KR102658666B1 - 고나도트로핀 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

hCG의 α 체인을 코딩하는 서열을 게놈에 병합한 상태로 포함하는 숙주 세포 및 재조합 hCG를 생산하기 위한 숙주 세포의 용도.

Description

고나도트로핀 생산 방법
본 발명은 불임 치료에 사용하기 위한 고나도트로핀에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인간 융모막성 고나토드로핀 (human chorionic gonadotrophin, hCG)에 관한 것이다.
고나도트로핀은 남성과 여성에서 생식선의 기능을 조절하는 이형이량체성 당단백질 호르몬 그룹에 속한다. 고나도트로핀으로는 난포 자극 호르몬 (FSH), 황체 형성 호르몬 (LH) 및 융모막성 고나도트로핀 (CG)이 있다.
인간 융모막성 고나도트로핀 (hCG)은 주로 임신기에 인간 태반에서 분비되어, 황체의 유지를 뒷받침한다. hCG는, 다른 당단백질 호르몬인 LH 및 FSH에서도 공통적인, 92개의 아미노산으로 구성된 α 서브유닛(α 체인)과, 호르몬 특이성을 결정하는 hCG에 고유한 145개의 아미노산으로 구성된 β 서브유닛(β 체인)을 포함한다. 각각의 서브유닛은 복잡한 탄수화물 잔기들의 부가에 의해 번역 후 수정된다. α 서브유닛은 아미노산 52 및 78번에 2개의 N-결합된 당화 부위를 포함하고 있으며, β 서브유닛은 아미노산 13 및 30번에 2개의 N-결합된 당화 부위와 아미노산 121, 127, 132 및 138번에 4개의 O-결합된 당화 부위를 포함하고 있다.
불임 치료에 임신부의 뇨에서 추출된 hCG [Choragon (Ferring)]가 다년간 사용되어 왔다. 뇨에서 추출되는 hCG의 제조에는 다량의 뇨 채집과 처리 공정이 수반된다. hCG의 재조합 버전, 즉 Ovitrelle (Serono)도 불임 치료 용도로 이용가능하다. 이 재조합 제품은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되며, 인간 뇨로부터 제조된 hCG와는 다른 약동학적 프로파일을 가진다.
존재하는 다양한 이소형 (isoform)의 양적 차이 측면에서 hCG 조제물들에 상당한 이종성이 존재한다. 개개 hCG 이소형은 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 번역 후 수정되는 정도에 차이가 있어; 개개 이소형은 탄수화물 분지 구조들의 이종성과 시알산 (말단 당)의 혼입량 차이로 특정화되는데, 이 2가지 모두 특정 이소형의 생활성에 영향을 미치는 것으로 보인다.
재조합 hCG("rhCG") 제품의 당화는 숙주 세포주에 존재하는 글리코실-트랜스퍼라제들의 범위(range)를 반영한다. 기존 rhCG 제품, Ovitrelle는 조작된 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)로부터 유래된 것이다. CHO 유래 rhCG에서 글리칸의 변형 범위는 뇨로부터 유래된 천연 산물에서 확인되는 것 보다 훨씬 더 한정적이다. CHO 유래의 rhCG에서 확인되는 글리칸의 이종성 저하의 예로는, 글루코사민 분지의 결핍과 코어 퓨실화 및 아세틸 락토스아민 연장의 양적 감소가 있다. 아울러, CHO 세포는 오직 α2,3 연결을 이용해 시알산을 부가할 수 있다 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).
지금까지 불임 치료에 사용되어 온 인간 뇨 hCG (즉, 임신부의 뇨에서 추출된 hCG)는 실제 태반 hCG이며; hCG는 (인간) 태반에서 만들어진 다음 뇨로 배출된다. 이 hCG는 제약학적 제품으로서 사용하기 위해 뇨로부터 추출된다. Bousfield et al (Rev Endocr Metab Disord (2011) 12:289-302)에는, "뇌하수체 고나도트로핀은 α2,3- 및 α2,6-연결된 시알산을 가지지만, 태반 hCG와 중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 재조합 고나도트로핀은 α2,3-연결된 시알산만 가진다"고, 언급하였다. 즉, (태반에서 생산된) 인간 뇨 hCG는 (CHO 세포주 유래 재조합 산물과 마찬가지로) α2,3-시알산화만을 포함한다. 따라서, hCG를 포함하는 공지된 약학적 조성물은 α2,3-연결된 시알산만 포함하고, α2,6-연결된 시알산은 포함하지 않는다.
재조합 FSH 조제물 (Organon)은, 뇌하수체, 혈청 또는 폐경 후 뇨 FSH와 비교해, 등전점(pI)이 4 미만인 (산성 이소형으로 간주됨) FSH가 양이 상이한 것으로 확인되었다 (Ulloa-Aguirre et al. 1995). FSH 뇨 조제물이, 재조합 제품인 Gonal-f (Serono) 및 Puregon (Organon)에 비해, 산성 이소형의 함량이 훨씬 더 높다 (Andersen et al. 2004). 이는, 설페이트로 변형된 음으로 하전된 글리칸의 함량이 FSH에서 더 적기 때문에, rFSH에서 시알산의 몰 함량이 더 낮을 수 밖에 없다는 것이다. 천연 FSH와 비교해, 시알산의 함량이 낮은 것은 상업적으로 시판되는 이들 2종의 FSH 제품들의 특징으로, 제조 공정의 한계를 보여준다 (Bassett and Driebergen, 2005). FSH의 순환성 수명이 다양한 소스들로부터 유래된 물질들에 대해 확인되고 있다. 이들 물질들 중 일부는, 산성이 강할수록 음전하가 높아지는 이들의 pI로 특정되는, 분자의 총 전하를 기준으로 분획화되었다. 분자의 총 전하를 결정하는 주된 인자는 각 FSH 분자의 시알산 총량이다. 예를 들어, rFSH (Organon)의 시알산 함량은 약 8 mol/mol인 반면, 뇨 유래의 FSH은 시알산 함량이 더 높다 (de Leeuw et al. 1996). 랫에서의 이들의 혈장 소거율은 0.34 및 0.14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al. 2003)이다. 재조합 FSH 샘플을 고 pI 분획과 저 pI 분획으로 나눈 경우, 고 pI(시알산 함량이 낮음) 분획은 생체내 효능은 저하되고 혈장 반감기는 짧아졌다 (D'Antonio et al. 1999). 본 출원인들은, 공지된 CHO로부터 유래된 FSH와 유사하게, 재조합 hCG 제품 (예, Ovitrelle) 역시 뇨 유래의 hCG 보다 등전점 4 미만 (산성 이소형으로 간주됨)인 hCG의 양이 더 적다는 것을 확인하였는데, 이 역시 기존 rhCG 제품이 뇨 유래의 hCG 보다 시알산 함량이 더 적다는 것을 의미한다.
Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online. 9(2), 231-236. Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177. D'Antonio M., Borrelli F. , Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167 Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356. Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1980) The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region. Nature, 286, 684-387. Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75. Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 7, 16-21. Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144. Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616. Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868. Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), 3657-3663. Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev.16(6), 765-787. Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), 379-389.
본 출원인은, CHO 세포주 유래 rhCG 제품 Ovitrelle 보다 더 강한 산성 프로파일을 가지며 시알산 함량이 높은, (인간 세포주에서 생산 또는 발현된, 예를 들어, 인간 세포주를 조작하여 제조된 재조합 hCG인) 인간 유래 재조합 hCG를 개발하였다. 이 rhCG는 WO 2011/042688로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/GB2010/001854의 내용이다. α2,3-연결된 시알산과 α2,6-연결된 시알산의 혼합물을 가진 재조합 hCG는 rhCG와 α2,3 시알릴트랜스퍼라제 둘다를 발현하도록 인간 세포주를 조작함으로써 제조되었다. 발현 산물들은 높은 산성을 띄며, 시알산 함량이 예를 들어 19.1 mol/mol [시알산 몰/단백질 몰 비로 표시됨]로서, α2,3- 및 α2,6-연결된 시알산의 믹스를 가지고 있는데; 후자는 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 제공된다. 본 출원인의 연구에 따르면, 시알산의 연결 타입, 즉 α2,3- 또는 α2,6-은 hCG의 생물학적 소거에 놀라운 영향을 미칠 수 있는 것으로, 보인다. 인간 세포주는, CHO 세포주와는 대조적으로, α2,3 및 α2,6 연결로 결합된 시알산을 가진 재조합 hCG를 발현할 수 있다.
WO 2011/042688의 세포주는 인간 유래의 재조합 hCG도 발현한다. 그러나, 이 세포주는 유리형 β 체인 (유리형 β 서브유닛)을 상대적으로 높은 수준으로 발현하므로, (산물 hCG로부터 이 유리형 β 체인을 제거하기 위해) 정제가 필요하였다.
현재, 본 출원인은 rhCG와 α2,3 시알릴트랜스퍼라제를 둘다 발현하는 새로운 세포주를 개발하였으며, 이 세포주는 유리형 β 체인의 함량이 저하된 rhCG를 생산하므로, 수율은 향상되고, 산물에 요구되는 정제 수준은 낮아졌다 (도 7 참조).
본 발명은, 서열번호 1에 따른 서열; 서열번호 1의 서열과 96.5% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 96.5% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 4에 따른 서열; 서열번호 4의 서열과 96.5% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 96.5% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열)로부터 선택되는, hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열을 게놈에 병합한 상태로 포함하는 것을 특징으로 하는, (예, 숙주) 세포를 제공한다. 바람직하게는, hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열은 AH007338로서 유전자은행에 등록된 서열이 아니다 (즉, 바람직하게는, hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열은 서열번호 5에 나타내지 않음). 세포는 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 cDNA, 예를 들어, 서열번호 3에 따른 서열을 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함할 수 있다. 세포는 hCG의 β 체인을 코딩하는 (핵산) 서열, 예를 들어, 서열번호 2에 따른 서열을 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함할 수 있다.
숙주 세포는, 예를 들어, PER.C6® 세포, HT1080 세포, GT-5s 세포 등이다. 바람직하게는, 세포는 PER.C6® 세포, 예를 들어, ECACC no. 96022940로 기탁된 PER.C6® 세포이다.
본 발명은, hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열을 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, ECACC no. 96022940로 기탁된 PER.C6® 세포 등의 PER.C6® 세포를 제공한다. hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열은 서열번호 1에 따른 서열; 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 4에 따른 서열; 서열번호 4의 서열과 90% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 및 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열)로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열은 AH007338로서 유전자은행에 등록된 서열이 아니다. 이 세포는 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 cDNA, 예를 들어 서열번호 3에 따른 서열을 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함할 수 있다. 이 세포는 hCG의 β 체인을 코딩하는 (핵산) 서열, 예를 들어, 서열번호 2에 따른 서열을 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "hCG의 α 체인을 코딩하는 서열" 또는 "hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열"이라는 용어는, hCG의 α 체인이 FSH (및 LH)에서와 동일하기 때문에, FSH의 α 체인을 코딩하는 서열 (또는 LH의 α 체인을 코딩하는 서열)을 지칭하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서, 용어 "핵산 서열"은 펩타이드, 단백질 등의 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 분자에 관한 것이다. 이들 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 이의 유사체로 형성될 수 있다. 그러나, 이는 DNA로 형성된 핵산 분자가 바람직하다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 출발 뉴클레오티드 서열의 변형이 코돈 용법에 대한 최적화 프로세스를 나타낸다는 것을 명확하게 인지하고 있다. 도입된 변화는 변형된 서열과 출발 서열을 비교함으로써 쉽게 동정할 수 있다. 또한, 이들 2종의 서열 (즉, 출발 서열과 최적화된 서열)은 동일한 아미노산 서열을 코딩할 것이다.
인간 hCG의 α-체인의 아미노산 서열은 WO 2011/042688 (문헌에 서열번호 1로 언급됨)에 언급되어 있으며, Fiddes and Goodman 1979에 기재되어 있다. 이는 AH007388로 유전자은행에 등록되어 있으며, 아래 서열번호 5로 나타낸다. 인간 hCG의 β-체인의 아미노산 서열은 서열번호 2에 기술되어 있으며, NP_000728로서 유전자은행에 등록되어 있다. 이들 아미노산 서열들은 인간 hCG의 α- 및 β-체인의 야생형 아미노산 서열이다. 본 발명에서, "야생형 핵산 서열" 또는 "출발 핵산 서열"이라는 용어는, 숙주 세포에서의 (과)발현에 이용되고자 의도되며 숙주 세포에서 코돈 용법에 순응되지 않은, 핵산 서열을 지칭하며, 이 서열은 단백질을 코딩하는 실제 야생형 핵산 서열이다. 본 발명에서 "최적화된 핵산 서열"이라는 용어는, 비-변형된/출발 핵산 서열의 서열을 순응시킴으로써 숙주 세포에서의 발현을 위해 변형된 서열을 지칭한다. 최적화된 핵산 서열은 비-변형된 서열에 의해 코딩된 단백질과 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 코딩한다. 본 출원인은 hCG의 α-체인을 코딩하는 최적화된 서열을 개발하였다 (예, 서열번호 1 및 4, 도 1 참조).
본 발명은, 추가적인 측면에서, 서열번호 1에 따른 핵산 서열; 서열번호 4에 따른 핵산 서열; 서열번호 1의 핵산과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 핵산 서열 (예, 서열번호 1의 핵산과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 핵산 서열); 및 서열번호 4의 핵산과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 핵산 서열 (예, 서열번호 4의 핵산과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 핵산 서열)로부터 선택되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 서열 (예, hCG의 α 체인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)을 제공한다.
본 발명은, 추가적인 측면에서, 적절한 배지에서 세포를 배양하는 단계 및 세포 및/또는 배지에서 재조합 단백질 (hCG)을 회수하는 단계 (예, 세포 배양 상층액으로부터 재조합 hCG를 회수하는 단계)를 포함하며, 세포 (숙주 세포)가 서열번호 1에 따른 서열; 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 4에 따른 서열; 서열번호 4의 서열과 90% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 및 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열)로부터 선택되는 hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열을 게놈에 병합한 상태로 포함하는, 세포에서 재조합 hCG를 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열은 AH007338로서 유전자은행에 등록된 서열이 아니다. 세포는 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 cDNA, 예를 들어, 서열번호 3에 따른 서열을 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함할 수 있다. 세포는 추가적으로 hCG의 β 체인을 코딩하는 (핵산) 서열, 예를 들어, 서열번호 2에 따른 서열을 게놈에 병합한 상태로 포함한다. 본 방법은 세포 및/또는 배지로부터 수득한 재조합 hCG를 정제 (예, 세포 배양 상층액으로부터 재조합 hCG 정제)하는 추가 단계 또는 단계들을 포함할 수 있다.
(숙주) 세포는, 예를 들어, PER.C6® 세포, HT1080 세포, GT-5s 세포 등일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 ECACC no. 96022940로 기탁된 PER.C6® 세포 등의 PER.C6® 세포이다.
본 발명은, 추가적인 측면에서, 적절한 배지에서 세포를 배양하는 단계 및 세포 및/또는 배지에서 재조합 단백질 (hCG)를 회수 (예, 세포 배양 상층액에서 재조합 hCG를 회수)하는 단계를 포함하며, 세포가 hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열을 게놈에 병합한 상태로 포함하는 PER.C6® 세포 (예, ECACC no. 96022940으로 기탁된 PER.C6® 세포)인, 세포에서 재조합 hCG를 생산하는 방법을 제공한다. hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열은, 서열번호 1에 따른 서열; 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 4에 따른 서열; 서열번호 4의 서열과 90% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 및 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열)로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, hCG의 α 체인을 코딩하는 (핵산) 서열은 AH007338로서 유전자은행에 등록된 서열이 아니다. 이 세포는 추가적으로 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 cDNA, 예를 들어 서열번호 3에 따른 서열을 게놈에 병합한 상태로 포함할 수 있다. 이 세포는 추가적으로 hCG의 β 체인을 코딩하는 (핵산) 서열, 예를 들어, 서열번호 2에 따른 서열을 게놈에 병합한 상태로 포함할 수 있다. 본 방법은 세포 및/또는 배지로부터 수득되는 재조합 hCG를 정제 (예, 세포 배양 상층액으로부터 재조합 hCG를 정제)하는 추가적인 단계 또는 단계들을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "숙주 세포"는, 예를 들어, 폴리펩타이드를 생산하기 위한 핵산 서열의 발현, 즉 전사 및 번역에 통상적으로 사용되는 임의의 세포를 지칭한다. 특히, 용어 "숙주 세포" 또는 "유기체"는 원핵생물, 하등 진핵생물, 식물, 곤충 세포 또는 포유류 세포 배양 시스템을 지칭한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유류 세포이며, 더 바람직하게는 숙주 세포는 인간 세포, 보다 더 바람직하게는 PERC6® 세포이다.
용어 "재조합 핵산 분자"는, 본 발명의 의미에서, 숙주 세포에 도입될 수 있으며 재조합 핵산 분자에 함유된 핵산 서열의 발현을 구현할 수 있는, 모든 타입의 핵산 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 이 용어는, 당해 기술 분야에 널리 공지된 바와 같이, 예를 들어, 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터 (예, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터들)를 포함한다.
본 발명은, 추가적인 측면에서, hCG의 α 체인을 코딩하는 (제1) 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하며, 이때 (제1) 핵산 서열은 서열번호 1에 따른 서열; 서열번호 1의 서열과 96.5% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 96.5% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 4에 따른 서열; 서열번호 4의 서열과 96.5% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 96.5% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 및 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열)로부터 선택된다. 바람직하게는, 이러한 측면의 본 발명의 재조합 핵산 분자는 인간 hCG의 α-체인을 코딩하는 최적화된 핵산 서열과 hCG의 β-체인을 코딩하는 핵산 서열 둘다를 포함한다. 바람직하게는, (제1) 핵산 서열은 숙주 세포에서 활성인 프로모터의 통제 하에 배치된다. 바람직하게는, 재조합 핵산 분자는 hCG의 β 체인을 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. hCG의 β 체인을 코딩하는 제2 핵산 서열은 서열번호 2에 따른 서열일 수 있다.
제2 핵산 서열은 숙주 세포에서 활성인 개별 프로모터의 통제 하에 배치될 수 있다. 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 바이러스 프로모터 (예, CMVie 프로모터)의 통제 하에 배치될 수 있다
본 발명은 다른 측면에서 전술한 재조합 핵산 서열을 포함하거나 또는 함유하는 숙주 세포 (예, hCG의 α 체인을 코딩하는 (제1) 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포, 상기 (제1) 핵산 서열은 서열번호 1에 따른 서열; 서열번호 1의 서열과 96.5% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 96.5% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 1의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열); 서열번호 4에 따른 서열; 서열번호 4의 서열과 96.5% 이상의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 96.5% 이상의 서열 동일성을 가진 서열); 및 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 상동성을 가진 서열 (예, 서열번호 4의 서열과 97% 이상 (예, 98% 이상 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 가진 서열)로부터 선택됨)를 제공한다.
본 출원인은, 세포 (숙주 세포), 이들 숙주 세포가 통합된 세포주, 재조합 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 방법이 재조합 hCG를 높은 수율과 순도 (예, 유리형 β 체인을 거의 포함하지 않음)로 생산할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명은, 다른 측면에서, α2,3- 및 α2,6-시알산화를 포함하는 재조합 hCG ("rhCG" 또는 "rechCG")를 제공하며, 재조합 hCG는 본원에 기술되고 청구항에 청구된 세포에서 생산된다. 재조합 hCG는 [단백질의 몰 수에 대한 시알산의 몰 수의 비율로 표시하였을 때] 12 mol/mol 내지 20 mol/mol, 예를 들어 12 mol/mol 내지 15.5 mol/mol, 예를 들어 12 mol/mol 내지 14.9 mol/mol의 시알산 함량을 가질 수 있다. rhCG (또는 rhCG 조제물)은 12.5 mol/mol 내지 14.5 mol/mol의 시알산 함량, 예를 들어 12.8 mol/mol 내지 13.2 mol/mol의 시알산 함량을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 rhCG (또는 rhCG 조제물)은 13 mol/mol의 시알산 함량을 가질 수 있다.
본 발명의 예에서, rhCG는 한가지 이소형으로 또는 이소형들의 혼합물로서 존재할 수 있다.
본 발명의 방법 및 세포에 의해 생산되는 재조합 hCG (또는 rhCG 조제물)는 α2,3- 및 α2,6-시알산화를 포함한다. 시알산화는 hCG 탄수화물 구조에 존재하는 시알산 잔기의 양을 의미한다. α2,3-시알산화는 (당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이) 2,3 위치에서의 시알산화를 의미하며; α2,6-시알산화는 (당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이) 2,6 위치에서의 시알산화를 의미한다. 즉, 본원에서, "전체 시알산화 중 %가 α 2,3-시알산화일 수 있다"는 표현은 hCG에 존재하는 시알산 잔기들 총 수에 대한 2,3 위치에서 시알화된 %를 지칭한다. "전체 시알산화의 %가 α 2,6-시알산화이다"라는 표현은 hCG에 존재하는 시알산 잔기들 총 수에 대한 2,6 위치에서 시알산화된 %를 지칭한다. "전체 시알산화의 %가 α 2,8-시알산화이다"라는 표현은 hCG에 존재하는 시알산 잔기들 총 수에 대한 2,8 위치에서 시알산화된 %를 지칭한다.
본 발명에 따른 방법 및 세포에 의해 생산되는 rhCG (또는 rhCG 조제물)는 전체 시알산화 중 1% 내지 99%가 α2,3-시알산화일 수 있다. 본 발명에 따른 방법 및 세포에 의해 생산되는 rhCG (또는 rhCG 조제물)은 전체 시알산화중 10% 이상이 α2,3-시알산화일 수 있으며, 예를 들어, 전체 시알산화 중 10% 내지 90%가 α2,3-시알산화일 수 있다. 예를 들어, 전체 시알산화 중 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80 또는 90% 또는 그 이상이 α2,3-시알산화일 수 있다. 전체 시알산화의 45% 내지 80%가 α2,3-시알산화일 수 있으며, 예를 들어, 전체 시알산화의 50% 내지 70%가 α2,3-시알산화일 수 있으며, 예를 들어, 전체 시알산화의 55 내지 65%가 α2,3-시알산화일 수 있다. rhCG (또는 rhCG 조제물)은 전체 시알산화의 65 - 95%, 예를 들어 전체 시알산화의 70 - 90%, 예를 들어 전체 시알산화의 85 - 90% 범위의 함량으로 α2,3-시알산화를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 세포에 의해 생산되는 rhCG (또는 rhCG 조제물)은 전체 시알산화의 1 - 99%가 α2,6-시알산화일 수 있다. 본 발명의 rhCG (또는 rhCG 조제물)은 전체 시알산화의 5 - 50%가 α2,6-시알산화일 수 있다. 예를 들어, 전체 시알산화의 5 내지 45%, 예를 들어 6 내지 40%, 예를 들어 7 내지 30%, 예를 들어 8 내지 20%가 α2,6-시알산화일 수 있다. rhCG (또는 rhCG 조제물)는 전체 시알산화의 20-75%, 예를 들어, 전체 시알산화의 30-60%, 예를 들어, 전체 시알산화의 35-45% 범위의 함량으로 α2,6-시알산화를 포함할 수 있다. rhCG (또는 rhCG 조제물)은 전체 시알산화의 5 내지 35%, 예를 들어, 전체 시알산화의 10 내지 20% 범위의 함량으로 α2,6-시알산화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전체 시알산화의 11-55%가 α2,6-시알산화일 수 있다.
본 방법 및 세포에 의해 생산되는 rhCG 또는 rhCG 조제물은 선택적으로 α2,8-시알산화를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 rhCG (또는 rhCG 조제물)는 전체 시알산화의 5% 이하가 α2,8-시알산화일 수 있으며, 예를 들어, 전체 시알산화의 0 내지 4%, 예컨대 0.1 내지 4%가 α2,8-시알산화일 수 있다. 본 발명의 rhCG (또는 rhCG 조제물)은 α2,8-시알산화를 함유하지 않을 수도 있다.
본 발명에 따른 방법 및 세포에 의해 생산되는 rhCG (또는 rhCG 조제물)는 (단백질+탄수화물의 중량이 아닌, 단백질 중량을 기준으로) 6 중량% 이상 (예, 6% 내지 15%, 예컨대 7% 내지 13%, 예컨대 8% 내지 12%, 예컨대 11% 내지 15%, 예컨대 12% 내지 14%)의 시알산 함량을 가질 수 있다.
rhCG (또는 rhCG 조제물)는 인간 세포주, 예를 들어, PER.C6® 세포주, HT1080 세포주 등에서 생산 또는 발현될 수 있다. rhCG (또는 rhCG 조제물)는 인간 유래 세포주 또는 변형된 인간 세포주, 예를 들어 PER.C6® 유래의 세포주 또는 변형된 PER.C6® 세포주, 변형된 HT1080 세포주 또는 HT1080 유래 세포주 등에서 생산 또는 발현될 수 있다. 바람직한 예에서, rhCG는 PER.C6® 세포주, PER.C6® 유래 세포주 또는 변형된 PER.C6® 세포주에서 생산 또는 발현된다. 인간 세포주 (예, PER.C6® 세포주, HT1080 세포주, GT-5s 세포주)에서 생산 또는 발현되는 rhCG는 [세포주의] 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 제공되는 일부 α2,6-연결된 시알산 (α2,6-시알산화)을 포함할 것이며, [세포주의] 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 제공되는 일부 α2,3-연결된 시알산 (α2,3-시알산화)를 포함할 것이다. 세포주는 α2,3-시알릴트랜스퍼라제를 사용해 변형될 수 있다. 다른 예로 또는 아울러, 세포주는 α2,6-시알릴트랜스퍼라제를 사용해 변형될 수 있다. 이는, 예를 들어 시알산화를 유지하기 위한 세포 증식 배지의 조작 및 조절이 공지된 프로세스 보다 덜 중요할 수 있기 때문에, 생산 방법이 단순화될 수 있(으며, 보다 효율적이게 만들 수 있)다. 또한, 본 방법은, 공지된 rhCG 제품들의 생산과 비교해 염기성 rhCG가 거의 생산되지 않고; 보다 산성의 rhCG가 생산되고, 염기성 hCG의 분리/제거가 거의 문제가 되지 않기 때문에, 보다 효율적일 수 있다.
rhCG는, 예를 들어, α2,3-시알릴트랜스퍼라제를 이용해 변형된 인간 세포주에 의해 생산되는, α2,3-시알릴트랜스퍼라제를 이용해 생산될 수 있다. rhCG는 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 생산된 α2,6-연결된 시알산 (α2,6-시알산화)를 포함할 수 있다. rhCG는, 예를 들어, α2,36-시알릴트랜스퍼라제 및/또는 α2,6-시알릴트랜스퍼라제를 이용해 변형된 인간 세포주에 의해 생산되는, α2,3-시알릴트랜스퍼라제 및/또는α2,6-시알릴트랜스퍼라제를 이용해 생산될 수 있다.
본 발명은, 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생산 또는 발현된, 본원에 기술된 바와 같은, 재조합 hCG 또는 재조합 hCG 조제물을 제공한다.
rhCG 구조는 글리칸 모이어티를 포함한다. 분지 형성 (branching)이 발생할 수 있으며, 이로써 당해 기술 분야에 잘 공지된 바와 같이, 글리칸은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 말단 당 잔기 또는 "안테나 (antennae)"를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 rhCG는 모노-안테나형, 및/또는 다이-안테나형, 및/또는 트리-안테나형, 및/또는 테트라-안테나형 글리칸 구조로 글리칸을 가질 수 있다. rhCG는 모노-안테나형, 및/또는 다이-안테나형, 및/또는 트리-안테나형, 및/또는 테트라-안테나형 글리칸 구조를 포함할 수 있으며, 예를 들어 상대적인 함량은 다음과 같다: 모노-안테나형 0.1 내지 3%; 다이-안테나형 65% 내지 85%; 트리-안테나형 15 내지 25% 및 테트라-안테나형 0.5 내지 1.5% (예, 하전된 글리칸의 WAX 분석을 통해 확인됨).
본 발명은 다른 측면에서 α2,3-시알산화 및 α2,6-시알산화를 가진 재조합 hCG (rhCG)를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기서 재조합 hCG는 본원에 개시된 방법 및/또는 세포에 의해 생산된다. rhCG는 [단백질 몰 수에 대한 시알산의 몰수의 비로 표시하였을 때] 12 mol/mol 내지 15.5 mol/mol, 예를 들어 12 mol/mol 내지 14.9 mol/mol (예, 전술한 바와 같음)의 시알산 함량을 가질 수 있다. rhCG는 12.5 mol/mol 내지 14.5 mol/mol의 시알산 함량, 예를 들어, 12.8 mol/mol 내지 13.2 mol/mol의 시알산 함량을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 rhCG는 13 mol/mol의 시알산 함량을 가질 수 있다.
약학적 조성물은 FSH 및/또는 LH를 더 포함할 수 있다.
FSH는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방식으로 수득할 수 있다. 본원에서 FSH는 인간 유래의 FSH 및 재조합 FSH를 포함한다. 인간 유래의 FSH는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 임의의 적합한 소스 (예, 뇨)로부터 정제될 수 있다. FSH는 재조합 FSH, 예컨대 인간 세포주에서 발현되는 FSH일 수 있다. 재조합 FSH를 발현 및 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
LH는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방식으로 수득할 수 있다. LH는 본원에서 인간 유래의 LH 및 재조합 LH를 포함한다. 인간 유래의 LH는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 임의의 적합한 소스 (예, 뇨)로부터 정제될 수 있다. LH를 발현 및 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
약학적 조성물은 불임 치료를 위한 것이거나 또는 불임을 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있으며, 예를 들어, 보조 생식 기술 (ART), 배란 유도 또는 자궁내 수정 (IUI)에 사용하기 위한 것일 수 있다. 약학적 조성물은, 최종 성숙/배란 및 황체 형성의 촉발, 중증 LH 및 FSH 결핍증을 가진 여성에서 난포 발생의 자극 및/또는 황체 지원 (rhCG/rLH)을 위한 것이거나 또는 이러한 용도로 사용하기 위한 것일 수 있다. 약학적 조성물은 무배란성 WHO 타입 II 여성에서 하나의 난포 발생 (monofollicular development)을 유도하거나 (예, rhCG + rLH), COH 중인 환자에서 LH 프라이밍을 이용한 하나의 난포 반응을 강화하거나 (예, rhCG + rLH), 및 착상/임신율을 개선하기 위해 COH를 보완하거나 (예, rhCG + rLH), 및/또는 보조 생식 기술에서 임신율을 높이기 위한 것이거나, 또는 이러한 용도로 사용하기 위한 것일 수 있다. 약학적 조성물은 유산을 방지하거나 및/또는 조산을 방지하기 위한 것이거나 또는 이러한 용도로 사용하기 위한 것일 수 있다. 약학적 조성물은 자궁내막증을 치료하기 위한 것이거나 또는 자궁내막증을 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다.
약학적 조성물은, 예를 들어, 공지된 hCG 조제물이 사용되는 의학적인 증상들에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 불임을 치료하기 위한 또는 불임 치료용 약제의 제조에 있어 본원에 기술된 rhCG 및/또는 rhCG 조제물의 용도를 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 임의의 약물 투여 경로용으로, 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 경피 (예, 패치 기법), 정맥니, 근육내, 피하, 낭내 (intrasusternal), 질내, 복막내, 국소 (산제, 연고제, 점적제) 또는 볼 또는 코 분무용으로, 널리 공지된 조성물로 제형화할 수 있다. 전형적인 조성물은, 특히 Remington's Pharmaceutical Sciences fifteenth edition (Matt Publishing Company, 1975), at pages 1405 - 1412 및 1461 - 87과 the national formulary XIV fourteenth edition (American Pharmaceutical Association, 1975)에 언급된 바와 같은, 약제학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어, 수용액, 무-독성 부형제, 예로, 염 및 보존제, 완충제 등을 포함한다. 적합한 수성 및 비-수성 약제학적 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는, 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시메틸셀룰로스 및 이들의 적정 혼합물, 식물성 오일 (예, 올리브 오일) 및 에틸 올리에이트와 같은 주사용 유기 에스테르 등이 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 비제한적인 예로서 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 미생물의 증식을 방지하기 위해 항균제 및 항진균제가 첨가될 수 있으며, 그 예로는 m-크레솔, 벤질 알코올, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등이 있다. 아울러, 당, 염화나트륨 등의 등장제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
일부 경우에는, 장기간 작용할 수 있도록, 피하 또는 근육내 주입을 통해 hCG (및 필요에 따라 다른 활성 성분)의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는, 수 난용성의 결정 또는 비정질 물질의 액체 현탁물을 사용함으로써, 달성할 수 있다. 그러면, hCG의 흡수 속도는 이것의 분해 속도에 따라 결정되며, 이는 다시 결정의 크기와 결정 형태에 따라 결정될 수 있다. 다른 예로, 비경구 투여된 hCG 조합 형태의 지연성 흡수는 오일 비히클에 hCG 조합을 용해 또는 현탁함으로써 달성된다. 주입가능한 데포트 형태 (injectable depot form)는 폴리락티드-폴리글리콜라이드 등의 생분해성 폴리머내에 hCG (및 존재하는 경우, 다른 제제)의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써, 제조할 수 있다. hCG 대 폴리머의 비율 및 사용되는 특정 폴리머의 특성에 따라, hCG의 방출 속도를 제어할 수 있다. 그외 생분해성 폴리머의 예로는, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(오르소에스테르), 폴리(안하이드라이드) 등이 있다. 데포트 주입가능한 제형은, 또한, 신체 조직에 친화적인 리포좀 또는 마이크로에멀젼내에 hCG를 포집함으로써 제조된다. 주입가능한 제형은, 예를 들어, 박테리아 체류 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용 직전에 멸균수나 다른 멸균 주사용 매질에 용해 또는 분산시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태에 살균제를 혼입함으로써, 멸균처리할 수 있다. 주입가능한 제형은 임의의 적정 용기, 예컨대 바이얼, 사전-충전된 주사기, 주사 카트리지 등의 안에 든 형태로 제공될 수 있다.
제형 (예, 주사용 제형)은 hCG (선택적으로 FSH, LH 등과 함께)를 함유한 약학적 조성물을 포함하는 제품으로서 제공될 수 있다. 2 이상의 활성 성분 (즉, hCG 및 예를 들어 FSH 또는 LH)이 존재한다면, 이는 분리하여 또는 함께 투여하는 것이 적합할 수 있다. 분리하여 투여하는 경우, 투여는 순차적으로 이루어질 수 있다. 제품은 임의의 적정 패키지로 제공될 수 있다. 예를 들어, 제품은 hCG, FSH 또는 FSH와 hCG의 조합물이 들어있는 사전-충전된 주사기 또는 바이얼을 다수 개 포함할 수 있다. 이 주사기 또는 바이얼은 블리스터 패키지 형태로 또는 멸균성을 유지하기 위한 다른 수단으로 포장될 수 있다. 제품에는 선택적으로 hCG 및 FSH 제형의 사용 설명서가 첨부될 수 있다.
약학적 조성물의 pH 및 다양한 구성 성분들의 실제 농도는, 본 기술 분야에서 일반적인 실무에 따라 조절된다. GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7th ed을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비경구 투여용 조성물로서 제공된다. 비경구 제형을 제조하는 일반적인 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, at pages 780-820에 기술되어 있다. 비경구 조성물은 투여 직전에 무균성 주사 매질과 혼합시킬 고체로서 또는 액체 제형으로 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 비경구 조성물은 투여 용이성과 투여량 균일성을 위해 투약 단위 형태 (dosage unit form)로 제공된다.
본 발명은 아래 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다:
도 1은 최적화된 hCG α 서열의 핵산 및 유추되는 아미노산 서열을 나타낸 것이고;
도 2는 최적화된 hCG β 서열의 핵산 및 유추되는 아미노산 서열을 나타낸 것이고;
도 3은 ST3GAL4의 핵산 및 유추되는 아미노산 서열을 나타낸 것이고;
도 4는 phCGalpha/beta 발현 벡터의 플라스미드 맵을 도시한 것이고;
도 5는 α2,3-시알릴트랜스퍼라제 (ST3GAL4) 발현 벡터를 도시한 것이고;
도 6은 본 발명에 따른 조성물 (레인 4, 5, 6 및 7, 각각 15 ㎍), 선행 기술의 CHO 유래 조성물 Ovitrelle (레인 2, 15 ㎍); 및 임신부로부터 수득한 인간 뇨 유래 제품 Novarel (레인 3, 15 ㎍)에서, rhCG 이소형을 IEF에 의해 검출한 코마시 블루 염색 결과를 나타낸 것이고;
도 7은 α 서브유닛의 "최적화된" 핵산 서열 등의 본 발명의 세포를 이용해 생산된 hCG ("alpha-beta hCG") 및 유리형 β 체인 ("beta hCG")의 농도를, WT (야생형) α 서브유닛 등의 비교예 세포에서 생산된 hCG ("alpha-beta hCG") 및 유리형 β 체인 ("beta hCG")의 농도와 비교하여 도시한 것이다.
실시예 1 - 7
세포주 개발 과정에 대한 개괄
별개의 CMVie 프로모터로부터 각각 전사되는 hCG α 체인과 β 체인을 가진 단일 플라스미드를 전기천공에 의해 PER.C6® 세포에 형질전환하였다.
이 플라스미드는 네오마이신 내성 유전자 카세트 (도 4)를 가지고 있어, G418 (제네티신)을 이용해 형질전환체를 선별할 수 있다. 형질전환체 풀을 증식시킨 후, 96웰 플레이트에서 G418 선별 하에 제한 희석 클로닝을 수행하였다. 클론주들을 증식시키고, 세포 배양 상층액의 hCG 역가를 기초로 고 발현성 콜로니를 동정하였다.
주요 클론 5개를 높은 생산성을 기초로 선별한 다음, 그 각각을 α2,3-시알릴트랜스퍼라제 유전자 ST3GAL4와 히그로마이신 선별 마커를 발현하는 제2 플라스미드 (도 5)로 형질전환하였다. 5종의 형질전환 풀 각각을 증식시키고, 세포 배양 상층액에서 hCG 농도 및 생체내 약동학 (PK)을 평가하였다.
기대되는 풀들을 대상으로 제한 희석 클로닝 2차 라운드를 수행하였다. 수득한 클론을 증식시키고, 세포 배양 상층액에서 hCG 농도와 hCG 단백질 상의 노출된 갈락토스를 (렉틴 ELISA에 의해) 측정하였다. 노출된 갈락토스의 수준이 낮은 클론들을 대상으로 생체내 PK 등의 추가적인 분석을 수행하였다. 최적의 PK 프로파일을 가진 hCG를 생산하며, 노출된 갈락토스 수준이 낮고, 단백질을 고 수준으로 발현하는 클론들을, 생산성 및 증식 특징들에 대해 평가하여 선별하였다.
실시예 1: 서열 선택 및 플라스미드 벡터
hCG α 폴리펩타이드의 유전자 코딩 영역은 도 1에 나타낸다. hCG α 폴리펩타이드 서열의 유전자 코딩 영역은 본원에서 서열번호 1로 지칭한다.
hCG β 폴리펩타이드의 유전자 코딩 영역은 Fiddes and Goodman (1980)에 따라 사용하였다. 이 서열은 NP_000728로서 유전자은행에 등록되어 있으며, CGbeta3, CGbeta5 및 CGbeta7 단백질 서열들과 일치한다. 이 서열을 본원에서 서열번호 2로 지칭한다.
β-갈락토시드 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 4 (α2,3-시알릴트랜스퍼라제, ST3GAL4)의 유전자 코딩 영역은 Kitagawa and Paulson (1994)에 따라 사용하였다. 이 서열은 L23767로서 유전자은행에 등록되어 있으며, 본원에서 서열번호 3으로 지칭된다.
2종의 플라스미드를 사용하였다: 제1, phCG는 hCG α 체인 및 β 체인을 공동-발현하며; 제2 플라스미드는 시알릴트랜스퍼라제 유전자 ST3GAL4를 발현한다.
실시예 2a: h CG 발현 벡터의 구축
phCG는, 천연 hCG α 신호 펩타이드를 포함하는, 포유류 세포에서 코돈 용법에 맞게 최적화된 hCG의 합성 α 체인이다. 이는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 조작할 수 있다.
hCG alpha 폴리펩타이드 (서열번호 1) 및 hCG beta 폴리펩타이드 (NP_000728, 서열번호 2)의 코딩 서열을, 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법 (예, 국제 특허 공개공보 WO2011/042688)을 이용해 PCR에 의해 증폭시켰다. phCG alpha DNA를 BamHI 및 NheI으로 절단하여, CMV 유래 포유류 발현 벡터 (Crucell vector pcDNA3002Neo)의 BamHI 및 NheI 사이트에 삽입하였다. 이로써 유전자는 하류 BGH 폴리 A 신호와 함께 CMVie 프로모터에 의해 구동되는 발현에 올바른 방향으로 놓이게 된다. 천연 신호 펩타이드를 비롯한 천연 hCG β 유전자를 제한 효소 AscI 및 HpaI으로 절단하여, 제2 CMVie 프로모터에 의해 추가적인 하류 BGH 폴리 A 신호와 함께 발현되도록, AscI 및 HpaI 사이트에 삽입하였다. 또한, 벡터의 백본에는 네오마이신 내성 마커 뿐 아니라 원핵생물 세포에서 선택 및 복제에 필요한 인자들이 포함되었다. 이 벡터를 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 방법을 이용해 증폭 및 서열분석하였다. 최적화된 hCG α 및 천연 (야생형) β 체인의 서열은 각각 도 1 및 2에 나타낸다.
서열분석을 위해 선택된 콜로니들 모두 서열번호 1 및 서열번호 2에 따른 올바른 서열을 포함하였다. 플라스미드 phCG A+B를 형질전환용으로 선택하였다 (도 4).
실시예 2b: ST3 발현 벡터의 구축
ST3GAL4 유전자는 pST3에서 발현된다.
β-갈락토시드 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 4 (ST3, L23767, 서열번호 3, 도 3)의 코딩 서열을 프라이머 조합 2,3STfw 및 2,3STrev를 이용해 PCR에 의해 증폭시켰다.
2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'
2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'
제조된 ST3 DNA 증폭산물을 제한 효소 BamHI 및 AflII로 절단하고, 이를 히그로마이신 내성 마커를 가진 CMV 구동형 포유류 발현 벡터 (벡터 pcDNA3002Neo) 상의 BamHI 및 AflII 사이트에, CMVie 프로모터의 하류에, BGH 폴리-A 서열의 상류에 위치되게, 삽입하였다. 또한, 벡터의 백본에는 히그로마이신 내성 마커 뿐 아니라 원핵생물 세포에서 선별 및 복제에 필요한 인자들이 포함되었다. 이 벡터를 종래 기술된 바와 같이 증폭시켜, 서열분석하였다. 클론 pST3#1 (도 5)이 서열번호 3에 따른 올바른 서열을 함유하고 있었으며, 이를 형질전환용으로 선별하였다.
실시예 3 - 플라스미드 형질전환
원핵생물의 β-락타마제 유전자에 위치한 PvuI 사이트 하나를 가진, 플라스미드 phCG (도 4)에, PvuI (New England Biolabs Cat. No. R0150)을 처리하여, 선형화하였다. 선형화된 플라스미드 DNA를 다음과 같이 PER.C6® 세포에 형질도입하였다.
세포 배양은, 250 ml 에를렌마이어 플라스크에서, L-글루타민 (Invitrogen Cat. No. 25030-123)이 최종 농도 3 mM로, Pluronic F68 (Invitrogen Cat. No. 24040-032)이 최종 농도 1.0g/L로 첨가된 PERMAB 완전 배지 (CD4PERMAB (Hyclone Cat. No. SH30871.01) 중에 유지하였다. 세포는 100 rpm, 5% CO2 및 37℃로 설정된 교반 인큐베이터 (Kuhner Climo-shaker ISF1-X)에서 형질전환하기 전 14일 이상 유지시켰다. 형질전환하기 48시간 전에, 세포를 신선한 배지에 0.5 x 106 세포/ml의 밀도로 이동시켰다.
형질전환 당일에, 세포를 Beckman Coulter ViCell XR에서 계수하여 세포 밀도를 측정하고, 생활성 >90%임을 확인하였다. 세포를 원심분리에 의해 회수하여 신선한 PERMAB 배지에 재현탁한 다음 선형화된 phCG DNA와 혼합하였다. 이 세포/DNA 믹스에는, 250 V, 5 msec로 설정된 전기천공기 챔버에 넣어 전기-충격을 가한 다음 즉시 미리-데운 PERMAB 배지 10 ml로 이동시켰다. 이 과정을 총 6번 반복하였으며, 형질전환주 총 6개를 T-175cm2 조직 배양 플라스크 하나에 수집하였다. 이 플라스크를 37℃ 및 5% CO2로 설정된 정지 인큐베이터 (static incubator)에 넣었다. 48시간 후, 세포를 적정 부피의 선택 PERMAB (PERMAB 완전 배지 + G418 (125 ㎍/ml))에 생존 세포 밀도 0.5 x 106/ml이 되게 다시 현탁하였다.
모든 배양물을 주당 2회 계대 배양하여, 세포의 생존율이 >50%까지 증가할 때까지 선택 배지에서 밀도 0.3 x 106 세포/ml로 유지시켰다. 생존율이 >50%에 도달하면, 세포를 250 ml 에를렌마이어 플라스크에서의 교반 배양으로 전환하였다. 수 주간 교반 배양한 후, 풀 상층액에서 샘플을 취하여, hCG 농도를 분석하였다. 풀이 hCG 발현에 양성인 것으로 확인되면, 세포에 대해 제한 희석 클로닝을 준비하였다.
G418 125 ㎍/ml이 첨가된 PERMAB 배지에서 0.3개 생존 세포/ml 밀도로 세포 현탁물을 준비하였다. 이 세포 현탁물을 바닥이 평평한 96웰 조직 배양 플레이트에 200 ㎕/웰로 분배하고, 37℃, 5% CO2 (결합제 CB150)에서 습윤 공기 하에 배양하였다. 플레이트를 정기적으로 Genetix Clone Select Imager로 스캐닝하여, 각 웰에서의 세포 증식을 추적하였다.
2주 후, 왕성하게 증식하는 세포 콜로니가 존재하는 웰 535개를 식별하였다. 이들 웰에서 상층액으로부터 샘플을 취하고, 시판 키트 (DRG diagnostics HCG ELISA Cat. No. EIA1469)를 사용해 hCG를 분석하였다. 이 분석 결과를 토대로, 총 162개의 콜로니를 PERMAB 선택 배지 0.5 ml/웰이 담긴 24웰 플레이트로 이동시켰다. 웰내 세포가 컨플루언시에 근접하면, 162개의 웰 각각에서 상층액으로부터 샘플을 취하여 hCG 수준을 분석하였다. 그 결과를 기초로, 발현성이 우수한 세포주 91개를 T-25 플라스크에서 증식시키기 위해 선별하였다. 이들 세포주를 거의 컨플루언스로 다시 배양하고, 상층액을 샘플링하여 전술한 바와 같이 hCG를 분석하였다. 그 결과를 기초로, 발현성이 우수한 세포주 58개를 T-75 플라스크에서 증식시켰다. 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 이들 세포주 58개 각각에 대해 비생산성 (Specific production rate, SPR) 분석을 수행하였으며, 비생산성을 pg/cell/day로 나타내었다.
즉, 본 실시예에서는, hCG alpha 및 beta 체인이 병합된 플라스미드를 PER.C6® 세포에 형질전환하고, 형질전환체를 G418이 첨가된 배지를 이용해 선별하였다. 세포를 배양한 콜로니들에 대해 상층액에서의 hCG 농도를 스크리닝하였으며, 발현 수준이 가장 높은 콜로니를 추가로 증식시켰다. 후속적인 증식 및 스크리닝을 수행한 후, hCG를 발현하는 클론 20개를 증식 및 생산성 실험을 위해 선별하였다. 이 실험의 결과를 기초로, ST3GAL4 유전자를 포함하는 제2 플라스미드를 형질전환하기 위해 클론 5개를 선별하였다.
실시예 4 - ST3GAL4 플라스미드 pST3로의 형질전환
실시예 3에서 이미 언급된 바와 같이 안정적인 클론들을 확보하였다.
실시예 3에 언급된 방법에 의해 수득한 최상의 클론 5개를, ST3GAL4 플라스미드 pST3 (실시예 2, 도 3 및 5 참조)로 형질전환하기 위한 용도로 선별하였다. 형질전환은 실시예 3에 언급된 방법과 동일한 방법을 이용해 전기천공에 의해 수행하였으며, 단, 형질전환주는 G418 대신 히그로마이신 0.5 ㎍/ml이 첨가된 PERMAB 완전 배지에서 선별하였다. 이 방법으로, hCG를 발현하는 5개의 풀을 수득하였다.
형질전환 풀들의 상층액 샘플을 랫 약동학 모델에서 평가하였으며, 이 데이타와 RCA-렉틴 결합 분석 (hCG 체인에서 노출된 갈락토스 측정) 데이타를 기반으로, 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 추가적인 제한 희석 클로닝하기 위한 용도로 하나의 풀을 선택하였다.
희석 클로닝 결과, >600개의 클론이 확보되었으며, 이들 각각에 대해 hCG 발현 및 RCA-렉틴 결합성으로 측정되는 노출된 갈락토스 정도를 스크리닝하였다. 노출된 갈락토스가 가장 적은 클론을 추가로 증식시키고, 샘플을 취해 생체내 PK를 수행하고, 렉틴 결합 데이타를 확보하였다. 하나의 풀에서 파생된 클론 5개에 대해 증식 및 생산성 특징에 대해 추가로 분석하였다.
이들 클론 각각을 증식시키고, 시드 스톡 세포 은행을 표준 저온보존 절차에 따라 준비하였다. 시드 스톡 세포 은행의 스톡을 해동시켰으며, 생존성을 확인하였다.
실시예 5 - 등전점 포커싱 (isoelectric focussing)에 의한 분석
전기영동은 전기장에 의해 하전된 분자들을 용매를 통해 이동시키는 것으로 정의된다. 전기장을 통한 생물 분자의 이동성은 전기장의 세기, 분자의 순 전하 (net charge), 분자의 크기와 형태, 이온 세기 및 분자가 통과하는 매질의 특성에 따라 결정될 것이다.
등전점 포커싱 (IEF)은 단백질의 pI에 따라 단백질을 분리시키는 전기영동 기법이다. pI는 단백질이 순 전하를 띄지 않아 전기장에서 이동하지 않는 pH이다. hCG 이소형의 시알산 함량이 각 이소형의 pI 포인트를 약간 변형시키므로, 이 기법을 이용하여 각 클론 유래의 Per.C6 hCG 이소형을 가시화할 수 있다.
Per.C6에서 생산된 hCG 이소형의 등전점을 등전정 포커싱을 이용하여 분석하였다. Per.C6 hCG는 실시예 6에 기술된 바와 같이 생산하였다.
Per.C6 hCG 샘플을 5% 폴리아크릴아미드가 함유된 Novex® IEF 겔에서 pH 3.0 - 7.0 농도 구배의 비변성 조건 (native condition) 하에 양성전해질 용액 pH 3.0 - 7.0 중에서 분리시켰다. 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 코마시 블루 염색으로 단백질을 가시화하였다.
도 6은 실시예 6에 기술된 방법에 의해 클로닝된 세포주로부터 생산된 본 발명에 따라 제조된 조성물 (레인 4, 5, 6 및 7, 각각 15 ㎍); 선행 기술의 CHO 유래 조성물 Ovitrelle (레인 2, 15 ㎍); 및 임신부로부터 수득한 인간 뇨 유래 제품 Novarel (레인 3, 15 ㎍)에서, rhCG 이소형을 코마시 블루로 염색된 IEF에 의해 검출한 결과를 보여준다. 밴드들은 시알산 분자를 서로 다른 개수로 포함하고 있는 hCG 이소형들을 표시한다. 도 6은, α2,3-시알릴트랜스퍼라제를 함유하도록 조작된 인간 세포 유래의 재조합 hCG (본 발명에 따른 조성물)가 Ovitrelle 및 임신부 유래의 뇨 hCG에 비해 산성이 더 높다는 것을, 보여준다.
도 7은 "최적화된" α 서브유닛을 포함하는 본 발명의 세포를 이용해 (즉, 실시예 1-4에 언급된 방법으로 구축한 세포주를 이용해) 생산된 hCG ("alpha-beta hCG") 및 유리형 β 체인 ("beta hCG")의 농도를, WT (야생형) α 서브유닛을 함유한 비교예 세포에서 생산된 hCG ("alpha-beta hCG") 및 유리형 β 체인 ("beta hCG")의 농도와 비교한 것이다. 도 7은, 본 발명의 세포가 hCG는 다량 발현하고, 유리형 β 서브유닛은 적게 발현한다는 것을 보여준다. 다시 말해, 본 발명의 세포 및 방법에 의해 생산되는 재조합 hCG은 수율 및 순도가 크게 개선되었다.
표 A는, 소수성 페닐-5PW HPLC 크로마토그래피에 의해 측정시, "최적화된" α 서브유닛 ("Opt. alpha hCG")을 포함하는 본 발명의 세포를 이용해 (즉, 실시예 1-4에 언급된 방법으로 구축한 세포주를 이용해) 생산된 다양한 hCG 배치들의 반-정제된 샘플에서의 유리형 β-hCG 서브유닛의 %를, WT (야생형) α 서브유닛 ("WT alpha hCG")을 함유한 비교예 세포에서 생산된 hCG의 반-정제된 샘플에서의 유리형 β-hCG 서브유닛의 %와 비교하여 나타낸 것이다.
표 A는, 본 발명의 세포가, WT α 서브유닛을 포함하는 세포 (64 - 66%)와 비교해, hCG를 다량으로 발현하지만 유리형 β 서브유닛은 오히려 적게 발현 (5.7 - 10.6%)함을 보여준다. 다시 말해, 본 발명의 세포 및 방법에 의해 생산된 재조합 hCG의 수율 및 순도가 크게 개선되었다.
표 A
클론 유리형 β-hCG의 %
(PHE - 5PW)
WT alpha hCG (1G2) 64.1
WT alpha hCG (1G2) 66.0
Opt. alpha hCG (13.8) 5.7
Opt. alpha hCG (29) 7.5
Opt. alpha hCG (29) 6.6
Opt. alpha hCG (29) 10.6
실시예 6 - 생산 및 정제에 대한 개괄
무혈청 배지에서 현탁 배양한 PER.C6 세포에서 재조합 hCG를 생산하기 위한 공정을 개발하였다. 이 공정은 아래에 기술되며, 수종의 hCG-생산 PER.C6 세포주에 적용되었다.
α2,3-시알릴트랜스퍼라제로 형질전환된 클론으로부터 전술한 실시예 1 - 4의 방법을 이용해 재조합 hCG를 제조하였다.
세포는, 세포 밀도 1 x 106 내지 3 x 106 세포/ml에 도달할 때까지 교반 플라스크내 6GRO 배지 (SAFC)에서 배양하였다. 세포를 약 1 x 106 세포/ml의 밀도로 5L 유리 교반 탱크 생물반응조로 옮겼다. 이 생물반응조는 Proper1 배지 (Lonza)를 이용해 관류 방식으로 작동하였다.
이후, 산물 rhCG의 정제는 다양한 한외여과 단계, 음이온 및 양이온 교환 포획 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 가성-친화성 크로마토그래피를 이용해 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 수행하였다.
모든 크로마토그래피 공정에서, 면역반응성 재조합 hCG의 존재는 ELISA (DRG EIA 1469)와 IEF (실시예 5)로 검증하였다.
실시예 7 - 시알산 함량
시알산은 단당류로 간주되는 단백질에 결합된 탄수화물이며, 갈락토스, 만노스, 글로코사민, 갈락토사민 및 푸코스와 같은 다른 단당류와 함께 만들어진다. 본 발명에 따른 정제된 rhCG 상의 총 시알산을 Stanton et. al. (J. Biochem. Biophys. Methods. 30 (1995), 37 - 48)의 방법에 기초한 방법으로 측정하였다.
(실시예 5 및 6의 방법에 의해 생산된) α2,3-시알릴트랜스퍼라제로 변형된 Per.C6 재조합 hCG 샘플에서 시알산 총 함량을 측정하였으며, 그 결과를 아래 표 1에 나타낸다 [단백질 몰수에 대한 시알산 몰수의 비로 표시됨].
실시예 8 - USP에 따른 hCG 생물학적 검정
아래 표 1의 샘플 각각에 대해 hCG 특이 활성을 측정하기 위해 hCG 생물학적 검정을 수행하였다. 활성은 표준물질로서 Ovitrelle을 이용해 USP (USP 모노그래프: 융모막성 고나도트로핀, USPC 오피셜 8/1/09-11/30/09)에 따라 측정하였다. Ovitrelle은 26,000 IU/mg의 생물 활성을 가진다 (Curr Med Res Opin. 2005 Dec; 21(12): 1969 - 76). 허용 한계 (acceptance limit)는 >21,000 IU hCG/mg이었다. α2,3- 시알릴트랜스퍼라제로 조작된 인간 세포주 유래 재조합 hCG 샘플의 생물 활성을 표 1에 나타낸다.
표 1
샘플 1 2 3 4 5 6
시알산 (SA) 함량
(μmol SA/ μmol hCG)		 13 13 13 13 13 15
활성 IU/mg 25363 25009 24904 24623 25645 26623
활성 %
(Ovitrelle 26000 IU/mg)		 97.5 96.2 95.8 94.7 98.6 102.4
샘플 7 8 9 10 11
시알산 (SA) 함량
(μmol SA/ μm hCG)		 14 14 13 13 13
활성 IU/mg 27227 26142 26539 26181 24230
활성 %
(Ovitrelle 26000 IU/mg)		 104.7 100.5 102 101 93.2
상기에 나타낸 바와 같이, 활성은 Ovitrelle과 유사하며, 이 보다 더 높을 수 있다 (예, 샘플 7 참조).
최적화된 hCG alpha
최적화된 hCG α의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 1)
Figure 112017077318200-pct00001
최적화된 hCG α의 단백질 서열
Figure 112017077318200-pct00002
인간 융모막성 고나도트로핀 β 폴리펩타이드
등재번호 NP_000728
hCG β의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 2)
뉴클레오티드 서열
Figure 112017077318200-pct00003
hCG β의 단백질 서열
Figure 112017077318200-pct00004
β-갈락토시드 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 4
등재번호 L23767
ST3GAL4의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 3)
Figure 112017077318200-pct00005
ST3GAL4의 단백질 서열
Figure 112017077318200-pct00006
최적화된 hCG α 체인
최적화된 hCG α 체인의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 4)
Figure 112017077318200-pct00007
최적화된 hCG α 체인의 단백질 서열
Figure 112017077318200-pct00008
hCG α 폴리펩타이드
등재번호 AH007338
hCG α의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 5)
Figure 112017077318200-pct00009
hCG α의 단백질 서열
Figure 112017077318200-pct00010
SEQUENCE LISTING <110> Ferring Pharmaceutical A/S <120> Method of Production of gonadotrophin <130> P/68899.WO01 <150> 15164965.4 <151> 2015-04-24 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 349 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggactact accggaagta cgccgccatc ttcctggtga ccctgagcgt gttcctgcac 60 gtgctgcaca gcgcccctga cgtgcaggac tgccccgagt gcaccctgca ggaaaacccc 120 ttcttcagcc agcctggcgc ccctatcctg cagtgcatgg gctgctgctt cagcagagcc 180 taccccaccc ccctgcggag caagaaaacc atgctggtgc agaaaaacgt gaccagcgag 240 agcacctgct gcgtggccaa gagctacaac cgggtgaccg tgatgggcgg cttcaaggtg 300 gagaaccaca ccgcctgcca ctgcagcacc tgctactacc acaagtcct 349 <210> 2 <211> 498 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggagatgt tccaggggct gctgctgttg ctgctgctga gcatgggcgg gacatgggca 60 tccaaggagc cgcttcggcc acggtgccgc cccatcaatg ccaccctggc tgtggagaag 120 gagggctgcc ccgtgtgcat caccgtcaac accaccatct gtgccggcta ctgccccacc 180 atgacccgcg tgctgcaggg ggtcctgccg gccctgcctc aggtggtgtg caactaccgc 240 gatgtgcgct tcgagtccat ccggctccct ggctgcccgc gcggcgtgaa ccccgtggtc 300 tcctacgccg tggctctcag ctgtcaatgt gcactctgcc gccgcagcac cactgactgc 360 gggggtccca aggaccaccc cttgacctgt gatgaccccc gcttccagga ctcctcttcc 420 tcaaaggccc ctccccccag ccttccaagt ccatcccgac tcccggggcc ctcggacacc 480 ccgatcctcc cacaataa 498 <210> 3 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgtgtcctg caggctggaa gctcctggcc atgttggctc tggtcctggt cgtcatggtg 60 tggtattcca tctcccggga agacaggtac atcgagcttt tttattttcc catcccagag 120 aagaaggagc cgtgcctcca gggtgaggca gagagcaagg cctctaagct ctttggcaac 180 tactcccggg atcagcccat cttcctgcgg cttgaggatt atttctgggt caagacgcca 240 tctgcttacg agctgcccta tgggaccaag gggagtgagg atctgctcct ccgggtgcta 300 gccatcacca gctcctccat ccccaagaac atccagagcc tcaggtgccg ccgctgtgtg 360 gtcgtgggga acgggcaccg gctgcggaac agctcactgg gagatgccat caacaagtac 420 gatgtggtca tcagattgaa caatgcccca gtggctggct atgagggtga cgtgggctcc 480 aagaccacca tgcgtctctt ctaccctgaa tctgcccact tcgaccccaa agtagaaaac 540 aacccagaca cactcctcgt cctggtagct ttcaaggcaa tggacttcca ctggattgag 600 accatcctga gtgataagaa gcgggtgcga aagggtttct ggaaacagcc tcccctcatc 660 tgggatgtca atcctaaaca gattcggatt ctcaacccct tcttcatgga gattgcagct 720 gacaaactgc tgagcctgcc aatgcaacag ccacggaaga ttaagcagaa gcccaccacg 780 ggcctgttgg ccatcacgct ggccctccac ctctgtgact tggtgcacat tgccggcttt 840 ggctacccag acgcctacaa caagaagcag accattcact actatgagca gatcacgctc 900 aagtccatgg cggggtcagg ccataatgtc tcccaagagg ccctggccat taagcggatg 960 ctggagatgg gagctatcaa gaacctcacg tccttctga 999 <210> 4 <211> 277 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gcccctgacg tgcaggactg ccccgagtgc accctgcagg aaaacccctt cttcagccag 60 cctggcgccc ctatcctgca gtgcatgggc tgctgcttca gcagagccta ccccaccccc 120 ctgcggagca agaaaaccat gctggtgcag aaaaacgtga ccagcgagag cacctgctgc 180 gtggccaaga gctacaaccg ggtgaccgtg atgggcggct tcaaggtgga gaaccacacc 240 gcctgccact gcagcacctg ctactaccac aagtcct 277 <210> 5 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat 60 gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca 120 ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca 180 tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag 240 tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg 300 gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a 351 <210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro 20 25 30 Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly 85 90 95 Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His Lys Ser 115 <210> 7 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Met Phe Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly 1 5 10 15 Gly Thr Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile 20 25 30 Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr 35 40 45 Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val 50 55 60 Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val 85 90 95 Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu 100 105 110 Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu 115 120 125 Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro 130 135 140 Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr 145 150 155 160 Pro Ile Leu Pro Gln 165 <210> 8 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Cys Pro Ala Gly Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val Leu 1 5 10 15 Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg Tyr Ile Glu 20 25 30 Leu Phe Tyr Phe Pro Ile Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln Gly 35 40 45 Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp 50 55 60 Gln Pro Ile Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro 65 70 75 80 Ser Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu 85 90 95 Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile Gln 100 105 110 Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu 115 120 125 Arg Asn Ser Ser Leu Gly Asp Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val Ile 130 135 140 Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser 145 150 155 160 Lys Thr Thr Met Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro 165 170 175 Lys Val Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys 180 185 190 Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys Arg 195 200 205 Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val Asn 210 215 220 Pro Lys Gln Ile Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala Ala 225 230 235 240 Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys Gln 245 250 255 Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu Cys 260 265 270 Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn Lys 275 280 285 Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met Ala 290 295 300 Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg Met 305 310 315 320 Leu Glu Met Gly Ala Ile Lys Asn Leu Thr Ser Phe 325 330 <210> 9 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys 20 25 30 Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 35 40 45 Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr 65 70 75 80 Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 <210> 10 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro 20 25 30 Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly 85 90 95 Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His Lys Ser 115 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ccaggatccg ccaccatgtg tcctgcaggc tggaagc 37 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tttttttctt aagtcagaag gacgtgaggt tcttg 35

Claims (12)

  1. 서열번호 1에 따른 핵산 서열, 또는 서열번호 1에 따른 핵산 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  2. 서열번호 4에 따른 핵산 서열, 또는 서열번호 4에 따른 핵산 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 세포로서,
    서열번호 1에 따른 핵산 서열, 서열번호 1의 서열과 96.5% 이상의 상동성을 가진 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 서열과 97% 이상의 상동성을 가진 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
    서열번호 4에 따른 핵산 서열, 서열번호 4의 서열과 96.5% 이상의 상동성을 가진 핵산 서열, 또는 서열번호 4의 서열과 97% 이상의 상동성을 가진 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
    로부터 선택되는, 인간 융모막성 고나토드로핀(human chorionic gonadotrophin; hCG)의 α 체인을 코딩하는 서열의 폴리뉴클레오티드를 게놈에 병합한 상태로 포함하는, 세포.
  6. 제5항에 있어서,
    ECACC no. 96022940로 기탁된, 세포.
  7. 인간 융모막성 고나토드로핀(human chorionic gonadotrophin; hCG)의 α 체인을 코딩하는 서열의 폴리뉴클레오티드를 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함하는, ECACC no. 96022940로 기탁된 세포.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    α-2,3-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 cDNA를 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함하는, 세포.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    hCG의 β 체인을 코딩하는 핵산 서열의 폴리뉴클레오티드를 게놈에 병합한 상태로 추가로 포함하는, 세포.
  10. 세포에서 재조합 인간 융모막성 고나토드로핀(human chorionic gonadotrophin; hCG)의 생산 방법으로서,
    제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포를 적절한 배지에서 배양하는 단계, 및
    상기 세포 및/또는 상기 배지에서 재조합 hCG를 회수하는 단계
    를 포함하는, 세포에서 재조합 hCG의 생산 방법.
  11. 세포에서 재조합 인간 융모막성 고나토드로핀(human chorionic gonadotrophin; hCG)의 생산 방법으로서,
    상기 세포를 적절한 배지에서 배양하는 단계, 및
    상기 세포 및/또는 상기 배지에서 재조합 hCG를 회수하는 단계
    를 포함하며,
    상기 세포는 hCG의 α 체인을 코딩하는 서열의 폴리뉴클레오티드를 게놈에 병합한 상태로 포함하는, ECACC no. 96022940로 기탁된 세포인,
    재조합 hCG의 생산 방법.
  12. 삭제
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