KR102654146B1 - Composition for controlling plant fungus disease comprising culture solution of Bacillus velezensis CE 100 or extract thereof, manufacturing methods thereof and controlling method for plant fungus disease - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 CE 100의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 진균병 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 배양액 또는 이의 추출물을 처리하였을 때 항진균 활성이 월등히 우수하므로, 식물 진균병의 방제에 이용할 수 있다.The present invention relates to a composition for controlling plant fungal diseases comprising a culture medium of Bacillus belegensis CE 100 or an extract thereof, a method for producing the same, and a method for controlling plant fungal diseases, wherein the antifungal activity is significantly greater when the culture medium or extract thereof is treated. Because it is excellent, it can be used to control plant fungal diseases.
Description
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물 진균병 방제방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for controlling plant fungal diseases comprising a culture medium of Bacillus belegensis CE 100 strain or an extract thereof, a method for producing the same, and a method for controlling plant fungal diseases.
식물병원성 진균은 식물 내부 또는 표면에 정착하여 식물의 영양분을 빼앗아 번식하며, 전 세계적으로 다양한 야채와 작물에 있어서 심각한 피해를 일으키고 있다. 진균에 의한 식물병은 과거 식물병에 의한 심각한 피해사례 33개 중에서 17개가 진균에 의한 것으로 나타날 정도로 다른 병원균에 비해 다양하고 피해정도가 크다.Phytopathogenic fungi settle inside or on the surface of plants and multiply by depriving the plants of their nutrients, causing serious damage to various vegetables and crops around the world. Plant diseases caused by fungi are more diverse and cause greater damage than other pathogens, with 17 out of 33 cases of serious damage caused by plant diseases in the past being caused by fungi.
식물병원성 진균에 의한 식물 진균병은 많은 식물병원성 진균이 과도할 정도로 많은 수의 포자를 효율적으로, 지속적으로 만들어 건전한 다른 식물체를 감염시키며, 감염 후 기주에서 포자 생산에 걸리는 시간이 짧고 포자의 이동성 또한 좋아 전염성이 높으며, 기주의 영양분을 탈취하는 능력이 좋고 기주에 해로운 독성 물질이나 효소를 분비하기도 하기 때문에 방제가 매우 어렵다. 이러한 특징으로 인하여 지속적인 방제 노력에도 불구하고 식물 진균병은 해마다 기주식물에 막대한 경제적 피해를 유발하고 있는 실정이다.Plant fungal diseases caused by phytopathogenic fungi efficiently and continuously produce an excessive number of spores to infect other healthy plants, and the time required for spore production in the host after infection is short and the mobility of the spores is also low. It is highly contagious, has a good ability to deprive the host of nutrients, and also secretes toxic substances or enzymes that are harmful to the host, making it very difficult to control. Due to these characteristics, despite continuous control efforts, plant fungal diseases cause enormous economic damage to host plants every year.
지난 수십년 동안 식물 진균병을 방제하기 위하여 화학적 살균제를 사용하여 왔으나, 이들의 반복적인 사용과 사용량 오남용으로 인하여 토양과 주변수를 포함한 환경의 오염, 유용 미생물의 감소, 잔류 독성 및 저항성 균주의 발생이라는 심각한 문제들을 유발하였다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하고자 화학농약을 대체할 수 있는 미생물 및 미생물 유래 천연물질을 이용한 친환경 살균제가 대안으로 제시되었고 관련 연구들이 현재까지 활발하게 진행되고 있다.Chemical fungicides have been used to control plant fungal diseases for the past several decades, but their repeated use and misuse have led to contamination of the environment, including soil and surrounding water, reduction of useful microorganisms, and occurrence of residual toxicity and resistant strains. caused serious problems. Therefore, to solve these problems, eco-friendly disinfectants using microorganisms and natural substances derived from microorganisms that can replace chemical pesticides have been proposed as an alternative, and related research is actively underway to this day.
항생제를 생성하는 박테리아는 분해가 용이하고 독성 잔류물이 남지 않는다는 점에서 화학 살생물제에 비해 많은 이점이 있으며, 최근 식물 질병 제어에서 널리 활용되고 있다. 특히, 바실러스 (Bacillus) 종은 광범위한 식물병원체를 광범위하게 억제한다고 알려져 있다. 최근 여러 연구에서 B.velezensis가 Botrytis cinerea, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, F.solani, Magnaporthe oryzae 및 Ralstonia solanacearum을 포함한 많은 병원성 진균에 대한 효과적인 항진균제임을 보고한 바 있다.Antibiotic-producing bacteria have many advantages over chemical biocides in that they are easy to decompose and do not leave toxic residues, and have recently been widely used in plant disease control. In particular, Bacillus species are known to broadly inhibit a wide range of plant pathogens. Several recent studies have reported that B.velezensis is an effective antifungal agent against many pathogenic fungi, including Botrytis cinerea , Fusarium verticillioides , Fusarium oxysporum , F.solani , Magnaporthe oryzae , and Ralstonia solanacearum .
한편, 바실러스 종에 의해 합성된 고리형 리포펩티드는 식물 보호를 위한 여러 식물 병원체의 억제에 대한 유망한 성능으로 인해 잠재적인 생물 제어 제품이다. 서팩틴 (Surfactin), 이투린 (iturin) 및 펀지신 (fengycin)과 같은 리포펙타이드 (lipopeptide)는 바실러스 종에서 유래한 주요 생리 활성 화합물이며 기공 형성 및 이온 누출에 의한 삼투 교란, 지질층과의 상호작용, 세포막의 구조적 변형, 막 완전성의 방해, 파괴 및 기공 형성과의 가용화를 통해 주로 표적 병원체의 세포막을 공격한다. 그러나 가장 작은 고리형 디펩티드의 항진균 활성에 대한 연구는 제한적이다. Meanwhile, cyclic lipopeptides synthesized by Bacillus species are potential biocontrol products due to their promising performance in the inhibition of several plant pathogens for plant protection. Lipopeptides, such as surfactin, iturin and fengycin, are major bioactive compounds derived from Bacillus species and are responsible for osmotic disturbances by pore formation and ion leakage, and interaction with lipid layers. It primarily attacks the cell membrane of target pathogens through its action, structural modification of the cell membrane, disruption of membrane integrity, destruction and solubilization with pore formation. However, studies on the antifungal activity of the smallest cyclic dipeptides are limited.
진균 병원체는 식물의 형태, 기능 및 보전을 부분적 또는 전체적으로 손상시키며, 특히, 콜레토트리쿰 (Colletotrichum)종은 다양한 열대 및 아열대 과일 및 채소 작물에서 진균병인 탄저병을 유발한다. 많은 콜레토트리쿰 종은 종자 매개 병원체로 문서화되었으며, 죽은 식물 잔류물에 존재하는 것이 감염을 위한 접종원의 주요 원천이다. 콜레토트리쿰 종은 포자 형태의 물 튀김 및 강우를 통해 쉽게 퍼질 수 있으며, 자낭포자 형태로 공기를 통해 전달할 수 있다. 감염은 식물 표면에 포자가 부착되며, 포자를 발아시키고 식물의 표피와 표피층을 관통하여 부착기 (appressirium)을 형성한다. 다른 수확 후 진균 병원체와 마찬가지로 콜레토트리쿰 종의 잠복성 또는 잠복성 감염이 수확 후 막대한 손실의 주요 원인이 된다.Fungal pathogens partially or completely damage the form, function and integrity of plants, and in particular, Colletotrichum species cause anthracnose, a fungal disease in various tropical and subtropical fruit and vegetable crops. Many Coletotrichum species have been documented as seed-borne pathogens, and the presence of dead plant residues is a major source of inoculum for infection. Colletotrichum species can be easily spread through water splash and rainfall in the form of spores, and can be transmitted through the air in the form of ascospores. Infection is caused by spores attaching to the plant surface, which germinate and penetrate the epidermis and epidermal layers of the plant, forming an appressirium. As with other postharvest fungal pathogens, latent or latent infections with Colletotrichum species are a major cause of significant postharvest losses.
일반적인 탄저병 증상은 감염 부위에 황갈색 또는 연어색의 포자 덩어리가 형성되는 함몰 및 괴사 병변이며, 통상 만코제브 (mancozeb), 베노밀 (benomyl), 마네브 (maneb), 클로로탈로닐 (chlorothalonil)과 같은 화학 살균제는 탄저병 작물 피해를 방지하기 위해 일반적으로 사용되어 왔다. 이러한 살균제의 빈번한 사용과 고용량은 살균제 내성균주의 출현을 유발하고, 토양 및 물을 오염시킬 수 있다. 건강에 대한 관심이 증가하고 길항미생물 및 그 활성 물질의 성능에 대한 최근 관심은 화학적 방제에 환경 친화적인 생물학적 방제 방법으로의 전환을 이끌고 있다.Common anthrax symptoms are depressed and necrotic lesions with tan or salmon-colored spore masses forming at the site of infection, usually treated with chemicals such as mancozeb, benomyl, maneb, or chlorothalonil. Fungicides have been commonly used to prevent anthracnose crop damage. Frequent use and high doses of these disinfectants can cause the emergence of fungicide-resistant strains and contaminate soil and water. Increasing health concerns and recent interest in the performance of antagonistic microorganisms and their active substances are leading to a shift from chemical control to environmentally friendly biological control methods.
여러 길항균주 중에서 Bacillus속은 식물 생장촉진의 높은 자극뿐만 아니라 여러 가지 항균 대사산물을 분비하여 식물병원성 미생물에 대한 억제작용을 하여 효과적인 생물방제를 위한 대표적인 군으로 잘 알려져 있다. Bacillus속은 토양, 물, 식물, 동물 등 자연계에 널리 분포하며 극한의 온도와 pH를 포함한 광범위한 스트레스 조건에서 내성이 있다. 내성은 장기간 동안 내생포자라고 하는 휴먼 구조의 변형을 통해 발생한다. 이러한 고유한 특성으로 인해 Bacillus속 기반 제품은 세균 및 곰팡이 식물병원체의 방제를 위한 생물 방제 시장에서 상업화되고 있는 추세이다. 이에, 식물병원 진균병을 방제하기 위한 천연물 농약과 합성 농약을 개발하기 위해 Bacillus속 기반의 신규 물질의 발굴이 절실히 필요한 실정이다.Among various antagonistic strains, the genus Bacillus is well known as a representative group for effective biological control not only by highly stimulating plant growth but also by secreting various antibacterial metabolites to suppress plant pathogenic microorganisms. The genus Bacillus is widely distributed in the natural world, including soil, water, plants, and animals, and is resistant to a wide range of stress conditions, including extreme temperatures and pH. Resistance develops over long periods of time through modification of human structures called endospores. Due to these unique characteristics, products based on the genus Bacillus are being commercialized in the biological control market for the control of bacterial and fungal plant pathogens. Accordingly, there is an urgent need to discover new substances based on the Bacillus genus to develop natural pesticides and synthetic pesticides to control plant pathogenic fungal diseases.
이에 본 발명자들은 발명은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 식물 진균병 원인균에 처리하였을 때 항진균 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.Accordingly, the present inventors have confirmed that the antifungal activity of the Bacillus belegensis CE 100 strain or its extract is significantly superior when treated with the causative agent of plant fungal disease.
이에, 본 발명의 목적은 항진균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 제공하는 것이다.Accordingly, the purpose of the present invention is to provide Bacillus velezensis CE 100 strain having antifungal activity.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for controlling plant fungal diseases comprising a culture medium of Bacillus belegensis CE 100 strain or an extract thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a composition for controlling plant fungal diseases, including a culturing step of culturing the Bacillus belegensis CE 100 strain.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 진균병 방제 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for controlling plant fungal diseases, which includes a step of treating a culture medium of Bacillus velegensis CE 100 strain or an extract thereof with a composition.
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주, 균주의 배양액 또는 추출물을 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물, 이의 제조방법, 및 식물 진균병 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 식물 진균병 방제용 조성물은 식물 진균병 원인균에 처리하였을 때 우수한 항균 활성을 나타낸다.The present invention relates to a composition for controlling plant fungal diseases comprising the Bacillus velezensis CE 100 strain, a culture medium or extract of the strain, a method for producing the same, and a method for controlling plant fungal diseases. The plant fungus according to the present invention The composition for disease control exhibits excellent antibacterial activity when treated against the causative bacteria of plant fungal diseases.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태는 항진균 활성을 갖는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to Bacillus velezensis CE 100 strain having antifungal activity.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 수탁번호 KACC 81101BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주인 것일 수 있다.In the present invention, the Bacillus belegensis CE 100 strain may be the Bacillus belegensis CE 100 strain deposited under the accession number KACC 81101BP.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 국립농업과학원미생물은행 KACC (Korean Agricultural Culture Collection; KACC)에 2019년 07월 31일자 수탁번호 KACC 81101BP로 기탁되었다.In the present invention, the Bacillus belegensis CE 100 strain was deposited at the Korean Agricultural Culture Collection (KACC), the National Academy of Agricultural Sciences' Microbial Bank, under accession number KACC 81101BP on July 31, 2019.
본 발명의 다른 일 양태는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a composition for controlling plant fungal diseases comprising a culture medium of Bacillus velezensis CE 100 strain or an extract thereof.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 수탁번호 KACC 81101BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주인 것일 수 있다.In the present invention, the Bacillus belegensis CE 100 strain may be the Bacillus belegensis CE 100 strain deposited under the accession number KACC 81101BP.
본 명세서상의 용어 “배양액”은 미생물을 배양한 후, 상기 미생물을 포함한 것을 의미한다.The term “culture medium” in this specification refers to containing microorganisms after culturing them.
본 명세서상의 용어 “추출물”은 균주의 배양액에서 분리한 것을 의미하며, 추출물은 분획물을 포함한다.The term “extract” in this specification refers to separation from the culture medium of the strain, and extract includes fractions.
본 명세서상의 용어 “추출물”은 균주의 배양액에서 분리한 것을 의미하며, 추출물은 배양여액을 포함한다.The term “extract” in this specification refers to something isolated from the culture medium of the strain, and extract includes the culture filtrate.
본 명세서상의 용어 “배양여액”은 원심분리 및 여과를 수행함으로써 배양액으로부터 균체를 여과하여 제거한 뒤에 남은 액체를 의미한다. 배양여액은 미생물이 자라는 과정에서 형성하여 배출한 물질들이 포함되어 있어서 그 물질을 정제하거나 추출할 수 있다.The term “culture filtrate” in this specification refers to the liquid remaining after filtering and removing bacterial cells from the culture medium by performing centrifugation and filtration. Culture filtrate contains substances formed and excreted during the growth of microorganisms, so the substances can be purified or extracted.
본 발명에 있어서 배양여액은 원심분리 및 여과를 수행함으로써 배양액으로부터 진균을 제거한 것을 의미한다.In the present invention, culture filtrate means removing fungi from the culture solution by centrifugation and filtration.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 콜레토르리쿰 아큐타텀 (Colletotrichum acutatum), 콜레토르리쿰 글로에스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토르리쿰 데마튬 (Colletotrichum dematium), 콜레토르리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 알테르나리아 포리 (Alternaria porri), 알테르나리아 솔라니 (Alternaria solani), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 실린드로카폰 데스트럭탄트 (Cylindrocarpon destructans), 디아포르테 시트리 (Diaporthe citri), 엘시노에 포세티 (Elsinoe fawcettii), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 글로멜라 신귤레이트 (Glomella cingulate), 모닐리니아 프룩티콜라 (Monilinia fructicola), 파이토프소라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프소라 캡시카 (Phytophthora capsica), 파이토프소라 인페스탄스 (Phytophthora infestans), 파이토프소라 니코티아네 (Phytophthora nicotianae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctoina solani), 스클레오티엄 세피보럼 (Sclerotium cepivorum), 스클레오티니아 마이너 (Sclerotinia minor) 및 스클레오티니아 스클레로티오럼 (Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 원인균으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, plant fungal diseases include Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloeosporioides , Colletotrichum dematium , and Colletotrichum coccodes. , Alternaria porri, Alternaria solani , Botrytis cinerea , Cylindrocarpon destructans , Diaporthe citri , Elsino. Elsinoe fawcettii , Fusarium graminearum , Fusarium oxysporum , Fusarium solani, Glomella cingulate, monilinia ph. Monilinia fructicola , Phytophthora cactorum, Phytophthora capsica, Phytophthora infestans, Phytophthora nicotianae , Rye One species selected from the group consisting of Rhizoctoina solani, Sclerotium cepivorum, Sclerotinia minor and Sclerotinia sclerotiorum The abnormality may be caused by the causative bacteria, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 탄저병, 검은무늬병, 겹둥근무늬병, 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 잿빛무늬병, 균핵병, 붉은곰팡이병, 시들음병, 역병, 잘록병, 흰가루병, 줄기마름병 및 더뎅이병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, plant fungal diseases include anthracnose, black spot, double round spot, gray mold, root rot, gray spot, sclerotia, red mold, wilt, late blight, green spot, powdery mildew, stem blight, and dieback. It may be one or more types selected from the group consisting of, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 식물 진균병 방제용 조성물은 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프로릴)(Cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl))를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the composition for controlling plant fungal diseases may include Cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl), but is not limited thereto. .
본 발명에 있어서 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프로릴)은 분자량이 244이며, 분자식이 C14H16N2O2 이다.In the present invention, cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl) has a molecular weight of 244 and a molecular formula of C 14 H 16 N 2 O 2 .
본 발명에 있어서 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프로릴)는 하기의 화학식 I을 갖는다.In the present invention, cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl) has the following formula (I).
[화학식 I][Formula I]
본 발명에 있어서 식물 진균병 방제용 조성물은 첨가제, 증량제, 영양제 또는 봉해제 등의 부가제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the composition for controlling plant fungal diseases may further include additives such as additives, extenders, nutrients, or sealing agents, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 첨가제는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the additives are polycarboxylate, sodium lignosulfonate, calcium lignosulfonate, sodium dialkyl sulfosuccinate, sodium alkyl aryl sulfonate, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, sodium tripolyphosphate, polyoxyethylene. The group consisting of alkyl aryl phosphoric esters, polyoxyethylene alkyl aryl ethers, polyoxyethylene alkyl aryl polymers, polyoxyalkylone alkyl phenyl ethers, polyoxyethylene nonyl phenyl ethers, sodium sulfonate naphthalene formaldehyde, Triton 100 and Tween 80. It may include one or more types selected from, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 증량제는 벤토나이트 (bentonite), 탈크 (talc), 다이아라이트 (dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the extender may include one or more selected from the group consisting of bentonite, talc, dialite, kaolin, and calcium carbonate. It is not limited.
본 발명에 있어서 영양제는 스킴 밀크 (skim milk, 배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트 (bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the nutritional agent may include one or more selected from the group consisting of skim milk, soybean flour, rice, wheat, red clay, diatomaceous earth, bentonite, dextrin, glucose, and starch. , but is not limited to this.
본 발명의 또 다른 양태는 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프로릴)(Cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl))를 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a composition for controlling plant fungal diseases comprising Cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl).
본 발명에 있어서 식물 진균병은 콜레토르리쿰 아큐타텀 (Colletotrichum acutatum), 콜레토르리쿰 글로에스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토르리쿰 데마튬 (Colletotrichum dematium), 콜레토르리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 알테르나리아 포리 (Alternaria porri), 알테르나리아 솔라니 (Alternaria solani), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 실린드로카폰 데스트럭탄트 (Cylindrocarpon destructans), 디아포르테 시트리 (Diaporthe citri), 엘시노에 포세티 (Elsinoe fawcettii), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 글로멜라 신귤레이트 (Glomella cingulate), 모닐리니아 프룩티콜라 (Monilinia fructicola), 파이토프소라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프소라 캡시카 (Phytophthora capsica), 파이토프소라 인페스탄스 (Phytophthora infestans), 파이토프소라 니코티아네 (Phytophthora nicotianae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctoina solani), 스클레오티엄 세피보럼 (Sclerotium cepivorum), 스클레오티니아 마이너 (Sclerotinia minor) 및 스클레오티니아 스클레로티오럼 (Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 원인균으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, plant fungal diseases include Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloeosporioides , Colletotrichum dematium , and Colletotrichum coccodes. , Alternaria porri, Alternaria solani , Botrytis cinerea , Cylindrocarpon destructans , Diaporthe citri , Elsino. Elsinoe fawcettii , Fusarium graminearum , Fusarium oxysporum , Fusarium solani, Glomella cingulate, monilinia ph. Monilinia fructicola , Phytophthora cactorum, Phytophthora capsica, Phytophthora infestans, Phytophthora nicotianae , Rye One species selected from the group consisting of Rhizoctoina solani, Sclerotium cepivorum, Sclerotinia minor and Sclerotinia sclerotiorum The abnormality may be caused by the causative bacteria, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 탄저병, 검은무늬병, 겹둥근무늬병, 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 잿빛무늬병, 균핵병, 붉은곰팡이병, 시들음병, 역병, 잘록병, 흰가루병, 줄기마름병 및 더뎅이병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, plant fungal diseases include anthracnose, black spot, double round spot, gray mold, root rot, gray spot, sclerotia, red mold, wilt, late blight, green spot, powdery mildew, stem blight, and dieback. It may be one or more types selected from the group consisting of, but is not limited to this.
본 발명의 또 다른 양태는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for producing a composition for controlling plant fungal diseases, including a culturing step of culturing Bacillus velezensis CE 100 strain to prepare a culture solution.
본 발명에 있어서 배양 단계는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 배양하여 배양액을 얻는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the culturing step may be obtaining a culture medium by culturing Bacillus velezensis CE 100 strain, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 배양 단계는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 트립톤 소이 브로스 (Tryptone Soy Broth; TSB) 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the culturing step may include culturing the Bacillus velezensis CE 100 strain in Tryptone Soy Broth (TSB) medium, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 배양 단계는 10 내지 50 ℃, 10 내지 45 ℃, 10 내지 40 ℃, 10 내지 35 ℃, 10 내지 30 ℃, 15 내지 50 ℃, 15 내지 45 ℃, 15 내지 40 ℃, 15 내지 35 ℃, 15 내지 30 ℃, 20 내지 50 ℃, 20 내지 45 ℃, 20 내지 40℃, 20 내지 35 ℃, 20 내지 30 ℃, 25 내지 50 ℃, 25 내지 45 ℃, 25 내지 40 ℃, 25 내지 35 ℃, 25 내지 30 ℃, 예를 들어 30 ℃로 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the culturing step is 10 to 50 ℃, 10 to 45 ℃, 10 to 40 ℃, 10 to 35 ℃, 10 to 30 ℃, 15 to 50 ℃, 15 to 45 ℃, 15 to 40 ℃, 15 to 35 ℃ ℃, 15 to 30 ℃, 20 to 50 ℃, 20 to 45 ℃, 20 to 40 ℃, 20 to 35 ℃, 20 to 30 ℃, 25 to 50 ℃, 25 to 45 ℃, 25 to 40 ℃, 25 to 35 ℃ ℃, 25 to 30 ℃, for example, may include culturing at 30 ℃, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 배양 단계는 80 내지 150 rpm, 80 내지 145 rpm, 80 내지 140 rpm, 80 내지 135 rpm, 80 내지 130 rpm, 80 내지 125 rpm, 80 내지 120 rpm, 85 내지 150 rpm, 85 내지 145 rpm, 85 내지 140 rpm, 85 내지 135 rpm, 85 내지 130 rpm, 85 내지 125 rpm, 85 내지 120 rpm, 90 내지 150 rpm, 90 내지 145 rpm, 90 내지 140 rpm, 90 내지 135 rpm, 90 내지 130 rpm, 90 내지 125 rpm, 90 내지 120 rpm, 95 내지 150 rpm, 95 내지 145 rpm, 95 내지 140 rpm, 95 내지 135 rpm, 95 내지 130 rpm, 95 내지 125 rpm, 95 내지 120 rpm, 100 내지 150 rpm, 100 내지 145 rpm, 100 내지 140 rpm, 100 내지 135 rpm, 100 내지 130 rpm, 100 내지 125 rpm, 100 내지 120 rpm, 105 내지 150 rpm, 105 내지 145 rpm, 105 내지 140 rpm, 105 내지 135 rpm, 105 내지 130 rpm, 105 내지 125 rpm, 105 내지 120 rpm, 110 내지 150 rpm, 110 내지 145 rpm, 110 내지 140 rpm, 110 내지 135 rpm, 110 내지 130 rpm, 110 내지 125 rpm, 110 내지 120 rpm, 115 내지 150 rpm, 115 내지 145 rpm, 115 내지 140 rpm, 115 내지 135 rpm, 115 내지 130 rpm, 115 내지 125 rpm, 115 내지 120 rpm, 예를 들어, 120 rpm으로 원심분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the culturing step is 80 to 150 rpm, 80 to 145 rpm, 80 to 140 rpm, 80 to 135 rpm, 80 to 130 rpm, 80 to 125 rpm, 80 to 120 rpm, 85 to 150 rpm, 85 to 145 rpm. rpm, 85 to 140 rpm, 85 to 135 rpm, 85 to 130 rpm, 85 to 125 rpm, 85 to 120 rpm, 90 to 150 rpm, 90 to 145 rpm, 90 to 140 rpm, 90 to 135 rpm, 90 to 130 rpm, 90 to 125 rpm, 90 to 120 rpm, 95 to 150 rpm, 95 to 145 rpm, 95 to 140 rpm, 95 to 135 rpm, 95 to 130 rpm, 95 to 125 rpm, 95 to 120 rpm, 100 to 150 rpm, 100 to 145 rpm, 100 to 140 rpm, 100 to 135 rpm, 100 to 130 rpm, 100 to 125 rpm, 100 to 120 rpm, 105 to 150 rpm, 105 to 145 rpm, 105 to 140 rpm, 105 to 135 rpm, 105 to 130 rpm, 105 to 125 rpm, 105 to 120 rpm, 110 to 150 rpm, 110 to 145 rpm, 110 to 140 rpm, 110 to 135 rpm, 110 to 130 rpm, 110 to 125 rpm, 110 to 120 rpm, 115 to 150 rpm, 115 to 145 rpm, 115 to 140 rpm, 115 to 135 rpm, 115 to 130 rpm, 115 to 125 rpm, 115 to 120 rpm, for example, 120 rpm. It may be done, but it is not limited to this.
본 발명에 있어서 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 수탁번호 KACC 81101BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주인 것일 수 있다.In the present invention, the Bacillus belegensis CE 100 strain may be the Bacillus belegensis CE 100 strain deposited under the accession number KACC 81101BP.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 콜레토르리쿰 아큐타텀 (Colletotrichum acutatum), 콜레토르리쿰 글로에스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토르리쿰 데마튬 (Colletotrichum dematium), 콜레토르리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 알테르나리아 포리 (Alternaria porri), 알테르나리아 솔라니 (Alternaria solani), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 실린드로카폰 데스트럭탄트 (Cylindrocarpon destructans), 디아포르테 시트리 (Diaporthe citri), 엘시노에 포세티 (Elsinoe fawcettii), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 글로멜라 신귤레이트 (Glomella cingulate), 모닐리니아 프룩티콜라 (Monilinia fructicola), 파이토프소라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프소라 캡시카 (Phytophthora capsica), 파이토프소라 인페스탄스 (Phytophthora infestans), 파이토프소라 니코티아네 (Phytophthora nicotianae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctoina solani), 스클레오티엄 세피보럼 (Sclerotium cepivorum), 스클레오티니아 마이너 (Sclerotinia minor) 및 스클레오티니아 스클레로티오럼 (Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 원인균으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, plant fungal diseases include Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloeosporioides , Colletotrichum dematium , and Colletotrichum coccodes. , Alternaria porri, Alternaria solani , Botrytis cinerea , Cylindrocarpon destructans , Diaporthe citri , Elsino. Elsinoe fawcettii , Fusarium graminearum , Fusarium oxysporum , Fusarium solani, Glomella cingulate, monilinia ph. Monilinia fructicola , Phytophthora cactorum, Phytophthora capsica, Phytophthora infestans, Phytophthora nicotianae , Rye One species selected from the group consisting of Rhizoctoina solani, Sclerotium cepivorum, Sclerotinia minor and Sclerotinia sclerotiorum The abnormality may be caused by the causative bacteria, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 탄저병, 검은무늬병, 겹둥근무늬병, 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 잿빛무늬병, 균핵병, 붉은곰팡이병, 시들음병, 역병, 잘록병, 흰가루병, 줄기마름병 및 더뎅이병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, plant fungal diseases include anthracnose, black spot, double round spot, gray mold, root rot, gray spot, sclerotia, red mold, wilt, late blight, green spot, powdery mildew, stem blight, and dieback. It may be one or more types selected from the group consisting of, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 배양 단계의 배지는 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 호모 및 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the culture medium may include one or more selected from the group consisting of milk proteins such as skim milk, whey, and casein, sugars, homologs, and extracts, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 식물 진균병 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 농축하는 농축 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the method for producing a composition for controlling plant fungal diseases may further include a concentration step of concentrating the culture solution.
본 발명에 있어서 식물병원성 진균 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 희석하는 희석 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the method for producing a composition for controlling plant pathogenic fungi may further include a dilution step of diluting the culture solution.
본 발명에 있어서 식물병원성 진균 방제용 조성물의 제조방법은 균체 내의 성분을 추출하는 추출 단계를 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, the method for producing a composition for controlling phytopathogenic fungi may include an extraction step of extracting components within the fungal cells.
본 발명에 있어서 제조방법은 배양액으로부터 활성 분획을 획득하는 분획 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the production method may include a fractionation step of obtaining an active fraction from the culture medium, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 분획 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:In the present invention, the fractionation step may include the following steps:
배양액으로부터 추출물을 얻는 추출 단계; An extraction step of obtaining an extract from the culture medium;
추출물을 분획하여 분획물을 얻는 분획 단계; 및A fractionation step of fractionating the extract to obtain a fraction; and
분획물을 순화 (purifiy)하여 활성 분획을 선별하는 정제 단계.A purification step in which the fractions are purified and the active fraction is selected.
본 발명에 있어서 추출 단계는 배양액을 3000 내지 9000 rpm, 3000 내지 8500 rpm, 3000 내지 8000 rpm, 3000 내지 7500 rpm, 3000 내지 7000 rpm, 3000 내지 6500 rpm, 3000 내지 6000 rpm, 3500 내지 9000 rpm, 3500 내지 8500 rpm, 3500 내지 8000 rpm, 3500 내지 7500 rpm, 3500 내지 7000 rpm, 3500 내지 6500 rpm, 3500 6500 rpm, 3500 내지 6000 rpm, 4000 내지 9000 rpm, 4000 내지 8500 rpm, 4000 내지 8000 rpm, 4000 내지 7500 rpm, 4000 내지 7000 rpm, 4000 내지 6500 rpm, 4000 내지 6000 rpm, 4500 내지 9000 rpm, 4500 내지 8500 rpm, 4500 내지 8000 rpm, 4500 내지 7500 rpm, 4500 내지 7000 rpm, 4500 내지 6500 rpm, 4500 내지 6000 rpm, 5000 내지 9000 rpm, 5000 내지 8500 rpm, 5000 내지 8000 rpm, 5000 내지 7500 rpm, 5000 내지 7000 rpm, 5000 내지 6500 rpm, 5000 내지 6000 rpm, 5500 내지 9000 rpm, 5500 내지 8500 rpm, 5500 내지 8000 rpm, 5500 내지 7500 rpm, 5500 내지 7000 rpm, 5500 내지 6500 rpm, 5500 내지 6000 rpm, 예를 들어, 6000 rpm으로 원심분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the extraction step is performed at 3000 to 9000 rpm, 3000 to 8500 rpm, 3000 to 8000 rpm, 3000 to 7500 rpm, 3000 to 7000 rpm, 3000 to 6500 rpm, 3000 to 6000 rpm, 3500 to 9000 rpm, 3 500 to 8500 rpm, 3500 to 8000 rpm, 3500 to 7500 rpm, 3500 to 7000 rpm, 3500 to 6500 rpm, 3500 to 6500 rpm, 3500 to 6000 rpm, 4000 to 9000 rpm, 4000 to 8500 rpm, 400 0 to 8000 rpm, 4000 to 8000 rpm 7500 rpm, 4000 to 7000 rpm, 4000 to 6500 rpm, 4000 to 6000 rpm, 4500 to 9000 rpm, 4500 to 8500 rpm, 4500 to 8000 rpm, 4500 to 7500 rpm, 4500 to 7000 rpm, 450 0 to 6500 rpm, 4500 to 4500 rpm 6000 rpm, 5000 to 9000 rpm, 5000 to 8500 rpm, 5000 to 8000 rpm, 5000 to 7500 rpm, 5000 to 7000 rpm, 5000 to 6500 rpm, 5000 to 6000 rpm, 5500 to 9000 rpm, 550 0 to 8500 rpm, 5500 to 5500 rpm It may include centrifuging at 8000 rpm, 5500 to 7500 rpm, 5500 to 7000 rpm, 5500 to 6500 rpm, 5500 to 6000 rpm, for example, 6000 rpm, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 상기 분획 단계는 용매로 n-헥산 (n-Hexane), 클로로포름 (Chloroform), 에틸아세테이트 (Ethyl acetate), 메탄올 (Methanol) 및 에탄올 (Ethanol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 분획하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the fractionation step involves fractionation with one or more solvents selected from the group consisting of n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol, and ethanol. It may include the step of doing so, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 정제 단계는 중압 액체 크로마토그래피 (Midium Pressure Liquid Chromatography; MPLC)로 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the purification step may include purification by medium pressure liquid chromatography (MPLC), but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 활성 분획은 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프로릴)(Cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl))를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the active fraction may include Cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl), but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 일 양태는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 진균병 방제방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for controlling plant fungal diseases, including the step of treating a culture medium of Bacillus velezensis CE 100 strain or an extract thereof with a composition.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 콜레토르리쿰 아큐타텀 (Colletotrichum acutatum), 콜레토르리쿰 글로에스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토르리쿰 데마튬 (Colletotrichum dematium), 콜레토르리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 알테르나리아 포리 (Alternaria porri), 알테르나리아 솔라니 (Alternaria solani), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 실린드로카폰 데스트럭탄트 (Cylindrocarpon destructans), 디아포르테 시트리 (Diaporthe citri), 엘시노에 포세티 (Elsinoe fawcettii), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 글로멜라 신귤레이트 (Glomella cingulate), 모닐리니아 프룩티콜라 (Monilinia fructicola), 파이토프소라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프소라 캡시카 (Phytophthora capsica), 파이토프소라 인페스탄스 (Phytophthora infestans), 파이토프소라 니코티아네 (Phytophthora nicotianae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctoina solani), 스클레오티엄 세피보럼 (Sclerotium cepivorum), 스클레오티니아 마이너 (Sclerotinia minor) 및 스클레오티니아 스클레로티오럼 (Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 원인균으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, plant fungal diseases include Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloeosporioides , Colletotrichum dematium , and Colletotrichum coccodes. , Alternaria porri, Alternaria solani , Botrytis cinerea , Cylindrocarpon destructans , Diaporthe citri , Elsino. Elsinoe fawcettii , Fusarium graminearum , Fusarium oxysporum , Fusarium solani, Glomella cingulate, monilinia ph. Monilinia fructicola , Phytophthora cactorum, Phytophthora capsica, Phytophthora infestans, Phytophthora nicotianae , Rye One species selected from the group consisting of Rhizoctoina solani, Sclerotium cepivorum, Sclerotinia minor and Sclerotinia sclerotiorum The abnormality may be caused by the causative bacteria, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 탄저병, 검은무늬병, 겹둥근무늬병, 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 잿빛무늬병, 균핵병, 붉은곰팡이병, 시들음병, 역병, 잘록병, 흰가루병, 줄기마름병 및 더뎅이병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, plant fungal diseases include anthracnose, black spot, double round spot, gray mold, root rot, gray spot, sclerotia, red mold, wilt, late blight, green spot, powdery mildew, stem blight, and dieback. It may be one or more types selected from the group consisting of, but is not limited to this.
본 발명에 있어서 배양액 또는 이의 추출물은 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프로릴)(Cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl))를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the culture medium or extract thereof may contain Cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl), but is not limited thereto.
본 발명에 있어서 조성물 처리 단계는 살포, 토양시용, 표면사용, 근권처리, 종자처리, 침지, 독이 및 훈연시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the composition treatment step may be performed by one or more methods selected from the group consisting of spraying, soil application, surface use, root zone treatment, seed treatment, immersion, poisoning, and smoking, but is not limited thereto. .
본 발명에 있어서 “살포”는 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말살포, 과립살포, 수명시용 및 상시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있다.In the present invention, “spraying” may be performed by one or more methods selected from the group consisting of spraying, misting, atomizing, powder spraying, granule spraying, lifetime use, and permanent use.
본 명세서상 용어 “관주”는 토양이나 나무에 구멍을 파서 약액을 주입하는 약제 살포의 한 방법이다.As used herein, the term “drenchment” is a method of spraying a chemical that involves digging a hole in the soil or tree and injecting a chemical solution.
본 명세서상 용어 “토양 관주”는 작물 재배토양에 약액을 주입 또는 살포하는 방법이다.As used herein, the term “soil irrigation” refers to a method of injecting or spraying a chemical solution into crop cultivation soil.
상기 식물 진균병 방제용 조성물의 제조 방법 및 식물 진균병 방제 방법에 있어서, 상기 식물 진균병 방제용 조성물과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.In the method for producing the composition for controlling plant fungal diseases and the method for controlling plant fungal diseases, content that overlaps with the composition for controlling plant fungal diseases is omitted in consideration of the complexity of the present specification.
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 CE 100의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 진균병 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 배양액 또는 이의 추출물을 처리하였을 때 항진균 활성이 월등히 우수하므로, 식물 진균병의 방제에 이용할 수 있다.The present invention relates to a composition for controlling plant fungal diseases comprising a culture medium of Bacillus belegensis CE 100 or an extract thereof, a method for producing the same, and a method for controlling plant fungal diseases, wherein the antifungal activity is significantly greater when the culture medium or extract thereof is treated. Because it is excellent, it can be used to control plant fungal diseases.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 배양 분석 후 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 식물 진균 병원체 (C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium, C.coccodes)의 균사체 성장 억제율(%)을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 배양 분석 후 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 식물 진균 병원체 (C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium, C.coccodes)의 균사체 성장 억제 결과를 보여주는 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 휘발성 유기 화합물 (Volatile Organic Compounds; VOC)에 의한 식물 진균 병원체 (C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium, C.coccodes)의 균사체 성장 억제율(%)을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 휘발성 유기 화합물 (Volatile Organic Compounds; VOC)에 의한 식물 진균 병원체 (C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes)의 균사체 성장 억제 결과를 보여주는 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 조추출물의 식물 진균 병원체 (C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes)의 균사체 성장 억제율(%)을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 조추출물의 식물 진균 병원체 (C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes)의 균사체 성장 억제 결과를 보여주는 도 이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 조추출물을 분리하여 분리된 화합물을 분석한 결과를 보여주는 화학식이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 조추출물로부터 분리된 화합물을 농도에 따라 처리한 C. gloeosporioides의 포자 발아 억제도(%)를 측정한 결과를 보여주는 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주의 조추출물로부터 분리된 화합물을 농도에 따라 처리한 C. gloeosporioides의 균사 및 포자의 형태를 전계방출 주사전자현미경 및 에너지분산분산분광법으로 관찰한 결과를 보여주는 도이다.Figure 1 shows mycelial growth of plant fungal pathogens ( C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium, C.coccodes ) of Bacillus velezensis CE 100 strain after dual culture analysis according to an embodiment of the present invention. This is a graph showing the results of measuring the inhibition rate (%).
Figure 2 shows mycelium growth of plant fungal pathogens ( C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium, C.coccodes ) of Bacillus velezensis CE 100 strain after dual culture analysis according to an embodiment of the present invention. This diagram shows the results of suppression.
Figure 3 shows plant fungal pathogens ( C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium ) by volatile organic compounds (VOC) of Bacillus velezensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention. , C.coccodes ) This is a graph showing the results of measuring the mycelium growth inhibition rate (%).
Figure 4 shows plant fungal pathogens ( C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium ) by volatile organic compounds (VOC) of Bacillus velezensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention. This diagram shows the results of mycelial growth inhibition of (and C.coccodes ).
Figure 5 shows the mycelial growth inhibition rate of plant fungal pathogens ( C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium and C.coccodes ) of the crude extract of Bacillus velezensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention. This is a graph showing the results of measuring (%).
Figure 6 shows the inhibition of mycelial growth of plant fungal pathogens ( C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium and C.coccodes ) of the crude extract of Bacillus velezensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention. This diagram shows the results.
Figure 7 is a chemical formula showing the results of analyzing the isolated compounds by separating the crude extract of Bacillus velezensis CE 100 strain according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 shows the degree of inhibition (%) of spore germination of C. gloe osporioides treated with compounds isolated from the crude extract of Bacillus velezensis CE 100 strain according to the concentration according to an embodiment of the present invention. This is a diagram that shows the results.
Figure 9 shows the morphology of hyphae and spores of C. gloe osporioides treated with compounds isolated from the crude extract of Bacillus velezensis CE 100 strain according to the concentration according to an embodiment of the present invention, using field emission scanning electron microscope. This diagram shows the results observed using a microscope and energy-dispersive dispersive spectroscopy.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 균주의 배양Example 1. Cultivation of strains
바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 (수탁번호: KACC 81101BP; 국립농업과학원미생물은행, KACC)는 트립톤 소이 아가 (Tryptone Soy Agar; TSA) 배지에 계대배양하고, 단일 콜로니를 이용하여 30 ℃, 120 rpm의 트립톤 소이 브로스 (Tryptone Soy Broth; TSB) 배지에 2일 동안 진탕 배양기에서 접종하였다. 그 다음, B.velezensis CE 100 (1×107 CFU/mL)의 2일 된 브로쓰 배양물을 추가 실험을 위해 멸균 50 % 글리세롤 용액과 혼합한 후 -80 ℃에서 유지하였다. 그 다음, 진균 병원체인 콜레토르리쿰 글로에스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides, 이하, C.gloeosporioides)(KACC 40003BP), 콜레토르리쿰 아큐타텀 (Colletotrichum acutatum, 이하, C.acutatum)(KACC 40804BP), 콜레토르리쿰 데마튬 (Colletotrichum dematium, 이하, C.dematium)(KACC 40013BP) 및 콜레토르리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes, 이하, C.coccodes)(KACC 40011BP)는 국립농업과학원미생물은행에서 구하여 25 ℃에서 7일 동안 감자 덱스트로스 한천 (PDA) 배지에서 계대배양하였다. Bacillus velezensis CE 100 (Accession number: KACC 81101BP; National Academy of Agricultural Sciences Microbial Bank, KACC) was subcultured on Tryptone Soy Agar (TSA) medium and incubated at 30°C using a single colony. , were inoculated into Tryptone Soy Broth (TSB) medium at 120 rpm in a shaking incubator for 2 days. Then, a 2-day-old broth culture of B.velezensis CE 100 (1 × 10 7 CFU/mL) was mixed with sterile 50% glycerol solution and maintained at -80 °C for further experiments. Next, the fungal pathogens Colletotrichum gloeosporioides (hereinafter C.gloeosporioides ) (KACC 40003BP), Colletotrichum acutatum (hereinafter C.acutatum ) (KACC 40804BP), and Colletotrichum acutatum (KACC 40804BP). Colletotrichum dematium (hereinafter, C.dematium ) (KACC 40013BP) and Colletotrichum coccodes (hereinafter, C.coccodes ) (KACC 40011BP) were obtained from the Microbial Bank of the National Academy of Agricultural Sciences and incubated at 25°C for 7 days. Subcultured on potato dextrose agar (PDA) medium for 1 day.
실시예 2. 균주의 조추출 Example 2. Crude extraction of strains
계대배양한 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주를 트립톤 소이 브로스 (Tryptone Soy Broth; TSB) 배지 12L에서 30 ℃, 120 rpm 및 14일간 배양하였다. 그 다음, 배양한 배양액을 6,000 rpm으로 30분간 원심분리한 후, 원심분리된 상등액을 Whatman No.6 필터페이터로 여과한 후, 여과액은 HCL로 pH 3으로 적정해 준 뒤 4 ℃ 냉장고에서 하루동안 보관하였다. 그 다음, 배양액은 유기용매를 같은 용량 (1:1, v/v)으로 사용하여 추출하였다. 배양액 12L를 각각의 n-헥산 (n-Hexane), 클로로포름 (Chloroform) 및 에틸아세테이트 (Ethyl acetate) 12L로 추출하였다. The subcultured Bacillus velezensis CE 100 strain was cultured in 12L of Tryptone Soy Broth (TSB) medium at 30°C, 120 rpm, and 14 days. Next, the culture medium was centrifuged at 6,000 rpm for 30 minutes, the centrifuged supernatant was filtered using a Whatman No.6 filter, and the filtrate was adjusted to pH 3 with HCL and stored in a refrigerator at 4°C for a day. It was stored for a while. Next, the culture medium was extracted using the same volume of organic solvent (1:1, v/v). 12L of the culture medium was extracted with 12L each of n-hexane, chloroform, and ethyl acetate.
실시예 2. 대치배양 분석Example 2. Replacement culture analysis
바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 4가지 진균 병원체 (C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes)에 대한 항진균 활성을 대치배양법으로 평가하였다. 각각의 균주는 성장에 따라 7 내지 10일 동안 25 ℃에서 PDA 배지에 접종되었다. 각 진균 병원체의 직경 5 mm 균사 플러그 (mycelial plug)를 멸균 PDA 플레이트의 한쪽 면에 놓고 동일한 배지의 다른 면에 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 획선도말 하였다. 대조군은 각각의 진균 병원체를 단독으로 접종한 PDA 배지를 사용하였다. 각 진균 병원체에 대해 3회 반복하여 수행하였다. 플레이트를 7 내지 10일 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 균사체 성장 억제는 다음 방정식으로 계산되었다.The antifungal activity of Bacillus belegensis CE 100 strain against four fungal pathogens ( C.acutatum, C. gloeosporioides, C.dematium , and C.coccodes ) was evaluated by replacement culture. Each strain was inoculated on PDA medium at 25°C for 7 to 10 days depending on growth. A mycelial plug with a diameter of 5 mm for each fungal pathogen was placed on one side of a sterile PDA plate, and the Bacillus belegensis CE 100 strain was smeared on the other side of the same medium. As a control group, PDA medium inoculated with each fungal pathogen was used. Three replicates were performed for each fungal pathogen. Plates were incubated at 25°C for 7-10 days. Mycelium growth inhibition was calculated with the following equation:
[계산식 1][Calculation Formula 1]
균사체 성장 억제(%) = R - r/R × 100 (상기 R은 대조 플레이트의 곰팡이 콜로니 반경이고, r은 이중 배양 플레이트의 곰팡이 콜로니 반경임).Mycelial growth inhibition (%) = R - r/R × 100 (where R is the radius of fungal colonies in the control plate and r is the radius of the fungal colonies in the dual culture plate).
이중 배양 분석 결과를 표 1 및 도 1, 2에 나타내었다.The results of the dual culture analysis are shown in Table 1 and Figures 1 and 2.
상기 표 1 및 도 1, 2에서 확인할 수 있듯이, C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes에 대한 억제율은 배양 10일 후 각각 44.63 %, 56.47 %, 63.89 % 및 66.05 %로 나타났다.As can be seen in Table 1 and Figures 1 and 2, the inhibition rates for C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium , and C.coccodes were 44.63%, 56.47%, 63.89%, and 66.05%, respectively, after 10 days of culture. .
이를 통해, 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주는 탄저병을 유발하는 원인균인 C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes에 대해서 모두 항균 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.Through this, it was confirmed that Bacillus belegensis CE 100 strain has antibacterial activity against C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium , and C.coccodes , which are the causative bacteria that cause anthrax.
실시예 3. 휘발성 유기 화합물 (VOC)의 항진균 활성 평가Example 3. Evaluation of antifungal activity of volatile organic compounds (VOC)
바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주 유래 휘발성 유기 화합물 (Volatile Organic Compounds; VOC)의 진균 병원체의 억제를 분석하기 위해 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 (2 x 106 CFU/mL)를 브로쓰 배양액에 접종하고 2일간 사전 배양한 후, 100 uL을 TSA 배지에 도말하였다. PDA 배지에서 7일동안 배양한 진균 병원체인 C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes 균체의 직경 5 mm 균사 플러그를 PDA 배지의 중앙에 놓았다.To analyze the inhibition of fungal pathogens by volatile organic compounds (VOC) derived from Bacillus velezensis CE 100 strain, Bacillus velezensis CE 100 strain (2 x 10 6 CFU/mL) was used in broth. After inoculating the culture and pre-culturing for 2 days, 100 uL was plated on TSA medium. Mycelial plugs with a diameter of 5 mm from the fungal pathogens C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium , and C.coccodes , which were cultured in PDA medium for 7 days, were placed in the center of the PDA medium.
그 다음, 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 도말한 플레이트와 C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes 균체를 접종한 플레이트를 파라필름으로 서로 마주보도록 밀봉하였다. 100 uL의 멸균된 증류수를 뿌린 TSA 플레이트를 C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes 균체를 도말한 플레이트와 함께 밀봉하여 대조군으로 사용하였다. C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes 균체를 25 ℃에서 5일 동안 배양하였으며, 모든 실험은 같은 실험을 3회 반복하여 진행하였다. 균사체 생장 억제율은 다음의 공식으로 계산하였다.Next, the plate smeared with the Bacillus belegensis CE 100 strain and the plate inoculated with C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium , and C.coccodes cells were sealed with parafilm so that they faced each other. A TSA plate sprinkled with 100 uL of sterilized distilled water was sealed together with a plate on which C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium , and C.coccodes bacteria were smeared and used as a control. C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium , and C.coccodes cells were cultured at 25°C for 5 days, and all experiments were repeated three times. The mycelium growth inhibition rate was calculated using the following formula.
[계산식 2][Calculation Formula 2]
균사체 생장 억제율(%) = D - d/D × 100 (여기서 D는 대조군의 진균 콜로니 직경, d는 미생물처리군의 진균 콜로니 직경)의 식으로 계산하였다.)Mycelium growth inhibition rate (%) = D - d/D × 100 (where D is the diameter of the fungal colony in the control group, and d is the diameter of the fungal colony in the microbial treatment group).)
B.velezensis CE 100의 VOCs에 의한 각 진균 병원체의 균사체 변화를 광학현미경으로 관찰하여 그 결과를 하기 표 2 및 도 3, 4에 나타내었다.Changes in the mycelium of each fungal pathogen due to VOCs of B.velezensis CE 100 were observed using an optical microscope, and the results are shown in Table 2 and Figures 3 and 4 below.
표 2 및 도 3에서 확인할 수 있듯이, B.velezensis CE 100에 의해 방출된 VOCs는 C.dematium에 대해 25.93 %, C. gloeosporioides에 대해 29.59 %, C.coccodes에 대해 33.71 %, C.acutatum에 대해 38.10 %의 억제율을 나타내었다 (참고로 각 데이터는 3회 반복의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다).As can be seen in Table 2 and Figure 3, the VOCs emitted by B.velezensis CE 100 were 25.93% for C.dematium , 29.59% for C. gloeosporioides , 33.71% for C.coccodes , and C.acutatum . An inhibition rate of 38.10% was shown (for reference, each data represents the mean ± standard deviation of three repetitions).
또한, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 대조군은 균사체가 직선 및 정상 형태로 나타났으나, C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium 및 C. coccodes는 VOC에 영향을 받아 균사체의 비정상적인 뒤틀린 형태를 나타내었다.In addition, as can be seen in Figure 4, the control group showed straight and normal mycelium, but C.acutatum , C.gloeosporioides , C.dematium , and C. coccodes were affected by VOC and showed an abnormal twisted shape of the mycelium. It was.
실시예 4. 균주 조추출물의 항진균 활성 평가Example 4. Evaluation of antifungal activity of crude strain extract
바실러스 벨레젠시스 (B.velezensis) CE 100 배양액을 클로로포름으로 추출한 균주 조추출물의 진균 병원체 (C.acutatum, C.gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes)의 항진균 활성을 평가하였다.The antifungal activity of the crude extract of B.velezensis CE 100 culture medium extracted with chloroform against fungal pathogens ( C.acutatum , C.gloeosporioides , C.dematium and C.coccodes ) was evaluated.
다양한 양의 균주 클로로포름 추출물 (50 mg, 100 mg 및 200 mg)을 메탄올 200μL에 용해하고, 각각의 추출물을 오토클레이브 냉각 PDA 배지와 블렌딩하여 250 mg/L, 500 mg/L 및 1000 mg/L의 상이한 농도의 균주 조추출물을 얻었다. 그 다음 각 진균 병원체의 직격 5 mm 균사 플러그를 각각의 균주 조추출물이 혼합된 PDA 배지에 접종하였다. 대조군으로는 200 uL 메탄올이 혼합된 PDA 배지에 접종된 각각의 진균 병원체를 사용하였다. 각각의 배지는 25 ℃에서 7일 동안 배양하고 대조군과 비교하여 성장 억제 (%)를 계산하여 하기 표 3 및 도 5에 나타내었으며, 각 배지에서 균사체의 작은 조각을 채취하여 광학 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.Different amounts of strain chloroform extracts (50 mg, 100 mg and 200 mg) were dissolved in 200 μL of methanol, and each extract was blended with autoclave-cooled PDA medium to obtain a concentration of 250 mg/L, 500 mg/L and 1000 mg/L. Crude extracts of the strains at different concentrations were obtained. Next, a 5 mm mycelial plug of each fungal pathogen was inoculated into PDA medium mixed with the crude extract of each strain. As a control, each fungal pathogen inoculated into PDA medium mixed with 200 uL methanol was used. Each medium was cultured at 25°C for 7 days, and the growth inhibition (%) compared to the control was calculated and shown in Table 3 and Figure 5. Small pieces of mycelium were collected from each medium and observed under an optical microscope. The results are shown in Figure 6.
상기 표 3 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 바실러스 벨레젠시스 CE 100 조추출물은 진균 병원체의 성장에 영향을 끼쳤다. 억제 효과는 농도 의존적이였으며, 조추출물의 농도 (250 mg/L, 500 mg/L 및 1000 mg/L)가 증가함에 따라 억제효과도 증가하였다. 특히, 최고 억제율은 1000 mg/L의 조추출물을 처리하였을 때 나타났으며, C.acutatum 43.83 %, C.gloeosporioides 49.86 %, C.dematium 59.05 %, C.coccodes 68.69 %의 억제율을 보였다. 균주 1000 mg/L의 조추출물을 처리하였을 때 C.acutatum는 C.gloeosporioides, C.dematium 및 C.coccodes보다 억제율이 떨어졌으며, 가장 낮은 농도인 250 mg/L로 처리하였을 때는 모든 진균 병원체의 성장 억제율이 낮게 나타난 것을 확인할 수 있다.As can be seen in Table 3 and Figure 5, the Bacillus velegensis CE 100 crude extract affected the growth of fungal pathogens. The inhibitory effect was concentration dependent, and the inhibitory effect increased as the concentration of the crude extract (250 mg/L, 500 mg/L, and 1000 mg/L) increased. In particular, the highest inhibition rate was observed when 1000 mg/L of crude extract was treated, with inhibition rates of 43.83% for C.acutatum , 49.86% for C.gloeosporioides , 59.05% for C.dematium , and 68.69% for C.coccodes . When treated with 1000 mg/L of crude extract, C.acutatum had a lower inhibition rate than C.gloeosporioides, C.dematium , and C.coccodes , and when treated at the lowest concentration of 250 mg/L, the growth of all fungal pathogens was reduced. It can be seen that the inhibition rate is low.
또한, 도 6에서 확인할 수 있듯이, 바실러스 벨레젠시스 CE 100 조추출물이 처리된 진균 병원체의 균사체는 정상 균사체 발달을 가진 대조군에 비해 비정상적인 팽창을 보이고, 균사체가 조밀하게 밀집되어 있으며, 규칙적인 균사체 형태를 상실하였다. 그리고 바실러스 벨레젠시스 CE 100 조추출물 처리로 인한 팽창, 비틀림, 불규칙한 확장 및 과도한 분기를 포함한 모든 진균 병원체의 심각한 균사 변형이 나타났다. 반면, 대조군에서는 규칙적인 분지를 갖는 직선형 균사가 관찰되었다.In addition, as can be seen in Figure 6, the mycelium of the fungal pathogen treated with the Bacillus velegensis CE 100 crude extract shows abnormal expansion compared to the control group with normal mycelium development, the mycelium is densely packed, and has a regular mycelium shape. was lost. And treatment with Bacillus velegensis CE 100 crude extract resulted in severe mycelial deformation of all fungal pathogens, including swelling, torsion, irregular expansion, and excessive branching. On the other hand, straight hyphae with regular branches were observed in the control group.
실시예 5. 항진균 화합물의 분리 Example 5. Isolation of antifungal compounds
바실러스 벨레젠시스 CE 100 브로쓰 배양물의 클로로포름 조추출물 (4.0 g)을 클로로포름 (CHCl3) 및 메탄올 (MeOH)의 구배 용리와 함께 SNAP KP 실리카 (340g 및 120g) 및 옥타데실실란 (ODS; SNAP Ultra C18 120g) 컬럼을 통해 중압 액체 크로마토그래피 (MPLC; Isolera one, Biotage, 스웨덴)를 사용하여 분리하였다.A chloroform crude extract (4.0 g) of a Bacillus velegensis CE 100 broth culture was incubated with SNAP KP silica (340 g and 120 g) and octadecylsilane (ODS; SNAP Ultra) with gradient elution of chloroform (CHCl 3 ) and methanol (MeOH). Separation was performed using medium pressure liquid chromatography (MPLC; Isolera one, Biotage, Sweden) through a C18 120g) column.
파장은 화합물을 검출하기 위해 220 nm 및 254 nm로 설정되었다. 5분 동안 0 % CHCl3 → 150 mL/분의 유속으로 25분 동안 100 % MeOH의 구배 용리로 실리카겔 컬럼 (340 g)을 통해 클로로포름 분획으로부터 8개의 분획 (C1-C8)을 얻었다. 콜레토트리쿰 (Colletotrichum)종에 대한 항진균 활성에 대한 예비 시험을 마친 후, 활성 분획 C1 (t R 12.7313.47 min, 612.4 mg)을 선택하고, 32분 동안 15% B → 47분 동안 51.56분 동안 25% B의 선형 구배에 의해 실리카 겔 (120g) 컬럼을 통해 다시 분획화하여 25 mL/min의 유속으로 3개의 하위 분획 (C1a-C1c)을 획득하였다. 마지막으로, ODS C18 컬럼 (120g)을 통해 25 mL/min의 유속으로 물과 아세토니트릴 (MeCN)(10 % MeCN for 12 min → 50 % MeCN for 48 min)의 구배 용출을 사용하여 하위 분획 C1b (tr 8.32-11.92, 377.4 mg)에서 항진균 활성물질 (t R 42.40-45.60 min, 30.6 mg, a cream-colored amorphous form)을 얻었다.The wavelength was set at 220 nm and 254 nm to detect the compounds. Eight fractions (C1-C8) were obtained from the chloroform fraction through a silica gel column (340 g) with a gradient elution of 0% CHCl 3 over 5 min → 150 mL/min and 100% MeOH over 25 min. After preliminary tests for antifungal activity against Colletotrichum species, active fraction C1 ( t R 12.7313.47 min, 612.4 mg) was selected, 15% B for 32 min → 51.56 min for 47 min. After fractionation again through a silica gel (120 g) column by a linear gradient of 25% B, three subfractions (C1a-C1c) were obtained at a flow rate of 25 mL/min. Finally, subfraction C1b ( An antifungal active substance (t R 42.40-45.60 min , 30.6 mg, a cream-colored amorphous form) was obtained.
실시예 6. 분리된 항진균 활성물질의 화학 구조 동정Example 6. Identification of chemical structure of isolated antifungal active substance
6-1. 질량분석 및 분자식6-1. Mass spectrometry and molecular formula
전자분무 이온화 소스와 함께 제공되는 하이브리드 이온 트랩 비행 시간 질량 분석기 (ESI-QToF-MS; Xevo G2-XS QTOF, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 항진균 화합물의 분자량과 공식을 결정하였다. unityINOVA 500 분광계 (Varian, Walnut Creek, CA, USA; 전남대학교 한국기초과학연구원)를 사용하여 중수소화 메탄올(CD3OD)에서 분리된 화합물을 분석하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.The molecular weight and formula of the antifungal compounds were determined using a hybrid ion trap time-of-flight mass spectrometer (ESI-QToF-MS; Xevo G2-XS QTOF, Waters, Milford, MA, USA) provided with an electrospray ionization source. The compounds separated from deuterated methanol (CD3OD) were analyzed using a unity INOVA 500 spectrometer (Varian, Walnut Creek, CA, USA; Korea Institute for Basic Science, Chonnam National University), and the results are shown in Figure 7.
도 7에서 확인할 수 있듯이, 분리된 화합물의 분자식은 m/z 245.1289 [M+H]+(C14H17N2O2에 대해 계산됨, m/z 245.1290, -0.1 mDa)에서 양성자화된 분자 이온 피크에 의해 확립된 바와 같이 C14H16N2O2인 것으로 결정되었다.As can be seen in Figure 7, the molecular formula of the isolated compound is protonated at m/z 245.1289 [M+H]+ (calculated for C 14 H 17 N 2 O 2 , m/z 245.1290, -0.1 mDa) It was determined to be C 14 H 16 N 2 O 2 as established by the molecular ion peak.
6-2. 구조의 확인6-2. Confirmation of structure
분리된 화합물의 구조적 결정은 1H 및 13C NMR 스펙트럼에 기초하여 수행되었으며, 이는 1H-1H 상관 분광법 (1H-1H COSY), 이핵 다중 양자 일관성 (HMQC) 및 이핵 다중 결합 상관 관계 (HMBC) 결과에 의해 뒷받침하였다.Structural determination of the isolated compounds was performed based on 1H and 13C NMR spectra, which were analyzed using 1H - 1H correlation spectroscopy ( 1H - 1H COSY), heteronuclear multiple quantum coherence (HMQC) and heteronuclear multiple bond correlation. (HMBC) supported by results.
1H NMR 스펙트럼은 δ 4.07 (H-2)에서 1개의 메틴 및 δ 3.38-3.56 (H-5) 및 2.13-1.17 (H-3 및 H-4)에서 4개의 메틸렌의 양성자 신호에 상응하는 프롤린 부분을 보여주었다. 또한, 페닐알라닌 부분은 δ 7.22-7.31에서 5개의 메틴 (H-2'-H-6'), δ 3.11-3.21에서 1개의 메틸렌 (H-7'), δ 4.46에서 1개의 질소화된 메틴의 양성자 신호에 해당했다 (H-8'). 페닐알라닌과 프롤린 부분의 proton-proton 상관관계는 1H-1H COSY 스펙트럼에서 확인되었다 (도 7, 굵은선). 1H NMR 결과는 δ 171.0(C-1) 및 167.0(C-9')에서 2개의 아미드 카르보닐 탄소를 포함하는 12개의 탄소 신호를 나타내는 13C NMR 스펙트럼에 의해 뒷받침되었다. MS 및 1D NMR 결과는 고리형 디펩티드가 페닐알라닌 및 프롤린 부분과 결합되었음을 시사한다. 아미노산은 또한 HMBC 상관관계에 의해 확인되었다 (도 7, 화살표). 특히, HMC 스펙트럼에서 δ 4.07 (H-2')/171.0(C-1) 및 δ 4.46(H-8')/167.0(C-9')의 3JHC 상관관계(도 7, 화살표)가 관찰되었다. 본 연구에서 분리한 항진균성 화합물의 MS 및 1D NMR 결과, 정제된 디펩티드인 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프롤릴)과 일치했다. 1H NMR spectrum shows proline corresponding to the proton signals of one methine at δ 4.07 (H-2) and four methylenes at δ 3.38-3.56 (H-5) and 2.13-1.17 (H-3 and H-4) part was shown. Additionally, the phenylalanine moiety consists of five methines (H-2'-H-6') at δ 7.22-7.31, one methylene (H-7') at δ 3.11-3.21, and one nitrogenated methine at δ 4.46. Corresponded to the proton signal (H-8'). The proton-proton correlation between phenylalanine and proline moieties was confirmed in the 1H - 1H COZY spectrum (Figure 7, thick line). The 1 H NMR results were supported by the 13 C NMR spectrum showing a 12 carbon signal including two amide carbonyl carbons at δ 171.0 (C-1) and 167.0 (C-9'). MS and 1D NMR results suggest that the cyclic dipeptide is bound to the phenylalanine and proline moieties. Amino acids were also identified by HMBC correlation (Figure 7, arrows). In particular, the 3 J HC correlations of δ 4.07 (H-2')/171.0 (C-1) and δ 4.46 (H-8')/167.0 (C-9') in the HMC spectrum (Figure 7, arrows). was observed. The MS and 1D NMR results of the antifungal compound isolated in this study were consistent with the purified dipeptide, cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl).
바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 균주로부터 분리한 항진균 활성물질인 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프롤릴)의 NMR 데이터를 정리하면 하기 표 4와 같다.The NMR data of cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl), an antifungal active substance isolated from Bacillus velezensis CE 100 strain, is summarized in Table 4 below.
3b3a
3b
1.17-1.26 (1H, m)2.07-2.13 (1H, m)
1.17-1.26 (1H, m)
5b5a
5b
3.56-3.40 (1H, m)3.52-3.38 (1H, m)
3.56-3.40 (1H, m)
실시예 7. 정제된 디펩티드의 효능 평가Example 7. Efficacy evaluation of purified dipeptides
정제된 디펩티드인 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프롤릴)의 C.gloeosporioides의 포자 발아 억제 및 균사 변형도를 평가하였다.The purified dipeptide cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl) was evaluated for inhibition of spore germination and hyphal deformation of C.gloeosporioides .
7-1. 포자 발아 억제도 평가7-1. Evaluation of spore germination inhibition
포자 현탁액은 C.gloeosporioides의 전체 포자균 군집에 10 mL의 멸균 증류수를 주입하여 제조하고 광학 현미경하에서 혈구계를 사용하여 포자 수를 계산하였다. 최종 포자 농도(106 포자/mL)는 멸균 증류수로 희석하여 제조하고 포자 발아 억제 분석에 사용하였다. 정제된 화합물의 각 양 (1 mg, 2 mg 및 3 mg)을 12μL의 메탄올에서 제조하였다. 그 다음 화합물을 100 μL의 PDB 배지와 100 μL의 포자 현탁액이 들어 있는 에펜도르프 튜브에 첨가하고 멸균 증류수로 부피를 1 mL에 도달하도록 증가시켜 최종 농도를 1 mg/mL, 2 mg/mL 및 3 mg/mL로 만들었다. 화합물 대신 12 μL 메탄올이 포함된 튜브를 대조군으로 사용하였다. 화합물의 각 농도에 대해 3회 반복하여 사용하였다. 튜브를 25 ℃에서 7시간 동안 배양하여 포자 발아를 확인하고 대조군을 기준으로 발아 억제(%)를 계산하여 그 결과를 하기 표 5 및 도 8에 나타내었다.A spore suspension was prepared by injecting 10 mL of sterile distilled water into the entire spore colony of C. gloeosporioides , and spore numbers were counted using a hemocytometer under an optical microscope. The final spore concentration (10 6 spores/mL) was prepared by diluting with sterile distilled water and used for spore germination inhibition analysis. Each amount (1 mg, 2 mg and 3 mg) of purified compound was prepared in 12 μL of methanol. The compounds were then added to an Eppendorf tube containing 100 μL of PDB medium and 100 μL of spore suspension and increased in volume with sterile distilled water to reach 1 mL, resulting in final concentrations of 1 mg/mL, 2 mg/mL, and 3 mg/mL. Made into mg/mL. A tube containing 12 μL methanol instead of the compound was used as a control. Each concentration of compound was repeated three times. The tubes were incubated at 25°C for 7 hours to confirm spore germination, and germination inhibition (%) was calculated based on the control group, and the results are shown in Table 5 and Figure 8 below.
상기 표 5 및 도 8에서 확인할 수 있듯이, 정제된 디펩티드인 사이클로-(D-페닐알라닐-D-프로릴)은 C. gloeosporioides의 포자 발아 억제에 농도 의존적 효과를 보였다. 저해율은 디펩티드의 가장 낮은 농도 (1 mg/mL)에서 38.80 %에 불과했지만 농도를 2 mg/mL로 증가시켰을 때 억제율은 79.51 %로 증가하였다. 포자 발아는 배양 후 7시간에 3 mg/mL의 디펩티드 농도에 의해 완전히 억제되었다 (100 %).As can be seen in Table 5 and Figure 8, the purified dipeptide cyclo-(D-phenylalanyl-D-prolyl) showed a concentration-dependent effect on inhibiting spore germination of C. gloeosporioides . The inhibition rate was only 38.80% at the lowest concentration of dipeptide (1 mg/mL), but when the concentration was increased to 2 mg/mL, the inhibition rate increased to 79.51%. Spore germination was completely inhibited (100%) by a dipeptide concentration of 3 mg/mL at 7 hours after incubation.
7-2. 균사 변형도 평가7-2. Evaluation of mycelial deformability
튜브를 24시간 동안 25 ℃에서 유지하여 주사 전자 현미경을 사용하여 화합물의 다양한 농도에 의해 영향을 받는 균사 변경의 강도를 관찰하였다.The tubes were kept at 25 °C for 24 h to observe the intensity of hyphal alterations affected by different concentrations of the compounds using scanning electron microscopy.
25 ℃에서 24시간 배양한 후, 포자와 균사 세포를 인산염 완충액에 준비된 4 % 글루타르알데히드 고정 용액으로 30분 동안 처리하였다. 원심분리 후, 펠릿을 1 % 오스뮴 테트라옥사이드에 1시간 동안 재현탁 시켰다. 샘플을 인산염 완충액으로 두 번 헹구고 일련의 에탄올 용액 (35 %, 50 %, 75 %, 95 % 및 100 %)으로 탈수하였다. 마지막으로 헥사메틸디실라잔 (HMDS)을 사용하여 포자와 균사 세포를 완전히 건조시키고 60 ℃에서 15분간 금 입자로 코팅하였다. 전계방출 주사전자현미경 (FESEM; Gemini 500, Zeiss, Germany)과 에너지분산분광법 (EDS, Oxford X-MaxN 80, Gambridge, UK)을 이용하여 진균 병원체의 형태학적 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.After culturing at 25°C for 24 hours, spores and hyphal cells were treated with 4% glutaraldehyde fixation solution prepared in phosphate buffer for 30 minutes. After centrifugation, the pellet was resuspended in 1% osmium tetroxide for 1 hour. Samples were rinsed twice with phosphate buffer and dehydrated in a series of ethanol solutions (35%, 50%, 75%, 95% and 100%). Finally, the spores and hyphal cells were completely dried using hexamethyldisilazane (HMDS) and coated with gold particles at 60°C for 15 minutes. Morphological changes in fungal pathogens were observed using field emission scanning electron microscopy (FESEM; Gemini 500, Zeiss, Germany) and energy dispersive spectroscopy (EDS, Oxford X-MaxN 80, Gambridge, UK), and the results are shown in Figure 9 shown in
도 9에서 확인할 수 있듯이, 24시간 배양 후 디펩티드에 노출되면 C. gloeosporioides의 균사 및 포자의 형태가 변형되었다. 반면, 대조군에서는 정상적이고 건강한 균사 세포가 관찰되었다 (도 9, a참조). 균사 변형 정도는 디펩티드 농도에 따라 증가하였으며, 디펩티드의 노출은 균사 모양에 영향을 주어 표면이 울퉁불퉁하거나 세포가 편평한 부풀어 오른 세포를 초래하였다 (도 9, b,c참조). 가장 높은 농도인 3 mg/mL의 디펩티드로 처리하였을 때 비장상적인 모양과 주름진 포자가 나타났다. 긴 배양기간 동안 3 mg/mL 디펩티드 처리로 발아된 포자는 매우 적었지만 표면이 울퉁불퉁한 확장된 배아판의 극심한 팽창도 관찰되었다.As can be seen in Figure 9, when exposed to the dipeptide after culturing for 24 hours, the morphology of the hyphae and spores of C. gloeosporioides were modified. On the other hand, normal and healthy hyphal cells were observed in the control group (see Figure 9, a). The degree of hyphal deformation increased with dipeptide concentration, and dipeptide exposure affected hyphal shape, resulting in swollen cells with a bumpy surface or flat cells (see Figure 9, b, c). When treated with the highest concentration of 3 mg/mL of dipeptide, spores with an irregular shape and wrinkles appeared. During the long incubation period, very few spores were germinated by treatment with 3 mg/mL dipeptide, but extreme swelling of the expanded germ plate with a rough surface was also observed.
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Also Published As
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|---|---|
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