KR102699563B1 - 돼지열병 항원단백질 함량 증진을 위한 형질전환 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 재배 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 재배하는 단계에 있어서, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 정식한 후 적심 처리하는 단계를 포함하는, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법을 제공하여, 돼지열병 항원단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 형질전환 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)로부터 돼지열병 항원단백질(GP55)을 높은 함량으로 얻을 수 있는 재배법에 관한 것으로, 구체적으로는 식물공장 내 수경재배 생산시스템 하에서 항원단백질의 함량을 증진시킬 수 있는 광질조건, CO2 공급농도, 배양액 온도 및 적심처리에 관한 것이다.
가축 1종 관리 대상 전염병인 돼지열병은 감염 시 폐사율이 높고 전염성 또한 높은 특징이 있다. 현재까지 국내 양돈 농가의 경우 돼지열병의 대응책으로 생백신을 사용하고 있지만, 혈청학적으로 백신축과 야외감염축을 감별할 수 없었다.
그러나, 최근 혈청학적으로 백신축과 야외감염축을 감별할 수 있는 마커 백신 생산용 형질전환 식물 개발이 완료되었으며, 이와 같은 형질전환 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서 추출 정제한 백신으로 목적 동물 효능 검증이 완료된 바 있다.
상기 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)는 외부 DNA의 발현이 용이하고 생장속도가 빠른 형질전환 식물로서 애기장대와 더불어 생명공학 기술의 원료식물로 주로 이용되고 있다. 이에 종래 한국공개특허 제2017-0072747호에 개시된 바와 같이 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 수경재배 시 광(光), 온도 및 양수분을 제어하여 식물의 생장을 촉진시키는 효과적인 재배법이 개발되고 있다.
다만, 식물의 생장과 관계없는 단백질이나 대사체들의 함량은 특정 스트레스 조건 하에서 많이 발현될 수 있기 때문에, 형질전환 식물체에서 목적물질의 생산은 식물체의 생장에 비례하여 증가하지 않을 수도 있으므로, 형질전환 식물체의 경우 광조절, 온도제어, CO2공급 등의 생육환경에 따라 목적물질의 함량 변화를 고려해야 한다. 나아가, 종래 기술에 비하여 항원단백질 함량을 보다 효율적으로 증대시킬 수 있는 기술 개발의 요구가 계속되고 있다.
따라서, 형질전환 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 생육환경을 조절하여 항원단백질 함량을 효율성 있게 증대 시킬 수 있는 방법이 개발되는 경우, 상기와 같은 돼지열병 항원백신용 원료 물질의 효율적인 생산 및 이를 포함하는 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 형질전환 식물체인 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)를 이용하여 돼지열병 항원단백질인 GP55의 함량을 효율적으로 증진시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 재배하는 단계에 있어서, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 정식한 후 적심 처리하는 단계를 포함하는, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 재배방법은 돼지열병 항원단백질을 효율적으로 증진시킬 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 LED 광질에 따른 생체중(도 1a), 항원단백질 함량(도 1b) 및 재배된 형질전환 니코티아나 벤타미아나(도 1c)를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 CO2 공급농도에 따른 생체중(도 2의 (a)) 및 항원단백질 함량(도 2의 (b))을 나타낸다.
도 3는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 배양액의 온도에 따른 생체중(도 3의 (a)) 및 항원단백질 함량(도 3의 (b))을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 엽의 월령에 따른 항원단백질 함량 차이를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 순지르기(적심) 처리시기에 따른 항원단백질 함량을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 순지르기(적심) 처리처리 정도에 따른 항원단백질 함량을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 CO2 공급농도에 따른 생체중(도 2의 (a)) 및 항원단백질 함량(도 2의 (b))을 나타낸다.
도 3는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 배양액의 온도에 따른 생체중(도 3의 (a)) 및 항원단백질 함량(도 3의 (b))을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 엽의 월령에 따른 항원단백질 함량 차이를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 순지르기(적심) 처리시기에 따른 항원단백질 함량을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 순지르기(적심) 처리처리 정도에 따른 항원단백질 함량을 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 "식물공장 생산 시스템"은 밀폐된 시설 안에서 인공광원, 온도, 배양액 및 CO2등의 생육환경을 인위적으로 조절하여 외부기후와 관계없이 식물을 연중 연속으로 생산하는 장치 및 설비를 의미한다.
본 명세서에 기재된 "순환형 수경재배방식"은 육묘된 개체가 정식(定植)되어 재배될 때 일정 기울기를 가진 재배대에서 배양액이 연속적으로 흘러 작물의 뿌리가 배양액을 흡수하고 일부는 공기에 노출될 수 있도록 설치되는 방식을 의미한다.
본 명세서에 기재된 "정식(定植)"은 파종 후 본엽이 출현된 모종을 재배하는 곳에 옮겨 심기 하는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 "적심(摘心)"은 순지르기를 하여 곁가지를 유도하는 것을 의미한다.
본 발명은 밀폐형 식물생산 시스템에서 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 재배 시 항원단백질(GP55)의 함량을 증진시키기 위한 재배방법을 제공하는 것이며, 보다 구체적으로 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 재배하는 단계에 있어서, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 정식한 후 적심 처리하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 니코티아나 벤타미아나는 돼지열병 항원백신 생산용 형질전환된 니코티아나 벤타미아나일 수 있다.
한편, 본 발명의 재배 방법이 적용되는 묘목을 획득하기 위한 발아 단계는 특히 제한되는 것은 아니나, 28 내지 30℃의 온도에서, 명암 주기는 12시간/12시간으로 하고, 광도는 120 내지 300 μmol/m2/s로 유지시켜 수행될 수 있다. 한편, 상기 니코티아나 벤타미아나의 파종은 포수된 암면셀에 실시하고, 복토는 일반 원예용 상업용토(상토)로 수행할 수 있다.
나아가, 상기 발아 단계를 수행한 니코티아나 벤타미아나의 육묘 단계는 특히 제한되는 것은 아니나, 파종 5 내지 7일 후 발아가 되어 자엽이 전개된 개체를 72공 혹은 105공 플라스틱 셀 트레이에 옮겨 육묘과정을 수행할 수 있다. 이때, 명암주기는 14시간/10시간로 하며, 광도는 120 내지 300 μmol/m2/s로 유지시킬 수 있으며, 온도는 25 내지 27℃가 되도록 유지할 수 있고, 배양액을 저면급수로 EC 0.5~0.6 μS/cm 농도로 공급할 수 있다. 이때, 육묘 단계는 정식 전 까지 12 내지 16일 사이로 실시하며, 바람직하게는 14일 동안 실시한다.
즉, 본 발명의 수경재배 방법은 담배식물 종자를 발아 단계 및 육묘단계를 거쳐 획득된 묘목에 대해 수행되거나 또는 발아된 묘목을 상업적으로 획득하여 적용할 수도 있다.
본 발명의 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법은 식물공장 생산 시스템 하에서 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 재배 방법은 수경재배 방식으로 수행되며, 보다 구체적으로 순환 담액 수경재배(DFT) 또는 순환 박막 수경재배(NFT) 방식에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 순환 박막 수경재배(NFT) 방식에 의해 수행되는 것이다.
상기 묘목을 재배하는 단계에서 상기 묘목에 조사하는 광은 백색광과 적색광의 비율이 90:10 내지 50:50이며, 바람직하게는 50:50인 것이다. 백색광과 적색광의 비율이 100:0인 경우 애기장대의 생체중 및 항원단백질 함량 모두 감소하는 문제가 있다.
상기 백색광과 적색광에 사용되는 광원은 인공광원 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 LED 및 형광등으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 사용할 수 있다. 상기 광은 백색광과 적색광의 소자 개수 비로 조합을 이룰 수도 있으며, 예를 들어 광원으로 LED를 이용하는 경우 백색광 90%+적색광 10%, 백색광 75%+적색광 25% 또는 백색광 90%+적색광 10%으로 광질을 조성할 수 있다.
또한, 백색광 및 적색광의 소자의 수는 1:1로 하고 소자의 광도의 세기비율로 조합될 수도 있다. 예를 들어 백색광 90%+적색광 10%와 같은 효과를 얻기 위해서 백색광의 광도는 180μmol/m2/s, 적색광의 광도는 20μmol/m2/s으로 하는 것이다.
상기 광원의 광도는 150 내지 250μmol/m2/s 인 것이 바람직하고, 광조사(artificial lighting)는 니코티아나 벤타미아나의 재배 기간 동안 이루어질 수 있다. 이 때, 광주기는 12 내지 14시간인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 약 14시간인 것이다. 상기 광주기가 12시간 미만인 경우에는 조기 개화유도 및 묘의 도장(Over-growth)을 초래할 수 있으며, 전기에너지 효율성을 고려하면 14시간을 초과하지 않는 것이 바람직하다. 또한 상기 광원의 광도가 150μmol/m2/s 미만인 경우에는 광합성율 감소로 인한 생장속도 둔화의 문제가 있으며, 광도가 250μmol/m2/s를 초과하는 경우에는 과다한 전력소비 및 광원의 발열로 인한 문제가 발생한다.
상기 광도는 광원으로부터 약 20cm거리에서 측정하였을 경우의 광도를 기준으로 하는 것이다.
본 발명의 니코티아나 벤타미아나의 재배를 수경재배 방식으로 수행하는 경우 공급되는 배양액의 온도는 18 내지 22℃인 것으로, 바람직하게는 20℃인 것이다. 이 때, 밀폐형 식물공장 내에서 실내 온도관리 시 배양액의 온도는 지하수의 온도인 18℃ 이하로는 내려가지 않으며, 배양액의 온도가 인공광원의 발열로 인해 22℃를 초과하는 경우 잎이 오그라들면서 뿌리가 갈변하는 등의 생리적 장애가 발생하는 문제가 생긴다.
상기 배양액은 특히 제한되는 것은 아니나, 오오츠카(Otsuka) 파프리카 배양액 또는 야마자키(Yamazaki) 상추전용 배양액 등을 조제로 하여 사용할 수 있다.
상기 묘목을 재배하는 단계에서 공급되는 CO2 농도는 주간을 기준으로 500 내지 1,500ppm인 것으로, 예를 들어 900 내지 1,200ppm이고, 바람직하게는 1000ppm 내외이다. 이 때, 상기 주간에 공급되는 CO2 농도가 500 ppm 미만인 경우 애기장대의 광합성에 충분한 CO-2가 공급되지 않아 애기장대의 생장이 충분히 일어나지 않는 문제가 발생하며, 1,500ppm을 초과하는 경우 CO2 비용에 대한 공급효율성이 낮아지는 문제가 발생한다.
나아가, 상기 묘목을 재배하는 단계에서 야간에는 CO2의 공급은 행하지 않는다. 야간의 경우 빛이 없는 조건에서는 광합성을 하지 않고 호흡만을 행하게 되므로 CO2의 공급은 효율성이 없기 때문이다.
상기 적심 처리하는 단계는 정식 후 7 내지 14일에 적심 처리를 수행하는 것으로, 바람직하게는 정식 후 14일에 적심 처리를 수행하는 것이다. 이 때, 정식 후 7일이 안되었을 때 적심 처리를 하는 경우 적정 엽수를 확보하는 것이 어려워 생장속도가 현저히 낮아질 수 있으며, 14일이 지난 후 적심처리 하는 경우 적심처리 하지 않는 경우 보다 항원단백질 함량이 감소하는 문제가 있다.
상기 적심 처리하는 단계는 생장점으로부터 2 내지 7cm 아래를 적심 처리하는 것으로, 바람직하게는 생장점으로부터 2 내지 5cm 아래를 적심 처리하는 것이며, 가장 바람직하게는 생장점으로부터 2cm 아래를 적심 처리 하는 것이다. 이 때, 생장점으로부터 2cm보다 위를 적심 처리 하는 경우 새로운 잎과 줄기를 출현시키기 위한 적심의 효과가 낮아지는 문제가 생길 수 있으며, 생장점으로부터 7cm보다 아래를 적심 처리 하는 경우 생장량이 현저히 낮아지는 문제가 생길 수 있다.
본 발명에 있어서, 니코티아나 벤타미아나의 재배 기간은 정식한 후 7일 내지 29일인 것이 바람직하며, 예를 들어 7일 내지 21일이다. 보다 구체적으로, 정식 후 7일 및 14일째의 단백질 수율(yield)이 상대적으로 높고, 이 기간을 경과하여 정식 후 21일 및 29일째에는 식물체의 항원단백질의 수율이 낮아지나, 묘목의 생중량은 29일까지 증가하므로, 이들을 통합적으로 고려한 재배 기간은 7일 내지 29일인 것이 바람직하다. 재배 기간이 7일 미만인 경우에는 항원단백질 수율이 불충분한 경향이 있고, 재배 기간이 29일을 초과하는 경우에는 항원단백질 수율이 오히려 낮아지는 경향이 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 묘목의 획득
본 발명의 돼지열병 항원단백질 함량 증진을 위한 식물체로써 형질전환 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 사용하였으며, 이를 위해 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 종자를 ㈜바이오앱으로부터 입수하여, 포수된 암면셀에 파종하였고, 복토는 일반 원예용 상토로 하여, 온도는 28 내지 30℃로 유지하여 발아하였다. 이때, 명암주기는 12h/12h로 하며, 광도는 120 내지 300 μmol/m2/s로 유지시켰다.
파종 5 내지 7일 후 발아가 되어 자엽이 전개된 개체는 72공 혹은 105공 플라스틱 셀 트레이에 옮겨 육묘과정을 거친다. 이때, 명암주기는 14h/10h로 하며, 광도는 120 내지 300 μmol/m2/s로 유지시켰다. 육묘과정의 온도는 25 내지 27℃가 되도록 유지하였으며 상기 배양액을 저면급수로 EC 0.5~0.6 μS/cm 농도로 공급하였다. 이때, 육묘과정은 정식 전 까지 14일 동안 실시하였다.
상기 형질전환 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 묘목을 식물공장 생산 시스템 하에서 재배하였다. 재배 조건에 따른 돼지열병 항원단백질(GP55) 함량의 변화를 측정하기 위해 하기 2.(1) 내지 2.(5)와 같이 재배 조건을 변화시켰다.
2. 재배 조건에 따른 돼지열병 항원단백질 함량의 변화 측정
형질전환 니코티아나 벤타미아나의 재배 시 광질의 조성, CO2공급농도, 배양액의 온도, 정식 후 적심 처리 시기 및 정식 후 적심 처리 정도가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량 변화에 미치는 영향을 조사하였다. 본 실험에서는 순환 박막 수경방식(NFT)을 적용하였다.
(1) 광질의 조성이 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량 변화에 미치는 영향 확인 실험.
순환 박막 수경 재배 시 광질의 조성이 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량에 미치는 영향을 조사하였다. 광원은 LED광원을 사용하였으며, 광도는 150 μmol/m2/s 이상, 광주기는 14시간으로 유지하여 재배하였다.
그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, LED 어레이를 이용한 광질의 조성을 백색(W)100%, 백색(W)90%+적색(R)10%, 백색(W)75%+적색(R)25%, 백색(W)50%+적색(R)50% 로 달리 하여 묘목에 조사했을 때, 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 생체중은 백색(W)100% 단일 광조사에서 가장 낮게 나타났으며, 백색과 적색의 혼합광 처리간 생체중의 차이는 없었다. 도 1c는 광질의 조성을 백색(W)100%, 백색(W)90%+적색(R)10%, 백색(W)75%+적색(R)25%, 백색(W)50%+적색(R)50%으로 하였을 때 재배된 형질전환 니코티아나 벤타미아나를 나타낸다.
한편, 도 1b에 나타난 바와 같이, 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 항원단백질(GP55) 함량은 백색(W)100%에서 가장 낮았고(93㎍/g) 백색(W)50%+적색(R)50%에서 가장 높았다(117.3㎍/g).
따라서, 일반적인 백색 광원만을 적용하는 것 보다 적색광원이 10% 내지 50%정도 혼합된 혼합광으로 이용하는 것이 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 항원단백질 고 발현에 유용할 것으로 판단된다.
(2) CO
2
공급 농도가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량 변화에 미치는 영향 확인 실험.
순환 박막 수경 재배 시 CO2 공급 농도가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과 도 2(a)에서 보여지는 바와 같이, CO2의 농도가 대기수준(420ppm)과 유사한 500ppm에서 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 생체중이 가장 낮게 나타났으며 1,000ppm 공급 시 가장 무겁게 나타났다.
한편, 도 2(b)에서 보여지는 바와 같이, 항원단백질 함량을 분석한 결과에서는 CO2 농도가 1,000ppm일 때, 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 항원단백질의 농도가 높은 것으로 확인되었으나, 500, 700 및 1,500ppm일 때와 큰 차이는 나타내지 않았다.
따라서, 밀폐형 식물공장에서 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 수경재배 시 항원단백질 고발현을 위해서는 주간 CO2 농도를 1,000ppm 내외로 유지하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
(3) 배양액의 온도가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량 변화에 미치는 영향 확인 실험.
순환 박막 수경 재배 시 배양액의 온도가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과 도 3(a)에서 보여지는 바와 같이, 배양액의 온도가 20℃에서 26℃로 증가할 때 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 생체중은 84.7g에서 49.5g으로 점진적으로 감소하였다.
또한, 도 3(b)에서 보여지는 바와 같이, 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 항원단백질의 함량은 배양액의 온도가 낮을 때 높게 나타났으며 26℃에서는 165㎍/g으로 현저히 낮았다. 다만, 배양액의 온도가 높아지는 경우 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 잎과 줄기가 마르며 뿌리가 갈변되는 등의 생리적 장해도 발생하였다.
따라서, 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 박막 수경 재배 시 배양액의 온도는 20℃에서 22℃ 내외로 유지하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
(4) 엽의 월령에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량 변화 확인.
순환 박막 수경 재배 시 엽의 월령에 따른 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량 변화를 확인하였다.
그 결과 도 4에 보여지는 바와 같이, 재배된 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 엽의 월령에 따른 항원단백질 함량은 상위 엽일수록 항원단백질의 함량이 증가함을 알 수 있었다.
(5) 정식 후 적심처리 시기가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량 변화에 미치는 영향 확인 실험.
순환 박막 수경 재배 시 정식 후 적심처리 시기가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량에 미치는 영향을 조사하였다.
형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 적심처리하지 않은 경우(무처리), 정식한 후 14일째 생장점 아래 2cm를 적심처리한 경우(표 1의 '가') 및 정식한 후 21일째 생장점 아래 2cm를 적심처리한 경우(표 1의 '나')의 초장, 생체중 및 잎의 수를 표 1에 나타내었다.
| 초장(Plant height, cm) | 생체중(Fresh weight, g) | 생체중 총 중량(g) | 잎의 수 | ||
| 잎(Leaf) | 줄기(Stem) | ||||
| 무처리 | 16.9±2.2 | 51.3±6.8 | 35.4±5.1 | 86.7±9.4 | 30.2±4.6 |
| 가 | 14.2±1.3 | 55.6±7.8 | 31.2±3.0 | 86.7±6.9 | 39.0±2.6 |
| 나 | 11.6±1.7 | 31.3±9.7 | 19.2±1.5 | 50.5±10.3 | 28.7±4.5 |
그 결과 상기 표 1에 보여지는 바와 같이, 형질전환 니코티아나 벤타미아나를 정식한 후 14일째 생장점 아래 2cm를 적심처리한 경우(표 1의 '가')는 무처리(적심처리 하지 않음)와 비교해 초장(plant height, cm)만 다소 억제시켰을 뿐 잎과 줄기의 무게에서 차이를 나타내지 않았다. 반면, 정식 후 21일째 생장점 아래 2cm를 적심처리한 경우(표 1의 '나'), 지상부의 생체중이 무처리에 비해 많이 감소되었으나, 엽수는 무처리와 차이가 없었다.
이 때, 새로 출현되는 잎의 경우 정식 후 14일째 적심처리한 경우가 무처리에 비해 9장 정도가 많은 것으로 확인되었다.
한편, 도 5에 보여지는 바와 같이, 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 정식 후 14일째 생장점 아래 2cm 적심처리(도 5의 '가')는 무처리에 비해 돼지열병 항원단백질의 함량이 높았으나, 정식 후 21일째 생장점 아래 2cm 적심처리한 경우(도 5의 '나')의 돼지열병 항원단백질의 함량은 무처리와 거의 차이가 없었다. 이는 정식 후 21일째 생장점 아래 2cm 적심처리한 경우에 수확일(정식 후 약 29일)까지 새로운 잎 출현이 늦고 잎의 생장량이 감소되었기 때문인 것으로 판단된다.
(6) 정식 후 적심 처리 정도가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량 변화에 미치는 영향 확인 실험.
순환 박막 수경 재배 시 정식 후 적심 처리 정도가 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 돼지열병 항원단백질 함량에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과 도 6에 보여지는 바와 같이, 형질전환 니코티아나 벤타미아나를 정식한 후 14일째 생장점으로부터 2cm 아래를 적심한 경우(도 6의 'A') 무처리에 비해 지상부의 무게감소 없이 항원단백질의 함량을 약 50% 이상 증진시킬 수 있었다.
또한, 형질전환 니코티아나 벤타미아나 재배 시 적심처리하지 않은 경우(무처리), 정식한 후 14일째 생장점 아래 2cm를 적심처리한 경우(표 2의 'A') 및 정식한 후 14일째 생장점 아래 7cm를 적심처리한 경우(표 2의 'B')의 초장, 생체중 및 잎의 수를 표 2에 나타내었다.
| 초장(Plant height, cm) | 생체중(Fresh weight, g) | 생체중 총 중량(g) | 잎의 수 | ||
| 잎(Leaf) | 줄기(Stem) | ||||
| 무처리 | 17.5±2.2 | 58.3±8.2 | 41.7±7.5 | 99.0±11.4 | 30.5±3.4 |
| A | 14.3±1.8 | 68.7±4.3 | 35.7±7.3 | 104.3±4.9 | 37.0±1.3 |
| B | 11.6±1.7 | 50.5±7.7 | 20.9±4.4 | 71.4±8.1 | 28.5±3.6 |
이 때, 상기 표 2에 보여지는 바와 같이, 정식 후 14일째 생장점으로부터 7cm 아래를 적심한 경우(표 2의 'B') 무처리에 비해 지상부 무게감소가 나타났으며, 도 6을 살펴보면 정식 후 14일째 생장점으로부터 7cm 아래를 적심한 경우(도 6의 'B')의 항원단백질 함량은 무처리에 비해 높게 나타났으나 지상부의 무게 감소 정도를 고려하면 전체적인 항원단백질 함량의 차이는 크지 않은 것으로 확인되었다.
따라서, 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 생육에 부정적인 영향을 미치지 않고 항원단백질의 함량을 높일 수 있는 재배적 방법은 정식 후 14일에 생장점 2cm아래 적심하는 것으로 판단된다. 또한 상기와 같이 적절한 시기의 형질전환 니코티아나 벤타미아나의 적심을 통해 새로운 잎을 많이 얻는 재배적 방법은 항원단백질의 고함량 생산에 유용할 것으로 판단된다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (8)
- 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 재배하는 단계에 있어서, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 묘목을 정식한 후 적심 처리하는 단계를 포함하며,
상기 묘목을 재배하는 단계에서 상기 묘목에 조사하는 광은 백색 광과 적색광의 비율이 90:10 내지 50:50인, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 묘목을 재배하는 단계는 순환 담액 수경재배(DFT) 또는 순환 박막 수경재배(NFT) 방식에 의해 수행되는, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 묘목을 재배하는 단계에서 상기 묘목에 조사하는 광은 백색 광과 적색광의 비율이 50:50인, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 광의 광원은 인공광원, LED 및 형광등으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 수경재배 시 공급되는 배양액의 온도는 20℃ 내지 22℃인, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 묘목을 재배하는 단계는 500 내지 1,500ppm 농도의 CO2가 공급되는, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적심 처리하는 단계는 정식 후 7 내지 14일에 적심 처리를 수행하는. 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적심 처리하는 단계는 생장점으로부터 2 내지 7cm 아래를 적심 처리하는, 니코티아나 벤타미아나의 재배 방법.
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