KR19990025737A - 신규한 녹농균 세포 외막 단백질 유전자 및 이를 이용한 녹농균 감염 예방용 백신 및 녹농균 감영증 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 DNA 염기 서열로 나타내는 녹농균 세포 외막 단백질(Opr) 유전자 및 이 유전자에 의해 발현된 재조합 Opr, 및 재조합 Opr을 이용한 녹농균 감염 예방용 백신 및 녹농균 감염증 치료제에 관한 것이다.

Description

신규한 녹농균 세포 외막 단백질 유전자 및 이를 이용한 녹농균 감염 예방용 백신 및 녹농균 감염증 치료제

본 발명은 신규한 녹농균(Pseudomomas aeruginosa) 세포 외막 단백질 유전자 및 이를 이용한 녹농균 감염 예방용 백신 및 녹농균 감염증 치료제에 관한 것이다. 더욱 상세하게 설명하자면, 본 발명은 녹농균의 신규한 공통 항원인 세포 외막 단백질을 발현하는 유전자 및 이 유전자에 의해 발현된 세포 외막 단백질로부터 제조된 녹농균 감염 예방용 백신 및 녹농균 감염증 치료제에 관한 것이다.

녹농균 감염증의 예방이나 치료에 공통 항원을 사용하여 백신 및 치료제를 개발하려는 많은 시도가 이루어지고 있다. 그 예로서는, 녹농균의 세포 외막을 구성하고 있는 성분들 중에서 면역학적으로 방어 효과가 있는 특정 부분을 단리해내어, 이를 항원으로 이용하는 방법을 들 수 있다. 주목을 받고 있는 세포 외막 구성 성분은 고분자량의 폴리사카라이드, 무독화시킨 LPS-단백질 접합체, 폴리사카라이드-톡신 A 접합체, 편모(flagella), 섬모(pili) 및 세포 외막 단백질 등이다(Infect. Immun. 52, pp 161-165, 1986; J. Clin. Invest. 69, pp 303-308, 1982; 및 J. Biol. Chem. 256, pp 7305-7310,1981).

녹농균의 세포 외막 단백질들은 9 내지 87 KDa의 다양한 분자량을 가지고 있는데, 이 중에서 백신 및 치료제의 개발을 위해 현재 활발하게 연구되고 있는 것으로서는 OprF와 OprI가 있다. OprF와 OprI는 모두 대장균에서 클로닝함으로써 그의 DNA 염기서열이 밝혀져 있고, 그의 생물학적 기능도 알려져 있다. 특히, 포린(porin)의 일종인 OprF(포린 프로테인 F)가 가장 바람직한 물질이라고 보고되어 있다(Infect. Immun. 56, pp1017-1022, 1988). OprF는 일반적으로 녹농균의 모든 균주에 존재하며, 면역학적으로 교차 면역 반응성을 가지고 있다(J. Clin. Microbiol. 26, pp 1161-1165, 1988; 및 J. Infect. Dis. 146, pp 770-779, 1982). 재조합 OprF는 녹농균으로부터 유래된 LPS가 전혀 없는 상태에서도 감염 예방 백신의 효과를 지니고 있다고 보고되어 있다(Matthews-Greer et al. Curr. Microbiol. 20, 171-175, 1990).

또 다른 연구에 의하면, OprF를 항원으로 하여 동물에 면역시키면 다양한 피셔(Fisher) 혈청형을 갖는 녹농균에 대한 방어 효과를 보여 주었다(Infect. Immun.56, 1017-1022, 1988 및 J. Infect. Dis. 155, 1282-1291, 1987). 또한, 녹농균의 OprF는 야생형의 경우에 세포 표면에 노출되어 있으며(FEMS Microbiol. Lett. 14, 43-45, 1982: Infect. Immun. 42, 1027-1033, 1983), 이것이 존재하지 않는 변이체는 약독성(avirulent)이 된다(Curr. Microbiol. 20, 171-175,1990). 이러한 점에서 OprF는 녹농균 감염에 대한 예방 백신 및 치료제의 개발에 있어서 가능성이 높은 후보 물질이 될 수 있다.

그러나, OprF를 사용하는 한 가지 큰 단점은 이 OprF가 녹농균 감염 예방에 있어서 주요한 공통 항원이지만, 이를 단독으로 사용하는 경우에는 서로 다른 혈청형을 갖는 모든 녹농균에 대한 교차 면역 반응을 효과적으로 일으키지 못하므로, 전체의 세포 외막 단백질을 사용하는 경우에 비해 비교적 방어 유효성(protective efficacy)이 낮다는 점이다.

본 발명자들은 녹농균 자체의 고유한 독성의 위험은 없으면서 인체에 투여시에 효과적으로 녹농균에 대한 유효 항체의 생성을 유발함으로써 우수한 면역원성 (즉, 항원성) 작용을 나타낼 수 있는 수단을 찾기 위해 광범위한 연구를 수행한 결과 우수한 특성을 갖는 새로운 세포 외막 단백질(이하, Opr이라 한다)을 제조하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신규의 녹농균 세포 외막 단백질 유전자 및 이 유전자에 위해 발현된 재조합 Opr을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 유전자에 의해 발현된 세포 외막 단백질을 항원으로 사용하여 제조된 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 유전자에 의해 발현된 세포 외막 단백질로부터 유도되는 항체 및 이를 함유하는 치료제를 제공하는 것이다.

도 1은 PCR에 의해서 증폭된 본 발명에 따른 DNA 단편의 아가로즈 겔 전기 영동 결과를 나타낸 사진.

도 2는 PCR에 의해서 증폭된 대조군의 DNA 단편의 아가로즈 겔 전기 영동 결과를 나타낸 사진.

도 3은 본 발명에 따른 재조합 DNA의 아가로즈 겔 전기 영동 결과를 나타낸 사진.

도 4는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드의 서던 혼성화 결과를 나타내는 X선 사진.

도 5는 디데옥시 사슬 종결법에 따라 결정된 Opr 유전자의 염기 서열을 나타낸 도면,

도 6은 본 발명에 따른 재조합 프라스미드의 세포 농도에 따른 발현율을 나타내는 그래프.

도 7은 본 발명의 재조합 플라스미드로 발현된 Opr의 원심 분리 결과를 나타낸 도면.

도 8은 본 발명의 재조합 플라스미드로 발현된 Opr의 분자량 분석 결과를 나태낸 도면.

도 9는 ELISA의 분석법에 의해 측정한 재조합 Opr에 대한 폴리클로날 항체의 결합 활성을 나타낸 도면.

도 10은 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 면역 블로팅에 의한 재조합 Opr의 분석 결과를 나타낸 도면.

도 11은 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 면역 블로팅에 의한 재조합 Opr의 분석결과를 나타낸 도면.

도 12는 형광 현미경에 의한 세포 외막내 존재 확인 시험 결과를 나타낸 도면.

이와 같은 본 발명의 목적은 유전자 재조합 기술을 이용하여 슈도모나스속균주(Pseudomonas species)의 공통 항원 OprF에 해당하는 유전자의 5' 및 3' 말단에 공통적으로 존재하는 염기 서열에 대한 프라이머를 합성하고 PCR을 통해서 증폭시켜 얻은 신규의 Opr 유전자를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 제 1특징에 따라 하기의 염기 서열을 갖는 녹농균의 신규한 Opr 유전자 및 이 유전자에 의해 발현된 재조합 Opr이 제공된다.

슈도모나스속 균주의 OprF에 해당하는 아미노산 서열에는 N-말단과 C-말단의 양쪽 말단에 공통적으로 존재하는 서열이 있다(Microbiology 140, 1377-1387, 1994). 따라서, 본 발명자들은 슈도모나스속 균주의 OprF에 해당하는 유전자의 5' 및 3' 말단에 공통적으로 존재하는 뉴클레오티드 서열에 대해서 프라이머를 합성하고, 녹농균CFCPA 20215(KCCM 10030)에서 분리한 크로모좀 DNA를 주형으로 하여 폴리머라제 사슬 중합법(Polyamerase chain reaction: PCR)을 수행하여 증폭시키고, 여기서 얻어진 신규한 Opr을 플라스미드에 재조합하여 클로닝하고 DNA 서열화를 통해서 기존의 밝혀진 OprF 또는 다른 세포 외막 단백질과는 전혀 다른 새로운 형태의 세포 외막 단백질을 코딩하는 유전자를 얻을 수 있었다. 이와 같이 하여 얻은 Opr 유전자를 포함하는 미생물(대장균 JM 105- CFC)은 1996년 4월 9일자로 한국 종균 협회에 KCCM-10079의 수탁번호로 국재 기탁되어 있다.

이와 같이 하여 얻은 신규의Opr 유전자를 대장균에서 클로닝하고 발현시켜 재조합 녹농균 세포 외막 단백질을 얻고, 그의 생물학적 특성을 규명하였다. 또한, 이들 단백질이 각종 녹농균에 대해 우수한 감염 방어 효과를 나타낼 뿐 아니라, 녹농균 감염증에 대한 치료율이 높은 유효한 항체 생산을 위한 항원으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 또 다른 특징에 의하면 신규한 Opr 유전자에 의해 발현된 재조합 Opr을 항원으로 함유하는 녹농균 감염 예방용 백신이 제공된다. 또한, 상기 재조합 Opr에 대한 항체를 함유하는 녹농균 감염증 치료제가 제공된다.

본 발명에 따른 재조합 Opr은 그대로 사용하여 녹농균 감염 예방용 백신으로 제조할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 재조합 Opr은 백신의 항원성을 높이기 위해 제약학상 허용되는 부형제, 예를 들면 인산알루미늄(AIPO₄), 수산화알루미늄(AI(OH₃)등을 함유할 수 있다.

녹농균 감염 예방 백신으로 사용할 경우의 사용량은 녹농균 감염이 우려되는 투여 대상의 연령, 체중, 성별, 건강의 일반적인 상태 및 녹농균 감염증의 정도에 따라 다르지만, 2일 또는 1주일 간격으로 (0.05mg 내지 2mg/체중 60Kg)의 양으로 3회 투여한다. 투여 경로는 근육내 투여가 바람직하다.

녹농균의 감염증을 치료하기 위한 치료제로 사용되는 면역 글로불린은 재조합 Opr을 함유하는 항원을 면역 항체를 유발할 수 있는 양으로 실험 동물에 투여함으로써 얻는다. 치료제는 실험 동물, 예를 들면 마우스, 기니픽, 토끼, 양 또는 말의 심장으로부터 체혈하고 분리함으로써 얻어지는 항혈청을 정제하여 얻어진 순수한 항체를 사용한다. 별법으로서는, 정제된 감마 글로불린 성분을 생리 식염수, 포도당 수용액 또는 인산염 완충액을 함유하는 조성물의 형태로 사용해도 좋다.

본 발명에 의한 면역 글로불린은 필요에 따라 액체 또는 동결 건조된 형태로 제형화해도 좋으며, 임의로 제약학상 허용되는 담체, 예컨대 안정화제, 방부제, 등장화제 등을 함유시킬 수도 있다. 제약학상 허용되는 담체로는 동결 건조된 제제일경우, 만니톨, 락토오스, 사카로오스, 인간 알부민 등을 예로 들 수 있다. 액상 제제의 경우에는 생리 식염수, 주사용수, 인산염 완충액 등을 예로 들수 있다. 그러나, 이들에만 한정되는 것은 아니다.

면역 글로불린의 투여량은 환자의 연령, 체중, 성별, 건강의 일반적인 상태, 녹농균 감염증의 정도 및 투여되는 면역 글로불린의 성분에 따라 다양하다. 본 발명의 면역 글로불린 제제는 일반적으로 정맥내 투여의 경우 성인에 대하여 체중 ㎏당 1일 0.1내지 1000㎎, 바람직하게는 1 내지 100㎎으로 투여하는 것이 좋다.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 방식으로든 제한되는 것은 아니다.

(실시예 1)

PCR에 의한 새로운 Opr 유전자의 분리 및 증폭

슈도모나스속 균주의 OprF에 해당하는 유전자의 5'과 3' 말단에 공통적으로 존재하는 뉴클레오티드 서열에 대한 프라이머를 합성하였다. 이 프라이머들은 하기 표 1의 P1-P3의 서열을 갖는다. 이들 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. DNA 주형으로는 녹농균 CFCPA 20215(KCCM10030)에서 분리한 크로모좀 DNA를 사용하였다. 10 x Taq DNA 폴리머라제 완충액 5㎕, 25mM 염화마그네슘 3 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕, 2차 증류수 38㎕, 각 포지티브 및 네가티브 프라이머(50 pmole/ul)1 ㎕를 첨가 후, 100℃에서 5분간 끊인 다음, 얼음에 넣어 두었던 주형 DNA 1㎕를 첨가하고, 1 U/㎕ Taq DNA 폴리머라제(COSCO) 1㎕를 넣어준 후, 광유 50㎕로 덮은 후 DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer #480, Englewood Cliffs, New Jersey, U.S.A)를 사용하여 42℃에서 1분간 프라이머와 결합시키고, 72℃에서 2분간 중합 반응시켜 92℃에서 15초간 변형시키는 공정을 30회 반복하였다. 마지막 회의 공정에서는 반응을 완전히 종결시키기 위해 72℃에서 10분간 충분히 중합반응시켰다. PCR에 의해서 증폭된 DNA 단편은 아가로즈 겔 전기 영동법으로 확인하였다.

도 1(레인 1)에서 보는 바와 같이 1.1kb의 DNA가 단일 밴드로서 증폭되었다. 증폭된 DNA가 신규한 녹농균 Opr인지를 확인하기 위해서 P2-P3 프라이머를 사용한 네스티드(nested) PCR을 수행하였다. 예상대로 72bp가 작은 DNA의 밴드는 확인할 수 없었다(도 1, 레인 2). 1 차로 증폭된 PCR 생성물을 분리한 후 기존에 보고된 녹농균 OprF의

제한 효소 지도를 이용하여 내부에 존재하지 않는 Hind Ⅲ와 1개의 절단 부위가 있는 SalI으로 절단한 결과 OprF DNA에 존재하지 않는 하나의 Hind Ⅲ가 존재하였으며, SalI에 대한 절단 부위는 존재하지 않았다. 새로 증폭된 PCR 생성물이 artifact인 지를 확인하기 위해서 8가지의 서로 다른 녹농균 균주[CFCPA10142(KCCM10029), CFCPA20215(KCCM10030), CFCPA30720(KCCM10031), CFCPA40057(KCCM10032), CFCPA60534(KCCM10034), E2,ⅡSⅡ6 및 C2027]와 음성 대조군으로 대장균 JM105(thi, rpsL(Str^r), endA, sbcB15, hsdR 4, supE, △(lac-proAB), F[traD36, proAB⁺; lacI^q. lacZ△M15)를 사용하여 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 P1-P3 프라이머를 사용한 경우에는, 사용한 네스티드 PCR의 경우는 뚜렷하게 모든 균주에서 증폭되었으나(도 2A), P2-P3 프라이머를 사용한 네스티드 PCR의 경우는 뚜렷하게 목적으로 하는 DNA를 증폭시킬 수 없었다. (도 2B). 도 2에서 레인1 내지 9의 결과는 각각 녹농균 CFCPA 10142, CFCPA 20215, CFCPA 30720, CFCPA 40057, CFCPA 60534, E2, ⅡSⅡ6 및 C2027, 및 대장균 JM105(thi, rpsL(Str^r), endA, sbcB15, hsdR 4, supE, △(lac-proAB), F[traD36, proAB⁺; lacI^q. lacZ△M15에 대한 결과이다. 이상의 사실들로 미루어 새로운 형태의 Opr 유전자임을 확인하였다. 새로이 증폭된 유전자를 클로닝하기 위해서 유전자 내부에 존재하지 않는 2개의 EcoRI 부위와 PstI 부위를 붙인 P9-P10프라이머(표 1)를 합성하여, 상기와 같은 방법으로 증폭한 후 생성된 DNA 단편을 분리하였다. 분리된 DNA 단편은 EcoRI과 PstI으로 절단시킨 후 페놀/클로로포름으로 처리하고 에탄올 침전시켜 TE 완충액에 녹여서 아가로즈 겔 전기 영동법으로 확인 후 보관하였다.

(실시예 2 )

대장균 내에서의 신규한 Opr 유전자의 클로닝

(1) PCR 생성물의 분리

PCR에 의해 증폭된 DNA 단편이 포함된 반응액은 광유가 섞이지 않도록 분리하여 튜브에 옮긴 다음, 잔존하는 광유를 완전히 제거하기 위해서 동량의 클로로포름을 넣고 혼합하여 5분간 원심 분리후 상층액을 얻었다.

2회 반복적으로 페놀/클로로포름으로 처리하고 에탄올 침전 후, 생성된 침전 물을 멸균된 TE 용액(10mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.6) 또는 2차 멸균된 증류수에 녹여 DNA 결합을 위한 표적 DNA로 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

(2) 발현 벡터 pKK223-3의 정제

목적으로 하는 플라스미드를 대량으로 얻기 위해서, 샘브룩 등의 방법(Sambrook, J., Fritsch,E.,F., and Manoiatis, T. Molecular cloning 2nd edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA))에 따라 다음과 같이 실험하였다. 발현 벡터인 pKK223-3를 가지고 있는 대장균 JM105의 단일 군락을 35μg/ml 앰피실린이 포함된 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 1% 염화 나트륨) 50ml에 접종하여 레이트 로그 페이즈(late log phase)까지 키운 후, 동일배지 500ml에 2%의 종자 배양물(Seed culture)를 넣어주고 6내지 14시간 동안 37℃로 유지되는 진탕 배양기에서 배양하였다. 4℃에서 1,200 x g로 15분간 원심분리(Sorvall centrifuge, RC5C)하여 균체를 회수하고, 미리 얼음 속에서 차가워진 100ml의 STE용액(0.1 M 염화나트륨, 10mM Tris HCl. 1 mM EDTA, pH8.0)에 현탁시킨 후, 4℃에서 4,000 x g로 10분간 원심 분리하여 균체를 세척하였다. 회수한 균체에 9ml의 용액 I(500mM 글루코즈, 25mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH8.0)을 넣어 현탁시키고, 여기에 10mg/ml의 리소자임 용액 1ml를 넣은 후 충분히 혼합하여 균체와 반응시켰다. 여기에 20ml의 용액 Ⅱ(0.2 N NaOH, 1% SDS)를 넣고 알칼리 용해가 일어나도록 5분간 방치하였다. 다시 여기에 15ml의 용액 Ⅲ(3M 초산칼륨, 11.5% 빙초산)을 넣어주고 4℃에서 10,000 x g로 20분간 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 전체 상층액의 0.6배 부피의 이소프로판올을 넣어 실온에서 10분간 방치한 후 , 10,000 x g에서 15분간 원심분리하여 얻은 침전물은 70%에탄올을 넣어 재차 원심 분리하였다. 생성된 침전물은 멸균된 TE 용액 또는 2차 멸균된 증류수에 녹여서 후술하는 초고속 원심 분리를 수행함으로써 고순도 정제를 행하였다.

(3) 염화세슘 농도 구배 초고속 원심 분리에 의한 발현 벡터의 고순도 정제

실시예 2의 (2)에서 분리한 발현 벡터인 pKK223-3 DNA를 용해시킨 TE 용액 1ml당 정확히 1g의 염화세슘을 넣고 30℃에서 완전 용해시킨 후, 이 용액 10ml마다 브로화에티듐(10mg/ml)을 0.8ml씩 첨가한 후 혼합하였다. 원심 분리기(Sorvall centrifuge)를 이용하여 실온에서 5,000 x g로 5분간 원심 분리후 상층액을 울트라-클리어(Ultra-Clear) 초 원심 분리 튜브(Beckman)에 옮겨 넣고 윗부분을 파라핀 오일로 덮은 다음, 발란싱(balancing)하여 밀폐하였다. 20℃에서 55,000 x g로 20시간 초원심 분리하였다. 분리된 DNA 밴드를 자외선 발광기(ultraviolet transilluminator)에서 확인한 후 주사기를 사용하여 회수하였다. 회수된 용액과 동량의 수(water) 포화 1-부탄올을 첨가하여 브롬화에티듐을 용출시키고 원심 분리하여 브롬화에티듐을 제거하는 과정을 6회 반복하였다. 생성된 수층을 물로 3배 희석 하고 에탄올을 6배 첨가하여 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 4℃에서 10,000 x g로 15분간 원심 분리하고 멸균된 2차 증류수에 녹여서 260nm에서 흡광도를 측정하여 플라스미드 DNA의 농도를 정량한 후 소분하여 -20℃에서 보관하였다.

(4) 발현 벡터의 단편 분리

발현 벡터인 pKK223-3내에 폴리링커 부위를 이용하여 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 클로닝하기 위해서 pKK223-3 DNA를 EcoRI과 PstI으로 37℃에서 1시간 절단시키고, 아가로즈 겔 전기 영동하여 4.5kb의 DNA 단편이 포함된 아가로즈 겔을 잘라 이것을 진 크린 Ⅱ키트(Gene Clean Ⅱ kit: BIO 101 Inc. LaJolla, Califonia, U.S.A)를 사용하여 정제하였다.

상술하면, 잘라낸 밴드 무게의 3배에 해당하는 6M 요오드화나트륨 용액을 넣고 50~55℃에서 10분간 방치하여 아가로즈를 완전히 용해시킨 다음, 여기에 글라스 밀크 용액 5~20μl를 첨가하여 완전히 현탁시키고 상온에서 매 1~3분마다 흔들어 반응시켰다. 소형 원심분리기(microcentrifuge)에서 5초간 원심 분리한 후 상층액은 버리고 침전물을 10 내지 50배 용량의 냉동 보관했던 신선한 세척 용액(상품명: NEW wash)으로 3회 세척하였다. 생성된 침천물을 10㎕의 멸균된 2차 증류수로 현탁시키고 50~55℃에서 다시 3분간 두었다가 30초간 원심분리하여 DNA단편이 포함된 상층액을 회수하였다.

(5) DNA 결합(ligation)

EcoRI과 PstI로 절단 후, 실시예 2의 (4)에서 분리한 4.5 kb의 pKK 223-3 DNA 단편에 실시예 1에서 P9-P10프라이머를 사용하여 PCR로 얻어진 EcoRI-PstI단편 1.1 kb의 DNA를 연결하기 위해서 결합시켰다. 돌출 말단 DNA의 결합에 있어서는, 원하는 제한 효소로 자른 DNA 단편 0.1~0.5μg을 삽입하고자 하는 벡터 DNA 0.1~0.5μg에 넣고 45℃에서 5분간 두었다가 얼음에서 0℃로 차갑게 하였다. 여기에 10 x 결합 완충액(660mM Tris HCl, 50mM 염화마그네슘, 10mM 디티오트레이톨 10mM ATP, pH 7.5) 1 μl, T4 DNA 리가아제(5 U/ul)1 μl, 5mM, ATP 1 μl를 혼합하고 멸균 2차 증류수를 넣어 총 10μl가 되게 한 후, 16℃에서 2~4시간 또는 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 아가로즈 겔 전기 영동으로 결합을 확인한 후 후술하는 형질 전환에 사용하였다.

(6) 대장균 JM105 균주의 컴피턴트 세포(competent cell)의 제조 및 DNA 형질 전환

대장균 JM105의 단일 군락을 멸균된 LB의 배지에 접종하고 37℃의 진탕 배양기에서 200rpm으로 16~18시간 배양한 후, 이 중 0.1ml를 25ml LB 배지에 접종하여 600nm에서 흡광도가 0.6 정도일 때까지 배양하였다. 배양된 대장균 JM105는 얼음 속에서 10 분간 방치한 후, 4℃에서 1,200 x g로 10분간 원심 분리하였다. 배지를 제거하고 남아 있는 균체를 미리 얼음에 두어 0℃로 차가워진 0.1M 염화칼슘 2.5ml에 현탁시키고 다시 상기와 동일한 방법으로 원심 분리하고, 최종적으로 균체를 0℃의 0.1M 염화칼슘 1ml에 다시 현탁시키고, 이를 4℃에서 보관 후 24~48시간 동안 컴피턴트 세포로서 사용하였다.

전술한 염화칼슘법에 의해서 제저한 대장균 JM105 컴피턴트 세포 100μl를 결합 생성물 50~100 ng과 혼합하여 얼음에 30분간 두었다가 42℃에서 90초간 열충격을 가하고, 얼음에 다시 1-2분간 두었다가 0.9ml SOC 배지(2% 박토 트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 10mM Nacl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10mM MgSO₄, 20mM 글루코즈)를 첨가하여 혼합한 후, 진탕 배양기에서 200 rpm로 1시간 배양시켰다. 미리 준비된 35μg/ml의 앰피실린이 포함된 LB 아가 플레이트에 50~200μl의 균주 배양액을 넣어 유리 밀대로 골고루 퍼지게 하였다. 실온에서 1~2시간 균주 배양액이 스며들게 한 후 37℃ 배양기에서 14~16시간 동안 군락을 성장시켰다.

(7) 군락의 선별

재조합 플라스미드가 형질 전환되어 앰피실린에 내성을 나타내는 군락을 일차적으로 크래킹하여 외래 DNA가 삽입된 클론들을 선별하고, 선별된 클론들로부터 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 이 방법에서는, 단일 군락을 35μg/ml의 앰피실린이 포함된 3~5ml LB 배지에 접종하고 37℃ 진탕 배양기에서 16~18시간 동안 배양하였다. 배양액은 12,000 x g에서 5분간 원심 분리하여 배지를 제거한 균체를 용액 I 100μl을 넣고 충분히 현탁시킨 후 실온에서 10분간 방치하였다. 용액Ⅱ 200㎕를 혼합하고 얼음에 5분간 방치하여 알칼리 용해시킨 후 용액 Ⅲ 150㎕를 넣고 혼합 후 얼음에서 5분간 두었다. 4℃에서 12,000 x g로 5분간 원심 분리한 후 상층액을 분리한 후 4℃에 5분간 12,000 x g으로 원심 분리하였다. 분리시킨 수층에 0.1배 용량의 초산나트륨(pH 5.2)와 2.2배 용량의 에탄올을 넣고, 혼합한 후 4℃에서 5분간 12,000 x g에서 15분간 원심 분리하여 침전물을 얻고, 여기에 다시 70% 에탄올을 넣고 12,000 x g에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 얻은 재조합 플라스미드 DNA를 20μg/ml의 RNase가 포함된 2차 증류수 용액 30~50μl에 용해시켰다. 이 재조합 플라스미드 DNA를 하나의 제한 효소 부위를 가지고 있는 EcoRI 및 PstI(도 3, 레인1), HindⅢ(도 3, 레인 2)로 절단시킨 다음 아가로즈 겔 전기 영동한 후 0.5 μg/ml의 브롬화에티듐이 포함된 1 x TAE 용액 (0.04 M Tris-아세테이트, 0.01 MEDTA)에서 15-30분간 DNA를 염색한 후 그 밴드 패턴을 관찰한 결과 1.1kb의 DNA 단편이 정확하게 클로닝되어 있음을 확인하고 pPWJ로 명명하였다. (도 3, 레인 1).

(실시예 3)

서던 혼성화(Southern hybridization)에 의한 숙주 염색체 내의 존재 확인

아가로즈 겔 전기 영동 후 겔을 변성 용액 (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH)에 1시간 동안 담가 DNA 를 변성시키고, 다시 중화 용액(1.5M NaCl, 0.5 M Tris Hcl, pH8.0)에서 30분간 방치하여 중화시켰다. 처리된 겔은 서던의 방법[J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1975]과 샘부룩(Sambrook. J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. Molecular cloning 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).]의 방법을 변형하여 20 x SSC; 0.15 M NaCl, 0.15 M 시트르산나트륨, pH7.0)용액하에서 나일론막에 이동시키고 2 x SSC에서 5분간 처리하고 젖은 상태로 UV 가교시켰다. 처리한 나일론막은 10ml의 전혼성화 용액 (6 x SSC, 0.5% SDS, 100 μg/ml 연어 정자 DNA, 5 x 덴하트 용액)을 첨가하고 65℃에서 6시간 반응시켰다. 전혼성화가 끝난 후 용액을 제거하고 신선한 전혼성화 용액에 동위 원소로 표지된 프로브를 넣고 동일한 반응 조건으로 12~16시간 반응시켰다. 2 x SSC1×SSC 용액으로 68℃에서 15분간 2회 세척하고 다시 0.1 x SSC로 동일 조건하에서 1회 세척하였다. 세척이 끝난 나일론 막은 카세트에 고정하고, X선 필름을 넣어서 -70℃에서 12시간 이상 방치 후 현상하여 시그날을 확인하였다.

도 4에서 보는 바와 같이, pKK223-3에 클로닝된 1.1kb의 유전자가 녹농균의 염색체에서 유래하였는지를 확인하기 위해서 pPWJ 플라스미드를 EcoRI과 PstI으로 절단하여 삽입물을 분리해 내었다. 이 삽입물을 랜덤 프라임드 DNA 라벨링키트(Boehringer Manheim, Mannheim, Germany)를 사용하여 [α-³²P]dCTP로 표지시킨 프로브를 가지고 각각 제한효소 EcoRI(레인 1)및 HindⅢ(레인 2)로 처리한 녹농균 CFCPA 20215 혼성화시킨 결과 EcoRI으로 처리한 경우는 6.5 kb의 크기를 갖는 단일 DNA와 강하게 결합하였으며, HindⅢ으로 처리한 경우는 대략 4.7 Kb 및 8 Kb의 두개의 DNA와 결합하였다. 따라서, 클로닝된 1.1kb의 유전자가 녹농균 CFCPA 20215의 염색체 DNA로부터 얻어진 것임을 확인할 수 있었다. 이 유전자가 다른 혈청형의 녹농균에서도 확인되는 지를 알아보기 위해서 같은 방법으로 녹농균 CFCPA 10142, CFCPA 30720 및 CFCPA 60534와 혼성화사킨 결과 실험에 사용한 모든 균주에서 역시 6.5kb의 크기를 갖는 DNA와의 반응을 나타내었다.

(실시예 4)

DNA 서열화에 의한 Opr유전자의 염기 서열 결정

Opr 유전자의 염기 서열은 디데옥시 사슬 종결법을 사용하여 결정하였으며 (도 5), 결정된 염기 서열은 PC/GENE과 푸스텔(Pustell : IBI Inc., U.S.A)을 이용하여 분석하였다.

PCR 생성물로부터 클로닝된 유전자 전체의 DNA 서열을 밝히기 위해서 생거 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467, 1977]에 따라 염기 서열을 분석하였다. 별도로 A, C, G, T로 표시한 미세 원심 분리 튜브에 80μM dCTP, 80 μM dGTP, 80 μM dTTP, 50mM NaCℓ, 10% DMSO 및 0.08 μMddATP(D 튜브)가 포함되도록 한 혼합액 2㎕을 분주해 놓았다. 새로운 튜브에 140ng(20pmol)프라이머, 60ng(0.025pmole) DNA, 40mM Tris HCl, pH 7.5, 25mM MgCl₂50mM NaCl, 10% DMSO가 포함된 6㎕ 용액을 3분간 비등시키고, 0℃로 급냉하여 DNA를 변성시키고, 여기에 표지 혼합물(25mM DTT, 10μCi³⁵S-dATP), 2단위 시쿼나제가 포함된 4㎕를 혼합한 후 이를 A, B, C 및 D 튜브에 각기 2㎕씩 넣어 혼합하고 37℃에서 5분간 반응시켜 중합 반응 및 종결 반응이 일어나도록 한 후 0.25 mM dATP, 0.25mM dCTP, 0.25mM dTTP, 0.25 mM dTTP, 50 mM NaCl, 10% DMSO 가 포함된 용액 2 ㎕를 혼합하여 37℃에서 5분간 더 반응시켰다. 종결 용액을 각기 4 ㎕씩 넣고 75℃에서 2분간 두었다가 즉시 얼음속으로 옮겨 넣었다. 6% 폴리아크릴아미드 겔(두께 0.4 mm)에 각기 4㎕씩 로딩(loading)하여 45와트로 3.5 시간 동안 핵산 시퀀서(IBI)를 이용하여 전개시켰다. 한쪽 유리판만을 제거한 채로 겔을 10% 메탄올과 10% 아세트산 혼합액에 넣어 30분간 고정시키고, 80℃ 겔 드라이어(Biorad)에서 5시간 동안 말린 후, 암실에서 Hyperfilm-β-Max (Amersham # RPN11)에 노출시키고 상온에서 24시간 보관하였다가 암실에서 필름을 꺼내어 X선 디벨로퍼에서 3 분간, 그리고 픽서에서 3~5분간 반응시킨 후, 흐르는 물에 5분간 담구어 두었다가 염기 서열을 확인하엿다.

도 5에 나타나 있는 바와 같이, Opr 유전자는 783 bp를 가지는 하나의 오픈리딩 프레임으로 되어 있으며, 이 유전자에 의해서 발현되는 재조합 Opr은 261개의 아미노산을 갖는 단백질로 구성되어 있다. 또한, 783번 위치의 번역 종결 코돈인 TAG로부터 21bp 떨어진 곳에 전사 터미네이터 서열이 될 수 있는 이차 스템 루프구조를 보여주고 있다. 발현된 재조합 Opr은 SDS-PAGE 상에서 대략 30 KDa으로 추정되는데, 컴퓨터를 이용하여 재조합 Opr의 염기 서열을 아미노산 서열로 전환하여 계산한 이론적인 분자량과도 일치하였다. 또한, 150~155의 아미노산 잔기를 갖는 부분이 가장 친수성이 높은 곳으로 나타났다. 인터넷을 통한 GENINFO(R) BLAST 네트워크를 이용하여 재조합 Opr 유전자의 염기 서열과 아미노산 서열을 분석한 결과, 지금까지 보고된 바가 없는 새로운 Opr 유전자임을 밝혀내었다.

(실시예 5)

대장균 JM105 내에서의 재조합 Opr 유전자의 발현

재조합 DNA로 형질 전환된 대장균 JM105(KCCM-10079)를 앰피실린이 포함된 LB 배지에서 12~16시간 배양하고, 동일한 배지로 1 : 10으로 희석하여 37℃에서 1 시간 배양한 다음, IPTG를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가한 후 4시간 동안 더 배양하여 인덕션(induction)시켰다. 발현 정도는 소니케이터(Sonicator)와 프렌치프레서(French pressure)로 세포를 파쇄하여 SDS-PAGE로 분석하였다.

발현 단백질을 분리하기 위해 배양액을 원심 분리하여 균체를 회수하고 습윤 중량으로 1g 당 5㎖의 10mM Tris HCl(pH 7.5) 완충 용액으로 현탁시키고, 반복적으로 소니케이터 또는 프렌치프레서를 사용하여 세포를 파쇄하였다. 얻은 세균분해물은 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 회수하고 동일한 완충 용액을 사용하여 2회 세척한 후 같은 부피로 현탁시켜 50% 슈크로즈 10㎖에 5㎖의 균체 추출물을 로딩한 후 원심 분리하고, 여기서 얻은 펠릿을 회수하여 실험에 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

재조합된 플라스미드 pPWJ를 대장균 JM105에 도입하고, IPTG를 사용하여 37℃에서 4시간 인덕션시켜서 Opr을 발현시켰다(도 6). 더욱 구체적으로 설명하면 재조합 플라스미드 pPWJ로 형질전환된 대장균 JM105 세포를 밤새 배양시킨 배양액을 LB 배지에서 1 : 10 비율로 희석하고, 37℃에서 1시간 동안 성장시켰다. 600nm에서 배양액의 흡광도가 각각 0.5(레인 2, 4 및 5)또는 1.0(레인 3, 6 및 7)에 도달하였을 때, 1mM IPTG를 가하고, 추가로 4시간동안 배양하였다. 원심분리에 의해 세포를 수거하여 8M 우레아(레인 2 및 3)로 파쇄시켰다. 소니케이터(레인 4 : 상층액, 레인 5 : 펠릿) 및 프렌치프레서(레인 6 : 상층액, 레인 7 : 펠릿)를 사용하여 세포를 파쇄하고, 10,000 x g로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액 및 펠릿을 분리하였다. 단백질을 크기 마커로 사용하였다(레인 1). Opr의 발현을 위한 실험 결과, IPTG의 농도는 1mM이 가장 좋았으며, 인덕션 시간은 시간별로 배양액을 수확하여 분석한 결과 4시간이 가장 적절하였으며, 그 이후에는 Opr의 발현율이 낮아지는 현상을 관찰하였다. 그러나. IPTG 처리 직전의 세포 농도가 0.D. 0.5 나 1.0인 경우에 있어서 별다른 발현율의 차이를 보이지 않았다(도 6). 또한, 발현된 Opr은 대부분 인클루젼 바디(inclusion body) 상태로 존재하였으며, 발현된 Opr을 분리하기 위해서 회수한 균체를 소니케이터와 프렌치프레서를 사용하여 세균 분해물을 얻어서 10mM Tris HCl(pH7.5) 완충액으로 2회 세척하고 10,000rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 펠릿을 동일한 부피로 현탁시켜 다양한 농도의 슈크로즈 10㎖에 5㎖을 로딩한 후 3,000rpm(도 7A) 또는 10,000 rpm(제7도, B)으로 1시간 원심 분리하여 펠릿을 회수하였다. 도 7에서 슈크로즈 농도는 다음과 같다.

레인 1: 표준 분자량 표지물

레인 2: 대조 시료

레인 3: 5%

레인 4: 10%

레인 5: 15%

레인 6: 20%

레인 7: 25%

레인 8: 30%

레인 9: 40%

레인 10: 50%

얻은 펠릿을 SDS-PAGE하여 분석한 결과, 30% 이상의 스큐로즈 농도에서 10.000rpm으로 1시간 원심 분리한 경우에 가장 순순한 상태로 단백질을 얻을 수 있었으며, 분자량은 대략 30 KDa인 것으로 추정되었다(도8).

(실시예 6)

항체의 제조

(1) 신규한 Opr 단백질에 대한 마우스 및 기니픽 항체의 제조

분리 정제한 Opr에 대한 폴리클로날 항체를 제조하기 위해서 발리의 방법(Bailcy. G.S. The production of antisera, p295-300, In J.M. walker (ed.), Method in Molecular Biology Vol 1 Humana Press. Clifton, New Jersey.)에 따라서 실험하였다. 0.5mg/㎖의 정제된 단백질 1㎖과 완전 프로인드 보조제 1㎖을 이중 실린지 장치에 넣고 혼합하여 에멀젼을 제조한 다음, 마우스 및 기니픽에 적정량(10~50ug/kg)을 1 주일 간격으로 2회 면역시켰다. 1주 후에 1㎖의 불완전 프로인드 보조제에 1㎖의 동일한 항원을 에멀젼시킨 다음 마우스 및 기니픽에 최초 투여 용량의 절반(5-25ug/kg)을 추가 접종하고, 7일후 일정 간격으로 출혈시켜 얻은 혈액을 상온에서 방치하여 응혈이 일어나도록 하였다. 이어서, 4℃에서 하룻밤 방치한 다음 3,000 x g로 10분간 원심분리하여 상층의 혈청 부분을 얻었다.

(2) CFC-101에 대한 토끼 항체의 제조

4개의 약독화된 서로 다른 피셔 면역형(F1, F2, F3 및 F6)의 녹농균주로부터 순수 분리 정제하여 얻은 세포 외막 단백질은, 단백질의 농도를 기준으로 등량(1:1:1:1) 혼합하여 제조하였다(CFC-101으로 명명). 동량 혼합된 세포 외막 단백질을 가지고 항혈청을 얻기 위해서 토끼에 면역시켰다. 10mM 인산염 완충 용액(pH7.2)으로 적절히 희석하여 토끼 당 1㎖(100 ug/kg)씩 1주일 간격으로 2회 피하투여하고 채혈하기 1주일 전에 1㎖(50 ug/kg)을 정맥 주사하였다. 7일 간격으로 3회 투여 후 일주일 후에 채혈하여 항체가 충분히 생성되었는 지의 여부를 ELISA로 측정하였다. 이어서, 심장으로부터 채혈하여 얻은 항혈청은 분리한 후, 생화확적 또는 면역학적 분석에 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

(3) 녹농균에 감염된 후 회복된 환자의 항혈청 수득

녹농균의 감염된 환자들로부터 채혈된 서로 상이한 20여종의 혈액을 각각 약 1내지 5㎖씩 무균적으로 분양 받아 실온에서 1 시간 정도 방치하고, 4℃의 냉장고에서 밤새 보관한 다음 4℃에서 1500 x g으로 10분간 원심 분리하여 고형물을 제거하고 상층액으로 혈청을 수득하였다. 미리 준비된 1.0 내지 1.5% 아가를 첨가한 트립틱 소이 브로스 배양 평판에 상기에서 얻어진 혈청을 인산염 완충 용액(ℓ당 Na₂HPO₄1.15 g, KCl 0.2 g, KH₂PO₄0.2 g, NaCl 8.766 g)으로 1:10의 비로 희석하여 각각을 도말한 후, 37℃로 유지되는 호기성 조건의 배양기에서 12 시간 이상 배양하였다. 이렇게 하여 수득된 배양물을 새로운 배양 평판에 옮겨서 공지의 미생물 순수 분리 방법[참조: Biology of Microorganisms, 5th Edition, Tomas D, Brock, Michal T. Madigan, pp28-34, 1988]을 사용하여 미생물을 순수한 형태로 분리하였다. 분리된 녹농균들의 혈청학적 및 면역학적 분류는 이미 알려져 있으며(참조: Bergey's Manual), 시판되고 있는 분석 키트를 이용하여 다음과 같은 분석 방법으로 동정하였다(J. Gen. Microbiol. 130. 631-644, 1984). 트립틱 소이 브로스 5㎖을 시험관에 넣고 각각의 균을 접종한 후, 37℃로 유지되는 호기성 조건하에서 배양하여 650nm에서의 흡광도가 대략 2.0이상이 유지되도록 균체농도를 조절하였다. 이 배양액 1㎖을 무균적으로 분취하여 4℃에서 6000 x g으로 10분간 원심 분리한 후, 상층의 배양액을 제거하고 침전된 미생물에 동량의 멸균 식염수를 가하여 현탁시켰다. 준비된 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 시험 혈청 및 대조 혈청 (정상 토끼 혈청) 15μl씩을 각각 가한후, 각 혈청에 상기에서 수득된 미생물 현탁액 15μl씩을 가하여 혼합시키고, 10내지 30분 사이에 응집 반응(agglutination)이 일어나는지 여부를 관찰하였다. 이때, 양성의 응집 반응이 일어나는 웰의 균주는 거기에 첨가한 혈청과 일치되는 혈청형(Serotype)을 가지는 것이므로 쉽게 구별할 수 있다. 여기서, 양성 반응을 보인 환자중에서 녹농균 감염증에서 회복된 환자를 선별하여 혈액을 채취하고 전술한 방법에 따라서 항혈청을 분리하여 생화학적 또는 면역학적 분석에 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

(4) 재조합 Opr에 대한 모노클로날 항체의 생산

정제된 Opr 항원(100 ug/㎖) 0.1㎖을 완전 프로인드 보조제와 1:1로 현탁시켜서 Balb/c 마우스에 복강 투여하고, 7~10일 간격으로 2회에 걸쳐서 보조제를 첨가하지 않은 같은 농도의 항원을 복강내 주사하였다. 25일 후에 마우스당 5 ug/㎖의 항원을 꼬리 정맥에 투여하고 3일 경과 후에 세포 융합(cell fusion)을 수행하였다(Nature 256, 495-497, 1975). 세포 융합을 위하여, 면역된 Balb/c 마우스의 비장 세포를 적출하여 DMEM에 현탁(1 x 10⁸세포)시키고, 동시에 준비된 Sp2 골수종 세포(1 x 10₇세포)를 10:1의 비율로 혼합하여 50% PEG(polyethyleneglycol) 1450을 첨가하고, 42℃에서 세포 융합 후에 동량의 컨디션드 배지(conditioned media)(Sp2 골수종 세포의 배양액)과 HAT 배지를 첨가하여 배양하였다. 1주 후 HT 배지로 교체하고 현미경하에서 포도송이 모양의 세포주들이 관찰될 때 ELISA 방법을 사용하여 스크리닝하였다. 이 때, 선별된 하이브리도마 세포는 즉시 클로닝 하였으며, 여기서 얻은 하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 항체를 얻어서 정제한 후 실험에 사용하였다.

세포 융합 후 4일째부터 융합된 세포를 현미경하에서 관찰할 수 있었고, 1주일 경과 후에는 많은 웰에서 확인되었다. 2주 후에 상기의 ELISA 방법을 사용하여 투여 항원에 대해 특이하게 반응하는 클론을 찾기 위해서 스크리닝하였다. 이 때, 선별된 하이브리도마 세포로부터 얻어진 모노클로날 항체는 대부분 IgG 형으로, 배양 플라스크에서 배양하였을 때 생산된 항체의 양은 20 μg/㎖이며, 프로테인 A 컬럼으로 정제하여 ELISA, 웨스턴 면역 블롯 및 간접 형광 현미경을 이용한 세포내 편재화를 밝히기 위한 실험에 1차 항체로서 사용하였다.

(5) 재조합 Opr에 대한 폴리클로날 항체의 결합 활성

재조합 Opr에 대한 폴리클로날 항체의 결합 활성을 확인하기 위해서 다양한 종류의 항체 또는 혈청을 사용하여 ELISA를 수행하였다. ELISA 분석 방법은 후술하는 방법과 같다. 우선, 코팅 완충액(0.05M 탄산염 완충액, pH 9.6)로 20 μg/㎖의 농도로 조정된 Opr을 희석하여 96-마이크로플레이트의 각 웰에 100μl를 첨가하였다. 각 플레이트는 실온에서 2 시간 또는 4℃의 습윤 챔버에서 12내지 16시간 반응시켜 Opr 단백질을 플레이트에 부착시킨 다음 수용액을 제거하고, 여기에 각 플레이트에 비결합된 부분을 차단하기 위해 1% 우혈청 알부민(BSA) 200μl를 첨가후 2 시간 동안 반응시켜 단백질-비결합 부분을 차단시켰다. 다시, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS(PBST, pH 7.2)로 3회 세척후, 각 Opr이 코팅된 마이크로플레이트의 각 웰에 PBS로 1:50이 되게 희석한 혈청 또는 동량의 항체 100μl를 첨가하고 2시간 반응시켰다. 이때, 음성 대조군으로서는 Opr로 면역시키지 않은 각각에 해당하는 정상 항체 또는 혈청을 사용하였다. 반응 종료 후 다시 동일한 인산염 완충 세척액으로 4 내지 5회 세척하였다. 여기에, 각각에 대응하는 2차 항체 100μl를 가하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 동일한 인산염 완충 세척액으로 5회 이상 격렬하게 세척하였다. 여기에, 기질로서 시트레이트-포스페이트 완충액(0.1M Citrate -Phosphate buffer, pH 5.0)에 오르토-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드를 0.3 내지 0.4mg/㎖의 농도로 조정하여 50μl씩 첨가하고, 20분간 차광하에 반응시킨 후, 1N-황산 50μl씩을 가하여 반응을 정지시켰다. 그 후, 분광 광도계를 이용하여 각 반응 용액의 Opr-항체 결합 활성을 490nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 그 결과, 프로테인 A 컬럼으로 정제한 항체(0.7 mg/㎖)를 계열 희석시켜 10⁴희석 배수일 때, 2 종류의 서로 다른 동물로부터 얻은 항체에 있어서 모두 재조합 Opr에 대해 490nm에서의 흡광도가 0.4를 나타내었다. 그러나, 녹농균에 감염된 환자의 혈청을 사용한 경우에는 10배, CFC-101에 대한 토끼 항체를 사용한 경우는 100배 정도 낮은 결합 활성을 보여주었다. 이들 결과로 미루어 볼 때, 재조합 Opr에 대해 생산된 두 항체가 매우 높은 특이성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 9).

(6) 웨스턴 면역 블로팅에 의한 Opr의 동정 및 분석

정제한 재조합 Opr을 SDS-PAGE한 후 니트로 셀룰로오즈 막에 옮겼다. SDS-PAGE는 라엠리 방법(Nature 227,680-685, 1970)을 따랐으며, 직선 또는 선형 구배 아크릴아미드 겔(NOVEX Co.)을 구입하여 사용하였고, 시료 16μl와 4μl의 5 x 시료 로딩 완충액을 섞어서 95℃에서 5분 동안 가열한 후에 겔에 로딩하였다. 분리된 단백질들은 여기에 다양한 공급원으로부터 얻어진 항체를 처리하여 반응성을 조사해 보았다. 일차로 CFC-101에 대한 토끼 항체(레인 1), 녹농균에 감염된 환자의 혈청(레인 2), 그리고 재조합 Opr에 대한 마우스 항체(레인 3)를 사용한 결과, 사용한 모든 경우에서 분자량이 30 KDa인 Opr에서 특이하게 반응이 일어남을 알 수 있다(도 10). 또한, 재조합 Opr에 대한 모노클로날 항체를 사용한 결과도 위의 실험에서 사용한 폴리클로날 항체의 경우처럼 동일한 위치에서 특이하게 반응이 일어남을 확인하였다(도 11, 레인 1). 또한, 모노클로날 항체를 사용하며 녹농균 CFCPA 20215의 배양 상층액과 균체를 분리해서 웨스턴 면역 블로팅한 결과 균체를 제거한 배양액의 시료에서는 어떠한 밴드도 관찰되지 않았으나, 회수한 균체로부터 세포외막 단백질만을 분리하여 분석한 시료에서는 동일한 위치에서 밴드를 확인하였다(도 11, 레인 2). 재조합 Opr이 분명하게 세포 외막 관련 단백질임을 보여주는 직접적인 결과로서 확인하였다.

(실시예 7)

형광 현미경에 의한 세포 외막내 존재 확인 시험

대장 균 JM105로부터 발현시켜 분리한 재조합Opr이 녹농균의 세포 외막 단백질임을 확인하기 위한 실험으로 간접 면역 형광 표지법(Hubbard. A. L., and Cohn, Z. A. (1976) Specific labels for cell surfaces. In Biochemical analysis of membranes, ED. a. H. maddy p.427-501. Chapman Hall, London)을 사용하였다. 녹농균 CFCPA 20215 (KCCM10030)를 미드-로그 페이즈까지 배양 후 6,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심 분리하여 세포를 수확하였다. 각 튜브당 50μl(1 x 10⁷세포/㎖)를 넣고 Opr에 대한 모노클로날 항체를 10 mM PBS(pH 7.2)로 적절히 희석하여 50μl(100 μg/㎖)를 첨가하고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 1%의 BSA가 포함된 10mM PBS (PBS/BSA)로 2회 세척하고, 1:1000으로 희석한 FITC 콘쥬게이트 염소 항-마우스 1gG를 50μl를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후 다시 PBS/BSA로 2회 세척하였다. 세척한 세포에 PBS/BSA 용액 500μl를 넣고 암실에서 형광 현미경으로 관찰하였다. 균주에 대한 음성 대조군으로는 대장균 JM105를 사용하였으며, 녹농균에 대한 음성 대조군으로는 1차 항체 대신에 10mM PBS를 사용하였다. 실험 결과 녹농균 CFCPA 20215의 세포 표면에서 첨가한 Opr에 대한 모노클로날 항체와 반응하여 형광을 보여주었다(도 12). 그러나, 실험에 사용한 두 가지 음성 대조군에서는 어떠한 형태의 형광도 나타나는 것을 관찰할 수 없었다. 따라서, 재조합 Opr이 녹농균 CFCPA20215의 세포 표면에 존재함을 최종적으로 확인할 수 있었다.

(실시예 8)

재조합 Opr의 감염 방어 효과 시험

(1) 능동면역에 의한 Opr의 감염 방어효과

정제한 재조합 Opr을 항원으로 사용하여 녹농균에 대한 감염 방어 효과를 알아보기 위해서 5주령의 건강한 웅성 ICR 마우스(20-25 g)를 사용하여 실험을 수행하였다. 대장균 JM105로부터 발현시켜 분리 정제한 재조합 Opr을 매회 0.2mg/kg의 용량으로 16 마리의 마우스에 2일 간격으로 3회 복강 투여 하고, 최종 투여 5일 후에 녹농균 GN11189를 복강 내에 감염시킨 다음 7일간 생존율을 관찰하였다. 음성 대조군은 8 마리를 사용하였고 재조합 Opr 대신에 생리 식염수를 투여하는 것을 제외하고는 동일한 조건에서 실험하였다. 감염 방어 효과에 대한 결과는 표 2에 나타내 있는데, 재조합 Opr을 투여한 경우 94%의 감염 방어 효과를 보여주었다. 이와 같은 우수한 감염 방어 효과가 항원으로 사용한 재조합 Opr내의 어떤 대장균 JM105로부터 유래된 오염물에 기인할 수 있는 가능성을 배제할 수가 있다. 왜냐하면, 본 발명의 기초 실험 및 많은 연구자의 보고에 의하면, 대장균에서 추출한 단백질을 실험 동물 내에 면역시킨 후 공격용 균주로 녹농균을 감염시킨 경우에 유의성 있는 감염 방어 효과를 관찰할 수 있었다. 따라서, 이 실험 결과에 의하면 재조합 Opr이 우수한 항원성을 지니고 있음을 확인할 수 있었으며, 또 다른 백신 후보항원으로서의 가능성을 보여주었다.

(2) 수동 면역에 의한 Opr의 치료 효과

실시예 8의 (1)에서 얻어진 Opr에 대한 마우스의 항혈청을 가지고 수동 면역에 의한 치료제로서의 효과를 알아보기 위해서 5주령의 건강한 웅성 ICR 마우스(20-25 g)를 사용하여 실험을 행하였다. Opr에 대한 항혈청을 0.3㎖의 용량으로 각 그룹당 20마리씩 복강에 투여하고, 2 시간 후에 공격균인 녹농균 GN11189를 복강 내에 감염시킨 다음 7일간 생존율을 관찰하였다. 음성 대조군은 마우스의 정상 혈청을 사용하였고, 동일한 조건에서 20 마리를 사용하여 실험하였다. 수동 면역에 의한 치료 효과에 대한 결과는 표 3에 나타나 있다.

표 3에서 보는 바와 같이 Opr에 대한 항혈청을 사용한 시험군의 경우, 생존율이 100%인 우수한 치료 효과를 보였으며 대조군의 경우는 생존율이 20%로 나타났다. 이 실험 결과에 의하면 Opr을 사용한 경우에 녹농균에 대한 치료 효과는 동물실험을 통한 생존율이 매우 우수한 겻으로 미루어 치료율이 높은 유효한 항체 생산을 위한 항원으로서 사용 가능성을 보여주고 있다.

(3) 상이한 혈청형의 녹농균에 대한 교차 면역 방어효과

대장균 JM105로부터 정제한 Opr에 대한 다양한 혈청형의 녹농균에 대한 감염 방어 효과를 알아보기 위해서 5주령의 건강한 웅성 ICR 마우스(20-25 g)를 사용하여 실험을 행하였다. 분리 정제한 Opr를 매회 0.2 mg/kg의 용량으로 각 그룹당 20마리씩 2일 간격으로 3회 복강내 투여하고, 최종 투여 5일 후에 감염 유발용 시험균주인 녹농균 피셔 1형, 2형, 3형, 4형, 5형, 6형, 7형을 각각 복강내에 감염시킨 다음 7일간 생존율을 관찰하여 교차 면역 효과를 측정하였다. 각 음성 대조군은 20 마리를 사용하였으며 Opr 대신에 생리 식염수를 투여하는 것을 제외하고는 동일한 조건에서 실험하였다. 교차 면역 방어효과에 대한 결과는 표 4에 나타나 있다. 표4에 기재된 녹농균 균주형 F1 내지 F7은 피셔-데블린(Fisher-Devlin) 면역형에 따른 것이다(참조: J. Bacteriol. 1969, 98, 835-837).

표 4에서 보는 바와 같이, 공격용 균주로 F2 및 F6을 사용한 경우는 95%의 방어 효과를 나타냈으며 F1, F3 및 F4의 경우는 90%, F5와 F7의 경우는 85%의 감염 방어 효과를 보여주었다. 결과적으로 85% 이상의 다양한 교차 면역 방어 효과를 보여 주고 있으며, 효과 측면에서 기존의 다른 세포 외막 단백질을 항원으로 사용한 경우보다 비교적 우수한 감염 방어 효과를 나타내었다. 따라서, 한 종류의 Opr만을 가지고도 넓은 범위의 녹농균의 감염을 교차 면역 방어할 수 있다는 사실은 본 발명의 신규한 Opr이 모든 녹농균에 대한 중요한 면역원성을 지닌 공통 항원이라는 것을 나타내는 것이다.

(실시예 9)

재조합 Opr의 독성 시험

본 발명은 재조합 Opr을 함유하는 백신의 독성을 다음과 같이 시험하였다. 체중이 20 내지 25 g 인 ICR계 마우스 및 스프래그 돌리(SD) 랫트를 시험 동물로 사용하여 근육 투여 후 독성을 시험하였다. 백신의 투여 용량 설정은 약물의 용해도 및 예상 임상 적용량을 고려하여 최고 용량군을 50mg/kg으로하고, 공비를 0.5로 하여 중상(25mg/kg), 중하(12.5mg/kg)및 최저 투여군(6.25mg/kg)을 설정하였고, 투여 액량은 모든 개체에서 10㎖/kg이 되게 하였다. 투여 후 1 주일간 관찰하여 그 결과를 다음의 표 5에 나타내었다.

상기 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 마우스 및 랫트에 백신의 근육 투여에 의한 독성 시험을 실시한 결과 모든 투여군(최고 용량: 50mg/kg) 및 대조군에서 폐사예 및 특이 증상이 관찰되지 않았다. 또한, 체중 변화에 있어서도 대조군과 백신 투여군 사이에 유의성 있는 차이는 보이지 않았다.

따라서, 본 시험의 모든 조건에서 LD₅₀은 50mg/kg이상으로, 이는 예상 임상 사용 평균 용량의 3000배로 매우 안전한 물질임을 확인하였다.

(실시예 10)

면역 글로불린의 제제화

상기 실시예 6에서 제조된 항혈청을 체중 kg 당 1 내지 100mg 씩 투여할 수 있도록 제약학상 허용되는 후술하는 적합한 담체를 사용하여 제제화하였다. 제제화된 면역 글로불린을 녹농균 감염증이 유발된 생쥐에 투여하여 담체의 종류에 따른 면역 글로불린의 유효성 차이를 관찰하였다. 그 결과 액상 제제의 경우에는 담체로 주사용 생리식염수 또는 인산염 완충액을 사용한 면역 글로불린 제제가 유효성이 나타났으며, 동결 건조된 제제의 경우에는 만니톨, 사카로오스, 락토오스를 담체로 사용한 경우에 높은 유효성을 나타내었다. 반면에, 동결 건조 제제인 경우, 인체 알부민을 병용한 경우에는 유효성이 오히려 낮았으며, 액상 제제로는 수산화알루미늄을 사용한 경우에 그 효과가 떨어졌다. 이 결과들은 다음의 표 6에 나타내었다.

(실시예 11)

제제화된 면역 글로불린의 유효성 실험

실시예 10에서 유효성이 높은 것으로 확인된 인산염 완충 제제를 사용하여 제제화된 면역 글로블린의 열상, 화상, 외상 등에서의 2차 피부 감염에 대한 예방 및 치료제로서의 유효성을 확인하였다. 공지의 화상 시험 방법 (J. Infect. Dis. 131, 688-691, 1975)으로 마우스에 화상을 유도한 후, 인산염 완충액 ㎖ 당녹농균 면역 글로불린 0.5 내지 1㎖을 함유하는 액상 제제로 분무제를 제형화하여 시험군의 생쥐의 화상 부위에 분무 처리하여 그 효과를 비처리군에서의 상태와 비교하여 판정하였다. 그 결과를 다음의 표 7에 나타내었다.

상기 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 면역 글로불린-인산염 완충액 분무제로 분무 처리한 마우스 집단에서는 대조군에 비해 월등히 우수한 생존율을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 녹농균 면역 글로불린 함유 제제는 녹농균의 감염증에 대해 우수한 및 및 치료 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있다.

본 발명에 따라, 녹농균 자체의 고유한 독성의 위험은 없으면서 인체에 투여시에 효과적으로 녹농균에 대한 유효 항체의 생성을 유발함으로써 우수한 면역원성(즉, 항원성) 작용을 나타낼 수 있는 우수한 특성을 갖는 새로운 세포 외막 단백질이 제공 된다.

Claims (5)

1. 다음의 DNA 염기 서열로 나타내는 녹농균 세포 외막 단백질(Opr) 유전자.
2. 제 1항 기재의 Opr 유전자에 의해 발현된 재조합 Opr.
3. 제 2항 기재의 재조합 Opr을 항원으로 함유하는 녹농균 감염증 예방용 백신.
4. 항원으로서 제2항 기재의 재조합 Opr에 대한 항체.
5. 제4항 기재의 항체를 함유하는 녹농균 감염증 치료제.