KR19990043047A - 녹농균 감염증 치료제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약독화 녹농균의 세포외막 단백질 성분을 리간드로 사용하여 친화 컬럼을 제작하고 사람 정상 혈청으로부터 순수하게 분리한 면역글로불린을 함유하는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) 감염증 치료제에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 약독화 녹농균주는 피셔 면역형태에 따른 1, 2, 3 및 6형의 균주로서 약독화된 균주인 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534의 4종의 약독화 균주이다.
본 발명에 따른 면역글로불린 제제는 녹농균 감염증에 대해 우수한 치료 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 감염증 치료제에 관한 것이다. 특히 본 발명은 신규한 약독화 녹농균주로부터 순수하게 분리한 세포외막 단백질들을 리간드(ligand)로 사용한 CNBr-활성화 세파로스(Sepharose) 4B 수지 컬럼(column)에 의해 정상인의 혈장으로부터 분리·정제된 면역글로불린을 함유하는 녹농균 감염증 치료제에 관한 것이다.
녹농균은 길이가 1.5 내지 3.0 ㎛ 이고, 폭이 0.5 ㎛ 정도인 간균으로서 1개의 편모를 갖고 있고 운동성이 있는 통성 호기성의 그람 음성균이며 토양, 물, 하수 및 사람의 장관에 널리 분포되어 있다[Mol. Microbiol. 4, 1069-1075, 1990]. 이러한 녹농균은 전신 감염, 만성 기도 감염, 췌낭포성 섬유증 환자에 있어서 난치성 감염을 일으키는 병원성 세균이다. 특히 녹농균에 의해 야기되는 패혈증은 수술, 화상 및 외상 등에 의해 저항력이 저하된 환자의 혈액 내에 미생물 그 자체가 침입하거나 그의 독성 구성 성분이 분비됨으로써 유발되는 질병으로서 고열, 혈압 저하 등의 쇼크를 일으켜 결국 사망에까지 이르게 하는 것으로 알려져 있다. 더구나 최근에는 녹농균이 콘택트렌즈 사용자의 안구 및 요로에서도 검출되어 더욱 주목을 받게 되었다. 따라서, 상처 감염, 폐렴, 요로 감염 등을 통해서 혈액 내에 흘러 들어간 세균이 야기하는 독성에 의해 여러 장기에 치명적인 손상을 발생시키는 것을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약제의 개발이 절실히 요구되어 왔다. 그러나, 녹농균은 일부의 항생제를 제외한 대부분의 상용 항생물질에 대해 내성을 갖고 있을 뿐만 아니라 현재까지 안전하면서도 좋은 방어 효과를 갖는 예방 백신 및 치료제가 개발되어 있지 않은 상태이므로 녹농균 감염으로 인한 치사율은 갈수록 높아지고 있다는데 그 문제의 심각성이 있다.
녹농균의 일반화된 대표적인 분류 방법으로는 피셔 면역 형태 (Fisher Immunotype)에 따라 7 가지로 분류하는 방법, 테라다(Terada)에 의해 제안된 O-항원 그룹 분류 방법, 또는 IATS(International Antigenic Typing Scheme) 분류 방법 등이 있다. 국내외적으로 녹농균 감염증 환자로부터 가장 빈번하게 검출되는 녹농균은 피셔 면역형/IATS 혈청형/O-group (Terada)으로 6/8/C, 3/2/B, 2/11/E 및 1/6/G 형이 주종을 이루고 있다.
현재까지 개발된 녹농균 감염증에 대한 치료법으로는 녹농균에 대한 항독소를 만들어 녹농균에 의해 분비되는 독소를 중화시키는 방법이 있다. 항독소는 패혈증이 진행된 환자에게 사용하는 치료제로 가격이 상당히 고가이므로 일반 환자에게 범용적으로 사용할 수 없다는 단점을 지니고 있다. 또한, 가장 커다란 결점은 이 항독소의 투여를 통해서 치료될 수 있는 완치율이 비교적 낮으며, 부작용도 매우 심해서 치료제로서 사용하기가 부적절하다는 것이다.
또, 다른 녹농균 감염증에 대한 치료 방법으로서 광범위 항생물질이나 녹농균에 대해 선택성이 높은 화학요법제 등을 선택하여 치료하는 방법이 있으나, 녹농균의 약제 내성이 일반적으로 매우 높고 형(type)이 다양하여 치료가 불가능한 녹농균에 의한 희생자가 많았다.
또 다른 방법으로는 세포융합 기술을 이용하여 녹농균에 대한 마우스 모노클로날 항체[J. Inf. Dis. 152, 1290-1299, 1985] 또는 인간 모노클로날 항체[FEMS Microbiol. Immunol. 64, 263-268, 1990]를 생산하고 각 항체 중에서 녹농균을 가장 잘 중화시킬 수 있는 항체 생산 세포주를 선별하고, 이것을 생산 세포주로 사용하여 대량 생산을 통한 저가의 치료제를 개발하려는 시도가 있다. 그러나, 이 방법 역시 한 종류의 모노클로날 항체에 의해서는 현재까지 혈청학적, 면역학적으로 알려진 수십여종의 녹농균에 의한 감염증을 모두 치료할 수는 없을 뿐만아니라 폴리클로날 항체에 비해서 중화시킬 수 있는 능력이 매우 약하므로 효과적으로 치료할 수 없다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 서로간의 교차반응성(cross-reactivity)을 조사하여 몇 가지의 항체를 동시에 투여하는 방법과 녹농균 감염 환자의 혈액을 채취하여 녹농균의 혈청학적 또는 면역학적 형태를 규명하여 여기에 맞는 모노클로날 항체를 투여하는 방법이 제시되기도 하였으나, 이것 역시 시간이 많이 소요되기 때문에 시간을 다투는 환자의 치료법으로는 부적절할 뿐만아니라 상술한 바와 같이 한 종류의 모노클로날 항체 사용시 중화능력이 매우 낮아서 치료 효과 또한 미지수이다. 따라서, 최근에는 상술한 녹농균 감염 치료제의 단점을 해소시키는 한가지 방법으로서 공통항원을 이용하여 치료제를 생산하는 방법이 적극적으로 연구되고 있다.
본 발명의 목적은 종래의 녹농균 감염증 치료제의 단점을 개선하기 위하여 안전한 약독화 녹농균주로부터 분리·정제된 세포외막 단백질에 특이적으로 결합하는 사람 면역글로불린을 활성 성분으로서 함유하는 치료 효과가 우수한 녹농균 감염증 치료제를 제공하는 것이다.
도 1은 각각의 약독화 녹농균주로부터 리간드로 사용하기 위해서 분리·정제한 세포외막 단백질의 SDS-PAGE 패턴을 보여주는 도면.
도 2는 각 정제 단계별 녹농균 감염 치료용 사람 항체의 SDS-PAGE 패턴을 보여주는 도면.
본 발명자들은 다양한 형태의 녹농균에 의한 감염증에 대하여 높은 유효성을 나타낼 수 있는 치료제를 개발하고자 광범위하고 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 특정하게 약독화시킨 녹농균주들로부터 얻은 세포외막 단백질을 리간드로서 CNBr-활성화 세파로스 4B 수지에 커플링 (coupling)한 후 이를 이용하여 정상인의 혈장에 소량 존재하는 녹농균에 대한 면역글로불린을 고순도로 분리·정제하고, 이러한 면역글로불린이 다양한 녹농균 감염 뿐 아니라, 중증의 녹농균 감염증에 대하여도 우수한 치료 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 녹농균 감염증 치료제에 관한 것이다. 특히 본 발명은 녹농균 세포 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 함유하는 녹농균 감염증 치료제에 관한 것이다. 상기 면역글로불린은 약독화시킨 안전한 녹농균주로부터 세포외막 단백질만을 순수하게 분리하여 이것을 리간드로 컬럼에 커플링한 후 이 컬럼을 이용하여 정상인의 혈장으로부터 분리·정제하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 항체 결합용 리간드인 세포외막 단백질의 공급원으로 사용되는 약독화 녹농균주는 신규한 균주로서 본 출원인에 의해 1993년 6월 7일자로 출원된 특허 출원 제93-10273호에 기재되어 있다. 이 약독화 녹농균주는 녹농균에 감염된 환자로부터 녹농균주를 단리하고, 이들 단리된 미생물들을 피셔 면역형태에 따라 7종으로 분류한 후, 이중 대표적인 미생물들을 면역 형태별로 1주씩 반복적인 온도 처리 및 실험동물에서의 분리 과정을 통해 순화시킨 다음에 각 균주에 대해 가장 약독화된 균주를 선별하여 얻어지는 안전한 균주이다. 이렇게 하여 수득되는 안전한 약독화 녹농균주는 CFCPA 10142(피셔 1형), CFCPA 20215(피셔 2형), CFCPA 30720(피셔 3형), CFCPA 40057(피셔 4형), CFCPA 50243(피셔 5형), CFCPA 60534(피셔 6형) 및 CFCPA 70018(피셔 7형)의 7종이다. 이들 균주는 각각 1993년 5월 12일자로 국제 기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터에 기탁되어 있으며, 그 수탁 번호는 각각 다음과 같다.
| 균주명 | 수탁 번호 |
| CFCPA 10142 | KCCM 10029 |
| CFCPA 20215 | KCCM 10030 |
| CFCPA 30720 | KCCM 10031 |
| CFCPA 40057 | KCCM 10032 |
| CFCPA 50243 | KCCM 10033 |
| CFCPA 60534 | KCCM 10034 |
| CFCPA 70018 | KCCM 10035 |
이들 균주가 기재되어 있는 상기 특허 출원 제93-10273호는 1995년 1월 3일자로 공개 번호 제95-865호로 공개되어 있으므로, 현재 한국 종균협회로부터 분양 가능한 상태에 있다.
이러한 약독화 녹농균주를 최적 생장조건을 유지한 발효조에서 배양하여 대량의 균체를 수득하고, 수득한 균체를 각각 유기 용매 처리 및 추출, 한외 여과에 의한 분자량 크기에 따른 분리, 초원심분리(ultracentrifuge) 등의 일련의 과정에 따라 처리함으로써 세포외막 단백질을 수득한다. 이 과정에서 약독화 녹농균주의 배양을 위한 배지로는 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)를 사용하거나, 또는 녹농균주의 배양에 적합하도록 구성된 특수 배지를 사용한다. 이 특수 배지는 글루코스 (30 g/ℓ), 펩톤 (15 g/ℓ), MgSO4(0.5 g/ℓ), CaCO3(5 g/ℓ), KH2PO4(1 g/ℓ), FeSO4(5 ㎎/ℓ), CuSO4(5 ㎎/ℓ) 및 ZnSO4(5 ㎎/ℓ)로 구성된다. 이 특수 배지는 약독화 녹농균주의 배양에 적합하도록 본 발명자들에 의해 특별히 고안된 것으로 신규한 것이다. 이들 약독화 녹농균주를 특수 배지에서 배양하면 트립틱 소이 브로스 배지에서 배양하였을 때에 비해 건조 균체의 중량을 기준으로 30％ 이상 더 많은 건조 균체를 수득할 수 있으므로 특수 배지를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
이러한 균체 배양 단계에서의 최적 배양 조건은 온도 37℃, 통기량 1 v/v/m(용량/용량/분)으로서 균주를 배양 배지액의 5％(v/v)의 양으로 접종하여 200 rpm의 교반 속도에서 10 내지 18시간, 바람직하게는 12 내지 14시간 동안 배양한다. 배양이 완료되면, 제2 단계로 배양액으로부터 세포를 원심분리 등의 방법에 의해 분리한다. 제3 단계에서는 분리한 세포를 유기 용매로 처리하여 미생물을 불활성화시키는 동시에 세포외막내 지질 성분을 제거한다. 이때 유기용매로는 바람직하게는 아세톤, 에탄올, 부탄올 등이 사용되며, 가장 바람직하게는 아세톤이 사용된다. 계속해서, 제4 단계에서는 세포가 파괴되지 않도록 하면서 3 내지 4회 반복해서 세포외막 단백질을 추출한다. 이를 위해서는 미생물 세포를 10 mM 인산염 완충액 (10 mM PBS, pH 7.2), 트리스염 완충액 (10 mM Tris·Cl, pH 7.5) 등의 용매, 바람직하게는 인산염 완충액 중에서 믹서(mixer) 또는 균질화기(homogenizer)를 사용하여 추출하며, 이때 추출 과정은 4℃에서 50 내지 200 rpm으로 교반하여 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 제4 단계에서는 세포가 파괴되지 않도록 주의하여야 하며, 이는 목적하는 세포외막 단백질에 세포질내의 유독성 단백질 및 핵산이 혼입되는 것을 방지하기 위함이다. 따라서, 추출 과정 중에 세포질내 표지효소인 락테이트 데하이드로게나제(lactate dehydrogenase)를 측정함으로써 세포의 파쇄 여부를 계속 확인하는 것이 필요하다.
이렇게 하여 상등액으로 수득되는 약독화 녹농균주의 세포외막 단백질은 1차 및 2차 한외여과하여 분자량이 10 kDa 내지 100 kDa인 단백질만이 수득되도록 분획화시킨다. 이때 세포외막 단백질의 분자량 범위가 10 kDa 내지 100 kDa이 되도록 하는 것은 매우 중요하다. 분자량이 10 kDa 미만인 분획은 색소 및 저분자 단백질로 구성되어 있어서 항체 유도 물질로서의 효과가 없으므로 친화성 리간드(affinity ligand)로서 무의미하고, 분자량이 100 kDa보다 큰 범위의 분획에서는 고 분자량의 리포폴리사카라이드(LPS)가 존재하게 되는데 커플링된 리포폴리사카라이드에 의해 분리·정제되는 항체 자체는 녹농균 감염증에 대한 부수적인 치료제가 될 수 있으므로 문제가 없으나, 컬럼에 커플링된 리포폴리사카라이드가 유리될 경우 이로 인해 독성이 야기될 수 있다.
단리된 분자량 범위 10 kDa 내지 100 kDa의 세포외막 단백질 분획은 다시 초원심분리하여 잔존할 수 있는 미량의 리포폴리사카라이드를 제거함으로써 순수한 세포외막 단백질을 수득한다. 이렇게 하여 각각의 약독화 녹농균주로부터 순수하게 분리한 세포외막 단백질을 일정 비율로 혼합한 후 펠리콘 카세트 시스템 (Pellicon Cassette System, 밀리포어(Millipore)사)에서 분자량 10 kDa 차단 멤브레인 필터를 사용하여 한외여과함으로써 농축과 완충액 교환의 과정을 동시에 수행하여 적정 부피의 커플링 완충액 (coupling buffer; 0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3)에 녹도록 한다.
이 단백질을 리간드로서 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)사의 CNBr-활성화 세파로스(Sepharose) 4B 수지에 커플링하여 친화 컬럼(affinity column)을 제조하고, 이 친화 컬럼을 사용해서 정상인의 혈장으로부터 면역글로불린을 분리·정제한다. 면역글로불린의 분리·정제 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
컬럼에 로딩하는 정제전 혈장 원액은 정상인 FP 혈장에 2.77%(w/v) CaCl2용액을 최종 부피의 10%(v/v)가 되도록 처리한 후 37℃ 항온 수조에서 2시간 방치하여 피브린 덩어리가 생긴 것이 관찰되면 원심분리하여 상등액만을 수집함으로써 항응고제 처리된 FP 혈장 내의 피브리노겐을 제거한 것으로서, 이를 다시 멸균된 거즈를 이용하여 여과한 후 동일 부피의 인산염 완충액과 혼합하여 제조하고, 최종 0.02%(w/v)가 되도록 치메로살(thimerosal)을 가하여 미생물의 번식을 방지한다.
정제전 혈장 원액을 로딩할 때 유속은 시간당 400 ㎖이며, 로딩이 끝난 후 5배, 바람직하게는 10배 겔(gel) 부피의 인산염 완충액으로 컬럼을 씻어낸다. 친화 컬럼에 결합한 유효 항체(면역글로불린)는 0.2 M 아세테이트 완충액 (pH 3.2)을 사용하여 용출시키고, 유효 항체의 용출은 pH 5.5 부근에서 시작되며, 얻어진 용출액은 1 M 탄산염 완충액 (pH 9.0)으로 적정하여 pH 7.0으로 중화시킨다. 유효 항체의 용출이 끝난 친화 컬럼은 4배 겔 부피의 상기 용출 완충액으로 씻어내고 다시 10배 부피의 인산염 완충액으로 씻은 후 최종적으로 0.02%가 되도록 치메로살을 함유한 5배 겔 부피의 인산염 완충액으로 씻어낸 후 4℃에 보관한다.
정제한 유효 항체를 고 순도로 정제하기 위해서 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 이용한다. 파마시아 바이오테크사의 단백질 A 세파로스 CL-4B 수지 50 ㎖을 취하여 10배 부피의 인산염 완충액을 가하고 잘 섞어준 후 정치시켜서 상층액에 부유하는 미세한 수지 입자를 제거한 후 적절한 컬럼에 충전한다. 10배 부피의 인산염 완충액을 사용하여 시간당 150 ㎖의 유속으로 충전된 컬럼을 씻어준 후 정제한 유효 항체 용액을 시간당 150 ㎖, 바람직하게는 80 ㎖의 유속으로 로딩한다. 로딩이 끝난 컬럼은 10배 부피의 인산염 완충액으로 잘 씻어서 비특이적으로 부착되어 있는 단백질을 제거한 후, 0.2 M 아세테이트 완충액 (pH 3.2)을 사용하여 용출한다. 유효 항체의 용출은 pH 5.5 부근에서 시작되고, 얻어진 용출액은 1 M 탄산염 완충액 (pH 9.0)으로 적정하여 pH 7.0으로 중화시키며, 이 경우의 유속도 시간당 150 ㎖을 유지한다. 유효 항체의 용출이 끝난 컬럼은 4배 겔 부피의 상기 용출 완충액으로 씻어주고 다시 10배 부피의 인산염 완충액으로 씻은 후 최종적으로 치메로살을 0.02%가 되도록 함유한 5배 겔 부피의 인산염 완충액으로 씻어낸 후 4℃에서 보관한다.
고 순도로 정제한 유효 항체를 농축하여 제형화에 적합한 농도와 조성으로 조절하기 위해서 밀리포어(Millipore)사의 Prep/Scale TFF 멤브레인 (차단 분자량: 30 kDa, 재생 셀룰로스)을 이용한 한외여과(diafiltration)를 실시한다. 고 순도의 유효 항체를 함유한 용액을 상온에서 자석 교반기를 이용하여 서서히 교반시키면서 10배 부피의 주사용 생리 식염수로 한외여과하여 항체 용액의 농도를 1 ㎎/㎖이 되도록 농축한다.
7종의 약독화 녹농균주의 세포외막 단백질 각각을 일정 비율로, 일반적으로는 거의 동량의 비율로 배합시켜 리간드로 사용한 친화 컬럼을 이용하여 정상인 혈장으로부터 얻어진 면역글로불린을 사용할 수도 있다. 그러나, 서로의 교차 반응성을 고려하여 볼때 바람직하게는, 약독화 녹농균주 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534의 4종의 균주로부터 얻은 세포외막 단백질을 1:1:1:1의 비율로 배합시켜 리간드로 사용한 친화 컬럼을 이용하여 정상인 혈장으로부터 얻어진 면역글로불린을 단백질 A 컬럼 크로마토그래피와 접선 유동 여과 장치(Tangential Flow Filtration system)를 통하여 고 순도로 정제한 녹농균 감염증 치료용 유효 항체를 사용함으로써도 피셔 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7형 모두의 녹농균에 의한 감염증에 대해 우수한 치료 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 녹농균 감염증 치료용 유효 항체는 필요에 따라 제약상 허용되는 담체, 예를 들면 안정화제, 보존제, 등장화제 등을 추가로 함유하는 동결건조 제제 또는 액상 형태의 제약 조성물, 바람직하게는 주사제 형태로 제형화시킬 수 있다. 사용될 수 있는 제약상 허용되는 담체는 바람직하게는 예를 들면, 동결건조 제제의 경우 만니톨, 락토스, 사카로스 등이며, 액상 제제의 경우에는 생리 식염수, 주사용 증류수, 인산염 완충액 등이다.
투여 용량은 녹농균에 감염된 환자의 연령, 체중, 성별, 건강 상태 및 녹농균 감염증의 심도 및 배합된 면역글로불린의 종류에 따라 광범위하게 상이하지만, 일반적으로 1일당 성인 체중 1 kg당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 바람직하게는 1 ㎎ 내지 100 ㎎을 정맥내 투여한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 녹농균의 세포외막 단백질의 분리·정제
(1) 약독화 녹농균의 배양
임상균주들로부터 순수하게 분리하여 약독화시킨 4개의 녹농균주 [P. aeruginosa CFCPA10142 (KCCM 10029), CFCPA20215 (KCCM 10030), CFCPA30720 (KCCM 10031) 및 CFCPA60534 (KCCM 10034)]들의 균체를 대량으로 수득하기 위해 150 리터 배양기를 사용하였다. 150 리터 배양기에 증류수 1ℓ당 트립틱 소이 브로스 30 g을 용해시켜 수득한 배지 용액 100 ℓ를 pH 7.2로 조정하여 투입한 다음 멸균하였다. 배양온도는 37℃, 통기량은 1v/v/m, 접종량은 배양용액에 대해 5％(v/v)의 조건을 사용하였으며 교반 속도를 200 rpm으로 고정시킨 후 12 내지 14시간 동안 배양하였다. 녹농균주의 종류에 따라서 수득된 균체의 양은 다소 다르나, 평균적으로 배양액 ℓ당 대략 습윤 중량으로 최소 25 g의 균체를 얻을 수 있었다.
(2) 약독화 녹농균주로부터 세포외막 단백질의 부분 정제
수득한 4종의 녹농균주로부터 세포외막 단백질을 부분 정제하기 위해서 하기에 상술한 방법을 사용하였으며 대표적인 예로서 피셔 3형의 균주 CFCPA 30720 (KCCM 10031)을 사용하였고, 다른 약독화 녹농균주에 대해서도 하기에 언급한 정제방법과 동일한 방법을 사용하여 정제하였다.
150 리터 발효조에서 배양이 완료된 후, 100 리터의 배양액을 실온에서 0.1 ㎛ 멤브레인 필터가 장착된 사르토콘(Sartocon) II 시스템(독일에 소재한 사르토리우스(Sartorius)사)을 사용하여 균체를 초기 배양 부피의 20분의 1인 5 리터로 농축하고, 이 농축 배양액을 4℃에서 6,000 x g로 20분간 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, 침전된 세포를 4℃의 10 mM 인산염 완충액(ℓ당 Na2HPO41.15 g, KCl 0.2 g, KH2PO40.2 g, NaCl 8.766 g, pH 7.2)에 현탁시키고 다시 원심분리한 후, 동일한 10 mM 인산염 완충액으로 세포를 세척하였다. 수득된 세포 약 2,500 g에 3배 용적의 아세톤을 가하고 일정한 시간 간격으로 교반해 주면서 4℃에서 12시간 동안 방치하였다. 침전된 세포로부터 아세톤을 제거한 후, 2배 용적의 신선한 아세톤을 다시 가하여 5 내지 10분 동안 교반하고 4℃에서 12시간 방치한 후 8,000 x g로 20분간 원심분리시켰다. 상층의 아세톤을 제거하고 침전 세포에 동일 용적의 아세톤을 가하여 상기와 동일한 방법으로 교반 및 정치한 다음 원심분리하고 상등액을 제거하여 침전된 세포를 수득하였다. 수득한 녹농균은 상기와 동일한 인산염 완충액 2,500 ㎖을 가하여 현탁시켰다. 4℃로 유지된 상태에서 균질화기(EYELA사 제품)를 사용하여 10분 동안 50 내지 200 rpm의 속도로 세포외막 단백질을 추출하였다. 수득한 현탁액을 8,000 내지 10,000 x g로 30분간 원심분리하여 상등액을 얻은 다음, 침전된 세포에 다시 동일 용적의 인산염 완충액을 가하여 현탁시킨 후, 상기의 추출 방법과 동일한 조건으로 2차 추출하여 다시 상등액을 얻었다.
상기에서 사용한 추출 방법과 동일한 조건을 사용하여 세포가 파쇄되지 않는 상태로 유지해 주면서 3 내지 4회 반복 추출하였다. 이때 세포의 파쇄 여부는 세포질내 표지물질인 특정 단백질, 즉 락테이트 데하이드로게나제를 측정함으로써 확인하였다. 세포질내 단백질인 락테이트 데하이드로게나제가 혼입되지 않은 상태로 세포외막 단백질이 추출된 것으로 확인된 각각의 상등액을 모아 교반한 다음, 최종적으로 4℃에서 12,000 x g로 30분간 재원심분리하여 투명한 상등액을 수득하였다. 이렇게 하여 수득한 단백질 용액은 거의 순수한 세포외막 단백질만으로 구성되어 있으며 단백질 정량을 통해서 농도가 1 mg/ml 내지 2 mg/ml로 유지되도록 조정하였다.
(3) 조 세포외막 단백질의 순수 정제
1 내지 2 mg/ml의 농도로 조정된 조 세포외막 단백질을 유효 성분만을 갖도록 순수 분리하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다. 2 내지 2.5 리터의 조 세포외막 단백질 수용액에 10 리터의 인산염 완충액을 첨가하여 4 내지 5배 희석하고 펠리콘 카세트 시스템에서 분자량 100 kDa 차단 멤브레인 필터를 사용하여 먼저 분자량 100 kDa 이상의 단백질 분자를 제거하였다. 이렇게 하면 분자량이 100 kDa 이하인 단백질은 여과액으로 빠져나가게 되며 분자량이 100 kDa보다 큰 단백질은 계속 순환되면서 분자량이 100 kDa보다 작은 분자들을 분리시키게 된다. 최초 용적의 10 내지 20％로 농축된 단백질 수용액을 최초 용적의 10배인 20 내지 25 리터의 멸균된 인산염 완충액(ℓ당 Na2HPO41.15 g, KCl 0.2 g, KH2PO40.2 g, NaCl 8.766 g)으로 계속 세척해 줌으로써 분자량 100 kDa 이하인 단백질을 90％ 이상 회수할 수 있었다. 여과액 중에 분리된 분자량 100 kDa 이하의 단백질을 동일 시스템에서 분자량 10 kDa 차단 멤브레인 필터를 사용하여 분자량이 10 kDa 미만인 단백질, 색소 및 기타 성분을 제거하는 동시에 분자량 10 kDa 내지 100 kDa 사이의 단백질을 1 mg/ml의 농도가 될 때까지 농축시켰다.
상기의 방법으로 약독화 녹농균주의 세포외막 단백질은 1차 및 2차 한외여과에 의해 분자량이 10 kDa 내지 100 kDa 범위의 단백질만 수득되도록 분획화시켰다. 이때 세포외막 단백질의 분자량 범위가 10 kDa 내지 100 kDa이 되도록 하는 것은 매우 중요한데, 이는 분자량이 10 kDa 미만인 분획은 색소 및 미량의 저분자 단백질로서 항체유도 물질로서의 효과가 없으므로 친화성 리간드로서 무의미하고, 분자량이 100 kDa보다 큰 범위의 분획에서는 고분자량의 리포폴리사카라이드가 존재하게 되는데 커플링된 리포폴리사카라이드에 의해 분리·정제되는 항체 자체는 녹농균 감염증에 대한 부수적인 치료제가 될 수 있으므로 문제가 없으나, 컬럼에 커플링된 리포폴리사카라이드가 유리될 경우 이로 인해 독성이 야기될 수 있기 때문이다.
최종적으로, 상기에서 수득한 분자량 10 kDa 내지 100 kDa의 세포외막 단백질 분획은 미량으로 존재하는 리포폴리사카라이드나 세포외막 관련 변성 단편들을 제거하기 위해 초원심분리시켰다. 초원심분리는 4℃로 유지된 상태에서 180,000 x g 내지 200,000 x g으로 3 시간 동안 수행하여 침전물을 제거한 후, 수득한 상등액을 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 제균함으로써 최종적으로 4,000 내지 5,000 mg의 순수한 세포외막 단백질을 수득하였다. 또한, 단백질 용액에 대해서 8 내지 15％ 농도구배 전기영동 방법에 의해 순도를 확인한 결과 목적하는 분자량 10 kDa 내지 100 kDa 범위의 세포외막 단백질의 존재를 확인할 수 있었다 (도 1). 상기 도 1에서, 레인 1은 표준 분자량 표지마커, 레인 2는 CFCPA10142의 세포외막 단백질, 레인 3은 CFCPA20215의 세포외막 단백질, 레인 4는 CFCPA30720의 세포외막 단백질, 레인 5는 CFCPA60534의 세포외막 단백질의 전기영동 결과를 나타낸다.
(4) 다른 면역형태를 가진 약독화 녹농균으로부터 세포외막 단백질의 정제
실시예 1의 (1), (2), (3)에 기술된 바와 같은 CFCPA 30720 녹농균에 대한 세포외막 단백질 조성물 제조를 위한 미생물 배양 및 정제 공정과 동일한 조건 및 방법에 따라 본 발명에서 사용된 나머지 3종의 약독화 녹농균주 CFCPA 10142, CFCPA 20215 및 CFCPA 60534를 처리하였다. 이렇게 하여 수득한 최종 녹농균 세포외막 조성물은 8 내지 15％ 농도구배의 SDS-PAGE에서 CFCPA 30720에서 얻어진 것과 동일한 밴드 형태를 나타내었으며, 표준 분자량 표지물(Standard molecular weight marker)과 비교해 본 결과 모든 단백질이 10 kDa 이상 내지 100 kDa 이하의 단백질들로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다 (도 1).
(5) 각 약독화 녹농균주로부터 정제한 세포외막 단백질의 배합
실시예 1의 (1), (2), (3) 및 (4)에 기술된 바와 동일한 조건 및 방법을 반복 수행하여 4종의 약독화 녹농균주 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534로부터 각 균주별로 4,000 내지 5,000 mg의 순수한 세포외막 단백질을 수득하였고, 얻은 세포외막 단백질을 1:1:1:1의 비율로 혼합하여 리간드로 사용할 총 5,000 ㎎의 순수한 세포외막 단백질을 제조하였다.
실시예 2 : 항체 제조용 친화 컬럼의 제조
(1) 항체 결합용 리간드의 전처리
실시예 1의 (5)에서 수득한 총 5,000 ㎎의 순수한 세포외막 단백질을 함유하는 10 mM 인산염 완충액을 펠리콘 카세트 시스템에서 분자량 10 kDa 차단 멤브레인 필터를 사용하여 한외여과함으로써 농축과 완충액 교환의 과정을 동시에 수행하여 최종 800 ㎖의 커플링 완충액(0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3)에 용해되도록 하였다.
(2) 컬럼 수지의 전처리 및 리간드의 커플링
파마시아 바이오테크사의 CNBr-활성화 세파로스 4B 수지 145 g을 1 mM HCl 1,000 ml에 충분히 현탁시킨 후 소결 유리 필터 (sintered glass filter)를 이용하여 1 mM HCl 9,000 ml로 세척해서 미세한 입자나 보존제 등을 제거하였다.
실시예 2의 (1)에서 기술한 바와 같은 방법으로 제조한 5,000 ㎎의 순수한 세포외막 단백질이 포함된 800 ml의 커플링 완충액 (0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3)에 상기 세척된 CNBr-활성화 세파로스 4B 수지를 잘 풀어 4℃에서 12시간 동안 자석 교반기를 사용하지 않고 흔들어 준 후 소결 유리 필터를 이용하여 커플링 완충액으로 가볍게 씻어 주고 나서 1,000 ml의 차단 용액(blocking solution) (1 M 에탄올아민, pH 8.0)에 현탁시켜 4℃에서 3시간 이상 흔들어줌으로써 반응하지 않고 남아있는 수지의 CNBr 반응성 기질들을 막아주었다. 이 겔을 소결 유리 필터를 이용하여 인산염 완충액으로 가볍게 씻어 준 후 1,000 ml의 인산염 완충액에 풀어 주고 나서 진공 펌프를 사용하여 기포가 관찰되지 않을 때까지 충분히 탈기시켰다.
상기 방법으로 커플링된 겔을 2배 부피의 0.1 M 아세테이트 완충액 (pH 4.0, 0.5 M NaCl) 및 동일 부피의 커플링 완충액을 사용해서 교대로 3회 반복하여 씻어주므로써 반응하지 않고 겔에 정전기적으로 결합되어 남아있는 세포외막 단백질 리간드를 제거하였다.
커플링이 완료된 수지를 적절한 컬럼에 충전하고 3배 부피의 0.1 M 아세테이트 완충액 (pH 4.0, 0.5 M NaCl) 및 동일 부피의 커플링 완충액을 사용해서 교대로 1회 반복하여 씻어준 후 10배 부피의 인산염 완충액으로 충분히 씻어주었다. 커플링 전후의 총 단백질량을 정량하여 비교한 결과, 상기 과정을 통하여 커플링된 리간드의 양은 건조 중량 기준으로 수지 1 g당 18.5 ㎎이었으며 총 2,682 ㎎의 정제된 순수 세포외막 단백질 리간드를 세파로스 CL-4B 수지에 커플링하였으며 이때의 커플링 효율은 54%이었다.
실시예 3 : 정상인 혈장으로부터 녹농균 감염증 치료용 유효 항체(면역글로불린)의 고순도 정제
(1) 정상인 혈장의 전처리
적십자 혈액원으로부터 구입한 정상인 FP 혈장 12 단위 (220∼230 ㎖/단위)를 모으고 2.77% CaCl2용액을 최종부피의 10%가 되도록 처리한 후 37℃ 항온 수조에서 2시간 방치하여 피브린 덩어리가 생긴 것이 관찰되면 10,000 x g, 4℃ 조건 하에서 40분간 원심분리하여 상등액만을 수집함으로써 항응고제 처리된 FP 혈장 내의 피브리노겐을 제거하였다. 12 단위의 혈장 백(bag)으로부터 상기 처리를 통해 얻은 약 2 ℓ의 혈장을 4 내지 5겹의 멸균 거즈를 이용하여 여과한 후 동일 부피의 인산염 완충액과 혼합하여 총 4 ℓ의 정제전 혈장 원액을 제조하였고, 최종 0.02%가 되도록 0.8 g의 치메로살을 가하여 미생물의 번식을 방지하였다.
(2) 친화 컬럼 크로마토그래피를 이용한 유효 항체의 정제
실시예 2의 (2)에서 제작한 친화 컬럼에 실시예 3의 (1)의 정제전 혈장 원액 4ℓ를 로딩하였다. 이 때 유속은 시간당 400 ㎖이었으며, 로딩이 끝난 후 5배, 바람직하게는 치메로살을 함유하지 않은 10배 겔 부피의 인산염 완충액으로 컬럼을 씻어주었다. 친화 컬럼에 결합한 유효 항체의 용출은 0.2 M 아세테이트 완충액 (pH 3.2)을 사용하였으며 유효 항체의 용출은 pH 5.5 부근에서 시작되었고, 이때 용출액 내의 유효 항체가 변성되는 것을 방지하기 위해서 2배 농도인 20 mM 인산염 완충액(pH 7.2)을 미리 준비하여 이 용액 내로 용출액이 용출되어 나오도록 하였다. 얻어진 용출액은 1 M 탄산염 완충액 (pH 9.0)으로 적정하여 pH 7.0으로 중화하였으며 최종 부피는 1,200 ㎖이었고 단백질 정량 결과 총 576 ㎎의 유효 항체를 얻을 수 있었다 (제조 번호 1, 표 1). 유효 항체의 용출이 끝난 친화 컬럼은 4배 겔 부피의 상기 용출 완충액으로 씻어주고 다시 10배 부피의 인산염 완충액으로 씻은 후 최종적으로 치메로살을 0.02% 되게 함유한 5배 겔 부피의 인산염 완충액으로 씻어주어 4℃에 보관한다.
(3) 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 이용한 유효 항체의 고순도 정제
실시예 3의 (2)의 방법으로 정제한 유효 항체를 고 순도로 정제하기 위해서 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 이용하였다. 파마시아 바이오테크사의 단백질 A 세파로스 CL-4B 수지 50 ㎖을 취하여 10배 부피의 인산염 완충액을 가하고 잘 섞어준 후 정치시켜서 상층액에 부유하는 미세한 수지 입자를 제거한 후 적절한 컬럼에 충전하였다. 충전된 컬럼은 10배 부피인 500 ㎖의 인산염 완충액을 사용하여 시간당 150 ㎖의 유속으로 씻어준 후 실시예 3의 (2)의 방법으로 정제한 유효 항체 용액을 시간당 150 ㎖, 바람직하게는 80 ㎖의 유속으로 로딩하였다. 로딩이 끝난 컬럼은 10배 부피인 500 ㎖의 인산염 완충액으로 잘 씻어서 비특이적으로 부착되어 있는 단백질을 제거한 후, 0.2 M 아세테이트 완충액 (pH 3.2)을 사용하여 유효 항체를 용출하였다. 유효 항체의 용출은 pH 5.5 부근에서 시작되었고, 이때 용출액 내의 유효 항체가 변성되는 것을 방지하기 위해서 2배 농도인 20 mM 인산염 완충액(pH 7.2)을 미리 준비하여 이 용액 내로 용출액이 용출되어 나오도록 하였다. 얻어진 용출액은 1 M 탄산염 완충액 (pH 9.0)으로 적정하여 pH 7.0으로 중화하였으며, 이 경우의 유속도 시간당 150 ㎖을 유지하였다. 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제한 결과, 용출액의 최종 부피는 720 ㎖이었고 단백질 정량 결과 총 351 ㎎의 고 순도로 정제된 유효 항체를 회수할 수 있었다 (제조 번호 1, 표 1). 유효 항체의 용출이 끝난 컬럼은 4배 겔 부피의 상기 용출 완충액으로 씻어주고 다시 10배 부피의 인산염 완충액으로 씻은 후 최종적으로 치메로살을 0.02% 되게 함유한 5배 겔 부피의 인산염 완충액으로 씻어주어 4℃에 보관한다. 표 1에서 보는 바와 같이 동일한 정제 공정을 3회 수행한 결과, 최종적으로 정제된 사람 항체의 양은 평균 353 mg이었으며 제조 배치별로 매우 안정적인 항체 회수율을 나타냈다. 또한, 각 정제 공정별로 얻어진 시료를 사용하여 실시한 8 내지 15% 농도 구배의 SDS-PAGE 결과는 도 2 (레인 1, 표준 분자량 표지마커; 레인 2, 원혈장의 전체 단백질; 레인 3, 친화 컬럼에서 용출된 단백질; 레인 4, 단백질 A 컬럼에서 용출된 최종 정제된 사람 항체 단백질)에 도시하였으며, 최종 정제한 녹농균 세포외막 단백질에 특이적으로 결합하는 사람 항체는 95% 이상의 순도(도 2, 레인 4)를 보이므로 매우 순수하게 정제되었음을 확인하였다.
| 제조 번호 | 사용한 혈장의부피 (㎖) | 친화 컬럼 용출액: 농도(용출 부피) | 용출된 항체의 총량 (mg) | 단백질 A 컬럼 용출액: 농도 (용출 부피) | 최종 정제된 사람 항체의 총량 (mg) |
| 1 | 2,000 ㎖ | 480 ㎍/㎖(1,200 ㎖) | 576 mg | 488 ㎍/㎖(720 ㎖) | 351 mg |
| 2 | 2,000 ㎖ | 554 ㎍/㎖(1,000 ㎖) | 554 mg | 483 ㎍/㎖(720 ㎖) | 348 mg |
| 3 | 2,000 ㎖ | 586 ㎍/㎖(1,050 ㎖) | 615 mg | 507 ㎍/㎖(710 ㎖) | 361 mg |
(4) TFF (접선 유동 여과, tangential flow filtration) 시스템을 이용한 유효 항체의 농축
실시예 3의 (2) 및 (3)에서 고 순도로 정제한 유효 항체를 농축하여 제형화에 적합한 농도와 조성으로 조절하기 위해서 밀리포어사의 Prep/Scale TFF 멤브레인 (차단 분자량 30 kDa, 재생 셀룰로스)을 이용한 한외여과를 실시하였다. 실시예 3의 (3)에서 수득한 고 순도의 유효 항체를 함유한 용액 720 ㎖(제조번호 1, 표 1)을 상온에서 자석 교반기를 이용하여 서서히 교반시키면서 10배 부피인 7200 ㎖의 주사용 생리식염수에 대하여 한외여과하여 최종 340 ㎖의 유효 항체 용액으로 농축하였으며 이 때 농도는 1 ㎎/㎖이었다.
실시예 4 : 정제된 유효 항체의 녹농균 감염증에 대한 치료 효과
실시예 3에서 수득한 유효 항체의 녹농균 감염증에 대한 치료 효과를 다음과 같은 방법에 의해 확인하였다. 이하에서는 각 군당 20 마리씩의 생쥐를 사용하였다.
사람 혈장에서 순수 정제된 유효 항체를 5주령의 웅성 ICR 생쥐당 0.2 ㎎의 양으로 0.5 ㎖을 복강내 주사하고 2 내지 6시간 후에 피셔 면역형 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7형의 병원성 녹농균을 각각 LD50의 5 내지 10배에 해당하는 3.6 내지 7.3 x 107세포씩 복강내 주사하여 녹농균 감염증을 야기시키고 이에 대한 정제 항체의 치료 효과를 시험하였다. 대조군에는 유효 항체 대신에 주사용 생리식염수 0.5 ㎖를 복강내 주사하였다. 대조군의 공격 균주로는 피셔 면역형 1형을 사용하여 4.6 x 107세포를 투여하고, 동일한 방법으로 생존율을 관찰하였다.
그 결과, 주사용 생리식염수만을 투여한 대조군에서는 48시간 이내에 50％ 이상, 72시간에 100％의 치사율을 나타낸 반면에, 유효 항체를 투여한 모든 시험군에서는 72시간 후에도 최소 85% 이상의 생존율을 나타내었다. 따라서, 정상인 혈장으로부터 정제한 녹농균에 대한 유효 항체가 모든 피셔 면역형의 병원성 녹농균주에 의한 감염증의 치료에 유효한 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명에 따라 정상인 혈장으로부터 정제한 녹농균에 대한 유효 항체 조성물은 전체 피셔 면역형의 녹농균주에 의한 감염증에 대한 효과적인 치료제로서 사용할 수 있다. 상기 결과는 표 2에 요약하여 나타내었다.
| 공격 균주 | 투여량(cfu/생쥐) | 생존 생쥐/전체 생쥐 | 생존율(%) | ||||
| 0일 | 1일 | 2일 | 3일 | 5일 | |||
| F1 | 4.6 x 107 | 20/20 | 19/20 | 19/20 | 18/20 | 18/20 | 90 |
| F2 | 5.5 x 107 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 19/20 | 19/20 | 95 |
| F3 | 4.1 x 107 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 100 |
| F4 | 7.0 x 107 | 20/20 | 19/20 | 18/20 | 18/20 | 18/20 | 90 |
| F5 | 3.6 x 107 | 20/20 | 18/20 | 18/20 | 18/20 | 18/20 | 90 |
| F6 | 5.2 x 107 | 20/20 | 20/20 | 19/20 | 19/20 | 19/20 | 95 |
| F7 | 7.3 x 107 | 20/20 | 18/20 | 17/20 | 17/20 | 17/20 | 85 |
실시예 5 : 정제된 유효 항체의 제제화
상기 실시예 1에서와 같이 선택된 4 종의 약독화 녹농균주 CFCPA10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534를 배양 및 추출하여 수득한 세포외막 단백질의 배합 조성물을 실시예 2 및 3에서와 같은 방법으로 세파로스 CL-4B 수지에 커플링하여 제조한 친화 컬럼 및 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정상인 혈장으로부터 분리·정제한 녹농균 감염증 치료용 유효 항체를 체중 kg당 유효 항체 1 내지 100 ㎎이 투여될 수 있도록 다양한 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제제화하였다. 제제화된 유효 항체 0.2 mg을 각 시험군별로 20마리의 생쥐에게 복강내 투여한 다음, 2시간 후에 공격 균주를 복강내 투여하고 담체의 종류에 따른 사람 항체의 유효성 차이를 관찰하였다. 이때 사용한 공격 균주는 GN11189이며 5 x LD50에 해당하는 1.0 x 107세포씩 복강내 주사하여 녹농균 감염증을 야기시키고 그 효과를 생존율로 비교하여 판정하였다. 이 시험의 결과는 다음 표 3에 나타내었다. 그 결과, 액상 제제의 경우에는 담체로서 주사용 생리식염수 또는 인산염 완충액을 사용한 유효 항체 제제가 유사한 정도의 높은 유효성을 보였고, 동결건조 제제인 경우에는 만니톨, 사카로스 또는 락토스를 담체로 사용한 경우에 액상 제제와 유사한 높은 유효성을 나타내었다.
| 제 제 | 사용한 담체 | 생존율 (%) | 유효성 |
| 액 상 | 생리 식염수 | 95 | +++ |
| 인산염 완충액 | 95 | +++ | |
| 트리스염 완충액 | 80 | + | |
| 동결건조 | 만니톨 | 95 | +++ |
| 사카로스 | 90 | ++ | |
| 락토스 | 95 | +++ | |
| 사람 알부민 | 85 | + |
(+++; 우수, ++; 보통, +; 미흡)
실시예 6 : 제제화된 유효 항체 조성물의 유효성
실시예 5의 시험 결과에 따라 유효성이 높은 것으로 관찰된 인산염 완충액을 사용하여 제제화된 유효 항체의 열상, 화상, 외상 등에서의 2차 피부 감염에 대한 예방 및 치료제로서의 유효성을 확인하였다. 공지의 화상 시험 방법[참조: J. Infect. Dis. 131, 688-691, 1975]으로 5주령 웅성 ICR 생쥐에게 화상을 유도하고 15시간 경과 후 95% 이상의 생존율을 보임을 확인한 다음, 인산염 완충액 ㎖당 녹농균 감염증 치료용 사람 항체 1.0 ㎎을 함유하는 액상 제제를 시험군 생쥐당 500 ㎕씩 복강내 투여하였다. 복강내 투여 2시간 후 피셔 면역형 6형의 병원성 녹농균주 GN11189를 5 x LD50에 해당하는 1.0 x 107세포씩 복강내 주사하여 녹농균 감염증을 야기시키고 그 효과를 대조군인 생리식염수를 복강내 투여한 치료 항체 비처리군에서의 생존율과 비교하여 판정하였다. 그 결과, 유효 항체-인산염 완충액 액상 제제로 복강내 투여한 생쥐군에서는 비처리군에 비해 월등히 우수한 생존율을 나타내었으며, 따라서 본 발명에 따른 녹농균 감염증 치료용 유효 항체 함유 제제가 녹농균 감염증에 대해 우수한 치료 효과를 나타냄을 알 수 있다. 이 시험의 결과는 다음 표 4에 나타내었다.
| 시험군 | 항체 투여량 (mg/생쥐) | 공격군 GN11189 투여량 (cfu/생쥐) | 생존 생쥐/전체 생쥐 | 생존율(%) | ||||
| 0일 | 1일 | 2일 | 3일 | 5일 | ||||
| 대조군 | 0 | 1.0 x 107 | 20/20 | 3/20 | 1/20 | 1/20 | 1/20 | 5 |
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본 발명에 의해 안전한 약독화 녹농균주로부터 분리·정제된 세포외막 단백질에 특이적으로 결합하는 사람 면역글로불린은 다양한 녹농균 감염 뿐만아니라 중증의 감염증에 대해서도 우수한 치료 효과를 보이고, 따라서 이 면역 글로불린을 활성 성분으로서 함유하는 녹농균 감염증 치료제는 그 의학적 유효성이 우수하다.
Claims (1)
- 활성성분으로서 안전한 약독화 녹농균주로부터 분리·정제된 세포외막 단백질에 특이적으로 결합하는 사람 면역글로불린을 포함하는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) 감염증 치료제.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1019970064024A KR100250714B1 (ko) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | 녹농균 감염증 치료제 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019970064024A KR100250714B1 (ko) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | 녹농균 감염증 치료제 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19990043047A true KR19990043047A (ko) | 1999-06-15 |
| KR100250714B1 KR100250714B1 (ko) | 2000-12-01 |
Family
ID=19525903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1019970064024A KR100250714B1 (ko) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | 녹농균 감염증 치료제 |
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-
1997
- 1997-11-28 KR KR1019970064024A patent/KR100250714B1/ko not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100250714B1 (ko) | 2000-12-01 |
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