KR19990034655A - 바이러스 저항성 식물체의 생산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이러스 외피단백질 도입을 통하여 난초, 담배등 바이러스 저항성 식물체의 생산에 관한 것으로서 심비디움 모자이크 바이러스(CyMV)의 외피단백질 유전자를 순수분리하여 재조합유전자를 제조한후 식물세포내로 도입하여 바이러스에 내성이 있는 형질전환 식물체를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

바이러스 저항성 식물체의 생산
본 발명은 바이러스 외피단백질 유전자도입을 통한 바이러스 저항성 난초, 담배등 식물체의 생산에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 심비디움 모자이크 바이러스(cymbidium mosaic virus, CyMV)의 외피단백질(coat protein) 유전자를 순수분리하여 재조합 유전자를 제조한 후 식물 세포내로 도입하여 바이러스 저항성 형질전환 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
난은 꽃과 줄기를 관상의 주된 대상으로 하기 때문에 병충해에 한번 피해를 입으면 상품가치가 떨어져 폐기 처분해야 하므로 어느 작물보다도 병충해에 의한 경제적 손실이 심각하다. 병충해에 의한 피해에서도 난의 품질을 퇴화시키는 가장 중요한 요인은 각종 바이러스병에 의한 피해이며, 난식물체에서 CyMV에 의한 바이러스병은 피해가 세계적으로 가장 심각한 실정이다. 이 바이러스에 감염되었을 경우 증상은 꽃 생산량 감소, 기형화 생성 증가, 꽃 품질 저하, 화아의 소실 등이 일어나며 심한 경우 식물 자체가 고사한다. 또한 CyMV 바이러스는 널리 재배되고 있는 난 품종을 기주로 하고 있으며, 난의 상품가치를 저하 시키는 증상을 나타내는 것으로 알려져 있다(Zettler et. al., Plant Disease, 74, 621-625, 1990).
종래 난에 대한 바이러스의 감염 및 그 피해정도를 줄이려는 연구가 다방면으로 있어 왔으나 아직은 그 효과가 미미한 상태이다. 그 이유는 바이러스의 감염기작이 확실하게 밝혀진 것이 없고 전형적인 생활상을 보이지 않기 때문이며 또 곤충이나 곰팡이, 세균 등과 같은 미생물에 대한 화학적 방제가 바이러스에는 어렵다는 것이다. 그러나 최근 분자생물학과 유전자조작 기술의 비약적인 발달에 의해 바이러스의 식물체 감염기작에 관한 연구가 활발히 진행되고 있고(Fraser, Annu. Rev., 28, 179-200, 1990), 식물체로의 외부유전자 도입 기술의 발달로 쌍자엽식물 뿐만 아니라 electroporation, bombardment등을 이용한 단자엽 및 기타 작물의 형질전환도 가능하게 되었다(Songstad et. al., Plant Cell. Org. Cult. 40, 1-15, 1995). 바이러스 저항성식물체를 유전공학적인 기법으로 개발하기 위해서는 외피단백질유전자를 식물체에 삽입 하거나 위성(satellite) RNA를 이용하는 방법, antisense RNA를 이용하여 바이러스유전자의 발현을 억제함에 따라 바이러스 저항성을 가지는 식물체를 얻는 방법들이 알려져 있다(Scolthof et. al., Plant Physiol. 102, 7-12, 1993).
한편, CyMV는 Jensen(Phytopath, 41,491-494, 1951)이 명명한 바이러스로서 모양은 구부러진 막대모양이며, 길이는 500nm, 폭은 18nm, 보존한계는 7일, 내열성은 65-75 C인 Potexvirus 그룹이다. 특히, CyMV의 RNA 제놈 크기는 6.8kb이고, 외피단백질의 크기는 25-26 kDa로 Ryu 등에 의하여 CyMV 외피단백질유전자의 염기서열이 결정되었으며(Gene, 156, 303-304, 1995), 상기의 유전자를 식물체서 발현시켜 형질전환체를 제조하고자 하는 시도가 진행되고 있다.
따라서 본 발명의 목적은 CyMV viral RNA로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이로부터 순수분리한 CyMV 외피단백질유전자를 식물세포로 유전자를 운반하는 적당한 벡터에 삽입하여 식물세포를 형질전환시키기에 적합한 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 벡터로 형질전환되어 세포에서 CyMV 외피단백질 유전자를 생성하는 식물체의 생산방법을 제공하여, CyMV 내성이 약한 식물을 이 바이러스에 내성이 있는 식물로 형질전환하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여 CyMV 외피단백질 유전자를 CyMV의 증식기주인 Nicotiana occidentalis에 증식시킨 다음 CyMV viral RNA를 분리하고, 1㎍의 viral RNA로부터 cDNA 라이브러리를 제조한 다음, CyMV에 특이적인 프라이머를 이용하여 CyMV 외피단백질 유전자를 순수분리하였다. 분리한 CyMV 외피단백질 유전자를 클로닝하여 이들에 대하여 생거(Sanger)의 디데옥시사슬 종결방법(dideoxy chain termination)으로 전체 염기서열을 결정하였다(Sanger, Science, 214, 1205-1210, 1981).
또 분리한 CyMV 외피단백질 유전자를 식물체에서 발현시키기 위하여 이원벡터(binary vector)인 pMBP1의 절편을 연결시켜 식물체의 형질전환에 사용할 벡터 pMBPCPS와 pMBPCPA를 완성하였다.
그리고, CyMV 외피단백질 유전자를 식물체에서 발현시키기 위하여 pMBPCPS 와 pMBPCPA를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404)로 도입하고, 이 아그로박테리움으로 식물세포를 형질전환하였다. 상기의 벡터는 1997년 10월 17일 생명공학연구소에 기탁번호(KCTC 8839P)로 기탁하였다. 형질전환된 식물세포는 100㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin)과 300㎍/㎖ 카베니실린(carbenicillin)이 함유된 슈트(shoot)유도 선택 배지에서 슈트를 유도한다. 유도된 슈트를 선택배지에 치상하여 뿌리를 유도하고, 뿌리가 유도된 식물을 포트에 옮겨 순화시키고 계속 생육시켰다. 식물세포로 도입된 CyMV 외피단백질 유전자가 발현되는지의 여부를 검정하기 위하여 PCR를 수행하여 CyMV 외피단백질 유전자가 식물체의 게놈(genome)에 도입되었는지 확인하였다. 또한, 노던 블롯 방법으로 유전자가 전사(transcription)되었는지의 여부를 확인하였다. 끝으로 형질전환된 식물체에 CyMV를 접종하여 바이러스에 대한 내성을 검정하였다.
이하 본 발명의 구체적으로 구성과 작용을 실시예에 의거하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 설명을 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위는 이에만 제한되지 않는다.
도 1은 cDNA 라이브러리로부터 순수분리한 CyMV 외피단백질 유전자의 완전한 염기서열을 나타내고,
도 2는 CyMV 외피단백질 유전자를 식물체에서 발현시키기 위하여 pMBPCPS 와 pMBPCPA를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404)로 도입하는 일련의 순서를 도식화한 그림이며,
도 3은 발현벡터와 pMBPCPS와 pMBPCPA를 이용한 담배세포의 형질전환 과정을 순서대로 보여주고 있으며,
도 4는 형질전환된 담배로부터 NPTII 특이적 프라이머를 이용해서 PCR한 결과를 나타내며,
도 5는 CyMV 외피단백질 유전자를 도입시킨 담배로부터 분리한 전체 RNA를 분리하여 노던(Northern) 분석을 수행한 결과를 나타내며,
도 6은 형질전환된 담배의 접종 15일 후의 바이러스검정을 나타내며(상부잎은 증상이 없음),
도 7은 형질전환되지 않은 담배의 접종 5주 후 2차엽이 바이러스에 감염된 것을 나타내는 바이러스 검정결과이다.
도 8은 형질전환된 담배의 접종 5주 후, 2차엽의 바이러스 검정결과이다.
실시예1 : CyMV viral RNA로부터 cDNA 합성과 클로닝
CyMV viral RNA 분리는 PEG(polyethylene glycol) 침전법과 원심분리에 의하여 CyMV를 분리하고, viral RNA 정제는 두 번의 phenol 추출과 페놀/클로포름(1:1) 추출에 의하여 정제하였다.
정제한 1㎍의 viral RNA를 올리고(dT) 셀룰로스 컬럼을 이용하여 mRNA를 분리하고 정제하였으며, 분리한 5㎍의 mRMA를 취하여 ZAP-cDNA 합성 키트(Stratagene, U.K.)를 이용하여 cDNA을 합성하였다. 합성된 cDNA에 EcoRI 어댑터(adapter)를 붙인 후, 세파크릴(Sephacryl) S-400 스펀 컬럼으로 합성된 cDNA를 크기에 따라 분획하였다. 분획된 cDNA를 Uni-Zap XR 벡터(Stratagene, U.K.)와 결합한 후 패키징 익스트랙트(packaging extract)를 사용하여 실험실적 패키징(in-vitro packaging)을 수행하였다.
실시예2 : CyMV cDNA의 염기서열 결정
CyMV cDNA의 염기서열 결정은 Amersham의 thermo sequenase cycle sequencing kit의 방법에 따라 수행하였다. CyMV 유전자를 분리하기 위하여 증폭된 PCR 반응산물의 절편을 DIG-Labeling & Detection 키트(Boehringer Mannheim, Germany)를 이용하여 표지하고 이를 프로브(probe)로 사용하였다. 먼저 82-mm 페트리디쉬(petri dish)에 약 6×105pfu의 프라크(plaque)가 형성되도록 대장균(E. coli) XL1-Blue에 파아지(phage)를 감염시켜, 37℃에서 12시간 배양하여 스크리닝을 수행하였다. 스크리닝으로부터 white colony만을 얻었고 재조합 Uni-ZAP XR 파아지들이 지니고 있는 파아지미드(phagemid)를 대장균인 XL1-blue로 옮기기 위하여 R408 헬퍼파지 (helper phage)를 이용하여 생체내 절단(in vivo excision)을 수행하였으며, 생성된 콜로니들을 각각 8개씩 선별하여 알칼리 용혈(alkaline detergent) 방법으로 플라스미드를 분리하고, EcoRI과 KpnI으로 이중절단하여 amarathin 유전자를 지니고 있는 클론들을 선별하였다.
염기서열을 결정하기 위하여 분리한 클론을 pBlueScript SK(-) 벡터에 서브클로닝(subcloning)시켰다. 선발된 클론을 PstⅠ으로 절단한 후 자가연결(self ligation)을 수행하여 형질전환가능한 XL1-Blue에 형질전환시킨 다음, 50㎍/㎖ 앰피실린이 함유된 LB 배지(10g/ℓ Bactotrypton, 5g/ℓ Yeast exrtact, 5g/ℓ NaCl, pH 7.5)에서 생성된 콜로니들을 선별하여 알칼리 용혈 방법으로 플라스미드를 분리하여, HindⅢ+SmaⅠ으로 절단한 다음 적당한 서브클론들을 선발하였다.
각, 콜로니로부터 얻은 DNA를 정제하여 SK 프로모터 프라이머, T7 프로모터 프라이머를 사용하여 디데옥시 사슬 종결법으로 시쿼나제(Sequenase, USB)를 사용하여 CyMV cDNA 삽입체(insert)의 염기서열을 결정하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, pMBP1이 지니고 있는 CyMV cDNA 삽입체의 염기서열을 결정한 결과, 전체크기는 약 1.5kbp이며, 이 가운데 CyMV 외피단백질을 합성하는 구조유전자 부분은 660bp로 이루어진 하나의 개방 해독틀(open reading frame)로 되어 있으며, 다른 potexvirus와 마찬가지로 CyMV의 외피단백질 유전자가 3' 쪽에 위치한다는 것과 3'이 폴리아데닐 부위(polyadenylation site)가 있음을 볼 수 있었다. 도 1에서 (*)는 종결코돈을 나타내며, 아미노산 서열은 IUPAC 명명법에 따라 작성되었다. 도 1에 보듯이 CyMV 외피단백질은 아미노산 200개로 구성된 약 35kDa의 단백질로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
한편, 다른 CyMV 외피단백질유전자의 염기서열을 비교해 본 결과 CyMV-S(Chia et. al., Plant Mol. Biol., 18, 1901-1099, 1992)와 CyMV-K(Ryu et. al., Gene, 156,303-304, 1995)와 nucleotide sequences에서는 각각 93% 와 91%의 동일성이 있었다. 이들은 염기서열상에서 각각 44개와 59개의 염기가 치환되어 있었다.
실시예3 : 이원벡터(binary vector) pMBP1의 조작 및 pMBPCPS 와 pMBPCPA의 제작
식물발현용 운반 벡터는 pMBP1을 사용하고 CyMV의 외피단백질이 역방향과 정방향으로 삽입된 발현벡터를 사용하였다(도 2).
pCyMV1을 PstⅠ+EcoRⅠ으로 자르고 T4 DNA Polymerase를 처리하여 blunt end로 만든 후 0.8% gel에 전기 영동하여 외피단백질 유전자가 포함된 band를 잘라 elution하였다. 이것을 SmaⅠ-cut pGEM-7Z(+) vector에 ligationt시킨후 E. coli JM109에 transformation시킨 다음 12개의 white colony를 선발하여 DNA를 준비한 후 EcoRⅠ과 BamHⅠ으로 잘라 외피단백질 유전자와 삽입여부를 확인하였다.
또한 이 DNA들을 BamHⅠ과 PvuⅡ로 잘라 외피단백질 유전자와 삽입방향을 확인하였고, 이를 sequencing을 통하여 재차 확인한 결과 T7 promotor에 대하여 정방향(sense)으로 삽입된 것과 역방향(antisense)으로 삽입된 것으로 구분하여 이 클론들을 각각 pCyCPS와 pCyCPA라고 명명하였다.
한편, pMBPⅠ을 kanamycin(50㎍/㎖)이 첨가된 LB액체배지에 배양하여 DNA를 준비한 후 XbaⅠ으로 자른 다음 CIP를 처리한 후 전기 영동하여 elution하였다.
이와 마찬가지로 pCyCPS를 XbaⅠ으로 잘라 CyMV외피단백질 유전자가 포함된 band를 elution하여 XbaⅠ-cut pMBⅠ에 ligation시키고 E. coli JM109에 transformation시켜 15개의 clone을 얻었다. Transformation 된 cell을 kanamycin(50㎍/㎖)이 포함된 LB고체배지에 도말하여 transformant 4개의 clone을 선발하였으며 이 클론들을 kanamycin(50㎍/㎖)이 첨가된 3㎖ LB액체배지에 배양하여 DNA를 준비한 뒤 XBaⅠ, HindⅢ+KpnⅠ으로 각각 잘라 외피단백질 유전자의 삽입여부와 삽입방향을 확인하였다. 여기에서 얻은 클론들을 각각 pMBPCPS와 pMBPCPA라 명명하였다.
실시예 4 : 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개에 의한 식물세포의 형질전환
CyMV 외피단백질유전자가 CaMV 35S촉진유전자 하에서 발현이 조절되도록 제조한 실시예 3에서 수득한 식물체 형질전환용 이원벡터인 pMBPCPS 와 pMBPCPA를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404로 형질전환하기 위하여 동결-용해(freeze-thawing) 방법을 사용하였다. 상기벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404로 선별하기 위하여 아그로박테리움 프라스미드 퀵스크린(quick-screen) 방법으로 DNA를 분리하고 제한효소 HindⅢ+KpnⅠ로 절단하여 형질전환 여부를 확인하였다(Stanton et. al., Plant Molec. Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1988).
pMBPCPS 및 pMBPCPA으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404는 1997년 10월 17일 생명공학연구소에 기탁번호(KCTC 8839P)로 기탁하였다.
담배세포의 형질전환에는 Nicotiana occidentalis를 사용하였다. 온실에서 자란 담배본엽을 70%(v/v) 에탄올에 30초간 처리한 후 2% sodium hypochloride로 15분간 소독하고 멸균수로 5-6회 세척 후, 사방 8mm로 잘라서 담배세포의 형질전환용 재료로 사용하였다. pMBPCPS 및 pMBPCPA으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404는 LB배지에서 28℃, 200rpm으로 18시간 진탕배양하였다. 배양 후 원심분리하여 균체를 회수하고 MS기본배지로 세포수가 ml당 약 1 내지 2 x 103이 되도록 현탁하여 담배세포의 형질전환에 사용하였다. 담배잎 절편을 pMBPCPS 및 pMBPCPA을 지니고 있는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404 현탁액에 1일간 공조배양한 후, 2.0 mg/ℓ BAP(benzyl aminopurine), 100mg/ℓ kanmycin 그리고 300 mg/ℓ 카베니실린을 첨가한 MS 선발배지에서 슈트를 유도하였다. 배양조건은 온도가 25℃, 2500Lux, 일장은 16시간 주기로 하였으며, 잎절편에서 분화된 슈트는 잎절편의 배양 때와 같이 2주마다 계대 배양하였다. MS 선발배지에서 재분화된 형질 전환된 담배는 50mg/ℓ 카나마이신 그리고 300mg/ℓ 카베니실린을 첨가한 MS뿌리선발배지에 이식하여 뿌리형성을 유도하였으며, 뿌리가 형성된 형질전환 담배는 포트에 이식하여 순화시켜 다음 실험에 사용하였다. 담배 형질전환과정은 도 3에 나타내었다.
실시예 5 : 형질전환된 담배에서 PCR 분석
pMBPCPS 및 pMBPCPA 벡터로 형질전환시킨 담배에서 CyMV의 외피단백질 유전자가 제놈내로 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위하여 NPT II 유전자를 PCR로 증폭하여 형질전환 여부를 간접적으로 확인하였다(도 4). CyMV 외피단백질 유전자가 식물체의 제놈내로 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위하여 잠정적인 형질전환체로부터 genomic DNA를 분리한 후 PCR를 수행하였다. PCR은 100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 1.0% Triton X-100, 25mM mgCl2, 각각의 0.1mM dNTP, 50 pmol 프라이머, 그리고 4 units의 Tag polymerase를 사용하였다. PCR에 사용된 프라이머는 NPTII 유전자에 특이적인 염기서열을 합성하여 사용하였다(Back et. al., Gene, 19, 327-326, 1982). PCR은 DNA 합성기(DNA synthesizer, ABI, USA)를 이용하여 합성하고, DNA 열순환기(Cetus/Perkin-Elmer, USA)를 사용하여 VenttmDNA 중합효소(NEB, USA)로 변성(denaturation)(94℃, 1분), 결합(annealing)(60℃, 1분), 연장(extention)(72℃, 2분)을 35회(cycle) 진행시켰다. 도 4에서 보듯이 pMBPCPS(제4(A)) 및 pMBPCPA(제4(B)) 벡터와 동일하게 형질전환된 식물체에서도 같은 크기의 NPT II 유전자가 증폭되었음을 확인할 수 있었다(레인 각각: 3,4). 형질전환시키지 않는 식물체에서는 NPT II 유전자가 증폭되지 않았다(각 레인 2). 각 레인 1은 각각 pMBPCPS 벡터, pMBPCPA벡터를 나타내고, M레인은 Lamda HindIII로 절단한 사이즈 마커를 나타낸다.
실시예6 : 형질전환된 담배의 노던 블롯(Northern blot) 분석
pMBPCPA 벡터로 형질전환시킨 담배에서 CyMV의 외피단백질 유전자의 전사도(transcription level)를 알아보기 위하여 실시예 5에서 형질전환이 간접확인된 담배로부터 전체 RNA를 추출하고 10%(v/v) 포름알데히드가 함유된 1%(v/v) 아가로스 겔에서 전기영동한 후 nylon membrane에 RNA를 옮기고 PCR로 합성한 CyMV의 외피단백질유전자 프로브을 사용하여 혼성화 반응을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었는데 형질전환되지 않는 대조구(레인 N)에서는 밴드가 없고, 형질전환된 담배(레인 1,2)에서만 하나의 밴드가 나타남을 볼 수 있었다.
실시예7 : 형질전환된 담배의 바이러스 검정
ATCC로부터 구입한 동결건조된 CyMV 이병조직을 인산완충액을 이용하여 마쇄한 후, 원심분리하여 상층액을 취하고 바이러스 접종액을 만들어 바이러스접종액을 형질전환 담배와 대조구에 (본엽 5-6엽기) 접종하였다. 접종 15일 후 bioassay한 결과 형질전환되지 않는 대조구에서는 CyMV의 전형적인 병징인 모자이크증상이 전체 식물체에 나타났으나 형질전환된 담배는 도 6에서 보듯이, 상부잎에는 병징이 나타나지 않았음을 알 수 있었다. 또한 접종 5주 후 2차엽의 감염 여부를 관찰한 결과 도 7에서 보듯이 형질전환되지 않는 대조구에서는 CyMV의 전형적인 병징인 모자이크증상이 나타났고 반면 형질전환된 담배는 병징이 나타나지 않음을 알 수 있었다(도 8).
이상에서 상세히 설명되고 입증되었듯이, 본 발명은 식물세포내에서 외래유전자의 발현을 가능하게 하는 벡터에 CyMV 외피단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 삽입하여 제조한 CyMV 외피 단백질 유전자 발현벡터를 식물세포에 형질전환시키고 배양함으로써, CyMV 외피단백질을 생성하는 식물체를 생산하는 방법을 제공하기 때문에 본 발명의 방법에 의하여 CyMV 외피단백질을 생성하고 식물체를 제조함으로써 CyMV 내성이 강한 여러 가지 식물체를 개발할 수 있어 식물 육종산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (4)

  1. CyMV의 증식기주인 Nicotiana occidentalis에서 분리한 하기와 같은 염기서열을 갖는 CyMV 외피단백질 유전자
  2. CyMV 외피단백질 유전자를 함유하는 pMBPCPS 및 pMBPCPA로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404(균주 기탁번호 KCTC 8839P).
  3. 재조합 유전자로 형질전환된 아그로박테리움을 매개로 형질전환된 식물세포를 배양함으로써 CyMV에 대한 저항성을 생성하는 식물체를 생산하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, CyMV에 대한 저항성을 생성하는 식물체가 담배인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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