 mRNA로부터 정제된 62.5 ng 의 double-stranded cDNA는 λ-ZAPⅡ cDNA synthesis kit를 사용하여 합성되었다. 62.5 ng의 cDNA는 1 ㎍ 의 Uni-ZAP XR 벡터로 결합되었고 GigapackⅢ Gold packaging 추출물로 packaged되었다. 62.5 ng 의 cDNA로부터, 5.67×10⁵재조합들이 얻어졌다. 증폭후에, 9.0 × 10⁵plaque들은 [α-³²P]이 표지된 DsPCRIP5 단편들을 가지고 스크린되었다(approximately 3.5 × 10⁴plaques/ plate). 첫 번째 스크리닝에서 44 positive plaques가 얻어졌고, 두 번째 스크리닝을 통하여 최종적으로 38 개의 실제적인 클론들이 pBluescriptⅡ SK phagemide에서 클론되었다.

38개의 포지티브 클론들의 삽입 크기를 측정하기 위해 PCR이 적용되었다. 그 크기는 아카로스 겔 전기영동에 대하여 250 bp에서 1750 bp까지의 범위를 갖는다(도 5a). 겔은 blotted 되었고 DsPCRIP5를 가지고 혼성화되었다. 38개 중에서 30개 클론은 강한 혼성화 밴드를 나타내고, 8개 클론은 낮은 바탕 신호를 나타낸다(도 5b).

cross-hybridization으로부터 얻어진 결과들은 7개 클론이 패랭이의 RIP의 완전한 길이 cDNA임을 보여주었다(도 6c). cDS302 클론은 가장 긴 삽입물을 포함한다. 작은 단편은 모든 클론으로 혼성화되고, 반면에 큰 단편은 그 삽입 크리에서 cDS302와 유사한 4개의 클론으로 혼성화되었다(도 6a,b). 서브 클로닝과 작고 큰 단편의 배열을 통하여, cDS302는 보기드문 재조합 클론이 된다. 그것은 CP12 (큰 단편)와 부분 RIP 유전자 (작은 단편)로 구성되어 있다. cDS302 클론의 큰 단편(1,150bp)은 개시 코돈과 그 속에 polyA 꼬리를 가지고 있고 다른 CP12 유전자를 가지고 85% 상동관계를 나타낸다. cDNA 클론의 특징을 표 1에 요약해 놓았다. cDNA 클론에 대한 설명은 각 cDNA 클론들의 배열 데이터로부터 온 결과와 NCBI BLAST 조사 프로그램에 의한 분석에 기초한 것이다.

크기가 1kb보다 긴 cDNA 클론의 특징

	Serial clone number	clone size (bp)	Characteristics of partial sequenced cDNAs
1	cDS201	930	Partial cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
2	cDS203	1,260	Full length cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
3	cDS302	1,750	Hybrid cDNA clone of which 5'-region presents 67% homology to P. sativummRNA for CP12and 3'-region shows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
4	cDS901	1,180	Full length cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
5	cDS1102	1,150	Full length cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
6	cDS1202	1,190	Full length cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
7	cDS1401	1,750	Hybrid cDNA clone of which 5'-region presents 67% homology to P. sativummRNA for CP12and 3'-region shows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
8	cDS2101	960	Partial cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
9	cDS2302	1,180	Full length cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
10	cDS2303	1,750	Hybrid cDNA clone of which 5'-region presents 67% homology to P. sativummRNA for CP12and 3'-region shows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
11	cDS2401	1,200	Full length cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
12	cDS2402	1.170	Partial cDNA clone of which 5'-region contains ∼ 200 nt ofTC repeatsand 3' shows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
13	cDS2403	1,200	Full length cDNA cloneshows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
14	cDS2601	1.040	Partial cDNA clone shows∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
15	cDS2701	1,750	Hybrid cDNA clone of which 5'-region presents 67% homology to P. sativummRNA for CP12and 3'-region shows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes
16	cDS2702	1.160	Partial cDNA clone of which 5'-region contains ∼ 200 nt ofTC repeatsand 3' shows ∼ 80% homology to Dianthin 30 and saporin genes

실험예 2. cDS203, cDS1202 와 cDS2401의 염기 및 아미노산 서열

5' 과 3'-부위의 배열 결과로부터, 패랭이의 7개의 완전한 길이의 cDNA들은 그들의 염기 서열에 따라 세 개의 그룹으로 나누어진다. 7개중 3개의 클론, cDS203, cDS1202 그리고 cDS2401이 그들의 완전한 염기 서열을 결정하기 위해 선택되었다. cDS203, cDS1202 그리고 cDS2401는 길이가 각각 1,167 bp, 1,138 bp 그리고 1,170 bp 이었고 882bp의 open reading frame을 갖는다. 이러한 클론들은 그들의 3'-untranslated 부분에서 consensus polyadenylation 신호를 갖지 않는다(도 7). 그들의 이론적 pl과 Mw는 각각 9.71과 33 KDa이다. 추론된 아미노산 서열은 N-말단에서 23 아미노산 잔기의 추정 시그널 펩티드와 C-terminal에서 18 아미노산 잔기의 추정 시그널 펩티드를 갖고 291 아미노산 잔기의 코딩 서열을 갖는다(도 8). 컴퓨터 분석은 이러한 cDNA 클론이 dianthin 30과 saporin과 79% 동일성을 나타냈고 반면에 PAP 및 MAP와는 59% 동일성을 나타냈다. DsRIPs'의 염기서열에서는 약간의 이질성이 있다. 4, 8 그리고 13 누클레오티드 교환은 5'-untranslated region, 코딩 부위 그리고 3'-untranslated 부위에서 각각 나타났다.

세개의 DsRIP 클론중에서 누클레오티드 불일치는 단백질 서열의 변화를 야기한다. 10개의 아미노산 변경은 암호화 영역에서 18개의 누클레오티드 변화에 의한 것이다(도 8). 아미노산 서열에서 변화는 추정되는 N-말단 신호 펩티드와 효소 활성 부분의 adjacent 영역에서 우선적이다. 아미노산 서열에서 microheterosity에도 불구하고, RIPs의 효소 활성 부분인 "IQMVSEAARFKYI"의 서열은 보존되었다(도 8).

실시예 3. 수정된 패랭이 RIP 유전자의 E. coli에서의 발현

실험예 1. 5' 및/또는 3' 말단이 제거된 패랭이 RIP 유전자의 구축

시토졸(cytosol) 내의 패랭이 RIP의 전사를 제한하기 위해, cDS1202의 5'- 및/또는 3'-시그널 펩타이드를 제거하여 CDS1202 클론을 수정하였다. PCR 증폭을 위하여, 두 개의 upstream 프라이머들이 1에서 7(primer1, p1)까지와 24에서 31(primer2, p2)까지 아미노산 잔기의 배열에서 anneal하기 위해 설계되었다. 두개의 downstream 프라이머들은 269에서 276(primer3, p3)까지와 287에서 294(primer4, p4)까지의 cDS1202 아미노산 잔기에 혼성화되었다. 이러한 서열의 "ATG" 개시 코돈을 소개하는 5' 말단에서, NcoⅠ 또는 RcaⅠ 부분은 통합되었고 "TGA" 종결 코돈을 소개하는 이러한 서열의 3' 말단에서 통합되었다. 이 서열은 편리한 제한 부분, KpnⅠ, Sac Ⅰ과 HindⅢ을 통합한다고 소개되었다. RcaⅠ는 Nco1의 호환성 끝을 생성하고 그래서 RcaI 단편은 NcoⅠdigested 단편의 끝에 ligated 될 수 있다. 이러한 네 개의 프라이머를 사용함으로써, PCR에 의해 4개의 다른 구조들이 생성되었다. PCR 조건은 94℃에서 3분간 predenaturation되었고, 94℃에서 1분간 denaturation하고, 72℃에서 2분간 polymerization하고 55℃에서 1분간 annealing하였다. cycle의 총 수는 36이고 PCR 산물은 1.2% 아가로스겔에서 분리되었다.

실험결과, cDS1202 클론은 수정된 구조가 소개되고 강화식물에서 발현될 때 시토졸에서 변형된 산물을 제한하기 위해서 5' 및/또는 3' 시그날 펩타이드의 제거에 의해서 수정되었다. cDS203, cDS1202 그리고 cDS2401의 아미노산의 컴퓨터 분석으로부터 cDS1202는 추정가능한 23 N-terminal 아미노산 잔기(N-sp)와 18 C-terminal 아미노산 잔기(C-sp, 도 8)을 포함한다는 사실이 발견되었다. 또한, 전자는 이 단백질을 골지체, endoplasmic reticulum, 그리고 extracellular space로 전달하는 역할을 한다고 가정하였고 나머지는 그것을 액포로의 전달과 관련되어 있다. PCR 증폭에 대해, 두 개의 unstream 프라이머의 서열은 생산된다. 그리고 1에서 7까지(p1) 그리고 24에서 31(p2)까지 부합한다. 두개의 downstream 프라이머는 269부터 276(P3)까지 그리고 287에서 294(p4)까지 cDS1202 아미노산잔기로 혼성화시켰다. 이러한 서열의 5' 말단에서, "ATG" 개시 코돈을 나타내는 NcoⅠ 또는 RcaⅠ 부분은 통합되었고, 서열의 3' 말단에서 "TGA" 종결 코돈이 나타났다. 서열은 편리한 저해 부분, Kpn l, Sac l 그리고 HindⅢ 를 통합한다고 나타났다(도 9a). P1과 P2를 사용하는 PCR은 N-terminal과 C-terminal 시그날 펩타이드를 모두 포함하는 완전한 서열을 생산할 수 있다. 이 구조는 세포내 공간, 액포 그리고 DsRIP로 명명된 것을 제한하는데 기대된다. 형질전환된 식물에서 발현된 각 구조의 한정은 diagram아래에 설명되었다. PCR은 전기 실시예에 따라 수행되었다. 이 PCR 증폭은 측정된 크기에 대응하는 하나의 주요한 밴드의 특정 패턴을 준다. 각 PCR 산물의 예상되는 크기는 DsRIP, 3'ΔDsRIP, 5'ΔDsRIP and 5'3'ΔDsRIP에 대하여 각각 882 bp, 828 bp, 813 bp 그리고 759 bp이다(도 9b). cDS1202의 PCR 산물의 증폭된 4가지 다른 구조는 정제되었고 KpnⅠ과 HindⅢ로 소화되었다. 이러한 단편들은 E. coli의 발현벡터로서 pQE30또는 pQE32에 접합되었다. 재조합 플라스미드들은 pQE3214 (DsRIP), pQE3213 (3'ΔDsRIP), pQE3024 (5'ΔDsRIP) 그리고 pQE3023 (5'3'ΔDsRIP)로 명명하였다. E. coli 균주 M15는 실험구로서 이러한 플라스미드 pQE30과 pQE32에 의해 형질전환되었다. 각각의 형질전환체는 pQE3214/ M15, pQE3213/ M15, pQE3024/ M15, pQE3023/ M15, pQE30/ M15 그리고 pQE32/ M15로 명명하였다.

실험예 2. 수정된 패랭이 RIP 유전자의 발현용 벡터 구축

패랭이 RIP 유전자 발현용 pQE 벡터는 E. coli의 발현벡터로서 tac5 프로모터, 리보손 결합 부분, 개시 코돈 (ATG), 6×His-tag, multicloning site 그리고 종결 코돈 (도 10)으로 구성되어 있다. 그들의 암호화 능력에 따라, pQE30, pQE31 and pQE32의 세가지 종류의 벡터가 존재한다. 수정된 cDS1202 클론, 5'ΔDsRIP 그리고 5'3'ΔDsRIP는 pQE30에 결합되었고 pQE3024 과 pQE3023를 각각 생산한다 (도 10a). DsRIP와 3'ΔDsRIP는 pQE32와 결합되어 있고 pQE3214와 pQE3213를 각각 생산한다(도 10b). 이러한 재조합 플라스미드는 E. coli 숙주, M15로 형질전환되었고, 독성 유전자로부터 E. coli를 보호하는 안전 장치인 강력한 억제 레귤레이터 하에서 독성 유전자를 발현하도록 특별히 설계되었다.

실험예 3. 수정된 패랭이 RIP 유전자를 포함하는 E. coli 세포의 성장

클론된 패랭이 RIP 유전자의 E. coli에 대한 cytotoxicity를 조사하기 위해, DsRIP, 5'ΔDsRIP, 3'ΔDsRIP or 5'3'ΔDsRIP를 포함하는 E. coli 균주 M15는 100 ㎍/㎖ 의 암피실린과 25 ㎍/㎖ 의 kanamycin으로 3 ㎖ LB 배지에서 12시간동안 배양되었다. 50 ㎕ 의 1차 배양물은 20 ㎖ 의 배지에 이동되었고 즉시 그 O.D.₆₀₀를 측정하였다. O.D.₆₀₀=0.2가 되는 시간에, 1 mM 의 IPTG를 가하였고 각 형질전환체의 성장률 이 600nm에서 흡광도에 의해 관찰되었다.

pQE32 벡터 단독은 IPTG 유도에 대하여 잘 성장한 반면, DsRIP (pQE3214)와 3'ΔDsRIP (pQE3213)를 포함하는 pQE32는 IPTG 유도에서 성장하지 못했다(도 11). pQE32처럼, pQE30 단독은 정상적인 성장률을 보였고 3'ΔDsRIP (pQE3024)와 5'3'ΔDsRIP (pQE3023)를 포함하는 pQE30은 IPTG 유도에 의해 그들의 성장을 저해하였다.이러한 성장 저해는 수정된 패랭이 RIP 유전자의 전사 산물이 E. coli 리보솜에 대한 독성 효과를 가지고 있음을 나타내고 그것은 N- 및/또는 C-terminal 시그날 펩타이드의 제거에도 불구하고 E. coli에서 적어도 기능적인 단백질을 생산함을 나타낸다.

실시예 4. 수정된 패랭이 RIP 유전자를 사용한 웅성불임의 유도

실험예 1. Nicotiana tabaccum cv. samsun으로부터 pTA29 프로모터 부분의 증폭

N. tabaccum cv. Samsun의 게놈 DNA로부터 꽃밥 특정 프로모터 부분을 얻기 위해 두 프라이머가 설계되었다. 5' 말단 프라이머의 서열은 5'-dCGGGGTACCAAGC TTATCATCGATTATATTAGGG-3'(34-mers)이고 3' 말단은 5'-CTACCATGGTAGCTAATTTCTT TAAG-3'(26-mers)이다. 5'-말단 프라이머는 kpnⅠ and HindⅢ의 제한 효소 부위를 가지고 있고, 3'-말단 프라이머는 Ncol 부위를 가지고 있다. NcoⅠ 부위는 각각 A₁₅₂₅와 A₁₅₂₆이 G₁₅₂₅와 G₁₂₂₆으로 치환에 의해 생산된다. 밑줄친 부분은 pTA-29프로모터 (EMBL accession no. X52283)의 시작 부분을 나타낸다. PCR 반응 혼합물은 master mix (2.5 mM MgCl₂)과 Taq polymerase 1 unit을 포함한다. 템플레이트(template)의 농도는 2.5 ng, 50 ng과 200 ng으로, 각 템플레이트는 프라이머당 50 pmoles, 25 pmoles, 10 pmoles and 2.5 pmoles의 다양한 농도를 가진 프라이머와 결합한다. PCR 반응은 다음의 조건에 따라 수행된다. 즉 95℃에서 3분간 predenaturation되고, 94℃에서 1분간 denaturation, 50℃에서 2분간 annealing하고, 72℃에서 2분 30초간 polymerization되었다. 총 cycles의 수는 36이었다. PCR산물은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 전기영동 결과 분리된 프로모터의 염기서열은 도 12a에 나타냈다. 프로모터 부위의 염기서열은 도 12b와 같이 박스안에 표시하였다. 도 12b에서 박스안의 염기 서열은 프로모터를 증폭시키는데 사용된 프라이머를 나타낸 것이고 괄호안의 것은 증폭된 pTA29 프로모터에서 빠진 서열을 나타낸 것이다.

실험예 2. 패랭이 RIP 유전자를 사용한 웅성불임 식물의 생산용 벡터 구축

상기 실험예 1에서 PCR을 통해 얻은 pTA29 프로모터와 pLAT52-7은 제한 효소, KpnⅠ과 NcoⅠ로 소화한 다음 재결합하였다. 이 재조합 플라스미드는 pTA29 프로토머, GUS 부위 그리고 NOS-터미네이터를 가지는 pLTA29-gus로 명명되었다. pLTA29-gus는 NcoⅠ and SacⅠ로 소화되어 GUS 부위를 제거하고, NcoⅠ(or RcaⅠ)와 Sac l로 절단한 pQE3214, pQE3213, pQE3024 and pQE3023의 단편들과 결합시켰다. 이들 플라스미드는 pLTA2914, pLTA2913, pLTA2924와 pLTA2923로 명명하였다. 이들 구조들은 제한 효소, HindⅢ 와 SacⅠ로 소화하고, 식물 발현 벡터인 pMBP1와 결합시켰다. 최종 구조는 pMTA2914, pMTA2913, pMTA2924 그리고 pMTA2923로 명명되었다(도 13).

실험예 3. 키메라 유전자, pTA29-ΔDsRIP를 가진 담배 식물의 형질전환

2개월정도 된 온실에서 자란 식물로부터 얻은 건강한 담배잎들(Nicotiana tabacum cv. Xanthi N.N.)을 조심스럽게 수돗물로 헹구었고 2% sodium hypochlorite에서 교반하면서 15분간 담갔다. 멸균된 담배잎들은 800 ㎖의 증류수로 4번 헹구었다. 그것들을 petridish위에 놓고 표백-손상 부위를 제거하였다. 잎들을 sterile scalpel blade(#10)을 사용하여 1 ㎠ 로 자르고 Agrobacterium을 희석물과 혼합하였다. 각 구조(pMTA2914, pMTA2913, pMTA2923 and pMTA29-gus)를 포함하고 있는 Agrobacterium을 28℃에서 36시간동안 배양하고 희석 배지(MS basal liquid medium)에서 1:50까지 희석시켰다. 2시간 후에, 잎 디스크들은 건조하기 위해 멸균 여과지로 옮겼고 공서 배지(MS salts, MS vitamins, 30 g/ℓ of sucrose, 2.0 mg/ℓ of BA and pH 5.8)에 선택적인 항생물질없이 60시간동안 어두운 조건하에 놓았다. 공서 배양말기에, 접종된 잎 디스크들은 50∼70 ㎖ 의 sterile 증류수로 채워진 멸균된 플라스틱 트레이로 옮기고 2번 행구었다. 잎 디스크들은 여과지에서 건조하였고 재분화 배지(MS salts, MS vitamins, 30 g/ℓ of sucrose, 2.0 mg/ℓ of BA, 100 mg/ℓ of kanamycin sulfate, 250 mg/ℓ of carbenicillin, pH 5.8)에서 신초가 나타날때 까지 배양하였다. 접종된 잎 디스크들로부터 신초는 캘루스로부터 절삭되었고 생장이 정상인 발아와 엽액의 발아를 가진 셋 또는 다섯의 잎들을 좀더 남기기 위해 정돈되었다. 그것들은 발근용 배지(MS salts, MS vitamines, 30 g/ℓ of sucrose, 50 mg/ℓ of kanamycin sulfate, 250 mg/ℓ of carbenicillin)로 삽입되었다. 7내지 10일후, 뿌리가 난 담배 묘목을 직접 흙속에 옮기고 2~3일동안 그늘에서 유지하였다.

실험결과, 신초는 잎 디스크로부터 3주후에 분화되었고 (도 14a) 뿌리는 hormone없이 50 ㎎/ℓ 의 kanamycin 그리고 250 ㎎/ℓ 의 carbenicillin을 포함하는 MS 배지에서 유도되었다(도 14b). 묘목은 토양으로 옮겨 온실에서 자랐다(도 14c). 결과적으로, 46 pMTA2914, 38 pMTA2913, 58 pMTA2924, 65 pMTA2923 그리고 20 pMTA29-gus 형질전환 식물을 얻었다.

실험예 4. 담배에서 웅성 불임을 야기하는 pTA29-3'ΔDsRIP (pMTA2913) 유전자의 발현

1.5 kb pTA29 유전자 조절 단편을 수정된 패랭이 RIP 유전자에 융합하였다. ΔDsRIP 유전자는 액포 또는 세포외부공간으로 수송되지 않도록 그리고 이러한 구조들이 tapetum 세포에서 발현될 때 시토졸내에 유지되도록 앞서 수정되(도 9). 이러한 구조들이 담배 식물에 도입되고 결과적으로 207개의 pTA29-ΔDsRIP 유전자 형질전환체들이 얻어졌다. 4개의 구조중 pTMA2914 그리고 pMTA2913는 담배에서 웅성 불임을 야기하였다(도 15b). pMTA2913 형질전환체는 성장률, 키, 형태, 꽃의 기관계 그리고 꽃 색 패턴면에서 형질전환되지 않은 대조구 식물과 비교하여 동일하다. 열개성의 꽃밥에서 꽃가루의 수에서 주목할만한 감소는 pMTA2913 형질전환체에서 명백하게 나타났다(도 15c). pMTA2913 식물의 꽃밥은 오그라들어 있고, 색상은 회갈색이며, 꽃가루가 결여(도 16b)되었다. 꽃가루가 없는 pMTA2913 식물들은 열매 캡슐과 종자를 생산하는데 실패했다(도 17). 33개의 pMTA2913 식물중에서 9개가 서던 블럿 분석을 수행하였다. 3개 형질전환체가 단 하나의 pTA29-3'ΔDsRIP 유전자를 포함하고 나머지는 몇몇 pTA29-3'ΔDsRIP 유전자를 갖는 것으로 확인되었다(도 18).

본 발명자들은 본 발명에 사용한 유전자를 세균에 도입하여 Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pMTA2913 및 Escherichia coli JM109/pMTA2913으로 명명하고, 이 균주들을 1997년 12월 11일 자로 생명공학연구소에 KCTC 8859P 및 KCTC 8858P 수탁번호로 각각 기탁하였다.

실험예 5. 자성 번식력

상호간의 교배 수분은 불임이 다른 것에 대해서 제한되는지 아닌지를 결정하기 위해 형질전환된 식물과 형질전환되지 않은 대조식물간에 수행되었다. 형질전환 식물의 자성 번식 구조는 유전자 치환에 의해 명백하게 영향을 받지 않았다. 종자 수율은 자가수분 야생 대조 식물과 유사하였다. 하기 표 2는 대조구와 교배된 pMTA2913 종자의 평균 무게를 보여준다.

웅성불임 담배식물(pMTA2913)의 자성 번식력

Number of transgenic plant	Average weight of seeds per pod (g)
13M02	0.11
13M03	0.11
13M04	0.08
13M05	0.17
13M07	0.01
13M08	0.07
13M09	0.02
13M10	0.16
Untransformed normal	0.10

이상 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 잎 추출물을 이용하여 리보솜 불활성 단백질 유전자를 분리 동정하여 수정된 유전자를 제공하는 효과가 있으며, 이를 이용하여 담배 식물에서 웅성 불임을 야기하는 산업상 뛰어난 효과가 있다.

Claims

패랭이로부터 분리 및 동정된 하기 리보솜 불활성 단백질(RIP) 유전자의 염기서열
Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pMTA2913(KCTC 8859P) 및 Escherichia coli JM109/pMTA2913(KCTC 8858P)를 이용하여 생산된 웅성 불임 식물.