KR102664984B1 - 신규한 토마토황화잎말림바이러스 분리주 kg3 및 이의 감염성 클론 - Google Patents

신규한 토마토황화잎말림바이러스 분리주 kg3 및 이의 감염성 클론 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)의 신규한 국내 분리주 KG3와 이의 감염성 클론에 관한 것이다. 본 발명의 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드 및 이를 포함하는 대장균 및 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용 시, 매개충(insect vector) 없이도 효과적으로 작물에 토마토황화잎말림 바이러스의 감염을 유발시킬 수 있다. 더불어, 본 발명의 감염 시스템은 기존의 국내 TYLCV 분리주 KG1과 비교하여, 보다 심각한 병증을 유발할 뿐 아니라, 기존에 널리 사용되고 있는 TYLCV 저항성 관련 Ty-1 또는 Ty-2 locus가 도입된 TYLCV-저항성 품종 토마토에서도 병증을 유발할 수 있는 신규한 TYLCV 분리주 KG3를 이용한 것으로, 본 발명을 이용하여 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있다. 또한, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

신규한 토마토황화잎말림바이러스 분리주 KG3 및 이의 감염성 클론 {Novel Tomato yellow leaf curl virus isolate KG3 and Infectious clones thereof}
본 발명은 신규한 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 분리주 KG3 및 이의 감염성 클론에 관한 것이다.
토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)는 전세계의 토마토 재배에서 매년 상당한 경제적 손실을 초래하는 치명적인 병원체로서, 국내에서 2008년 남부 내륙 지역에서 재배되는 토마토 작물에서 처음 분리되었다. 현재는 그 범위가 확산되어 전국적으로 지속적인 TYLCV의 발생이 보고되고 있으며, 매년 토마토 작물에서 TYLCV가 발생하여 토마토 생산에 심각한 문제가 되고 있다.
일반적으로, TYLCV에 감염된 토마토 식물체는 잎이 위로 말리는 현상(leaf curling), 어린 잎의 황화현상(leaf yellowing), 발육 부진(stunting)과 같은 전형적인 황화잎말림병 증상을 나타낸다. 특히, 모종 정식 직후 발병하게 되면 토마토의 수확이 거의 불가능하고, 생육 도중 발병 시 과실에는 증상이 나타나지 않지만, 착과가 제대로 이루어지지 않아 토마토의 수확량이 70-80% 감소하고 품질이 저하되는 문제점이 있다.
TYLCV는 담배가루이(Whitefly, Bemisia tabaci Genn.)에 의해 매개되어 지속적이고 순환적인 방식으로 감염이 이루어질 수 있으며, 더욱이, 담배가루이는 이미 국내에 토착화가 이루어진 상태로 방제가 어렵기 때문에 TYLCV에 의한 감염을 예방하는 것은 매우 어려운 실정이다. 더욱이, 최근 연구에 따르면, TYLCV는 종자를 통해 전파될 수 있음이 새롭게 밝혀졌으며, 이는 새로운 지역으로 TYLCV의 광범위한 발생 가능성을 시사한다
그러나, 토마토 야생종에서 Ty-1, Ty-2, Ty-3, Ty-4 및 Ty-5를 포함하여 여러 TYLCV 저항성 유전자를 확인하였고, 최근 한국의 대부분의 토마토 농가에서는 서로 다른 Ty 좌위를 포함하는 TYLCV 저항성 품종을 재배함으로써 TYLCV 감염으로부터 토마토를 효과적으로 보호하고 있다. 하지만, TYLCV 집단의 유전적 다양성은 돌연변이, 핵산 염기 서열의 역위, 재조합 및 혼합 감염과 같은 바이러스 집단의 변이를 초래할 수 있는 다양한 메커니즘을 통해 새로운 감염성을 갖는 바이러스를 탄생시킬 수 있으며, 이로 인해 기존의 저항성의 무너뜨리고 새로운 TYLCV 질병의 재출현으로 이어질 수 있다.
따라서, 토마토 식물체에 심각한 병증을 유발할 뿐 아니라, 종래의 TYLCV-저항성 품종 토마토에도 TYLCV를 감염시킬 수 있는 신규한 TYLCV의 존재 여부를 확인하고, 이에 의한 감염 가능성을 확인할 필요가 있다.
대한민국 등록특허 제10-1430805호(등록일자: 2014.08.08)
본 발명자들은 신규한 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 분리주 KG3의 감염성 클론 및 이를 통한 인위적 감염시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 신규한 토마토황화잎말림바이러스 분리주 KG3의 감염성 클론을 바이너리 벡터(binary vector)에 담아 식물체에 아그로-이노큘레이션(Agro-inoculation)으로 도입하여, 식물체에 감염성 활성을 재현시키는 효과를 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 염기서열을 포함하는 신규한 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 분리주 KG3를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 서열번호 1로 표시되는 TYLCV 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 TYLCV 감염 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 TYLCV 분리주 KG3를 검출하는 제제를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 TYLCV 분리주 KG3를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 TYLCV의 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 TYLCV를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)의 연구를 위한 인위적 감염시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 신규한 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 분리주 KG3의 감염성 클론을 바이너리 벡터(binary vector)에 담아 식물체에 아그로-이노큘레이션(Agro-inoculation)으로 도입하여, 식물체에 감염성 활성을 재현시키는 효과를 규명하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 염기서열을 포함하는, TYLCV 분리주 KG3를 제공한다.
본 명세서에서 용어 '토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)는 Geminiviridae 과, Begomovirus 속에 속하는 식물 바이러스로서, 이는 주로 토마토에서 발생하는 것으로 알려져 있으나, 최근 토마토 외에 고추, 파프리카, 담배 등의 가지과 작물과, 박과, 콩과 작물 등 다양한 작물에도 감염이 가능한 것으로 보고되고 있다. TYLCV에 감염된 경우, 잎말림 증상이 발생하여 감염 식물체의 잎이 말리면서 황색으로 변하고 잎이 작아지는 증상을 나타낸다. 한편, 국내에서 최초로 보고된 TYLCV는 하나의 지놈(genome)을 갖고 있는 것으로 확인되었으며(Lee et al., 2010), 구체적으로, 본 발명의 TYLCV는 쌍십면체 모양으로 캡슐화 된 약 2.6-2.8 Kb의 원형 단일 가닥 DNA 모노파타이드 지놈(DNA-A)으로 구성되어 있는 것을 특징으로 한다,
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 TYLCV 분리주 KG3는 기존의 TYLCV 국내 분리주인 KG1과 비교하여, 보다 심각한 병증을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규한 TYLCV 분리주 KG3의 감염성을 확인하고자, 본 실시예에서는 기존에 밝혀진 TYLCV 국내 분리주 2종, 구체적으로, TYLCV 국내 분리주 KG1 및 KG2가 사용되었다.
보다 구체적으로, 상기 TYLCV 국내 분리주 KG1은 서열번호 4로 표시되는 TYLCV의 염기서열로 이루어진 것으로, 상기 염기서열은 GeneBank Accession No. HM130912에 해당하는 서열이며(Lee et al., 2011), 이는 경상도와 전라도의 9개 지역에서 2,774개의 염기 지놈을 가진 분리주를 포함하는 것이고, 토마토에서 중증도의 심각한 병증을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 TYLCV 국내 분리주 KG2는 서열번호 5로 표시되는 TYLCV의 염기서열로 이루어진 것으로, 상기 염기서열은 GeneBank Accession No. HM130913에 해당하는 서열이며(Lee et al., 2011), 이는 제주도와 전라도의 4개 지역에서 2,781개의 염기 지놈을 가진 분리주를 포함하는 것이고, 토마토에서 경미한 수준의 병증을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에서, KG3 및 KG4로 감염된 식물체는 기존의 중증도 병증을 나타내는 KG1과 비교하여, 보다 심각한 TYLCV-특이적 병증을 나타내며 높은 symptom severity score와 바이러스 DNA 카피 수를 나타내는 것을 확인하였다. 반면, KG5로 감염된 식물체는 경미한 수준의 병증을 나타내는 KG2와 동일/유사한 수준의 경미한 병증을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 TYLCV 분리주 KG3는 TYLCV 저항성 관련 Ty-1 또는 Ty-2 locus가 도입된 TYLCV-저항성 품종 토마토로부터 선택된 TYLCV-저항성 품종 토마토에서 감염을 일으키는 것을 특징으로 한다.
현재까지 바이러스 저항성 작물에 대한 연구는 국내외의 다양한 기관 및 종자회사에서 진행이 되고 있으며, 주로 토마토 근연종(야생종)인 Solanum 계통 종, 예를 들어, S. peruvianum, S. chilense, S. habrochaites, S.pimpinellifolium 및 S. cheesmaniae과 같은 TYLCV에 대해 저항성 유전자를 갖는 종과의 교배를 통하여 새로운 품종을 개발하는 형태로 이루어지고 있다. TYLCV에 대한 저항성 유전자는 현재까지 야생종 토마토에서 7개(Ty-1, Ty-2, Ty-3, Ty-3a, Ty-4, Ty-5 및 Ty-6)가 알려져 있으며, Ty-1, 3, 4, 6는 S. chilense, Ty-2는 S. habrochaites, Ty-5는 S. peruvianum로부터 보고되었다. 또한, 이들의 위치는 Ty-1 유전자는 6번 염색체, Ty-2 유전자는 11번 염색체, Ty-4 유전자는 3번 염색체, Ty-5 유전자는 4번 염색체, 및 Ty-6 유전자는 10번 염색체 상에 존재하는 것으로 보고되었으며, Ty-3과 Ty-3a는 6번 염색체의 동일한 유전자좌에 존재하는 대립유전자로 보고되었다. 상기 유전자 마커는 TYLCV 저항성 계통 및 품종 육성에 활발히 이용되고 있으며, 현재 시중에 유통되고 있는 여러 TYLCV 저항성 품종들이 농가에서 재배되고 있는 실정이다.
본 발명의 실시예에서, 초기에는 TYLCV 분리주(KG1, KG3 및 KG4)가 처리된 모든 TYLCV-저항성 품종 토마토에서 약간의 잎 말림 증상이 관찰되었으나, 감염 14일 이후에는, 처리된 감염성 클론에 따라 나타나는 병증에 차이가 있음을 확인하였다. 구체적으로, KG3 감염성 클론이 접종된 경우, 모든 TYLCV-저항성 품종 토마토에서 잎의 황변 및 말림 증상이 지속적으로 관찰되었으나, KG4의 경우, Ty-1 locus가 도입된 TYLCV-저항성 품종 토마토에서만 병증을 나타내었다. 반면, Mock 처리군과 비교하여, KG1으로 접종된 모든 TYLCV-저항성 품종 토마토에서는 특이적 병증이 관찰되지 않았다.
TYLCV 변이종에 대한 새로운 저항성 유전자원을 발견하기 위해서 국내에서 발생하는 모든 TYLCV 변이종에 대한 클론을 필요로 한다. 특히, 토마토 재배 포장 내에는 다양한 변이 바이러스 종이 존재하고 있으므로, 이로부터 신규한 TYLCV 변이종의 분리주를 확보함에 따라, 산업적인 품종 육성에 사용될 수 있는 TYLCV 저항성을 갖는 새로운 유전자원의 발견할 수 있다.
즉, 본 발명의 신규한 TYLCV 분리주는 TYLCV에 대한 저항성 자원을 찾고 저항성 품종을 만드는데 중요한 역할을 할 수 있다. 구체적으로, 기존의 저항성 품종 토마토에서 TYLCV-특이적 병증을 유도하는 KG3 및 KG4를 이용하여, 새로운 저항성 유전자의 발견 가능성을 기대할 수 있는 반면, 기존의 밝혀진 국내 분리주 KG2와 같이, 경미한 수준의 병증을 유발하는 KG5의 경우, 약독 바이러스로써 여러 환경 스트레스 내성을 유도하거나 강독 바이러스에 대해 사전적 예방을 위한 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로서의 전달체를 의미하며, 이는 플라스미드 벡터; 대장균 벡터; 아그로박테리움 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 세균 또는 바이러스 벡터 등을 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E.coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt·λ4B, λ-Charon, λ△z1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
구체적으로, 상기 재조합 벡터는 (a) 서열번호 1로 표시되는 TYLCV 염기서열; (b) 상기 염기서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 숙주세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터일 수 있다.
보다 구체적으로, 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
그러나, 본 발명의 벡터가 식물 세포에 적용되는 경우, 본 발명에 적합한 프로모터는 식물체의 유전자 도입을 위해 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터, BCB(blue copper binding protein) 프로모터, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터 및 PM 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.
본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 튜메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것(NOS 3' end)(Bevan, et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 구체적으로는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 노팔린 합성효소(nopaline synthase) 유전자의 종결서열(Tnos)이다.
또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지(selection marker)로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린(Ampicilin), 겐타마이신(Gentamicin), 카베니실린(Carbenicillin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 스트렙토마이신(Streptomycin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(geneticin), 네오마이신(Neomycin) 및 테트라사이클린(Tetracyclin)에 대한 내성 유전자가 있다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 식물체에 병을 일으키는 바이러스 분리주에 관한 것으로, 식물에 대하여 가장 바람직한 유용성을 갖는다. 즉, 본 발명은 식물체에서 신규한 바이러스 분리주 KG3에 따른 이의 감염성을 연구하고자, 식물체에서 상기 재조합 벡터의 발현을 필수로 하며, 이를 위한 식물 발현용 재조합 벡터의 구체적인 예로는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터를 들 수 있다.
상기 "아그로박테리움(Agrobacterium)"은 흙 속에 사는 운동성을 가진 토양미생물의 하나로, 암을 유발하는 플라스미드(Ti(Tumer induced) plasmid)를 가지고 있어 식물체의 상처 따위를 통하여 감염하여 조직 세포의 이상 증식을 유발한다.
상기 "바이너리 벡터(binary vector)"는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 염기서열을 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 의미한다.
본 발명에서 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 TYLCV 염기서열의 발현 또는 이로 인한 감염에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 KACC92454P인 것을 특징으로 하며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2022년 09월 21일자로 기탁되었다.
본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method), 열충격법(heat shock) 및 냉동-해빙법(freezethaw method) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "형질전환"은 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 의미한다. 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 식물세포, 원핵세포, 효모세포 또는 곤충세포 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하여 식물체에 감염시켰을 때, 효과적으로 TYLCV-특이적 병증을 나타내는 것을 확인하였으며, TYLCV-감수성 품종 토마토, 구체적으로, Solanum lycopersicum cv. Money Maker에서 뿐만 아니라, Ty-1 또는 Ty-2 저항성 유전자를 갖는 TYLCV-저항성 품종 토마토에서도 심각한 TYLCV-특이적 병증을 유발하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 TYLCV 감염 식물체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "식물(체)"는 성숙한 식물뿐만 아니라, 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명의 식물체는 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로, 토마토가 바람직할 수 있고, 최근 TYLCV의 기주 식물로 알려진 박과, 콩과, 고추과, 담배 등의 작물도 포함될 수 있으며, 또한 TYLCV가 감염되는 식물이라면 모두 포함될 수 있다.
상기 재조합 벡터의 식물체로의 도입은 당분야에 공지된 방법을 사용 할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 히트 쇼크법(heat shock), 전기천공법(electroporation) 또는 PEG(Poly ethylen glycol)에 의한 침전법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 TYLCV 분리주 KG3에 의한 TYLCV-특이적 병증을 식물체에 유도하기 위하여 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하는 방법이 사용될 수 있으며, 상기 아그로-이노큘레이션(Agro-inoculation) 방법은 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미할 수 있다. 아그로-이노큘레이션은 접종하고자 하는 식물의 정단부에 곤충핀을 이용하여 상처를 낸 후 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 주입하여주는 방법이다.
따라서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 TYLCV를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)를 검출하는 제제를 포함하는 TYLCV의 감염 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "조성물"은 목적하는 병증의 원인균을 검출하기 위한 프라이머, DNA 폴리머라제, dNTP 및 버퍼와 같은 DNA 검출 및 증폭용 시약을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스를 검출하는 제제는 TYLCV에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 TYLCV에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 하기 서열번호 20 및 21로 표시되는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, TYLCV에 특이적으로 결합하여 이를 검출할 수 있도록 하는 프라이머 또는 프로브에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합 효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기 서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한, 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 TYLCV의 감염 진단 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 TYLCV의 감염 진단 방법은 식물체 내 TYLCV의 존재를 확인함으로써, 보다 구체적으로, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 신규한 TYLCV 분리주 KG3 유전자의 존재를 확인함으로써 TYLCV 감염 여부를 진단하는 방법을 말한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 TYLCV를 진단하기 위한 프라이머를 이용한 증폭 반응을 수행하여 TYLCV를 특이적으로 검출할 수 있는 방법일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미하며, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로, 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제(self sustained sequence replication) (WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 등의 증폭 방법일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 TYLCV의 감염 진단 방법은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 TYLCV의 감염 진단용 조성물을 포함하므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 토마토황화잎말림 바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용 시, 매개충(insect vector) 없이도 효과적으로 작물에 토마토황화잎말림 바이러스의 감염을 유발시킬 수 있다. 더불어, 본 발명의 감염 시스템은 기존의 국내 TYLCV 분리주 KG1과 비교하여, 보다 심각한 병증을 유발할 뿐 아니라, 기존에 널리 사용되고 있는 Ty-1 또는 Ty-2 저항성 유전자를 갖는 TYLCV-저항성 품종 토마토에서도 병증을 유발할 수 있는 신규한 TYLCV 분리주 KG3를 이용한 것으로, 본 발명을 이용하여 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있다. 또한, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 기존의 TYLCV 국내 분리주 KG1 및 KG2와의 계통 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 신규한 TYLCV 국내 분리주의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸다.
도 3은 TYLCV-감수성 품종 토마토 (Solanum lycopersicum cv. Money Maker)에서 TYLCV-감염성 클론에 의한 TYLCV 감염성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 TYLCV 저항성 관련 Ty-1 또는 Ty-2 locus가 도입된 TYLCV 저항성 품종 토마토에서 TYLCV-감염성 클론에 의한 TYLCV 감염성을 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1. 신규한 토마토황화잎말림바이러스( Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 분리주의 확보
실시예 1.1. 신규한 TYLCV 분리주의 DNA 추출 및 동정
먼저, 신규한 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 분리주를 확보하고자, 국내 다양한 지역으로부터 채집된 토마토 샘플로부터 TYLCV을 동정하고 이의 지놈 DNA를 추출하였다.
구체적으로, 국내 여러 지역(충청남도, 강원도, 광주, 경상남도, 및 전라남도)에서 잎말림, 황화 및 발육 부진과 같은 전형적인 TYLCV-병증을 나타내는 다농(Danong) 토마토들을 채집한 후, 채집된 총 40개 샘플의 잎 조직으로부터 Viral Gene-spinTM Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 바이러스 DNA를 추출하였다.
다음으로, 상기 추출된 바이러스 DNA의 검출은, AccuPower® ProFi Taq PCR Master Mix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 TYLCV 분리주의 V1 유전자를 암호화하는 TYLCV-특이적 프라이머를 포함하는 20 ㎕의 최종 부피로 수행되었고, PCR에서 증폭 및 DNA 검출을 위해 T100 Thermal Cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)가 사용되었다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 3분 동안 초기 변성 후, 35 사이클(94℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 1분 동안 연장), 72℃에서 10분 동안 최종 확장. 그런 다음, PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하였고, 이후 PCR 생성물은 Macrogen Institute(Macrogen, Seoul, Korea)에서 Sanger sequencing을 이용하여 시퀀싱하였다. 본 실험에서는 DNA 샘플당 PCR 반응을 최소 3회 이상 수행하였다.
실시예 1.2. TYLCV의 재조합 플라스미드 제작 및 분리주 확보
새로 설계된 전체 지놈(genome) 프라이머(하기 서열번호 6 및 7로 표시됨, 2.7K-TYLCV-F 및 2.7K-TYLCV-R)를 사용하여, 상기 실시예 1.1에서 TYLCV 감염이 확인된 40개 샘플에 대한 바이러스 DNA로부터 TYLCV의 전체 서열을 증폭하였고, pGEM® T-easy vector(Promega, Madison, USA)를 이용하여 타겟 바이러스 DNA를 클로닝한 후, 개별 재조합 플라스미드를 Macrogen Institute(Macrogen, Seoul, Korea)에서 시퀀싱하였다. 그 다음, 획득한 염기서열을 BLAST 프로그램(basic local alignment search tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 이들의 동일성을 비교하였다.
본 실시예에서 총 40개의 TYLCV 분리주를 확보하였다.
실시예 1.3. 계통 비교 분석을 통한 신규한 TYLCV 분리주 확인
상기 실시예 1.2에서 확보된 TYLCV 분리주 40개 샘플로부터 신규한 TYLCV 분리주의 존재 여부를 확인하고자, 기존의 국내에서 확보된 TYLCV 분리주인 KG1(GenBank: HM130912) 및 KG2(GenBank: HM130913)의 전체 지놈 서열과 비교하여 계통 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이, KG1 및 KG2와 상기 40개의 TYLCV 분리주는 서로 다른 계통군으로 분류되었고, 국내에서 새롭게 출현한 신규 TYLCV 분리주는 총 3개임을 확인하였다.
구체적으로, 첫 번째 그룹에서 분리된 14개의 TYLCV 분리주는 KG3(GenBank: ON982178)로 명명되었고, KG1과 가장 밀접하게 쌍별 동일성(pairwise identity)을 나타냈으며, 두 번째 그룹에는 총 10개의 TYLCV 분리주가 속하여 KG4(GenBank: ON982198)로 명명되었고, 마지막 그룹에는 속한 16개의 TYLCV 분리주는 KG5(GenBank: ON982202)로 명명되었다.
실시예 2. 신규한 TYLCV의 감염성 클론의 제작
상기 실시예 1.3에서 확보한 신규한 TYLCV 분리주의 전장 재조합 플라스미드로부터 각 분리주에 대한 2개의 프라이머 세트를 사용하여 부분 탠덤(tandems)의 2개 단편을 증폭시켰고, 각 단편을 pGEM-T Easy Vector(Promega, Madison,USA)에 연결하여 pGEM-TYLCV-IC1 및 -IC2를 생성하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 클로닝된 단편을 제한 효소 KpnI, SphI 및 BamHI로 처리하여 잘라준 뒤, 상기 동일한 제한 효소로 잘려진 pCAMBIA-1303에 클로닝하였다. 이렇게 만들어진 TYLCV-KG3-pCAMBIA1303, TYLCV-KG4-pCAMBIA1303 및 TYLCV-KG5-pCAMBIA1303 플라스미드를 제한 효소 처리를 통해 정상적으로 플라스미드가 만들어졌는지 확인하였다. 마지막으로 확인된 플라스미드를 각각 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumafaciens) GV3101 strain에 형질전환하여 감염성 클론을 완성하였다.
실시예 3. 신규한 TYLCV 분리주 KG3, KG4 및 KG5 감염성 클론의 감염성 확인
상기 실시예 2에서 제작된 TYLCV 감염성 클론(KG3, KG4 및 KG5 감염성 클론)을 TYLCV의 기주식물로 알려진 토마토에 접종하여, 이의 감염성을 확인하고자 하였다. 상기 감염성은 다음을 측정함으로써 수행되었다:
(a) 식물의 표현형;
(b) 병증 심각도 점수(symptom severity scroe);
(c) 바이러스 카피수 (number of viral copies); 및
(d) PCR 분석을 통한 바이러스 검출.
구체적으로, 식물의 표현형은 TYLCV 감염성 클론을 접종 후 매주 관찰되었으며, symptom severity score는 Friedmann et al.에 따라 0 내지 4점으로 측정하였다. 또한, TYLCV가 접종된 식물체에서 FavorPrep Plant Genomic DNA Extraction Mini Kit(Favorgen, Pring-Tung, Taiwan)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였고, TYLCV-det-F/R 프라이머를 사용하여 매주 PCR 분석을 수행함으로써 상기 감염 식물체 내 TYLCV의 존재 여부를 확인하였으며, 바이러스 카피수는 Rotor Gene Q thermocycler(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 qPCR을 수행함으로써 측정되었다.
실시예 3.1. TYLCV-감수성 품종 토마토( Solanum lycopersicum cv. Money Maker)에서의 TYLCV의 감염성 확인
먼저, TYLCV-감수성 품종 토마토인 Solanum lycopersicum cv. Money Maker를 발아 후 4주간 재배하여 준비하였고, 준비된 토마토 식물체에 KG3 감염성 클론, KG4 감염성 클론 및 KG5 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리움 배양액을 처리하여 각각 신규한 TYLCV 분리주 KG3, KG4 및 KG5를 감염시켰으며, 이후 4주에 걸쳐 감염성 여부를 확인하였다. 매주마다 식물체의 잎으로부터 지놈(genome) DNA를 추출하여 TYLCV 검출 프라이머와 함께 PCR을 수행함으로써 바이러스가 식물체 내에 제대로 감염되었는지 확인하였다.
본 실시예에서 기존의 TYLCV 분리주 KG1 및 KG2 처리군은 양성 대조군으로 사용하였고, Mock 처리군은 음성 대조군으로 사용하였으며, 총 5개의 식물체에 대하여 3 반복 수행하였다.
그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군을 제외한, 모든 처리군에서 잎 말림 및 황화 현상이 일어나고, 성장이 위축되는 병증이 확인되었으며, 병증이 유발된 식물체 내에 TYLCV가 제대로 감염되었다는 것을 확인하였다.
구체적으로, 신규한 TYLCV 분리주 KG3 및 KG4가 감염된 식물체는 중증도 병증을 나타내는 KG1과 비교하여, 육안으로 관찰하였을 때도 훨씬 더 심각하게 TYLCV-특이적 병증을 나타내며 높은 symptom severity score를 가짐을 확인하였고, 바이러스 DNA의 카피 수도 현저히 높은 수준을 나타내는 것을 확인하였다. 반면, KG5에 감염된 경우, 경미한 수준의 병증을 나타내는 KG2 감염 식물체와 비교하여, 잎 말림 증상 및 성장이 다소 위축된 표현형을 나타냈고, 감염 4주 차에 조금 증가한 바이러스 DNA 카피 수를 나타내는 것을 확인하였다.
이로써, 기존의 중증도 병증을 나타내는 KG1 감염 식물체와 비교하여, KG3 및 KG4는 식물체에 훨씬 심각한 수준의 TYLCV-특이적 병증을 유발할 수 있고, KG5의 경우, 감염 식물체에서 기존의 경미한 수준의 병증을 나타내는 KG2에 비해, 좀 더 뚜렷한 TYLCV-특이적 병증을 나타낼 수 있는, 신규한 TYLCV 분리주임을 확인할 수 있었다.
실시예 3.2. TYLCV-저항성 품종 토마토( Ty -1 또는 Ty -2)에서의 TYLCV의 감염성 확인
먼저, TYLCV-저항성 관련 Ty-1 또는 Ty-2 locus가 도입된 TYLCV-저항성 품종 토마토에 중증도 병증을 유발하는 TYLCV 분리주 KG1과, 신규한 TYLCV 분리주 KG3 및 KG4의 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리움 배양액을 처리하여 각각 KG1, KG3 및 KG4를 감염시켰으며, 이후 감염성 여부를 확인하였다. 7 dpi 및 14 dpi에 식물체의 잎으로부터 지놈(genome) DNA를 추출하여 TYLCV 검출 프라이머와 함께 PCR을 수행함으로써 바이러스가 식물체 내에 제대로 감염되었는지 확인하였다.
본 실시예에서 TYLCV-감수성 품종 토마토(Solanum lycopersicum cv. Money Maker)를 양성 대조군으로 사용하였고, Mock 처리군은 음성 대조군으로 사용하였다.
그 결과는 도 4에 나타내었다.
초기에는 TYLCV 분리주 KG1, KG3 및 KG4가 처리된 모든 TYLCV-저항성 품종 토마토에서 약간의 잎 말림 증상이 관찰되는 것으로 보여졌으나, 14 dpi에 KG3 감염성 클론이 접종된 모든 TYLCV-저항성 품종 토마토에서 잎의 황변 및 말림 증상이 지속적으로 관찰된 반면, KG4 감염성 클론으로 접종된 경우, Ty-1 locus가 도입된 TYLCV-저항성 품종 토마토에서만 병증을 나타내었다(도 4a). 그러나, Mock 처리군과 비교하여 KG1 감염성 클론을 접종한 모든 TYLCV-저항성 품종 토마토에서는 병증이 관찰되지 않았다.
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 14 dpi에 각 균주에 대한 4개 ORF(V1, V2, C1 및 C4)의 상대적 발현을 확인한 결과, KG1에 감염된 식물체와 비교하여, KG3의 발현은 모든 TYLCV-저항성 품종 토마토에서 유의하게 증가됨(p<0.001)을 나타내었으며, KG4의 발현은 Ty-1 locus가 도입된 TYLCV-저항성 품종 토마토에서만 유의미한 수준(p<0.001)을 나타내었다. 상기 결과는 바이러스 DNA 카피 수를 나타내는 데이터에서도 동일하게 확인되었으며, 구체적으로, KG1으로 접종된 경우와 비교하여, KG3 감염성 클론을 접종한 모든 TYLCV-저항성 품종 토마토에서 유의하게 높은 수준의 바이러스 DNA 카피 수(p<0.001)를 나타낸 반면, KG4의 경우, Ty-1 locus가 도입된 TYLCV-저항성 품종 토마토에서만 이의 바이러스 DNA 카피수가 유의하게 높은 것을 확인하였다(p<0.001)(도 4c). 또한, Ty-1 또는 Ty-2 locus가 도입된 TYLCV-저항성 품종 토마토에서 신규한 TYLCV 분리주의 감염성은 PCR 결과를 통해서도 확인되었다(도 4d).
이로써, 신규한 TYLCV 분리주 KG3는 TYLCV-저항성 품종 토마토에서도 높은 수준의 바이러스 DNA 카피 수와 함께 가장 심각한 병증을 나타내는 분리주임을 확인할 수 있었다.
농업생명공학연구원 KACC92454P 20220921 농업생명공학연구원 KACC92455P 20220921 농업생명공학연구원 KACC92456P 20220921

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산 분자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens).
  6. 제5항에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 KACC92454P인 것을 특징으로 하는 아그로박테리움 튜머페이션스.
  7. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 감염 식물체.
  8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산 분자를 검출하는 제제를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 감염 진단용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출하는 제제는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 감염 진단용 조성물.
  10. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 핵산 분자를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)의 감염 진단 방법.
  11. 제4항의 재조합 벡터를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV)를 감염시켜 병증을 유도하는 방법.
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KR20130104078A (ko) * 2012-03-12 2013-09-25 대한민국(농촌진흥청장) 토마토 황화 잎 말림 바이러스에 대한 저항성 품종을 판별하는 방법
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Tomato yellow leaf curl virus DNA, complete genome, strain: TYLCV-GJ, GenBank: AB636409.1, 2011.06.07.* *

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