KR19990033549A

KR19990033549A - 한세눌라 폴리모르파의 지에이피디에이치 유전자 및 이의 프로모터

Info

Publication number: KR19990033549A
Application number: KR1019970054927A
Authority: KR
Inventors: 이상기; 손정훈; 최의성
Original assignee: 박원훈; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-10-24
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 1999-05-15
Also published as: KR100237979B1

Abstract

본 발명은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH) 유전자, GAPDH 프로모터 및 이 프로모터를 함유하는 발현 벡터에 관한 것으로, 본 발명에 따른 GAPDH 프로모터는 강력한 구성적 발현 프로모터로서 탄소원에 따른 별도의 발현 유도가 필요하지 않으므로 한세눌라 폴리모르파에서 외래 단백질을 발현시키는데 매우 유용한다.

Description

한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 유전자 및 이의 프로모터

본 발명은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH) 유전자, GAPDH 프로모터 및 이 프로모터를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

한세눌라 폴리모르파는 메탄올자화 효모 균주로, 강력한 프로모터 시스템을 가지고 있으면서 외래 유전자를 염색체에 다중으로 도입할 수 있어 재조합 단백질의 대량생산에 유용한 미생물이다(Glesson et al., Yeast, 4, 1(1988); Janowicz et al. Yeast, 7, 431(1991); Romanos et al., Yeast, 8, 423(1992); Faber et al., Yeast, 11, 1331(1995)).

현재 한세눌라 폴리모르파의 발현 벡터에 사용되는 프로모터는, 메탄올 대사관련 효소 유전자 유래의 강력한 메탄올 유도 발현 프로모터인, 메탄을 산화효소(Methanol oxidase, MOX)(Ledeboer et al., Nucleic Acids Res. 13, 3063 (1985)), 디히드록시아세톤 합성 효소(dihydroxyacetone synthetase, DAS) (Janowich et al., Nucleic Acids Res., 13, 3042(1985)) 및 개미산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FMDH)(Hollenberg et al., EPA 0299108(1987)) 등이 알려져 있다.

그러나 상기 프로모터들을 외래 유전자의 발현에 사용되는 경우에는 항상 한세눌라 폴리모르파 세포의 배양 단계와 유전자 발현 유도 단계를 구분하여야 하는 문제가 있고, 특히 대규모의 발효조를 이용하여 대량 발현하는 경우에는 단계를 구분하여야 하기 때문에 공정 비용 상승의 요인이 되고 있다.

한편, GAPDH 유전자는 생명체의 대사과정에 필수적인 유전자로서, 산업적으로는 식품 또는 임상에서 글루타르알데히드-3-인산의 정량에 사용되고 있다(Toyo Jozo, 국제특허 공고 제 92-21776 호).

또한, GAPDH 유전자의 프로모터는 매우 강력한 구성적 프로모터(constitutive promoter)로 알려져 있으며, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 등의 효모에서 외래 유전자의 발현을 위한 프로모터로 사용된 바 있으나(Kniskern et al., Gene, 46, 135(1986); Travis et al,. J. Biol. chem., 260, 4384 (1985); Hallewell et al., Bio/Technol., 5, 363 (1987); Rosenberg et al., Methods in Enzymol., 185, 341 (1990); Waterham et al., Gene, 186, 37 (1997), 한세눌라 폴리모르파에서는 아직 보고된 바 없다.

이에 따라 강력하면서도 탄소원에 따른 별도의 발현 유도 단계가 필요없이 한세눌라 폴리모르파에서 외래 유전자를 항상적으로 발현하기 위한 프로모터가 절실히 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 한세눌라 폴리모르파에서 항상적으로 발현되는 GAPDH 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한세눌라 폴리모르파에서 항상적으로 발현을 유도하는 강력한 GAPDH 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 GAPDH 프로모터를 포함하는 한세눌라 폴리모르파용 발현 벡터를 제공하는 것이다.

도 1은 플라스미드 pGAP7121, pGAP7123 및 pGAP7131의 제한효소 지도이다.

도 2는 플라스미드 pCE36 및 pHGAP-HIR의 구조를 도식화하여 나타낸다.

도 3는 플라스미드 pUC-4K, pBLT188 및 pGL418의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 4은 플라스미드 pBLT188 및 pGLG578의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 5a, 5b 및 5c는 플라스미드 pGL418, pGLG578 및 pGLG61을 각각 함유하는 G418-내성 형질전환체의 형질전환 여부를 확인하는 서던 블럿팅 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 6는 플라스미드 pGLG578, pGLG356, pGLG292, pGLG251, pGLG146 및 pGLG61의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된, GAPDH를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 GAPDH 프로모터를 제공한다.

한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)의 GAPDH를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 하기 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 가진다;

[서열 1]

본 발명의 GAPDH 유전자는 통상적인 DNA 합성기를 이용하여 상기 서열을 갖도록 합성하거나, 한세눌라 폴리모르파의 게놈 DNA로부터 사카로마이세스 세레비지에의 GAPDH 유전자를 프로브로 하는 서던 블럿팅 분석에 의해 얻을 수 있다.

상기 서열 1의 뉴클레오티드 서열로부터 유추된 아미노산 서열은 사카로마이세스 세레비지에의 GAPDH와 72%의 상동성을 나타내며, 하기 서열 2의 아미노산 서열을 가진다.

[서열 2]

또한, 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된 GAPDH 프로모터는 하기 서열 3을 가진다;

[서열 3]

본 발명의 GAPDH 프로모터는 특정 탄소원에 따른 발현 유도 과정이 필요없는 강한 구성적 프로모터라는 장점을 가지고 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열 3의 219번-796번, 441번-796번, 505번-796번, 546번-796번, 651번-796번 및 736번-796번 뉴클레오티드로 이루어진 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터의 단편을 사용할 수 있다.

더 나아가, 본 발명은 상기 서열 1 및 3과 실질적으로 동일하고, 이 서열들과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오티드를 역시 포함한다. 용어 "실질적인 상동성"은 공지된 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해서 또는 조사에 의해서 적절히 배열되었을 때 두 개의 폴리뉴클레오티드가 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 서열 상동성을 공유하는 것을 의미한다.

이하 본 발명을 참조예 및 실시예에 의해 상세히 설명하나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

참조예:

(1) 미생물의 형질전환

한세눌라 폴리모르파의 형질전환은 초산 리튬-DMSO 법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991)에 따라 실시하였다.

(2) 서던 블럿팅 분석(Southern blotting analysis)

서던 블럿팅 분석은 42℃ 하이브리디제이션 오븐(hybridization oven, Hybaid, 영국)에서 하이브리디제이션 용액(5×SSC, 0.1% N-라우로일 사코신(lauroyl sarcosine), 0.02% SDS, 5% 블록킹 시약, 50% 포름아미드)을 이용하여 서던 방법(Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503(1975)에 따라 실시하였다. 프로브는 비방사성 DNA 표지 및 감지 키트(Non-radioactive DNA Labeling and Detection Kit, Boehringer Mannheim, 독일)를 사용하여 제조하였다.

(3) 도입된 유전자의 카피수 결정

도입된 유전자의 카피수는 서던 덴시토그램(Southern densitogram)을 이미지분석 시스템(Image analysis sysem, Bio-Rad, Model GS-700)을 이용하여 측정하였다.

(4) 뉴클레오티드 서열 결정

유전자의 뉴클레오티드 서열은 ABI 서열분석 키트(ABI Prism Dye Terminatior Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Perkin-Elmer Cetus, 미국)와 DNA 서열분석기(DNA Sequencer, Model 373A, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 결정하였다.

[실시예 1]

한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 유전자

시카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)의 염기서열(Holland et al., J. Biol. Chem., 254, 9839(1979)에 근거하여, 하기 서열 4 및 5을 갖는 합성 프라이머 1 및 2를 제조하였다.

[서열 4]

5'-AAGCTTACCA GTTCTCACAC GG-3'

[서열 5]

5'-AAGCTTACAA TCAATGAATC GA-3'

상기 합성 프라이머 1 및 2를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 의해, 사카로마이세스 세레비지에 2805(R. B. Wickner, NIH, 미국)의 염색체 DNA로부터 사카로마이세스 세레비지에의 GAPDH 유전자(Sc-GAPDH 유전자)를 분리하였다.

분리한 Sc-GAPDH 유전자를 플라스미드 pT7-블루(Blue) T-벡터(Novagen 사)에 삽입하여, Sc-GAPDH 유전자를 포함하는 플라스미드 pT7-SGAP2를 제조하였다.

한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012) 유래의 영양요구성 변이균주인 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)(NPO Biotechnologia, 모스크바, 러시아)의 염색체 DNA를 분리한 후 제한효소 BamHI으로 절단하였다. 상기에서 제조된 플라스미드 pT7-SGAP2를 제한효소 XbaI로 절단하였다. 절단된 염색체 DNA를 디곡시게닌(DIG)으로 표지된 플라스미드 pT7-SGAP2를 프로브로하여 서던 블럿팅을 실시한 결과, 약 14kb 크기의 밴드를 얻었다.

한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)의 염색체 DNA를 제한효소 BamHI로 절단한 후; 12-16 kb의 DNA 절편들을 분리하고, 이 DNA 절편들을 제한효소 BamHI로 절단한 플라스미드 p블루스크립트(pBluescript) KS+(Stratagen Co.)에 삽입하여 게놈 라이브러리를 제조하였다.

이 게놈 라이브러리로 대장균을 형질전환시켜 1×10⁴개의 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 DNA를 분리한 후, DIG로 표지된 Sc-GAPDH 유전자를 프로브로 사용하여 서던 블럿팅을 실시하여, 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 유전자(Hp-GAPDH 유전자)를 포함하는 플라스미드 pGAP7121을 선별하였다. 플라스미드 pGAP7121의 제한효소 지도는 도 1에 나타나 있다.

플라스미드 pGAP7121을 제한요소 StuI으로 절단하여 Hp-GAPDH 유전자를 포함하는 DNA 절편을 얻고, 이 DNA 절편을 제한효소 EcoRV로 절단된 플라스미드 p블루스크립트 KS+에 삽입하여 플라스미드 pGAP7123을 얻었다.

한편, 플라스미드 pGAP7121을 제한효소 XbaI으로 절단하여 Hp-GAPDH 유전자를 포함하는 다른 DNA 절편을 얻고, 이 DNA 절편을 제한효소 XbaI로 절단된 플라스미드 p블루스크립트 KS+ 삽입하여 플라스미드 pGAP7131을 얻었다.

플라스미드 pGAP7131에 포함된 Hp-GAPDH 유전자의 뉴클레오티드 서열은 참조예에 기재된 방법에 따라 결정하였으며, 상세한 서열은 상기 서열 1에 나타나 있다.

또한, Hp-GAPDH 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유추되는 아미노산 서열은 상기 서열 2와 같고, 이는 Sc-GAPDH와 비교할 때 72%의 높은 서열 상동성을 가진 것으로 확인되었다.

[실시예 2]

Hp-GAPDH 프로모터의 획득

실시예 1에서 제조한 플라스미드 pGAP7123을 주형으로 하고 하기 서열 6 및 7의 합성 프라이머 3 및 4를 이용한 중합효소 연쇄 반응을 실시하여, Hp-GAPDH 프로모터를 포함하는 798 bp 크기의 DNA 절편을 얻었다.

[서열 6]

5'-GAATTCGAAT ATTGTTTCTA TATTATC-3'

[서열 7]

5'-GTAAAACGAC GGCCAGT-3'

[실시예 3]

Hp-GAPDH 프로모터의 특성

실시예 2에서 얻은 Hp-GAPDH 프로모터를 플라스미드 pT7-블루 T-벡터(No agen 사)에 삽입하여 플라스미드 pT7-HGAP를 제조하였다.

YEGα-HIR525(Sohn et al., Process Biochem., 30, 653(1995))를 제한효소 EcoRI 및 SalI으로 절단하여, 사카로마이세스 세레비지에 교배인자 α의 분비시그날 프리-프로 리더(pre-pro leader) 서열과 히루딘 유전자를 포함하는 DNA 절편을 얻었다. 또한 실시예 1에서 제조한 플라스미드 pGAP7131을 제한효소 SalI 및 XbaI으로 절단하여, Hp-GAPDH 전사종결인자(terminator)를 포함하는 DNA 절편을 얻었다. 상기에서 얻은 두 가지 DNA 절편들을 EcoRI 및 XbaI로 절단된 플라스미드 pT7-HGAP에 삽입하여, 히루딘 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 pT7-GAPHIR을 제조하였다.

플라스미드 pT7-GAPHIR을 제한효소 BamHI 및 HindIII로 절단하고, 클레나우 DNA 중합효소로 평활말단(blunt end)을 만들어 히루딘 발현 카세트를 포함하는 DNA 절편을 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 절편을, 제한효소 EcoRI으로 절단되고 클레나우 DNA 중합효소에 의해 평활말단이 된 플라스미드 pCE36(본 출원인의 동일자 출원 제 97-_______ 호 참조, 기탁번호 : KCTC 0352BP, 기탁일 : 1997년 7월 24일)에 삽입하여, 플라스미드 pHGAP-HIR을 제조하였다(도 2).

플라스미드 pHGAP-HIR로 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)를 형질전환시키고, 형질전환체를 YPD 배지(1% 효모 추출물, 2%, 박토-펩톤, 2% 글루코즈)에서 50세대 동안 안정화한 후, 안정화된 형질전환체를 최소 배지에서 선별하였다. 플라스미드 pHGAP-HIR을 포함하는 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)(H, ploymorpha DL-1L(pHGAP-HIR)은 1997년 7월 24일자 기탁번호 KCTC 0357BP로서 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행(KCTC)에 기탁되었다.

약 10개의 형질전환체를 YPD 배지에서 배양한 후 배양액으로 분비된 히루딘을 정량하였다. 히루딘의 정량을 위해서는, 인체 트롬빈(시그마사)을 트롬빈 반응 완충액(0.1 M Tris-HCL(pH 8.0), 0.12M 염화나트륨, 0.01% 아지드화 나트륨 및 0.1% 소 혈청 알부민)에 0.6 NIH U/㎖ 농도로 희석하고, 트롬빈의 인공 기질인 크로모자임 TH(Chromozym TH, Boehringer Mannheim)도 역시 트롬빈 반응 완충액에 200㎛의 농도로 용해시켰다. 표준 히루딘(Accurate Chemical & Scientific Co.)을 트롬빈 반응 완충용액에 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 및 0.6 ATU(antithrombin unit)/㎖로 희석하였다. 1 ATU는 인체 트롬빈 1 NIH 단위를 완전히 저해하는 히루딘의 양을 나타낸다. 히루딘의 정량은, 트롬빈 용액 50㎕에 희석된 배양액 각각 50㎕씩을 96-웰 마이크로타이터 플레이트(96-well microtiter plate)의 각 웰에 넣은 후, 크로모자임 TH 용액 100㎕씩을 가하고 엘리자 리더(ELISA reader, THERM(Omax, Molecular Devices)를 이용하여 405㎚에서 흡광도의 증가율을 5분간 측정하고, 배양액 대신 표준 히루딘 50㎕에 대하여 동일하게 측정한 흡광도 증가율과 비교하여 시료내의 히루딘 양을 결정하였다.

그 결과는 하기 표 1과 같다.

히루딘의 생산량이 가장 많은 6번의 형질전환체를 탄소원으로 2% 포도당, 2% 글리세롤, 2% 메탄올을 각각 함유하는 YP 배지(1% 효모추출물, 2% 박토펩톤)에서 30시간 배양한 후, 배양액내 히루딘의 양을 상기 방법과 같이 측정하였다.

히루딘의 생산량은 하기 표 2와 같다.

[표 2]

포도당, 글리세롤, 메탄올의 모든 탄소원에서 히루딘 유전자가 발현됨을 알 수 있었고, 또한 포도당이나 글리세롤을 사용한 경우에서 세포의 성장 속도가 메탄올을 사용한 경우보다 월등히 높았으며 시간당 생산성은 최대 500%로 높았다.

[실시예 4]

플라스미드 pGLG578의 제작

루이신 영양요구성 및 항생제 G418에 대한 내성을 선택표지로 하고 한세눌라 폴리모르파 다중병렬도입형 자지복제서열 TEL188을 포함하는 플라스미드 pGLG578을 다음과 같이 제작하였다.

(단계 1) 플라스미드 pBLT188의 제작

LEU2 유전자를 포함하는 플라스미드 pCE36(본 출원인의 동일자 출원 제 97-_______ 호 참조, 기탁번호 : KCTC 0352BP, 기탁일 : 1997년 7월 24일)을 BamHI 및 XbaI으로 절단하여 LEU2 유전자를 포함하는 DNA 절편을 얻었다. 상기 LEU2 유전자를 포함하는 DNA 절편을 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 자기복제서열 TEL188을 포함하는 플라스미드 pBKS-TEL188(본 출원인의 동일자 출원 제 97-______ 호 참조, 기탁번호 : KCTC 0355BP, 기탁일 : 1997년 7월 24일)의 BamHI - XbaI 위치에 삽입하여, 자기복제서열 TEL188 및 LEU2 유전자를 포함하는 플라스미드 pBLT188을 제작하였다.

(단계 2) 플라스미드 pGL418의 제작

대장균 유래의 프로모터하에 위치하는 대장균 트랜스포손 Tn903 (E. colitransposon Tn903) 유래의 아미노글리코시드 3-인산 전이효소(aminoglycoside 3- phosphate transferase, APH) 유전자를 한세눌라 폴리모르파에서 선별표지로 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 이 유전자를 한세눌라 폴리모르파에 도입하고 APH 유전자의 발현여부를 다음과 같이 실험하였다.

APH 유전자를 포함하는 플라스미드 pUC-4K(Pharmacia, 스웨덴)를 PstI으로 처리하여 얻은 DNA 절편을 PstI으로 절단한 플라스미드 pBLT188에 삽입하여, 자기복제서열 TEL188, LEU2 유전자 및 APH 유전자를 포함하는 플라스미드 pGL418을 제조하였다(도 2).

(단계 3) 플라스미드 pGLG578의 제작

대장균 트랜스포손 Tn903 유래의 APH 유전자와 한세눌라 폴리모르파 GAPDH 프로모터의 연결을 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 pUC-4K(Pharmacia사)를 주형으로 하고 하기 서열 7 및 8의 합성 프라이머 4 및 5를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 의해 APH 유전자의 cDNA를 얻고, 이를 EcoRV로 절단한 플라스미드 pT7-Blue T- 벡터(Novagen사)에 삽입하여 플라스미드 pT7-G418을 제작하였다.

[서열 7]

5'-GTAAAACGAC GGCCAGT-3'

[서열 8]

5'-GAATTCGTTA TGAGCCATAT TCAA-3'

다음으로 플라스미드 pT7-G418을 EcoRI 및 PstI으로 절단하여 APH 유전자인 약 1kb의 DNA 절편을 얻고, 실시예 3에서 제작된 플라스미드 pT7-HGAP를 XbaI 및 EcoRI으로 절단하여 Hp-GAPDH 프로모터인 578bp의 DNA 절편을 얻었다. 이 두 DNA 절편을 XbaI 및 PstI으로 절단된 플라스미드 pBLT188에 동시에 삽입하여, Hp-GAPDH 프로모터와 APH 유전자의 융합 유전자를 포함하는 플라스미드 pGLG578을 제조하였다(도 4).

[실시예 5]

한세눌라 폴리모르파에서 대장균 APH 프로모터의 작동 여부 확인

플라스미드 pGL418 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012) 유래의 영양요구성 변이균주인 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)(NPO Biotechnologia, 모스크바, 러시아)에 형질전환한 후 형질전환체를 최소 배지에서 배양하여 1차 선별하였다. 플라스미드 pGL418의 형질전환 효율은 2×10³형질전환체 / ㎍ DNA이었다. 1차 선별된 형질전환체를 합한 후 YPD 배지 50㎖에 접종한 후 50 세대까지 계대배양하여 안정화하였다. 배양중인 형질전환체중 일부를 일정 간격으로 취하여 최소 배지에서 배양하고 성장속도를 측정하였다. 세포간의 성장속도가 일정한 것을 안정화된 형질전환체로 판정하였다. 형질전환체 1×10⁵세포를 YPD 배지 및 최소 배지에 도말한 후 1주일간 배양하여 성정한 세포군락의 수를 측정하여 50 세대후의 안정화율을 결정하였다.

한편, 형질전환체 1×10⁵세포를 0, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 또는 4.0 ㎎/㎖ 농도의 항생제 G418을 포함하는 최소배지에 각각 도말한 후 1주일간 배양하여 G418 내성균주의 수를 측정하였다. 또한, 상기 실시예 4의 (단계 1)에서 제작된 플라스미드 pBLT188을 대조구로 사용하여 동일한 실험을 반복하였다.

그 결과는 하기의 표 3과 같다.

[표 3]

대조구 플라스미드 pBLT188을 포함하는 형질전환체는 G418 0.5㎎/㎖의 농도에서는 생존하지 못하였으나, 플라스미드 pGL418을 포함하는 형질전환체는 항생제 G418 4㎎/㎖의 농도에서도 생존하였고, 1.0㎎/㎖의 농도에서는 성장속도가 매우 느려 1주일후에 군락을 형성하였다.

플라스미드 pGL418을 포함하는 항생제 G418 내성 형질전환체로부터 DNA를 분리하여 제한효소 SmaI으로 절단하고, 디곡시게닌(DIG)으로 표지된 LEU2 유전자를 프로브로 사용하여 서던 블럿팅을 실시하였다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 염색체상에 단일 카피로 존재하는 숙주 자체의 LEU2 유전자는 약 30.0kb 위치에서 밴드로 나타났고, 다중 카피로 존재하는 플라스미드 유래의 LEU2 유전자는 약 1.0kb 위치에서 밴드로 나타나, 숙주 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)가 플라스미드 pGL418로 형질전환되었음을 확인하였다.

또한, G418에 내성을 나타낸 형질전환체중 무작위로 선별한 일부의 형질전환체는 항생제 G418 없이 루이신 선별 표지로만 선별한 대조구에 비하여 LEU2 유전자의 카피수가 증가하였으나, 증가 양상은 항생제 G418 농도와는 무관한 것으로 나타났으며, 그 외의 형질전환체들은 대조구보다 적거나 동일한 카피수로 나타나 자발적인 변이에 의하여 G418 내성을 보였음을 알 수 있었다.

이는 대장균 유래의 프로모터는 한세눌라 폴리모르파에서 제대로 작동하지 못함을 나타내며, 따라서 대장균 유래의 포로모터하에 위치하는 대장균 트랜스포손 Tn903 유래의 APH 유전자 그 자체로는 한세눌라 폴리모르파에서 선별표지로 사용될 수 없음을 나타낸다.

[실시예 6]

Hp-GAPDH와 APH의 융합 유전자에 의한 G418 내성 발현

실시예 4의 (단계 3)에서 제도된 플라스미드 pGLG578을 이용하여 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)를 형질전환시킨 후, 안정화된 형질전환체를 YPD 배지 및 G418을 포함하는 최소배지에서 48시간 동안 배양하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 절차를 반복하여, 50 세대 후 안정화율과 G418 내성 균주수를 측정하였다. 이때, 상기 실시예 4의 단계 1 및 2에서 제조된 플라스미드 pBLT188 및 pGL418을 대조구로 사용하여 동일한 실험을 반복하였다.

그 결과는 하기의 표 4와 같다.

[표 4]

대조구 플라스미드 pBLT188 및 pGL418의 형질전환체는 항생제 G418 1.0㎎/㎖의 농도에서는 48 시간동안 성장하지 못하였으나, 플라스미드 pGLG578의 형질전환체는 항생제 G418 4.0㎎/㎖의 농도에서도 빠르게 성장하였으며 항생제 G418의 농도에 따라 내성의 정도에 차이가 있었다.

즉, Hp-GAPDH 프로모터 대장균 APH 유전자의 융합 유전자는 효율적인 선별표지로 사용할 수 있는 것으로 확인되었다.

플라스미드 pGLG578을 포함하는 형질전환체에서 항생제 G418에 대한 내성과 도입된 유전자의 카피수와의 관계를 확인하기 위하여, 항생제 G418의 농도별로 내성을 가지는 형질전환체를 무작위로 6개씩 선별하여 게놈 DNA를 분리하고 제한효소 XhoI으로 절단한 후, DIG로 표지된 GAPDH 프로모터를 프로브로 사용하여 서던 블럿팅을 실시하였다.

그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 염색체상에 단일 카피로 존재하는 숙주자체의 GAPDH 프로모터는 약 5.5kb 위치에서 밴드로 나타났고, 다중 카피로 존재하는 플라스미드 유래의 GAPDH 프로모터는 약 0.7kb 위치에서 밴드로 나타났다.

한편, G418 농도에 따른 도입 유전자의 카피수를 측정하기 위해, 도 5b에서 pGLG578을 함유하는 형질전환체의 게놈 DNA를 TE 완충액(10mM Tris, 1 ㎖ EDTA, pH 7.5)으로 10배 희석하고, 도 5b에서와 같은 프로브를 사용하여 서던 블럿팅 분석을 실시하였다. 그 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.

[표 5]

즉, 도입된 유전자는 항생제 G418 2㎎/㎖의 농도에서 최대 약 15카피정도로 나타났다. 그러나 항생제 G418 2㎎/㎖이상의 농도에서는 카피수가 증가하지 않았는데, 이는 프로모터가 강력하여 동일한 카피수에서도 항생제 G418 2㎎/㎖ 이상의 농도에서 내성을 보이기 때문인 것으로 사료되었다.

[실시예 7]

결실된 Hp-GAPDH 프로모터를 포함하는 플라스미드의 제조

Hp-GAPDH 프로모터를 약화시켜 도입되는 형질전환 플라스미드의 카피수를 증가시키기 위하여, Hp-GAPDH 프로모터를 다음과 같이 결실시켰다.

즉, 실시예 1에서 제조된 Hp-GAPDH 프로모터를 포함하는 플라스미드 pGAP7123 20㎍을 NotI으로 절단한 후 클레나우 중합효소를 이용하여 α-티오(thio) dNTP를 가함으로써 평활말단을 만들었다. 생성된 DNA를 제한효소 BamHI으로 추가 절단하였다. 절단된 DNA 절편을 ExoIII/멍빈 뉴클레아제 결실 키트(ExoIII/Mung bean nuclease deletion kit(Stratagen사))를 이용하여 5'-말단을 점차적으로 결실하였다. 이 결실된 프로모터의 염기서열을 분석하여 결신된 GAPDH 프로모터의 크기를 결정한 결과, 서열 3를 갖는 Hp-GAPDH 프로모터의 441번-796번(GAP356), 505번-796번(GAP292), 546번-796번(GAP251), 651번-796번(GAP146) 및 736번-796번(GAP61) 뉴클레오티드로 이루어진 결실된 Hp-GAPDH 프로모터가 얻어졌다.

이들 결실된 Hp-GAPDH 프로모터와 APH의 융합유전자를 포함하는 플라스미드 pGLG356, pGLG292, pGLG251, pGLG146 및 pGLG61을 실시예 4의 (단계 3)에서와 같은 방법으로 제작하였다(도 6). 각각의 플라스미드를 실시예 5에서와 동일한 방법으로 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)에 형질전환하고 안정화한 후, YPD 배지 및 G418을 포함하거나 포함하지 않는 최소배지에서 48시간 동안 배양하여 안정화율 및 항생제 G418에 대한 내성을 조사하였다.

그 결과는 하기의 표 6에 나타낸 바와 같다.

[표 6]

표 4에서 보는 바와 같이, 서열 3를 갖는 Hp-GAPDH 프로모터의 1번 내지 650번 뉴클레오티드가 결실되어도 항생제 G418에 대한 내성이 감소하지 않았으나, 1번 내지 735번 뉴클레오티드가 결실된 경우에는 항생제 G418에 대한 내성이 상당히 감소하였다.

따라서, APH 유전자를 이용하여 플라스미드가 다중으로 도입된 세포를 선별하기 위하여는 GAP61이 적합한 것으로 확인되었다.

[실시예 8]

결실된 Hp-GAPDH 프로모터를 포함하는 플라스미드의 특성

실시예 7에서 제작된 플라스미드를 포함하는 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2) 형질전환체에서 항생제 G418에 대한 내성 및 도입된 유전자의 카피수와의 관계를 확인하기 위하여, 항생제 G418의 농도별로 각각의 플라스미드를 포함하는 형질전환체를 무작위로 선별하였다. 형질전환체로부터 게놈 DNA를 분리하고 제한효소 SmaI으로 절단한 후, DIG로 표지된 LEU2 유전자를 프로브로 사용하여 서던 블럿팅을 실시하였다.

이때 염색체상에서 단일 카피로 존재하는 숙주자체의 LEU2 유전자는 약 30.0 kb 위치에서 밴드로 나타나며, 다중 카피로 존재하는 플라스미드 유래의 LEU2 유전자는 약 1.0 kb 위치에서 밴드로 나타나게 된다.

그 결과는 도 5c에 나타낸 바와 같다. 즉, 플라스미드 pGLG61의 형질전환체는 G418 4.0 ㎎/㎖에서 성장한 다른 플라스미드의 형질전환체보다 시그날 강도가 강하였다. 특히, pGLG61로 형질전환한 경우 G418 농도 증가에 따라 시그날의 강도가 강해졌다.

한편, 플라스미드 pGLG61의 형질전환시 항생제 G418 농도에 따라 도입되는 유전자의 카피수를 결정하기 위하여, 도 5c에서 pGLG61을 함유하는 형질전환체의 게놈 DNA를 TE 완충액으로 25배 희석하여 도 5c와 동일한 프로브를 사용하여 서던 블럿팅하였다. 도입된 유전자의 카피수는 실시예 6의 방법에 따라 측정하였다.

그 결과는 표 7에 나타낸 바와 같다.

[표 7]

즉, 도입된 유전자는 항생제 G418 4.0㎎/㎖의 농도에서 최대 약 50 카피 정도로 나타났으며, 항생제 G418 농도가 증가함에 따라 카피수가 증가하는 것으로 나타났다.

따라서 항생제 G418 농도를 이용하여 유전자의 카피수를 1부터 50까지 조절할 수 있을 것으로 사료되었다.

본 발명의 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터는 강력한 항상성 발현 프로모터이므로, 한세눌라 폴리모르파의 발현 벡터에 사용될 경우 탄소원에 따른 발현 유도 단계가 필요없이 외래 유전자를 대량 발현할 수 있어 매우 유용하다.

Claims

하기 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH) 유전자:

[서열 1]
하기 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터:

[서열 3]
서열 3의 441번-796번, 505번-796번, 546번-796번, 651번-796번 또는 736번-796번 뉴클레오티드로 이루어진, 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터의 단편.
한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터 또는 그의 단편을 포함하는, 한세눌라 폴리모르파에서 외래 유전자를 발현시킥 위한 발현 벡터.
제 4 항에 있어서,

상기 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터가 서열 3을 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 4 항에 있어서,

상기 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터의 단편이 서열 3의 441번-796번, 505번-796번, 546번-796번, 651번-796번 또는 736번-796번 뉴클레오티드로 이루어진 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.