KR102658257B1 - 테트란드린 또는 이의 유사체를 포함하는 코로나바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 테트란드린 또는 이의 유사체인, 팡치놀린 및 세파란틴의 코로나바이러스에 대한 항바이러스 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명은 테트란드린 또는 이의 유사체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스에 대한 항바이러스용 약학 조성물; 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 및 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 테트란드린 및 이의 유사체인, 팡치놀린 및 세파란틴은 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스-2, 및 인간-코로나바이러스와 같은 코로나바이러스의 감염을 억제하는 효과를 나타내므로, 상기 바이러스 질환을 예방 또는 치료를 위한 항바이러스제 개발에 이용될 수 있다.

Description

테트란드린 또는 이의 유사체를 포함하는 코로나바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating coronavirus infection comprising Tetrandrine or its analogues}
본 발명은 테트란드린 또는 이의 유사체인, 팡치놀린 및 세파란틴의 코로나바이러스에 대한 항바이러스 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명은 테트란드린 또는 이의 유사체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스에 대한 항바이러스용 약학 조성물; 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 및 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
코로나 바이러스(coronavirus)는 1937년 닭에서 처음 발견된 뒤 개, 돼지, 조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에게서도 발견되었다. 개기일식 때 태양의 광구가 달에 가려졌을 때 그 둘레에서 하얗게 빛나는 현상인 코로나 현상과 생김새가 비슷하여 이러한 이름이 붙여졌다.
코로나바이러스는 사람과 동물에서 주로 폐렴과 장염을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 간혹 신경계 감염과 간염을 유발하는 것으로도 알려져 있다. 코로나바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는, 약 100-120 nm 크기의 positive sense RNA 바이러스이다. 코로나바이러스는 가장 외각에 있는 spike 단백질 (S), hemagglutinin-esterase (HE) 단백질, transmembrane (M) 단백질, small membrane (E) 단백질 및 nucleocapsid (N) 단백질 등 총 5개의 구조 단백질로 이루어져 있다. 이 중 spike 단백질은 세포 수용체와 결합하는 리간드 역할을 하며, 숙주세포와 바이러스간의 융합을 유도하는 단백질로 가장 변이가 심한 단백질로 알려져 있다.
지금까지 코로나바이러스는 사람에게는 거의 감염되지 않고 주로 개, 돼지, 소 등의 동물에 감염되는 병원균으로 인식되어 왔다. 사람에게 감염될 때에도 호흡기 증상을 유발하는 여러 바이러스 가운데 하나로서 단순한 감기를 유발하거나 어린이에게 위험성이 그리 높지 않은 설사 등의 장 질환을 일으키는 경우가 있을 뿐이었다. 그러나 세계적으로 수백명이 넘는 사망자와 수천여 명의 환자를 발생시킨 중증 급성 호흡기 증후군(사스;SARS)의 원인균, 중동 호흡기 증후군(메르스;MERS), 및 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019; COVID-19)의 원인균이 신종(변종) 코로나바이러스인 것으로 알려지면서 점차적으로 주목받기 시작하였다.
사스는 2002년 11월 중국 남부 광둥(廣東)성에서 발생, 홍콩을 거쳐 세계로 확산된 전염병으로, 갑작스런 발열, 기침 및 호흡곤란이 주 증상이며, 심한 경우 폐렴으로 진행돼 죽음에 이를 수도 있는 질환이다. 전파되는 경로는 아직 완전히 밝혀지지 않았지만 대기 중에 떠다니는 고체나 액체의 미세한 입자에 의해 전파되는 것으로 추측하고 있다. 사스는 2003년 7월까지 유행하였으며, 약 7개월 동안 32개국에서 총 8,096명의 감염자가 발생하고 그 가운데 774명이 사망한 것으로 알려져 있다.
메르스는 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견되었고, 고열, 기침 및 호흡곤란 등 심한 호흡기 증상을 나타내며, 심한 경우 합병증이 동반되면서 사망에 이르기도 하는 질환이다. 명확한 감염원과 감염경로는 확인되지 않았으나, 중동 지역의 낙타와의 접촉을 통해 감염될 가능성이 크고 사람 간 밀접접촉에 의한 전파가 가능하다고 보고되었다. 주로 중동 지역에서 환자가 집중적으로 발생하였다가 2015년 5월부터 우리나라 전역에서 100명이 넘는 감염자가 발생한 바 있다.
COVID-19는 2019년 말 중국 후베이 지방의 수도인 우한에서 처음 확인되어 전세계로 확산되어 진행성 팬데믹을 초래한 질환으로, 사스-코로나바이러스-2에 의해 유발되는 감염성 질환이다. 2020년 5월 7일을 기준으로 3.75백만 케이스 이상이 187개국에서 보고되었고, 사망자는 263천명에 이르며, 1.24백만명이 회복되었다. 보편적인 증상은 발열(fever), 기침(cough), 피로(fatigue), 호흡곤란(shortness of breath) 및 후각 및 미각의 상실이다. 대부분의 경우 증상이 경미하나 몇몇은 바이러스성 폐렴(viral pneumonia), 다중기관부전(multi-organ failure) 및 사이토카인 폭풍(cyrokine storm)으로 진행한다. 증상의 발현으로부터 발병까지의 시간은 일반적으로 약 5일이지만 2 내지 14일 사이일 수 있다. 바이러스는 주로 밀접접촉하는 동안, 때로는 기침, 재채기 및 대화시 발생하는 비말을 통해 사람 간에 전파된다. 증상 발현 후 처음 3일 동안 가장 전염성이 높으며, 증상이 나타나기 전이나 질환의 말기에라도 전파될 수 있다. 이를 진단하는 표준 방법은 비인두 면봉검사(nasopharyngeal swab)로부터의 실시간 역전사 PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction; rRT-PCR)을 이용한다.
다른 인간 병원체로서 인간코로나바이러스는 일반적인 감기(common cold)를 유발하는 것으로 알려져 있다. 이중 인간코로나바이러스-OC43은 가장 보편적인 인간코로나바이러스로서, 상기도감염(upper respiratory tract infection)을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 최근의 연구에 따르면, 다수의 어린이가 2세 이전이 초기에 인간코로나바이러스로 혈청변환(seroconvert)하며, 인간코로나바이러스-OC43이 가장 보편적인 것으로 나타났다. 인간코로나바이러스-OC43 감염은 어린이 또는 노인에서 중증호흡기질환 발병에 관여하는 것으로 나타났으며, 어린이에서 중증하기도질환을 유발하는 것이 확인되었다(Pediatr. Infect. Dis. J., 32(4):325-329).
앞서 언급한대로, 인간코로나바이러스-OC43, 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 및 사스-코로나바이러스-2는 모두 베타 코로나바이러스(Beta coronavirus) 속에 속하는 변종 코로나바이러스로 알려져 있다. 따라서 인간코로나바이러스-OC43, 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 및 사스-코로나바이러스-2는 임상 증상, 병인 및 감염 등에 있어서 일부 유사한 특성을 공유한다. 계통수(phylogenetic tree)에서, 사스-코로나바이러스 및 사스-코로나바이러스-2는 박쥐 사스-유사 코로나바이러스와 다른 박쥐 유래의 코로나바이러스를 포함하는 계통 B(lineage B)에 속하며, 메르스-코로나바이러스는 박쥐 유래의 코로나바이러스를 포함하는 계통 C에 속한다(Trends Microbiol 24:490-502; https://nextstrain.org/groups/blab/sars-like-cov?f_virus_type=SARS-CoV-2). 나아가, 인간코로나바이러스-OC43은 계통 B 및 계통 C 간의 재조합에 의해 형성되는 계통 D에 속한다.
인간코로나바이러스-OC43, 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 및 사스-코로나바이러스-2는 모두 다양한 코로나바이러스의 1차적인 보유 숙주인 박쥐로부터 유래한 것으로 여겨지며(Antiviral Res., 101:45-56), 그 정확한 감염 경로에 대해서는 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 한편, 사향 고양이(palm civet) 및 단봉낙타(dromedary camel)에 대한 상기 바이러스의 종간 전염은 인간에 대해 인수 공통 감염의 가능성을 증가시켰고(Nat. Rev. Microbiol., 14:523-534), 병원 내 감염은 인간과 인간 사이의 메르스-코로나바이러스 및 사스-코로나바이러스 감염의 주된 원인으로 여겨진다(BMC Med., 13:1-12).
한편, 테트란드린, 팡치놀린, 및 세파란틴은 모두 식용으로 사용되거나, 한약재로 쓰이고 있는 식물들로부터 추출, 분리 및 동정된 유사한 화학 구조식을 갖는 화합물들이다. 그러나 상기 테트란드린 및 이의 유사체의 코로나바이러스, 특히, 인간코로나바이러스-OC43, 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 및/또는 사스-코로나바이러스-2 감염질환의 예방, 치료 또는 개선 효과는 알려진 바가 없다.
현재까지 개발된 항바이러스들은 심한 부작용을 나타내고 있으므로, 그 응용에 있어서 많은 주의가 필요하다. 이러한 치료제는 효과적이지 못하며 부작용 또한 나타나고 있는 실정이다. 그러므로 코로나바이러스의 발생을 예방하고 치료하기 위한 감염 억제 효과가 뛰어나고 독성이 적은 우수한 새로운 코로나 바이러스제의 개발의 필요성이 증가하고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은, 신규한 코로나바이러스 치료제를 개발하기 위한 노력을 계속한 결과, 각각 분방기, 댕댕이덩굴 및 함박이로부터 분리한 테트란드린 및 이의 유사체인 팡치놀린 및 세파란틴이 인간코로나바이러스-OC43, 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 및 사스-코로나바이러스-2의 증식을 억제하는 우수한 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 테트란드린, 이의 유사체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 코로나바이러스에 대한 항바이러스용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 테트란드린, 이의 유사체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 테트란드린, 이의 유사체 또는 이들의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 테트란드린, 이의 유사체 또는 이들의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스에 대한 항바이러스용 약학 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
는 또는 이고,
R1은 메틸, R2는 수소 또는 메틸이거나,
R1 및 R2는 이들이 부착된 산소원자와 함께 5원 헤테로사이클을 형성하고,
R3 내지 R6은, 각각 독립적으로, 수소 또는 메톡시이거나,
R3 및 R5 또는 R4 및 R6이 서로 연결되어 -O- 브릿지를 형성함.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시 양태는 상기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 코로나바이러스를 억제하는 효과를 나타내므로, 이를 코로나바이러스 감염이 의심되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 통해 코로나바이러스에 의한 감염질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
상기 코로나바이러스는 인간코로나바이러스-OC43(human coronavirus-OC43; HCoV-OC43), 중동호흡기증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome-related coronavirus; MERS-CoV), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus; SARS-CoV), 또는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2; SARS-CoV-2)일 수 있다.
예컨대, 상기 화학식 1의 화합물은 테트란드린, 팡치놀린 또는 세파란틴일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "테트란드린(tetrandrine)"은 하기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물로서, 분방기(Stephania tetrandra; 粉防己), 구체적으로는 분방기 뿌리 추출물로부터 분리 동정할 수 있다. 상기 분방기는 중국 및 대만에 자생하는 새모래덩굴과(Menispermaceae family)의 다년생 초본 덩굴식물(herbaceous perennial vine)이다. 짧은 목질의 줄기(short, woody caudex)를 타고 자라며 약 3 m 높이까지 오른다. 그 뿌리는 한약재로 사용되기도 한다. 예컨대, 쏘는 맛과 쓴 맛을 가지며, 한약에서 바람과 습기를 제거하여 통증을 완화하고 이뇨를 촉진하는데 사용된다.
[화학식 2]
본 발명의 용어, "팡치놀린(fangchinoline)"은 하기 화학식 3의 구조를 갖는 화합물로서, 댕댕이덩굴(Cocculus orbiculatus), 구체적으로는 댕댕이덩굴 줄기 추출물로부터 분리 동정할 수 있다. 상기 댕댕이덩굴은 목방기속(genus Cocculus) 새모래덩굴과의 식물로, 댕댕이, 댕강넝쿨, 용린, 토고등으로도 불리는 낙엽이 지는 덩굴성 활엽수이다. 한국에서는 주로 산기슭의 양지나 밭둑, 돌 틈에 많으며, 황해도 이남 지역에 분포한다. 열매는 먹을 수 있고, 신 맛과 쓴 맛이 난다.
[화학식 3]
본 발명의 용어, "세파란틴(cepharanthine)"은 하기 화학식 4의 구조를 갖는 화합물로서, 함박이(Stephania japonica), 구체적으로는 함박이 뿌리 추출물로부터 분리 동정할 수 있다. 상기 함박이 함박이속(genus Stephania) 새모래덩굴과의 식물로, 원산지는 한국이며, 한국, 일본, 대만, 중국, 인도 말레이시아 등지에 분포하고, 바닷가나 산기슭에 서식하며, 국내에서는 제주 및 홍도에서 자란다. 가시가 없는 덩굴나무이며, 함바기, 함박이덩굴, 함백이 등으로도 불린다. 뿌리 및 경엽을 천금등(千金藤)이라 하며 약용한다.
[화학식 4]
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 예컨대, 테트란드린, 팡치놀린 또는 세파란틴을 포함하는 조성물은 이들 화합물에서 일부 당업자가 예상 가능한 범위의 유도체가 포함될 수 있으며, 본 발명에서의 동일한 효과가 있는 한 제한 없이 포함된다. 이들 화합물은 이를 포함하는 추출물에서 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 또한, 공지의 방법으로 합성해서 사용 가능하다.
본 발명의 용어, "인간코로나바이러스-OC43(HCoV-OC43)"은 베타코로나바이러스속(genus Betacoronavirus), 코로나비리네아과(subfamily Coronavirinae), 코로나비리네과(family Coronavirinae), 니도비렐리스목(order Nidovirales) 베타코로나바이러스 1 종의 외막형(enveloped) 양성꼬임(positive-stranded) RNA 바이러스의 아종(subspecies)이다. 인간코로나바이러스-OC43 유전자형은 주로 재조합에 의해 발생하는 D형이다. 인간코로나바이러스-OC43은 감기를 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 영아, 노인 및 화학용번 중이거나 HIV-AIDS 보균자와 같이 면역력이 약화된(immunocompromised) 개체에서 폐렴을 포함한 중증하기도감염을 유발할 수 있다.
본 발명의 용어, "메르스-코로나바이러스(MERS-CoV)"는 2012년 9월 24일에 새롭게 발견된 베타 코로나바이러스 속에 속하는 ssRNA 바이러스로, 5'-복제효소-구조 단백질(spikeenvelope-membrane-nucleocapsid)-poly(A)-3'[5'-ORF1a/b-S-E-M-N-poly(A)]의 구조를 갖는다. 메르스-코로나바이러스 게놈은 계통 발생적으로 계통군 A, 계통군 B로 분류되는데, 초기 메르스 사례들은 계통군 A(EMC/2012 and Jordan-N3/2012)였고, 새로 보고된 사례들은 유전적으로 별개인 계통군 B이다(Emerging Infectious Diseases, Vol. 20, No. 6, June 2014).
본 발명의 용어, "사스-코로나바이러스(SARS-CoV)"는 외피를 지닌 베타 코로나바이러스 속에 속하는 ssRNA 바이러스이다. 전체 게놈이 29,727 뉴클레오타이드로 구성되며, 현재까지 알려진 RNA 바이러스 중에서 가장 큰 게놈을 갖는 바이러스이다. 사스-코로나바이러스의 게놈은 11개의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 갖고 있으며 23종에 달하는 단백질을 코딩하고 있는 것으로 알려졌다. 사스-코로나바이러스의 주요 구조 단백질은 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid, N), 스파이크 (spike, S), 멤브레인 (membrane, M), 스몰 엔벨로프 (small envelope, E) 단백질임이 밝혀졌다.
이들 단백질에 대한 염기서열 분석결과, 사스-코로나바이러스가 다른 코로나바이러스와 비교하여 약 40 ~ 50% 정도의 매우 낮은 서열 상동성을 가짐이 밝혀졌다. 코로나바이러스의 항원성에 따른 계통발생학적 분류에 따르면, 사스 코로나바이러스는 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ그룹 중 Ⅱ그룹과 유연관계가 높은 것으로 나타났다.
본 발명의 용어, "사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)"는 호흡기 질환인 코로나바이러스 질환-19(coronavirus disease 2019; COVID-19)를 야기하는 바이러스 균주이다. 국립보건원(National Institutes of Health; NIH)에 의해 공지된 바와 같이, 사스-코로나바이러스(SARS-CoV)의 계승자(successor)이다. SARS-CoV-2는 양성 단일가닥 RNA 바이러스(positive-sense single-stranded RNA virus)이다. 인간에서 전염성이 있으며(contagious), 세계보건기구(World Health Organization; WHO)는 국제적 공중보건 비상사태(Public Health Emergency of International Concern; PHEIC)로 COVID-19의 진행성 팬데믹(ongoing pandemic)을 선언하였다. SARS-CoV-2는 분류학적으로 SARS-CoV의 계통(strain)으로, 동물원성 감염증의 기원(zoonotic origins)을 가지며, 박쥐 코로나바이러스와 근접한 유전적 유사성을 갖는 것으로 간주된다. 상기 SARS-CoV-2는 주로 사람들 간의 긴밀한 접촉을 통해 및/또는 기침이나 재채기시 발생하는 비말을 통해 전파되며, 주로 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(receptor angiotensin converting enzyme 2; ACE2)에 결합하여 인간 세포에 진입한다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 인간코로나바이러스-OC43, 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 및 사스-코로나바이러스-2를 억제하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 테트란드린, 팡치놀린 또는 세파란틴이 인간코로나바이러스-OC43, 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 및 사스-코로나바이러스-2의 감염을 억제능을 확인하고, 이를 양성 대조군 로피나비어와 비교하였다(도 1 내지 6).
본 발명의 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.
본 발명의 용어, "감염질환"은 감염에 의해 발병되는 질환을 의미한다.
상기 용어, "감염"은 병원성 미생물이 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하여, 발육증식한 상태를 의미한다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스에 의한 감염질환의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락틱액시드(Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(poly-L-lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버 등을 포함할 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 특별히 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "화학식 1로 표시되는 화합물", "코로나바이러스", "감염질환" 및 "예방"에 대한 설명은 상기에서 서술한 바와 같다.
또한, 여기서 "식품학적으로 허용 가능한 염"은 상기 "약학적으로 허용 가능한 염"에서 정의된 바와 같다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물, 예컨대, 테트란드린, 팡치놀린 또는 세파란틴은 우수한 코로나바이러스 억제 효과를 나타내므로, 코로나바이러스에 의한 감염질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 포함될 수 있으며, 상기 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 코로나바이러스에 의한 감염의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 용어, "개선"은 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물을 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 그대로 첨가되거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 방부제, 살균제, 산화방지제, 착색제, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 강화제, 유화제, 증점제, 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 코로나바이러스에 의한 감염질환의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 코로나바이러스에 의한 감염질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 식품조성물에 다양한 중량%로 포함될 수 있다. 구체적으로 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "화학식 1로 표시되는 화합물", "식품학적으로 허용 가능한 염", "코로나바이러스", "감염질환", "예방" 및 "개선"에 대한 설명은 상기에서 서술한 바와 같다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 우수한 코로나바이러스 억제 효과를 나타내므로, 코로나바이러스에 의한 감염질환의 예방 또는 개선을 목적으로 사료 조성물에 포함될 수 있으며, 상기 사료 조성물은 동물이 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 코로나바이러스에 의한 감염질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 테트란드린 및 이의 유사체인, 팡치놀린 및 세파란틴은 메르스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스, 사스-코로나바이러스-2, 및 인간-코로나바이러스와 같은 코로나바이러스의 감염을 억제하는 효과를 나타내므로, 상기 바이러스 질환을 예방 또는 치료를 위한 항바이러스제 개발에 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 화합물, 테트란드린, 팡치놀린, 및 세파란틴의 (A) 화학 구조식, (B) MRC-5 세포에서 인간코로나바이러스-OC43 감염 및 상기 화합물에 의한 치료의 개략도, (C) 이들 화합물의 농도에 따른 인간코로나바이러스-OC43(human coronavirus-OC43; HCoV-OC43) 억제 효능 및 (D) 이로부터 계산된 억제농도(inhibitory concentration, IC50) 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 2는 테트란드린, 팡치놀린, 및 세파란틴의 인간코로나바이러스-OC43에 대한 용량 의존적 및 시간 의존적 항바이러스 활성을 나타내는 그래프이다. MRC-5 세포를 인간코로나바이러스-OC43으로 감염시키되, 표시한 농도의 각 화합물을 비처리 또는 MRC-5 세포에 인간코로나바이러스-OC43과 함께 24시간 전-처리, 공-처리 또는 24시간 후-처리하였다.(A)는 MRC-5 세포에 대한 상기 화합물의 처리 시간에 관한 실험 디자인을, (B)는 감염 후 4일에서 MTS-기반 어세이에 의한 세포생존율을 나타낸다.
도 3은 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 시간 경과 어세이(time course assay)를 나타낸다. MRC-5 세포를 5 μM 농도의 각 화합물로 인간코로나바이러스-OC43 감염 전 24시간(pre 24), 12시간(pre 12), 6시간(pre 6), 및 3시간(pre 3), 감염과 동시에(during infection, co), 및 감염 후 12시간(post 12-96), 24시간(post 24-96), 및 48시간(post 48-96)에 처리하였다. (A)는 시간-부가 어세이(time-of-additional assay)에 대한 전체 개략도(파란 선은 투여 기간을 나타냄)를, (B)는 감염 후 4일에서 MTS-기반 어세이에 의한 세포 생존율을 나타낸다.
도 4는 (A) 테트란드린, (B) 팡치놀린, (C) 세파란틴 및 (D) 대조군으로서 로피나이어(Lopinavir)의 농도에 따른 중동호흡기증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome-related coronavirus; MERS-CoV) 억제 효능을 나타내는 그래프이다.
도 5는 (A) 테트란드린, (B) 팡치놀린, (C) 세파란틴 및 (D) 대조군으로서 로피나이어(Lopinavir)의 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus; SARS-CoV)에 대한 용량 의존적 항바이러스 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 (A) 테트란드린, (B) 팡치놀린, (C) 세파란틴 및 (D) 대조군으로서 로피나이어(Lopinavir)의 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2; SARS-CoV-2)에 대한 용량 의존적 항바이러스 활성을 나타내는 그래프이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 화합물의 준비
테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴을 DMSO에 용해시켜 20 mM 농도의 원액으로 -80℃에 보관하고, 실험시 FBS-불포함 배지를 이용하여 원하는 농도로 희석하여 사용하였다.
실시예 1: 인간코로나바이러스-OC43 감염 억제 확인
실시예 1-1: 세포주 및 바이러스 준비
본 발명에 사용한 MRC-5 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, CCL-81; Manassas, VA)을 구매하여 사용하였다. 세포는 10% 열 불활성화 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, WelGENE), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스프렙토마이신(Gibco)이 포함된 minimal essential medium(MEM, Corning)에서 부착배양하였다. 세포를 96-웰 플레이트(Thermo)에 1.5×104 세포 농도로 또는 24-웰 플레이트(Corning)에 8×104 세포 농도로 분주하여 37℃에서 5% 이산화탄소 하에서 배양하였다. 인간코로나바이러스(Human coronavirus; hCo-V, strain; OC43)를 ATCC로부터 구매하였다. 인간코로나바이러스-OC43(1010 copies/mL)을 2% 열 불활성화 FBS, 페니실린(100 U/mL)/스트렙토마이신(100 μg/mL)이 포함된 MEM으로 90% 컨플루언시의 MRC-5에서 33℃, 5% 이산화탄소 하에 증식시켰다. 50% 컨플루언시에 도달하였을 때, 상층액을 회수하고 0.22 μm 실린지 필터로 여과하였다. 여과된 상층액을 분주하여 사용시까지 -80℃에서 동결시켰다.
실시예 1-2: MTS 어세이를 이용한 인간코로나바이러스-OC43 감염 억제 확인
본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 인간코로나바이러스-OC43 감염 억제능을 확인하기 위하여 MTS 어세이를 이용하여 확인하였다.
보다 구체적으로, 96-웰 조직 배양 플레이트에 각 웰당 1.5×104개의 MRC-5 세포를 접종하였다. 이튿날 인간코로나바이러스-OC43으로 감염시키고, 10 mM 농도의 각 화합물을 2배씩 연속으로 희석하여 상기 MRC-5 세포에 처리하였다. 4일 동안 배양한 후, 각 군의 세포 생존율을 MTS 어세이로 측정하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 50%의 저해 농도를 나타내는 IC50은 각각 321.7 nM, 956.7 nM, 및 790.7 M이었고, 50%의 세포 독성을 나타내는 CC50은 모두 ＞10 μM인 것으로 측정되었다.
이를 통해, 본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴이 우수한 인간코로나바이러스-OC43의 감염 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 1-3: 첨가 시간에 따른 어세이
96-웰 조직 배양 플레이트에 각 웰당 1.5×104개의 MRC-5 세포를 접종하였다. 이튿날, 0.2, 1, 및 5 mM 농도의 화합물을 MRC-5 세포에 첨가하였다(전-처리; pre-treatment). 24시간 후, 상기 화합물들을 세척하고 세포를 1×10-3 농도의 인간코로나바이러스-OC43으로 4일 동안 감염시켰다. 이후, MRC-5 세포에 화합물을 감염시키는 동안 첨가하거나(공-처리; co-treatment), 또는 감염 후 24시간에 첨가하였다(후-처리; post-treatment). 추가적으로, 5 μM 농도의 화합물을 감염 전 24시간, 12시간, 6시간 및 3시간에 MRC-5 세포에 첨가하였다(전-처리). MRC-5 세포에 화합물을 감염시키는 동안(공-처리) 또는 감염 후 12시간, 24시간, 및 48시간 후에 첨가(후-처리)하였다. 4일 동안 감염 후, 각 군에 대한 세포 생존률을 MTS 어세이로 결정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 3종 화합물 모두에서 인간코로나바이러스-OC43 감염에 대해 전-처리 또는 공-처리한 경우가 후-처리한 경우에 비해 우수한 감염 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 1-4: 세포 생존률에 대한 MTS 어세이
CellTiter 96® AQueous One Solution 세포 증식 어세이(Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 세포독성을 측정하였다. 구체적으로, 배양된 세포로부터 배지를 회수하고 2% 열 불활성화 FBS, 페니실린(100 U/mL)/스트렙토마이신(100 μg/mL)를 포함하는 90 μL MEM 및 10 μL의 MTS 시약(Promega Corporation, Madison, WI, USA)을 각 웰에 첨가하였다. 2시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 습윤 조건에서 배양한 후, GloMax® Discover 마이크로플레이트 리더(Promega Corporation)를 이용하여 490 nm에서의 광학 밀도를 측정하여 세포 생존률을 산출하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 바이러스를 감염시키지 않은 경우, 어느 시점에 및/또는 어느 시간 동안 처리하더라도 비감염 비처리군에서와 같이 높은 생존율을 유지하였으며, 이는 본 발명에 따른 화합물, 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴이 모두 세포 독성을 나타내지 않음을 나타내는 것이다. 한편, 바이러스 감염군의 경우, 일부 정도의 차이는 있으나, 본 발명의 3종 화합물 모두에서 투여 시점 및/또는 총 투여 시간에 무관하게 비처리 군에 비해 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴 처리군에서 생존율이 향상되었으며, 이는 이들 화합물이 모두 인간코로나바이러스-OC43 감염 예방 및/또는 치료에 효과가 있음을 나타내는 것이다. 구체적으로, 테트란드린 및 팡치놀린 투여군의 경우, 감염 24시간 이전으로부터 공-처리군까지는 비감염군과 유사하게 매우 높은 생존율을 나타내었으며, 이후 감염 이후 화합물 투여시까지의 시간이 증가함에 따라 생존율이 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 상기 화합물들의 처리에 의해 인간코로나바이러스-OC43 감염에 의한 생존율 감소를 저해할 수 있음은 물론 감염 이전에 상기 화합물들을 처리함으로써 매우 우수한 인간코로나바이러스-OC43 감염 예방 효과를 얻을 수 있음을 나타내는 것이다. 한편, 세파란틴의 경우, 선-처리 및 후-처리의 경우 시간의 경과에 따라 다소 생존율 감소를 나타내기는 하나 여전히 우수한 인간코로나바이러스-OC43 감염 예방 및/또는 치료 효과를 나타내었으며, 감염 24시간 전 또는 감염과 동시에 처리시 특히 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 2: 메르스-코로나바이러스 감염 억제 확인
실시예 2-1: 세포주 및 바이러스 준비
본 발명에 사용한 베로 세포(vero cell)는 American Type Culture Collection (ATCC, CCL-81; Manassas, VA)을 구매하여 사용하였으며, L-글루타민 및 1×항생제-항진균제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Welgene, Gyeongsan, Korea)에 담아 24시간 동안 37℃에서 5% 이산화탄소 하에서 배양하였다. 24시간 후, DMSO에 용해시킨 본 발명의 화합물 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴을 농도별로 첨가한 후, 메르스-코로나바이러스로 감염시켰다. 상기 메르스-코로나바이러스로는 한국 분리주(MERS-CoV/KOR/KNIH/002_05_2015, Genbank accession no. KT029139.1 [Kim et al., 2015 doi:10.1128/genomeA.00787-15])를 한국 질병관리본부, 국립보건원으로부터 제공받아, 선행 문헌(Kim et al., 2016 doi:10.1093/cid/ciw239)에 제시된 방법에 따라 vero cell에서 증식하였다. 메르스-코로나바이러스를 사용한 모든 실험은 한국질병관리본부부터 승인 받은 국립보건원의 강화된 생물 안전 등급 3단계 (Biosafety Level 3, BL-3) 봉쇄 절차를 준수한 한국 파스퇴르 연구소에서 수행하였다.
실시예 2-2: 시약준비
로피나비어(Lopinavir; LPV, GP6351)는 Glentham Life Science (UK)에서 구매하였다. 일차항체로 사용된 항-메르스-코로나바이러스 스파이크 항체는 Sino Biological Inc. (Beijing, China)로부터 구매하였으며, 이차항체인 Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 및 세포핵 염색체인 Hoechst 33342는 MolecularProbes/ Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA)에서 구매하였다. 또한, 32% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde; PFA) 수용액과 정상 염소 혈청은 각각 Electron Microscopy Sciences(Hatfield, PA) 및 Vector Laboratories, Inc.(Burlingame, CA)에서 구매하였다.
실시예 2-3: 면역형광 어세이를 이용한 메르스-코로나바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 메르스-코로나바이러스 감염 억제능을 확인하기 위하여 면역형광어세이를 이용하여 확인하였다.
보다 구체적으로, 검은 384-웰 마이크로플레이트에 각 웰당 1.2×104개의 베로 세포를 접종하고, L-글루타민 및 1Х항생제-항진균제를 처리하여 24시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 24시간 후, DMSO에 녹인 본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴을 농도별로 첨가한 뒤, 메르스-코로나바이러스에 감염시켰다. 감염 후 24시간 뒤, PFA로 감염을 고정하고 Alexa Fluor 488 및 Hoechst 33342를 사용하여 염색하고, 염색된 세포는 20× 배율의 형광 이미징 시스템으로 이미지화 하여 감염억제율을 확인하였다. 또한, 양성 대조군으로는 로피나비어를 사용하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 50%의 저해 농도를 나타내는 IC50은 각각 8.72 μM, 7.04 μM, 및 5.25 μM이었고, 50%의 세포 독성을 나타내는 CC50은 24.02 μM, 45.81 μM 및 12.59 μM인 것으로 측정되었다(각각 도 4(A), 4(B) 및 4(C)로부터 산출). 또한, 대조군인 로피나비어의 50%의 저해 농도를 나타내는 IC50은 16.29 μM이었고, 50%의 세포 독성을 나타내는 CC50은 >50 μM인 것으로 측정되었다(도 4(D)로부터 산출).
이를 통해, 본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴이 양성 대조군에 비해 현저히 우수한 메르스-코로나바이러스의 감염 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3: 사스-코로나바이러스 감염 억제 확인
실시예 3-1: 세포주 및 바이러스 준비
본 발명에 사용한 베로E6 세포(VeroE6 cell)는 American Type Culture Collection(ATCC, CCL-81, CRL-1586; Manassas, VA)으로부터 구매하여 사용하였으며, 10% 열 불활성화 소태아혈청 및 1×항생제-항진균제가 포함된 DMEM에 담아 37℃에서 5% 이산화탄소 하에서 배양하였다. 사스-코로나바이러스 HK39849를 홍콩대학교의 말릭 패리스 박사님으로부터 제공받아 Peiris JS et al., 2003 doi: 10.1016/s0140-6736(03)13077-2 (PMID : 12711465)에 제시된 방법에 따라 베로 E6 세포에서 증식시켰다. 사스-코로나바이러스를 사용한 모든 실험은 한국질병관리본부부터 승인 받은 국립보건원의 강화된 생물 안전 등급 3단계 (Biosafety Level 3, BL-3) 봉쇄 절차를 준수한 한국 파스퇴르 연구소에서 수행하였다.
실시예 3-2: 시약 준비
로피나비어 (LPV; GP6351)는 Glentham Life Science (UK)에서 구매하였다. 일차 항체로 사용된 항-사스-코로나바이러스 스파이크 항체는 Sino Biological Inc.(Beijing, China)로부터 구매하였으며, 이차항체인 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG 및 세포핵 염색체인 Hoechst 33342는 MolecularProbes/ Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA)에서 구매하였다. 또한, 32% PFA 수용액과 정상염소 혈청은 각각 Electron Microscopy Sciences(Hatfield, PA) 및 Vector Laboratories, Inc.(Burlingame, CA)에서 구매하였다.
실시예 3-3: 면역형광어세이를 이용한 사스-코로나바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 사스-코로나바이러스 억제능을 확인하기 위하여 면역형광어세이를 이용하여 확인하였다.
보다 구체적으로, 검은 384-웰 마이크로플레이트에 각 웰당 1.2×104개의 베로 E6 세포를 접종하고 소태아혈청 및 1×항생제-항진균제를 처리하여 24시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 2% DMEM에 녹인 본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴을 농도별로 첨가한 뒤, 사스-코로나바이러스에 감염시켰다. 감염 후 24시간 뒤, PFA로 감염을 고정하고 Alexa Fluor 488 및 Hoechst 33342를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포는 20× 배율의 형광 이미징 시스템으로 이미지화 하여 감염억제율을 확인하였다. 또한, 양성 대조군으로는 로피나비어를 사용하였다.
그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 50%의 저해 농도를 나타내는 IC50은 각각 2.57 μM, 3.15 μM, 및 1.86 μM이었고, 50%의 세포 독성을 나타내는 CC50은 14.14 μM, 20.29 μM 및 11.73 μM인 것으로 측정되었다(각각 도 5(A), 5(B) 및 5(C)로부터 산출). 또한, 대조군인 로피나비어의 50%의 저해 농도를 나타내는 IC50은 16.7 μM이었고, 50%의 세포 독성을 나타내는 CC50은 >50 μM인 것으로 측정되었다(도 5(D)로부터 산출).
이를 통해, 본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴이 양성 대조군에 비해 현저히 우수한 사스-코로나바이러스 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 4: 사스-코로나바이러스-2 감염 억제 확인
실시예 4-1: 세포주 및 바이러스 준비
본 발명에 사용한 베로 세포(Vero cell)는 American Type Culture Collection(ATCC, CCL-81, Manassas, VA)으로부터 구매하여 사용하였으며, 10% 열 불활성화 소태아혈청 및 1×항생제-항진균제(Gibco)가 포함된 DMEM에 담아 37℃에서 5% 이산화탄소 하에서 배양하였다. 사스-코로나바이러스-2(βCoV/KOR/KCDC03/2020)를 한국질병관리본부(Korea Centers for Disease Control and Prevention; KCDC)로부터 제공받아 베로 세포에서 증식시켰다. 바이러스 역가는 베로 세포에서 플라크 어세이에 의해 결정되었다. 사스-코로나바이러스-2를 사용한 모든 실험은 한국질병관리본부부터 승인 받은 국립보건원의 강화된 생물 안전 등급 3단계 (Biosafety Level 3, BL-3) 봉쇄 절차를 준수한 한국 파스퇴르 연구소에서 수행하였다.
실시예 4-2: 시약 준비
로피나비어 (LPV; S1380)는 SelleckChem(Houston, TX)에서 구매하여, 선별을 위해 DMSO에 용해시켰다. 항-사스-코로나바이러스-2 N 단백질 항체는 Sino Biological Inc.(Beijing, China)로부터 구매하였다. Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) 이차 항체 및 Hoechst 33342는 MolecularProbes에서 구매하였다. 또한, 32% PFA 수용액과 정상염소 혈청은 각각 Electron Microscopy Sciences(Hatfield, PA) 및 Vector Laboratories, Inc.(Burlingame, CA)에서 구매하였다.
실시예 4-3: 면역형광어세이를 이용한 사스-코로나바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 사스-코로나바이러스-2 억제능을 확인하기 위하여 면역형광어세이를 이용하여 확인하였다.
각 시료에 대해 10 포인트 용량 반응 곡선(dose-response curves; DRCs)을 작성하였다. 구체적으로, 검은 색, 384-웰, μClear 플레이트(Greiner Bio-One)에 각 웰당 1.2×104개의 베로 세포를 접종하고 실험에 앞서 24시간 동안 2% 소태아혈청 및 1×항생제-항진균제를 포함하는 DMEM에 배양하였다. 0.05 내지 50 μM의 화합물 농도 범위에서 10 포인트 DRCs를 작성하였다. 바이러스 감염을 위해, 플레이트를 BSL-3 수용 시설로 옮기고, 사스-코로나바이러스-2를 0.0125의 감염다중도(multiplicity of infection; MOI)로 첨가하였다. 감염 후 24시간 뒤(24 hpi), 4% PFA로 세포를 고정하고, 면역형광으로 분석하였다. 세포 수 및 감염율(infection ratio)을 정량하기 위하여, 자체 개발한(in-house) 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 분석하였으며, 항-바이러스 활성은 각 어세이 플레이트에서 양성(mock) 및 음성(0.5% DMSO) 대조군에 대해 XLfit 4 소프트웨어 또는 프리즘 7을 사용하여 다음의 방정식으로 정상화하였다:
Figure 112023012717029-pat00008
.
상기 IC50 값은 정상화된 활성 데이터 세트-최적화된 곡선으로부터 계산되었다. 모든 IC50 및 CC50 값은 중복하여 측정하고, 각 어세이의 퀄리티는 Z'-인자와 변동계수 백분율(coefficient of variation in percent; %CV)로 조절하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴의 50%의 저해 농도를 나타내는 IC50은 각각 2.68 μM, 5.17 μM, 및 2.18 μM이었고, 50%의 세포 독성을 나타내는 CC50은 16.47 μM, 28.87 μM 및 32.81 μM인 것으로 측정되었다(각각 도 6(A), 6(B) 및 6(C)로부터 산출). 또한, 대조군인 로피나비어의 50%의 저해 농도를 나타내는 IC50은 13.00 μM이었고, 50%의 세포 독성을 나타내는 CC50은 >50 μM인 것으로 측정되었다(도 6(D)로부터 산출).
이를 통해, 본 발명의 테트란드린, 팡치놀린 및 세파란틴이 양성 대조군에 비해 현저히 우수한 사스-코로나바이러스-2 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus; SARS-CoV), 또는 SARS-CoV-2에 대한 항바이러스용 약학 조성물:
    [화학식 3]
    .
  2. 삭제
  3. 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV, 또는 SARS-CoV-2 감염질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 3]
    .
  4. 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV, 또는 SARS-CoV-2 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
    [화학식 3]
    .
  5. 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV, 또는 SARS-CoV-2 감염질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물:
    [화학식 3]
    .
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