KR102670707B1

KR102670707B1 - Ucma를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102670707B1
Application number: KR1020210139970A
Authority: KR
Inventors: 김정은; 이승훈; 이연주
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2024-05-31
Also published as: KR20220084999A

Abstract

본 발명은 UCMA를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 본 발명에서는 UCMA 단백질이 과발현된 유방암세포의 이동과 침습, 그리고 성장이 저해됨을 시험관 내(in vitro)에서 확인하였고, UCMA 단백질이 과발현된 유방암세포에 의한 종양 성장이 저해됨을 생체 내(in vivo)에서 확인하였으며, KM plotter를 통해 UCMA 발현이 높은 삼중음성유방암 환자들의 생존률이 높음을 확인하였다. 이에 앞으로 UCMA 단백질은 유방암 세포의 성장과 전이를 막는 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

UCMA를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating breast cancer comprising UCMA}

본 발명은 연골 특이 매트릭스-연관 단백질(Unique cartilage matrix-associated protein; UCMA)를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

유방암은 전세계 여성 사이에서 가장 흔한 암으로서, 이질적인(heterogeneous) 질환이다. 여러 서브그룹 중에서, 삼중음성유방암(triple negative breast cancer; TNBC)은 매우 공격적이고, 전이성이 높은 타입으로, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor; ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor; PR) 및 인간 표피성장인자 수용체 2(human epidermal growth factor receptor 2; HER2) 발현이 결핍되어 있다. TNBC는 진단된 모든 유방암의 대략 10%-20%를 차지한다. 다른 유방암 서브타입과 구별되는 TNBC의 전이 패턴은 매우 복잡하고, 잘 알려지지 않았으며, 뼈 뿐만 아니라 뇌 및 폐로의 전이 확률이 높다. 이에, TNBC는 다른 타입의 유방암보다 더 높은 등급을 갖는 경향이 있다. 불운하게도, TNBC 세포는 필요한 수용체가 결핍되어 있기 때문에, ER, PR 및 HER2를 표적으로 하는 일반적인 치료 전략은 효과가 없다.

비타민 K-의존성 단백질(Vitamin K-dependent proteins; VKDPs)은 γ-카르복시글루타민산(γ-carboxyglutamic acid; Gla) 도메인을 갖는데, 이는 비타민 K와 γ-glutamyl carboxylase (GGCX)에 의해 카르복실화된 후 칼슘 이온과 결합한다. 주요 VKDPs는 혈액 응고를 조절하는데 관여하는 혈액 응고 인자 및 항응고 단백질과, 뼈 항상성 유지 및 이소성 석회화 억제에 주로 관여하는 뼈 단백질을 포함한다. 상기 뼈 단백질들은 매트릭스 Gla 단백질(matrix Gla protein; MGP), 오스테오칼신(osteocalcin; OCN) 및 Gla-풍부 단백질(Gla-rich protein; GRP)을 포함한다. 혈관 평활근세포 및 연골세포에 의해 분비되는 MGP는 혈관 병변 석회화를 억제하고, 혈관 리모델링을 조절한다. 또한, MGP는 종양 세포 이동 및 침습을 포함하여 종양 형성에 역할을 수행한다. 뼈 내분비학에 있어서 주요 인자 중 하나인 OCN는 미네랄 침착 조절에 관여한다. 비록 OCN은 종양 형성에 직접적인 영향을 미치지는 않지만, OCN-발현 세포는 종양 형성을 조절하는, 호중구 활성화 및 종양 사이트로의 모집을 촉진한다. 연골 특이 매트릭스-연관 단백질(Unique cartilage matrix-associated protein; UCMA, GRP로도 알려짐)은 VKDPs의 새로운 멤버로서, MGP 및 OCN에 비해 더 많은 수의 Gla 도메인을 포함하고, 이로 인해 칼슘 이온에 더 강력하게 결합한다. UCMA는 연골에서 최초로 발견되었으며, 대동맥, 뼈 및 피부와 같은 여러 조직에서 발현된다. 비록 UCMA가 마우스 골격계 형성에 필수적이지는 않지만, 이는 조골세포 분화를 촉진시키고, 칼슘 침착을 증가시킨다. 심혈관계에서, UCMA는 칼슘 이온과 직접 결합하고 혈관 평활근세포 내 석회화를 억제한다. 비록 카르복실화되지 않은 UCMA가 유방암과 관련되어 있다고 보고되었지만, 유방암에서 UCMA의 생리학적 역할은 여전히 불명확하다.

Int J Biol Macromol. 2018;113: 309-316.(2018.02.27 공개)

이에, 본 발명에서는 연골 특이 매트릭스-연관 단백질(Unique cartilage matrix-associated protein; UCMA)를 유효성분으로 함유하는 유방암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.

본 발명은 UCMA를 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 UCMA를 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

도 1은 MDA-MB-231 및 4T1 세포 이동, 침습 및 콜로니 형성에 있어, UCMA-과발현에 의한 억제 결과를 나타낸다. (A) 이동 분석 결과, (B) 침습 분석 결과, (C) 콜로니 형성 분석 결과. **p < 0.01; ***p < 0.001 versus the mock control cells.
도 2는 Ucma 과발현 PY8119 세포 및 T47D 세포 이동, 침습 및 콜로니 형성에 있어, UCMA-과발현에 의한 억제 결과를 나타낸다.
도 3은 생체 내(in vivo) TNBC 종양 성장에 있어, UCMA-과발현에 의한 억제 결과를 나타낸다. (A) 이종 이식(xenografts) 암컷 BALB/c 누드 마우스에서의 종양 부피의 변화를 나타낸다. *p < 0.05; **p < 0.01 compared to the mock control tumors. (B) 주입 3주 후, 이종 이식된 마우스로부터 절단된 대표적인 종양의 비교 결과를 나타낸다. (C) MDA-MB-231 세포 및 대표적인 종양에서의 UCMA 과발현 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 4는 생체 내 종양 성장에 있어서, UCMA의 억제 효과를 확인하기 위한, Ucma 과발현 PY8119 세포의 종양 성장 억제 결과를 나타낸다.
도 5는 UCMA-Gla 단백질이 포함된 배양액에 의한 유방암 세포의 이동, 침습, 콜로니 형성 저해 효과를 나타낸다.
도 6은 KM plotter를 사용하여, TNBC 환자에서의 VKDP 유전자 발현에 대한 RFS 분석 결과를 나타낸다. 각 패널은 각각의 VKDP 유전자 및 TNBC 환자의 RFS 사이의 상관관계를 나타낸다. 생존 곡선은 각각의 VKDP 유전자에 대해서 높게(빨강) 그리고 낮게(검정) 발현하는 환자를 비교하였다. UCMA, unique cartilage matrix-associated protein; MGP, matrix Gla protein; OCN, osteocalcin; HR, hazard ratio.

이에, 본 발명자들은 TNBC 세포의 전이 및 침습과, 생체 내(in vivo) 종양 형성에 있어서, UCMA의 억제 효과를 확인하였고, TNBC에 대한 새로운 치료제로서 UCMA의 활용 가능성을 제시하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 연골 특이 매트릭스-연관 단백질(Unique cartilage matrix-associated protein; UCMA)를 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 유방암세포의 침습 및 전이를 억제할 수 있다.

바람직하게는, 상기 유방암은 전이성 유방암 또는 삼중음성유방암(triple negative breast cancer; TNBC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용된 "UCMA"는 NCBI accession no. NM_001113558 일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 세포 배양

본 발명을 위해서 다양한 유방암 세포주가 사용되었다. 삼중음성유방암 세포주로서, mammary gland/breast metastatic site-derived human breast epithelial cell line인 MDA-MB-231 및 mammary gland tissue-derived mouse breast cancer cell lines인 4T1 및 PY8119가 본 발명에 사용되었다. 또한 에스트로겐 수용체 (ER) 양성 luminal B 타입 마우스 유방암 세포주인 E0771 (CH3 BioSystems, Amherst, NY, USA)과 luminal A 타입 유방암 세포주인 T47D (ATCC, Rockville, MD, USA)도 사용되었다. MDA-MB-231은 DMEM-high glucose (Hyclone)에서, 4T1, E0771, PY8119는 RPMI-1640 (HyClone)에서, T47D는 Kaighn's Modification of Ham's F-12 (F-12K, ATCC)에서 각각 배양하였다. 모든 배양시에는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가해 주었다. 그 외에 HEK293-FT 세포는 10% FBS와 적절한 항생제가 첨가된 DMEM-high glucose (Hyclone)에서 배양하였다. Ucma 과발현 PY8119 및 T47D 유방암 세포는 Ucma 발현 벡터를 사용해서 제작되었다. 음성 대조군 세포는 Ucma가 없는 빈 벡터를 세포내에 형질 전환시킨 후 확보하여 mock 대조군이라 지칭하였다.

2. 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT- PCR )

Ucma 과발현 PY8119 및 T47D 세포, 혹은 Ucma 과발현 PY8119 세포로 형성된 종양 조직에서 Ucma 발현 여부를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 각각의 세포와 종양에서 total RNA를 추출한 다음 cDNA로 역전사하여 Ucma와 Gapdh를 증폭하였다. RT-PCR은 Ucma의 경우는 annealing 온도 67℃에서 30 cycles, Gapdh의 경우 annealing 온도 62℃에서 25 cycles로 수행되었다. RT-PCR 최종 산물은 2% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr) 염색으로 확인하였다. 사용한 프라이머 세트는 다음과 같다: Ucma, 5'-GTT TCT GGG GGT GCT CTG TA-3'과 5'-GAG GAA ATT GGA GGC ATC A-3'; Gapdh, 5'-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G-3'과 5'-TCC TTG GAG GCC ATG TAG GCC AT-3'.

3. 분비된 UCMA 단백질을 포함하는 배양액 준비

UCMA 단백질에서 γ-glutamyl carboxylase (GGCX) recognition site의 돌연변이 제작은 이전 논문에 잘 설명되어 있다[Biochem Biophys Res Commun. 2019 Apr 2;511(2):221-227]. 간략하게 설명하자면, UCMA의 GGCX recognition site의 3개의 뉴클레오티드를 C227T, C238A, T208A로 치환함으로써 각각 아미노산이 F48I, A54V, L58I로 바뀐 돌연변이 GGCX를 만들고 이를 UCMA/mGGCX로 명명했다. 분비된 UCMA 단백질을 포함하는 배양액을 얻기 위해, HEK293-FT 세포를 6-well 배양접시의 각 well에 3 × 10⁵개씩 심고, UCMA 또는 UCMA/mGGCX 발현 플라스미드를 일시적 형질감염(transiently transfection) 하여 4-6시간 정도 무혈청 배지(serum-free medium)로 배양했다. 이후 10% FBS를 넣어서 5시간 정도 회복시켜주고 나서 신선한 무혈청 배지(serum-free medium)로 교체하여 밤새 배양했다. 다음날 배양액을 획득하여 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 찌꺼기나 죽은 세포를 제거해 주었다. UCMA 또는 UCMA/mGGCX을 형질감염(transfection)하여 최종 확보된 각 배양액을 UCMA-Gla 또는 UCMA-Glu로 명명하였다.

4. 보이든 트랜스웰 챔버를 이용한 이동 및 침습 분석

세포 이동 및 침습 정도는 0.3 cm² 면적에 8 μm 막 구멍 크기를 가진 Boyden transwell chamber (Falcon, Corning, NY, USA)를 사용해서 수행되었다.

이동 분석에 있어서, 5×10⁴ 세포는 200 ㎕ 무혈청 배지와 함께 상단 트랜스웰 챔버로 옮겨졌고, MDA-MB-231 세포의 경우 10% FBS를 포함하는, 4T1 세포의 경우 2% FBS를 포함하는 700 ㎕ 성장 배지를 하단 챔버에 넣었다. 4시간 배양 후, 트랜스웰 챔버의 상단 표면에 남아있는 세포들을 제거하였고, 하단 표면으로 이동된 세포들은 크리스탈 바이올렛으로 염색하였고 계수하였다. 침습 분석에 있어서, 100 ㎕의 매트리젤(Matrigel) 및 무혈청 배지의 1:2 혼합물을 상단 트랜스웰 챔버에 넣고, FBS가 포함된 700 ㎕의 성장 배지를 하단 챔버에 넣었다. 밤새도록 혈청 고갈시킨 후, 5×10⁴ 세포 밀도를 상단 트랜스웰 챔버에 접종하였다. 36시간 배양 후, 크리스탈 바이올렛 염색하여 침습 세포의 수를 계수하였다.

Ucma 과발현하는 암세포의 이동 여부를 분석하기 위해서, Ucma 과발현 PY8119 암세포는 2.5 × 10⁴ 개, Ucma 과발현 T47D 암세포는 5 × 10⁴ 개를 200 μL의 무혈청 배지(serum-free medium)에 풀어 상부 트랜스웰 챔버에 심었다. 그리고 PY8119 세포에 대해서는 2% FBS를, T47D 세포에 대해서는 10% FBS를 각각 함유하는 700 μL의 성장 배지(growth medium)를 하부 챔버에 넣고, 각각 10시간 혹은 72시간 배양했다. 이후 트랜스웰 챔버 막의 상부 표면에 남아있는 세포를 제거하고 하부 쪽으로 이동된 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 분석하였다. Ucma 과발현하는 암세포의 암세포 침습 여부를 분석하기 위해서는, 매트리젤(matrigel)과 무혈청(serum-free) 배양액의 1:2 혼합물 100 μL를 상부 트랜스웰 챔버에 넣고 FBS가 포함된 700 μL 성장 배지는 하단 챔버에 넣는다. 밤새 동안 serum starvation 시켜둔 Ucma 과발현 PY8119와 T47D 암세포는 5 × 10⁴ 개씩 상부 트랜스웰 챔버에 올리고, 각각 60시간, 96시간 배양한 후 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색하여 침습성 세포의 수를 분석하였다. 암세포 침습이 생각보다 시간이 많이 걸려 상부 챔버의 무혈청(serum-free) 배양액과 하부 챔버의 성장 배지(growth medium)는 매일 교체해 주었다.

분비된 UCMA 단백질이 포함된 배양액을 사용한 암세포 이동 여부를 분석하기 위해서, 각 5 × 10⁴ 개의 MDA-MB-231, 4T1, E0771 암세포를 200 μL 무혈청(serum-free) UCMA-Gla 또는 UCMA-Glu 배양액과 함께 상부 트랜스웰 챔버에 심었다. 하부 챔버 쪽에는 2% FBS를 포함하는 700 μL 성장 배지(growth medium)를 넣고 6시간 배양한 후, 트랜스웰 챔버 막의 상부 표면에 남아있는 세포를 제거하고 하부 표면으로 이동된 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 분석하였다. 분비된 UCMA 단백질이 포함된 배양액을 사용한 암세포 침습 여부를 분석하기 위해서는, 매트리젤(matrigel)과 무혈청(serum-free) UCMA-Gla 또는 UCMA-Glu 배양액의 1:2 혼합물 100 μL를 상부 트랜스웰 챔버에 넣고 FBS가 포함된 700 μL 성장 배지(growth medium)는 하단 챔버에 넣는다. 밤새 동안 serum starvation 시켜둔 암세포는 5 × 10⁴ 개씩 상부 트랜스웰 챔버에 올리고, 36시간 배양 후 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색하여 침습성 세포의 수를 분석하였다.

5. 콜로니 형성 분석

콜로니 형성 분석을 위해, MDA-MB-231 및 4T1 세포를 웰 당 50 및 1000 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 각각 접종하였다. 각각 14일 및 9일 동안 배양한 후, 콜로니들을 고정시켰고, 4% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 계수하였다.

또한, Ucma-과발현 PY8119 및 T47D 세포는 6-well 배양 접시의 well 당 각각 50개 및 500개씩 심어서 배양했다. 각각 5일 및 13일 동안 배양한 후, 생성된 콜로니를 고정액으로 고정하고 4% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후 형성된 콜로니 수를 분석하였다. UCMA 단백질이 함유된 배양액을 이용한 콜로니 형성 정도의 분석을 위해 MDA-MB-231 및 E0771 세포는 각 50개씩, 4T1 세포는 1,000개씩을 6-well 배양접시의 각 well에 올리고, 10% FBS와 10% UCMA-Gla 혹은 UCMA-Glu 배양액을 첨가해서 배양했다. MDA-MB-231 및 E0771 세포는 14일 동안, 4T1 세포는 9일 동안 배양한 후, 생성된 콜로니를 고정액으로 고정하고 4% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후 형성된 콜로니 수를 분석하였다.

6. 마우스 내 종양 이종 이식( xenograft )

동물 실험에 관한 모든 절차는 경북대학교에서 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다.

7주령 암컷 BALB/c 누드 마우스를 사용하여, UCMA 발현 유무에 따른 MDA-MB-231 세포의 종양 성장을 평가하였다. 간단히 설명하면, 50 ㎕ 무혈청 배지에 현탁된 1×10⁶ 세포를 50 ㎕ 매트리젤(Matrigel)과 혼합하였고, 마우스의 유방 지방 패드에 정위적으로 주입하였다. Ucma-과발현 MDA-MB-231 세포 및 mock 대조군 세포를 왼쪽 및 오른쪽 두 번째 유선에 각각 주입하였다(n = 11). 주입 후 2일부터 2-3일마다 캘리퍼를 사용하여 종양 직경을 측정하였다. 측정된 수치는 다음의 식을 사용하여 부피로 변환하였다: V = 너비² × 길이 × 0.5. 주입 후 3주째, 마우스를 안락사시켰고, 종양 조직을 절단하였다. 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 수행하여, Ucma-과발현 MDA-MB-231 세포 및 상기 세포에서 형성된 종양에서의 Ucma 발현을 확인하였다. 증폭은 이전에 보고된 대로 수행하였다.

또한, 7주령 암컷 BALB/c 누드 마우스를 이용하여 Ucma 과발현된 유방암 세포의 종양 성장 여부를 평가하였다. 50 μL의 무혈청 배지(serum-free medium)에 1 × 10⁶ 개의 세포를 풀고, 50 μL의 매트리젤(matrigel)과 혼합한 후, 마우스의 지방 패드(fat pad)에 주입하되 (n = 8), Ucma 과발현 PY8119 암세포는 왼쪽, 대조군 PY8119 세포는 오른쪽의 각 두 번째 유선(mammary gland)에 주입했다. 주입 후 2일째부터 2-3일마다 caliper를 이용해서 종양의 직경 단축과 장축을 측정함으로써 종양의 성장과 부피를 모니터링했다. 최종 3주 후, 종양 조직을 확보하기 위해 마우스를 희생시켰다.

7. 카플란- 마이어 (Kaplan- Meier ) 플랏 분석

TNBC 환자에서 VKDPs (UCMA, MGP 및 OCN)의 mRNA 발현 간의 상관관계 및 TNBC 환자의 생존율은 Kaplan-Meier (KM) plotter database (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service)를 사용하여 분석하였다. 생존율에 대한 데이터는 환자로부터가 아닌 open-access KM plotter database로부터 얻었고, 이에 윤리적 승인이 필요하지 않았다.

8. 통계 분석

모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시된다. 데이터는 ANOVA 또는 Student’s t-test로 분석되었다. 세포 배양 실험은 최소한 2번의 독립적인 실험으로 수행되었고, 각 실험은 2번 반복하여 행해졌다. p 값 < 0.05는 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다.

< 실시예 1> UCMA 과발현에 의한 암세포의 이동, 침습, 콜로니 형성의 저해 효과

TNBC 세포에서 UCMA의 효과를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 Ucma-과발현 및 mock 대조군 TNBC 세포에서 이동, 침습 및 콜로니 형성 분석을 수행하였다. 세포 이동 및 침습 분석 결과, mock 대조군 세포에 비해 Ucma-과발현 MDA-MB-231 세포에서의 이동 및 침습된 세포수가 상당히 감소하였다(도 1A 및 도 1B). 유사하게, mock 대조군 세포에 비해 Ucma-과발현 4T1 세포에서의 세포 이동 및 침습은 상당히 감소하였다(도 1A 및 도 1B). 콜로니 형성에 있어서는, Ucma-과발현 MDA-MB-231 및 4T1 세포에서 각각의 mock 대조군에 비해 콜로니들의 수가 상당히 감소하였다(도 1C). 상기 결과는 UCMA가 TNBC 세포 이동, 침습 및 콜로니 형성을 상당히 억제한다는 것을 나타낸다

또한, 다른 유형의 유방암 세포에 대한 UCMA의 억제 효과를 확인하기 위함으로, 또 다른 삼중음성유방암 (TNBC) 세포주인 PY8119와 전형적인 luminal A 타입 유방암 세포주 T47D를 이용해서 세포의 이동, 침습, 콜로니 형성 여부를 추가 분석하였다. PY8119 세포는 4T1 세포와 유사하게 마우스 유래된 TNBC 세포주이지만, MMTV-PyMT (mouse mammary tumor virus promoter driven Polyoma middle T-antigen) 형질전환 C57BL/6 마우스의 유방 선암종(mammary adenocarcinoma)에서 확보된 것이다. T47D 세포는 사람의 mammary ductal carcinoma에서 분리된 에스트로겐 수용체(ER)와 프로게스테론 수용체(PR) 양성인 luminal A subtype이다. 본 발명을 위해 Ucma 발현 벡터를 안정적으로 발현하는 Ucma 과발현 PY8119 세포 및 T47D 세포를 제작하였고, 이들 세포에서의 Ucma 과발현 여부를 RT-PCR로 먼저 확인하였다(도 2A).

제작된 세포를 이용하여 암세포 이동 및 침습 여부를 관찰했는데, 이동 및 침습된 암세포의 수가 대조군 세포에 비해 Ucma 과발현 PY8119 세포에서 유의하게 감소했고(도 2B), Ucma 과발현 T47D 세포에서도 유사한 결과가 확인되었다(도 2C). 콜로니 형성 실험에서도 각 세포의 대조군과 비교했을 때, Ucma 과발현 PY8119 및 T47D 세포에서 생성된 콜로니 수가 의미있게 감소하였다(도 2B, 2C). 이러한 결과는 UCMA가 삼중음성유방암(TNBC) 세포 뿐만 아니라 luminal A 타입 유방암 세포에서도 세포 이동, 침습, 콜로니 헝성 여부를 유의미하게 억제한다는 것을 보여주고 있다.

< 실시예 2> UCMA 과발현에 의한 생체 내(in vivo ) TNBC 종양 성장 감소

TNBC 종양 성장에 있어서 UCMA의 억제 효과를 측정하기 위해서, Ucma-과발현 MDA-MB-231 세포 및 mock 대조군 세포를 암컷 BALB/c 누드 마우스의 유선에 이식함으로써, 생체 내(in vivo) 이종 이식(xenograft) 모델을 제작하였고, 3주 동안 종양 성장을 측정하였다. 비록 본 발명자들은 주입 1주일 후 종양 성장에 있어서 어떠한 차이도 관측할 수 없었으나, 2주 및 3주 동안 mock 대조군 세포에 비해 Ucma-과발현 MDA-MB-231 세포를 가진 마우스에서의 종양 성장은 상당히 감소되었다(도 3A). 또한, 측정 마지막 날에는 Ucma-과발현 MDA-MB-231 세포 유래 종양이 있는 마우스에서의 종양 크기가 mock 대조군 세포에 비해 더 작았다(도 3B). 상기 결과는 UCMA가 시험관 내(in vitro)에서의 억제 역할과 유사하게, 생체 내(in vivo) 종양 크기도 감소시킨다는 것을 나타냈다. RT-PCR을 통해, Ucma-과발현 MDA-MB-231 세포 및 상기 세포로부터 형성된 종양에서의 UCMA mRNA 발현을 확인하였다(도 3C). 종양을 가진 마우스에서, 다른 조직으로의 전이는 가시적으로 관측되지 않았다.

생체 내 종양 성장에 있어서, UCMA의 억제 효과를 확인하기 위해, Ucma 과발현 PY8119 세포와 대조군 세포를 암컷 BALB/c 누드 마우스의 유선에 이식하여 xenograft 모델을 만들고 3주 동안 종양 성장을 관찰하였다. Ucma 과발현 PY8119 세포의 종양 성장 억제 경향은 처음 주사 후 4일째 (p value = 0.026)와 11일째 (p value = 0.050)에 관찰되기 시작하였고, 16일 이후부터는 계속 유의한 감소를 확인할 수 있었다(도 4A). 3주간의 종양 성장을 관찰한 마지막 날 (21일)에 마우스를 희생하고 종양을 추출하여 크기를 비교하였다. Ucma 과발현 PY8119 세포에 의해 형성된 종양의 크기가 대조군 세포에 의해 형성된 종양보다 작은 것을 육안으로 확인하였다(도 4B). 또한 RT-PCR을 통해 UCMA 과발현 PY8119 세포로 형성된 종양에서 UCMA mRNA가 여전히 발현됨을 확인하였다(도 4C). 이 결과는 UCMA가 생체 내 마우스 모델에서 TNBC 종양 성장을 억제한다는 것을 재확인한 것이다.

< 실시예 3> UCMA - Gla 단백질이 포함된 배양액에 의한 유방암 세포의 이동, 침습, 콜로니 형성 저해 효과

유방암 세포에 대한 UCMA의 억제 효과를 또 다른 방식으로 확인하기 위해, 상기에 설명된 대로 UCMA 또는 UCMA/mGGCX을 형질감염(transfection)한 세포에서 분비된 UCMA 단백질을 포함하는 배양액을 수집하였다. 이들 배양액은 각각 UCMA-Gla 또는 UCMA-Glu로 명명하였다. 다시 한 번 설명하자면 UCMA-Gla는 정상적인 wild-type의 UCMA 단백질을 함유하는 배양액을 의미하고, UCMA-Glu는 UCMA 단백질내의 GGCX recognition site가 돌연변이됨으로써 undercarboxylated form의 UCMA 단백질을 함유하는 배양액을 의미한다. 이 실험을 위해 3가지 유형의 유방암 세포가 사용되었는데, MDA-MB-231 및 4T1 유방암 세포는 각각 사람과 마우스에서 유래한 삼중음성유방암 (TNBC) 세포주이고, E0771은 C57BL/6 마우스에서 분리된 유선암 세포주로 luminal B 타입의 세포이다. 이들 세포를 배양할 때 UCMA-Gla 혹은 UCMA-Glu 배양액을 처리함으로써 세포의 이동, 침습, 콜로니 형성 변화를 관찰하였다. UCMA-Glu 배양액과 비교했을 때, UCMA-Gla 배양액을 처리한 MDA-MB-231, 4T1, E0771 유방암 세포의 이동 및 이동된 세포의 수가 의미있게 감소했다(도 5A). 세포 이동 결과와 유사하게 UCMA-Gla 배양액을 처리한 경우, 이들 유방암 세포의 침습 정도와 침습된 세포 수 역시 의미있게 감소하였다(도 5B). 그리고 UCMA-Gla 배양액을 처리했을 때, MDA-MB-231, 4T1, E0771 유방암 세포의 콜로니 형성 여부와 생성된 콜로니 수도 유의미하게 감소하였다(도 5C). 이러한 결과는 분비된 UCMA 단백질을 포함하는 배양액이 유방암 세포의 이동, 침습, 콜로니 형성을 억제하는 효과가 있음을 보여주고 있다.

결론적으로 UCMA는 유방암 세포 이동, 침습, 콜로니 형성 억제 효과가 있고, 생체내 종양 성장 억제 효과도 있음을 알 수 있다.

< 실시예 4> VKDP mRNA 발현에 따른 TNBC 환자 생존율 분석

TNBC 환자에서의 생존율 및 VKDPs (UCMA, MGP 및 OCN)의 mRNA 발현 수준 사이의 상관관계를 확인하기 위해서, KM plot 분석을 수행하였다. 유효 Affymetrix IDs는 UCMA, MGP 및 OCN에 대해 각각 236800_at, 202291_s_at 및 206956_at이다. 흥미롭게도, 높은 UCMA mRNA 발현은 TNBC 환자에서의 좋은 무재발 생존(relapse-free survival; RFS)과 유의성 있는 상관관계를 나타냈다(p= 0.0034)(도 6). 다만, TNBC 환자에서의 MGP 및 OCN mRNA 발현은 RFS와 어떠한 유의성 있는 상관관계를 나타내지 않았다(각각 p = 0.96 및 0.72)(도 6). 상기 결과는 높은 UCMA 발현이 TNBC 환자에서 상당히 향상된 RFS와 연관되어 있다는 것을 나타낸다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

연골 특이 매트릭스-연관 단백질(Unique cartilage matrix-associated protein; UCMA)를 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 유방암세포의 침습 및 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유방암은 전이성 유방암 또는 삼중음성유방암(triple negative breast cancer; TNBC)인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
UCMA를 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 유방암세포의 침습 및 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 유방암은 전이성 유방암 또는 TNBC인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.