KR101379518B1 - Novel Uses of Cis-Cyclo（L-Phe-L-Pro） - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 특이적인 항진균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물, 농약 조성물 및 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대한 항진균제 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 담자균류의 진균에 대하여 우수한 항진균 활성을 나타냄에 따라 담자균류의 진균 제거 및 발생의 예방을 필요로 하는 다양한 산업분야에 적용될 수 있으며, 특히 적은 양으로도 항진균 활성을 나타내기 때문에 이용면에 있어서 경제적인 장점을 가진다. 또한, 본 발명은 생물학 제제를 이용하는 농약업계에 있어서 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)에 대한 생물학 제제으로서의 기초적인 자료를 제공한다.The present invention relates to a fungicidal composition comprising cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Phe-L-Pro)) as an active ingredient and having an antifungal activity specific to fungi of Basidiomycota The present invention also provides a method for producing an antifungal agent for fungi of Basidiomycota. Since the present invention exhibits an excellent antifungal activity against fungi of the mycelia, it can be applied to various industrial fields requiring the elimination of fungi and the prevention of the occurrence of fungi, and in particular, since they exhibit antifungal activity even in a small amount, Which is economically advantageous. The present invention also provides basic data as biological agents for cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) in the agrochemical industry using biological preparations.

Description

시스-사이클로(Ｌ-페닐알라닌-Ｌ-프롤린)의 신규한 용도{Novel Uses of Cis-Cyclo（L-Phe-L-Pro）}Novel Uses of Cis-Cyclo (L-Phe-L-Pro) for cis-cyclo (L-phenylalanine-L-proline)

본 발명은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 특이적인 항진균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a novel use of cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline). More specifically, the present invention relates to a fungicidal composition comprising, as an active ingredient, cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- And has a specific antifungal activity.

일반적으로, 젖산 발효 효능은 주로 유기산 축적과 기질 산화에 의존을 받는다.[1,2,3] 아세트알데히드, 디아세틸 화합물, 과산화수소 및 이산화탄소와 같은 대사산물은 박테리아균, 병원균 및 부패균의 성장을 억제하는데 중요하다.[1,2,3] 또한, 비-단백질 기질이 그람 양성균과 곰팡이균뿐 만 아니라 그람 음성균을 억제시키는 것으로 보고되었다.[4] Generally, lactic acid fermentation efficiency is mainly dependent on organic acid accumulation and substrate oxidation. [1,2,3] Metabolites such as acetaldehyde, diacetyl compounds, hydrogen peroxide and carbon dioxide are important in inhibiting the growth of bacterial, pathogenic and rot fungi. [1,2,3] It has also been reported that non-protein substrates inhibit Gram-positive bacteria as well as Gram-positive bacteria and fungi. [4]

최초 저분자량 항생제인 류테리사이클린(Reutericyclin)은 발효빵으로부터 분리된 락토바실러스 레우테리 LTH2584(Lactobacillus reuteri LTH2584)로부터 정제되었다. 류테리사이클린은 그람양성균, 그람음성균, 효모균 및 곰팡이와 같은 미생물에 다소 민감하다.[5] 젖산균 또는 유산균(Lactic acid bacteria: LAB)은 오랜 시간 동안 인류 및 동물에 있어 다양한 식량으로 이용되어 왔으며, 효모처럼 음식 발효, 보관 및 저장에 있어서 유용하였다.[1,2,3] The first low molecular weight antibiotic, Reutericyclin, was obtained from Lactobacillus reuteris LTH2584 ( Lactobacillus It was purified from reuteri LTH2584). Lytericycin is somewhat susceptible to microorganisms such as gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, yeast bacteria and fungi. [5] Lactic acid bacteria or Lactic acid bacteria (LAB) have been used for a long time in various foods for humans and animals, and are useful for fermentation, storage and storage of food as yeast. [1,2,3]

LAB는 일반적으로 세포외 길항제 화합물을 분비하여 많은 미생물과 대항하며, 내재성 대사 부산물에 의하여 세포외 환경을 변화시킨다.[6] LAB에 의하여 배설되는 화합물 중에서 다양한 종류의 항균 대사산물은 1000이하의 저분자량 화합물과 1000이하로 평가된 분자량을 가진 박테리오신(bacteriocins)로 분류될 수 있다.[7] LAB에 의한 항균활성에 대한 많은 연구들은 박테리오신에 초점을 맞추었다. LAB가 생산하는 박테리오신은 활성, 작용 모드, 분자량, 유전적 기원 및 생화학적 특성 측면에서 폭 넓은 스펙트럼에 따라 차이를 나타내는 항균 펩타이드와 단백질의 이종(heterogeneous) 그룹 중 한 종류이며,[8,9] 이러한 부류의 펩타이드와 단백질은 성숙 펩타이드(peptide) 및 프리펩타이드(prepeptide)의 서열을 기초로 3개로 분류되었다.[10,11,12,13] LAB generally secretes extracellular antagonist compounds to counteract many microorganisms and changes the extracellular environment by endogenous metabolic by-products. [6] Among the LAB excreted compounds, various types of antimicrobial metabolites can be classified as bacteriocins having a molecular weight of 1000 or less and a molecular weight of 1000 or less. [7] Many studies on antimicrobial activity by LAB have focused on bacteriocin. The bacteriocin produced by LAB is one of the heterogeneous groups of antimicrobial peptides and proteins that differ according to the broad spectrum in terms of activity, mode of action, molecular weight, genetic origin and biochemical properties [8,9] This class of peptides and proteins has been classified into three based on the sequence of mature peptides and prepeptides. [10, 11, 12, 13]

페디오신은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)에 의하여 생산된 것으로 알려져 있는 박테리오신의 한 종류이다.[14] 대부분의 이와 같은 화합물들은 양이온성 분자와 작은 크기의 기질들이 포함된다.[15] 그리고 이런 화합물들은 일반적으로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 종(Listeria species) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 그람 양성 몇몇 병원성 균주를 죽일 수 있다.[16,17,18] 또한, 어떤 박테리오신은 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 속과 같은 식품 병원성 균주들을 죽일 수 있다.[19] 지금까지는 사이클릭 다이펩타이드인 프롤린-함유 2,5-디케토피페라진(Proline-containing 2,5-diketopiperazine)이 집중적으로 연구 조사되어져 왔다.[6,20,22,23,24,25,26,27] 이러한 많은 사이클릭 또는 사이클로 다이펩타이드들은 많은 생물학적 이벤트와 현상 측면에서 기질로서 작용하는 것으로 여겨져 왔다.[22,23,24,25,26] 특히, 이와 같은 사이클릭 다이펩타이드의 잠재적인 치료 및 예방 효능은 박테라아균, 곰팡이균, 바이러스 및 암에 대하여 다양한 항생 활성들을 가지는 것으로 판명되었다.[6,23,26,27,28] 또한, 이러한 항균성 사이클릭 다이펩타이드들은 효모, 지의류 및 곰팡이 배양에서 확인되었다.[20,29] 스트렙토마이스 종으로부터 사이클로(1-류실-1-프로필)과 사이클로(1-페닐알라닐-1-프롤릴)의 분리는 이미 보고되었다.[20,24,25,29] 항균 활성 사이클릭 펩타이드들은 자연계 어디에서나 존재하며 인간을 위한 생물학적 타겟의 폭 넓은 다양성에 영향을 미친다.[22,23,25]
Pediocin is a type of bacteriocin that is known to be produced by Pediococcus pentosaceus . [14] Most such compounds include cationic molecules and small sized substrates. [15] and these compounds are commonly referred to as Bacillus subtilis subtilis), Listeria species (Listeria species) and Staphylococcus aureus (which can kill some pathogenic gram-positive strains such as Staphylococcus aureus). [16,17,18] In addition, some bacteriocins are found in Escherichia E. coli ) and Salmonella spp. [19] Heretofore, proline-containing 2,5-diketopiperazine, a cyclic dipeptide, has been intensively studied. [6,20,22,23,24,25,26,27] Many of these cyclic or cyclodipeptides have been considered to act as substrates in many biological events and phenomena. [22,23,24,25,26] In particular, the potential therapeutic and prophylactic efficacy of such cyclic di-peptides has been shown to have a variety of antibiotic activities against bactera, fungi, viruses and cancers. [6,23,26,27,28] These antimicrobial cyclic di-peptides were also found in yeast, lichens and mold cultures. [20,29] The separation of cyclo (1 -yl-1-propyl) and cyclo (1-phenylalanyl-1-prolyl) from streptomycin species has already been reported. [20,24,25,29] Antimicrobially active cyclic peptides exist anywhere in the natural world and affect a wide variety of biological targets for humans. [22,23,25]

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 진균, 특히 담자균류 진균에 대하여 우수한 항진균 활성을 가지는 신규한 물질을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 다이펩타이드 중 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))이 담자균류의 진균에 대하여 우수한 항진균 활성을 나타냄을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
The present inventors have sought to find a novel substance having excellent antifungal activity against fungi, particularly bacillus. As a result, it was confirmed that cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Phe-L-Pro)) in dipeptide exhibits excellent antifungal activity against fungi .

따라서, 본 발명의 목적은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 특이적인 항진균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a fungus, which comprises as an active ingredient cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- And has antifungal activity as an antifungal agent.

본 발명의 또 다른 목적은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 특이적인 항진균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 농약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing a fungus which comprises cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- Which has antifungal activity as an antifungal agent.

본 발명의 또 다른 목적은 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대한 항진균제 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing antifungal agents against fungi of Basidiomycota.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 특이적인 항진균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물을 제공한다.
According to one aspect of the invention, the invention is cis-of cycle (L- phenylalanine -L- proline) (cis -cyclo (L-Phe -L-Pro)) , and a, Basidiomycetes (Basidiomycota) comprising as an active ingredient The present invention provides a composition for an antifungal agent characterized by having an antifungal activity specific to fungi.

본 발명자들은 진균, 특히 담자균류의 진균에 대하여 우수한 항진균 활성을 가지는 신규한 물질을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 다이펩타이드 중 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))이 담자균류의 진균에 대하여 우수한 항진균 활성을 나타냄을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have sought to find a novel substance having excellent antifungal activity against fungi, particularly fungi. As a result, it was confirmed that cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- cyclo (L-Phe-L-Pro)) in dipeptide exhibits excellent antifungal activity against fungi .

본 발명에서 유효성분으로 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)은 자연계에 존재하는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)를 포함하며, 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)에 대한 화학구조식은 본 발명의 명세서에서의 도 22에 나타내었다. Cis contained as an effective ingredient in the present invention -cycloalkyl (L- phenylalanine -L- proline) are cis in nature - including a cycloalkyl (L- phenylalanine -L- proline), cis-bicyclo (L- -L-phenylalanine Chemical formula for -proline) is shown in FIG. 22 in the context of the present invention.

본 발명은 담자균류의 진균에 대하여 우수한 항진균 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized by having an excellent antifungal activity against fungi of the family Mycobacterium.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 담자균류의 진균, 특히 가노더마 속(Genus Ganoderma)의 진균에 대하여 항진균 활성을 가지며, 보다 바람직하게는 가노더마 보니넨스(Ganoderma boninense), 가노더마 아플라나툼(Ganoderma applanatum) 및 가노더마 조나툼(Ganoderma zonatum)으로 이루진 군으로부터 선택된 하나 이상의 가노더마 속 진균에 대하여 항진균 활성을 가지고, 보다 더 바람직하게는 가노더마 보니넨스(Ganoderma boninense)에 대하여 항진균 활성을 가진다.According to a preferred embodiment, the present invention has antifungal activity against fungi of the fungal, in particular in dermal Kano (Genus Ganoderma) of Basidiomycetes, and more preferably from Kano Derma I nenseu (Ganoderma boninense ), Ganoderma applanatum and Ganoderma zonatum have antifungal activity against one or more of the genus fungi selected from the group consisting of Ganoderma zonatum , even more preferably ganoderma boninens ( Ganoderma boninense ) has antifungal activity.

본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)은 젖산균으로부터 분리된 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 포함한다. System included as an active ingredient of the present invention -cycloalkyl (L- phenylalanine -L- proline) is a system separated from the lactic acid - include cycloalkyl (L- phenylalanine -L- proline).

바람직하게는, 본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)은 페디오코쿠스 속(Pediococcus), 락토바실러스(Lactobacillus ) 속 및 류코노스톡 속(Leuconostoc)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 젖산균으로부터 분리된 것이다.Consisting of a cyclo (L- phenylalanine -L- proline) is Phedi OKO kusu in (Pediococcus), Lactobacillus (Lactobacillus) and in Kono stock flow in (Leuconostoc) - Preferably, the system is included as an active ingredient of the present invention Lt; RTI ID = 0.0 > lactobacillus < / RTI >

본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 페디오코쿠스 속 젖산균으로부터 분리하는 경우, 페디오코쿠스 속 균은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코쿠스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코쿠스 셀리콜라(Pediococcus cellicola), 페디오코쿠스 클라우스세니(Pediococcus claussenii), 페디오코쿠스 담노수스(Pediococcus damnosus), 페디오코쿠스 에탄올리듀란스(Pediococcus ethanolidurans), 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus), 페디오코쿠스 파불루스(Pediococcus parvulus) 및 페디오코쿠스 스틸레시(Pediococcus stilesii)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 페디오코쿠스 속 젖산균을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 페디오코쿠스 속 젖산균으로부터 분리하는 경우, 페디오코쿠스 속 균은 페디오코쿠스 펜토사세우스 균이다.When the cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) contained as an active ingredient in the present invention is isolated from lactic acid bacteria of the genus Pediococcus , the genus Pediococcus is Pediococcus pentosaceus , Pediococcus, acidilactici ), Pediococcus cellicola , Pediococcus claussenii , Pediococcus damnosus , Pediococcus ethanolidurans , Pediococcus, inopinatus , Pediococcus parvulus) and Phedi OKO kusu and steel Lacey (Pediococcus stilesii) comprises a group of one or more lactic acid bacteria selected from the genus Phedi OKO kusu made. Preferably, when cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) contained as an active ingredient in the present invention is isolated from lactic acid bacteria of the genus Pediococcus, the genus Pediococcus is Pediococcus pentosaceus to be.

본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 락토바실러스 속 젖산균으로부터 분리하는 경우, 락토바실러스 속 젖산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 김치이(Lactobacillus kimchii), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부치네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 락토바실러스 속 젖산균을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 락토바실러스 속 젖산균으로부터 분리하는 경우, 락토바실러스 속 균은 락토바실러스 플란타룸 균이다.When the cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) contained as an active ingredient in the present invention is isolated from lactic acid bacteria in the genus Lactobacillus, the lactic acid bacteria in the genus Lactobacillus are Lactobacillus plantarum , Lactobacillus kimchii , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus < RTI ID = 0.0 > casei), Lactobacillus even know Phil Ruth (Lactobacillus acidophilus ), Lactobacillus brevis , Lactobacillus buchneri , Lactobacillus < RTI ID = 0.0 > fermentum), Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus Leu Terry (Lactobacillus reuteri , and Lactobacillus sakei . The lactobacillus belonging to the genus Lactobacillus is selected from the group consisting of Lactobacillus reuteri and Lactobacillus sakei . Preferably, when cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) contained as an active ingredient in the present invention is isolated from lactic acid bacteria in the genus Lactobacillus, the lactobacillus inoculum is Lactobacillus plantarum.

본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 류코노스톡 속 젖산균으로부터 분리하는 경우, 류코노스톡 속 젖산균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 인해(Leuconostoc inhae), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 젖산균을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 유효성분으로서 포함되는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)을 류코노스톡 속 젖산균으로부터 분리하는 경우, 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스이다.When the cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) contained as an active ingredient in the present invention is isolated from lactic acid bacteria in Leuconostoc, the lactic acid bacteria in Leuconostoc is isolated from leuconostocensenteroids mesenteroides , Leuconostoc kimchii , leuconostoc lactis ), Leuconostoc ( Leuconostoc inhae , Leuconostoc gelidum , Leuconostoc, paramesenteroides ), Leuconostoc potassium citreum ), Leuconostoc pseudomesenteroides ( Leuconostoc pseudomesenteroides ) And Leuconostoc holzapfelii. ≪ Desc / Clms Page number 2 > Preferably, when the cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) contained as an active ingredient in the present invention is isolated from lactic acid bacteria in Ryukono-stock, the Ryukono stoco is the Ryukonobacter scepteroid.

본 발명의 명세서에서 용어 "항진균 활성"은 곰팡이의 성장 억제, 증식 억제 및 사멸 작용을 의미하며, 본 명세서에서는 용어 "진균"은 "곰팡이"와 혼용되어 사용된다.
The term " antifungal activity "in the context of the present invention means inhibition of growth of the fungus, inhibition of proliferation and death, and the term" fungus "is used in combination with" fungus "

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 특이적인 항진균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 농약 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- The present invention provides an agricultural chemical composition characterized by having an antifungal activity specific to fungi.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 농약학적 유효량을 포함하는 농약 조성물을 제공한다.In addition, the composition of the present invention provides an agricultural chemical composition comprising an agrochemically effective amount of the cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) of the present invention.

보다 바람직하게는, 본 발명의 농약 조성물은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 농약학적 유효량; 및 (b) 농약학적으로 허용되는 용매, 담체, 유화제 및 분산제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분 또는 첨가물을 추가적으로 포함하는 농약 조성물이다. 본 명세서에서 용어 "농약학적 유효량"은 상술한 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))의 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 항진균 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.More preferably, the pesticidal composition of the present invention is a pesticidally effective amount of cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline); And (b) at least one ingredient or additive selected from the group consisting of pesticidally acceptable solvents, carriers, emulsifiers and dispersants. The term "pesticide effective amount" herein is the above-mentioned cis-bicyclo (L- phenylalanine -L- proline) (cis -cyclo (L-Phe -L-Pro)) antifungal efficacy against fungi of the Basidiomycetes (Basidiomycota) of Or < / RTI > activity.

본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 용매를 포함한다. 상기 용매로는 물, 방향족 용매 (예를 들어 솔베소(Solvesso) 제품, 크실렌), 파라핀(예를 들어 광유분획물), 알코올(예를 들어 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질 알코올), 케톤(예를 들어 시클로헥사논, 감마-부티로락톤), 피롤리돈(NMP, NOP), 아세테이트(글리콜 디아세테이트), 글리콜, 지방산 디메틸아미드, 지방산 및 지방산 에스테르(원칙적으로, 용매 혼합물을 사용할 수도 있음) 등이 포함된다.When the composition of the present invention is produced with an agricultural chemical composition, the agricultural chemical composition of the present invention includes a pesticide acceptable solvent. Examples of the solvent include water, aromatic solvents (e.g., Solvesso products, xylene), paraffins (e.g., mineral oil fractions), alcohols (e.g., methanol, butanol, pentanol, benzyl alcohol) (NMP, NOP), acetates (glycol diacetates), glycols, fatty acid dimethylamides, fatty acids and fatty acid esters (in principle, solvent mixtures may also be used) And the like.

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 예컨대, 상기 담체로는 예컨대 분쇄된 천연 광물(예를 들어 카올린, 점토, 활석, 백악) 및 분쇄된 합성 광물(예를 들어 고도로 분산된 실리카, 실리케이트)을 포함한다.In addition, when the composition of the present invention is manufactured from an agricultural chemical composition, the agricultural chemical composition of the present invention includes a pesticide acceptable carrier. For example, the carrier includes, for example, ground natural minerals (e.g., kaolin, clay, talc, chalk) and ground synthetic minerals (e.g., highly dispersed silica, silicates).

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 유화제를 포함한다. 예컨대, 상기 유화제로는 비이온성 및 음이온성 유화제(예컨대, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르, 알킬술포네이트 및 아릴술포네이트)를 포함한다.In addition, when the composition of the present invention is manufactured from an agricultural chemical composition, the agricultural chemical composition of the present invention includes an agriculturally acceptable emulsifier. For example, the emulsifier includes nonionic and anionic emulsifiers (e.g., polyoxyethylene fatty alcohol ethers, alkyl sulfonates, and aryl sulfonates).

또한, 본 발명의 조성물이 농약 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 농약 조성물은 농약학적으로 허용되는 분산제를 포함한다. 예컨대, 상기 분사제는 리그닌-술파이트 폐액 및 메틸셀룰로오스를 포함한다.In addition, when the composition of the present invention is manufactured from an agricultural chemical composition, the agricultural chemical composition of the present invention includes a pesticide acceptable dispersant. For example, the injecting agent comprises lignin-sulfite waste liquid and methyl cellulose.

본 발명은 상기 항진균용 조성물에 포함된 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하는 농약조성물이므로, 이 둘과 공통적인 사항은 본 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
The present invention is an agricultural chemical composition comprising the cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- cyclo- L-Phe-L-Pro) contained in the antifungal composition as an active ingredient. Are omitted for avoiding excessive description of the present specification.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 배양액내 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)를 항진균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대한 항진균제 생산 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing lactic acid bacteria, comprising the steps of: (a) culturing lactic acid bacteria to produce a lactic acid bacteria culture; And (b) concentrating the cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) in the culture solution to an effective concentration of the antifungal agent. The present invention also provides a method for producing antifungal agent for fungi of Basidiomycota .

본 발명에서 단계 (a)에서의 젖산균은 페디오코쿠스 속(Pediococcus), 락토바실러스(Lactobacillus ) 속 및 류코노스톡 속(Leuconostoc)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 젖산균이다.In the present invention, the lactic acid bacteria in step (a) are one or more lactic acid bacteria selected from the group consisting of Pediococcus , Lactobacillus , and Leuconostoc .

바람직하게는, 본 발명의 단계 (a)에서 젖산균으로 페디오코쿠스 속 균을 이용하는 경우, 상기 페디오코쿠스 속 균은 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코쿠스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코쿠스 셀리콜라(Pediococcus cellicola), 페디오코쿠스 클라우스세니(Pediococcus claussenii), 페디오코쿠스 담노수스(Pediococcus damnosus), 페디오코쿠스 에탄올리듀란스(Pediococcus ethanolidurans), 페디오코쿠스 이노피나투스(Pediococcus inopinatus), 페디오코쿠스 파불루스(Pediococcus parvulus) 및 페디오코쿠스 스틸레시(Pediococcus stilesii)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 페디오코쿠스 속 젖산균을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 페디오코쿠스 속 균은 페디오코쿠스 펜토사세우스 균이다.Preferably, when using the Pediococcus spp. As a lactic acid bacterium in step (a) of the present invention, the Pediococcus spp. Is Pediococcus pentosaceus , Pediococcus asidyllactic acid ( Pediococcus acidilactici ), Pediococcus cellicola), Phedi OKO kusu Klaus Senigallia (Pediococcus claussenii), Phedi OKO kusu damno Versus (Pediococcus damnosus ), Pediococcus ethanol Durans ethanolidurans), Phedi OKO kusu Ino Pina tooth (Pediococcus inopinatus), Phedi OKO kusu wave bulruseu (Pediococcus parvulus) and Phedi OKO kusu and steel Lacey (Pediococcus stilesii) comprises a group of one or more lactic acid bacteria selected from the genus Phedi OKO kusu made. More preferably, the Pediococcus bacterium is Pediococcus pentosaceus.

바람직하게는, 본 발명의 단계 (a)에서 젖산균으로 락토바실러스 속 균을 이용하는 경우, 상기 락토바실러스 속 균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 김치이(Lactobacillus kimchii), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부치네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 락토바실러스 속 젖산균을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 락토바실러스 속 균은 락토바실러스 플란타룸 균이다.Preferably, in the case of using the Lactobacillus genus as a lactic acid bacterium in step (a) of the present invention, the Lactobacillus genus is Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Lactobacillus kimchi ( Lactobacillus kimchii , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus < RTI ID = 0.0 > casei), Lactobacillus even know Phil Ruth (Lactobacillus acidophilus ), Lactobacillus brevis , Lactobacillus buchneri , Lactobacillus < RTI ID = 0.0 > fermentum ), Lactobacillus helveticus , Lactobacillus reuteri , and Lactobacillus sakei . The lactobacillus belonging to the genus Lactobacillus is selected from the group consisting of Lactobacillus reuteri and Lactobacillus sakei . More preferably, the Lactobacillus sp. Strain is Lactobacillus plantarum.

바람직하게는, 본 발명의 단계 (a)에서 젖산균으로 류코노스톡 속 균을 이용하는 경우, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 인해(Leuconostoc inhae), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 젖산균을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스이다.Preferably, in the case of using lactic acid bacteria as the lactic acid bacteria in step (a) of the present invention, the genus Leukon stock bacteria are Leuconostoc mesenteroides ( Leuconostoc mesenteroides ), Leukonostok Kimchi ( Leuconostoc) kimchii , leuconostoc lactis ), Leuconostoc ( Leuconostoc inhae , Leuconostoc gelidum ), Leuconostoc paramesenteroides , Leuconostoc potassium citreum ), Leuconostoc pseudomesenteroides ) And Leuconostoc holzapfelii. ≪ Desc / Clms Page number 2 > More preferably, the Leuconostoc bacterium is Leuconostoc mesenteroides.

본 발명에서 단계 (a)에서의 젖산균 배양액을 제조하는 단계는 당업계에서 이용할 수 있는 배지 조성 및 첨가물을 이용하여 실시할 수 있다.In the present invention, the step of producing the lactic acid bacteria culture solution in step (a) can be carried out using the medium composition and the additives available in the art.

본 발명에서 단계 (b)에서의 농축시키는 단계는 배양액으로부터 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 분리 및 정제하여 농축시키는 단계 또는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)이 포함된 배양액을 농축시키는 단계를 포함한다.Step of concentration in step (b) from the culture broth in the present invention are cis-bicyclo (L- phenylalanine -L- proline) (cis -cyclo (L-Phe -L-Pro)) and the separation step of purification by concentration or And concentrating the culture solution containing cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline).

본 발명의 단계 (b)에서 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)를 분리 및 정제는 공지된 다양한 방법을 통하여 실시된다.The separation and purification of cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) in step (b) of the present invention is carried out through various known methods.

예컨대, 상기 물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 실시된다.For example, a fraction obtained by passing the water through an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, a separation obtained by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity) Purification method.

본 발명에서의 표현 "효과적인 농도로 농축"은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린) 또는 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)를 포함하는 젖산균 배양액이 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 항진균 활성을 나타내는 농도로 농축시키는 것을 의미한다.The expression "enriched to an effective concentration" in the present invention means that the culture solution of lactic acid bacteria containing cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) or cis - cyclo (L- phenylalanine- To a concentration that exhibits antifungal activity.

예컨대, 상기 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린) 또는 배양액에 포함된 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)의 효과적인 가노도마 보니넨스(Ganoderma boninense)의 균체 농도는 50.24 mm2 (16π)에서 6.82 mM (20.47 μmol/3 ml 배지)이다.For example, the cis-bicyclo (L- phenylalanine -L- proline) or the sheath contained in the culture-cell density of nenseu (Ganoderma boninense) effective Kano Thomas it of cyclo (L- phenylalanine -L- proline) is 50.24 mm 2 (16.4) and 6.82 mM (20.47 μmol / 3 ml medium).

본 발명은 상기 항진균용 조성물에 포함된 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 포함하는 항진균제 생산 방법이므로, 이 둘과 공통적인 사항은 본 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
The present invention provides a system including the above-mentioned antifungal composition because antifungal production methods, including cycloalkyl (L- phenylalanine -L- proline) (cis -cyclo (L-Phe -L-Pro)), the common information and the two Are omitted to avoid overriding the description herein.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))을 유효성분으로 포함하고, 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대하여 특이적인 항진균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항진균용 조성물, 농약 조성물 및 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대한 항진균제 생산 방법을 제공한다.(I) The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) ( cis- The present invention provides an antifungal composition, an agricultural chemical composition, and a method for producing an antifungal agent against fungi of Basidiomycota.

(ⅱ) 본 발명은 담자균류의 진균에 대하여 우수한 항진균 활성을 나타냄에 따라 담자균류의 진균 제거 및 발생의 예방을 필요로 하는 다양한 산업분야에 적용될 수 있으며, 특히 적은 양으로도 항진균 활성을 나타내기 때문에 이용면에 있어서 경제적인 장점을 가진다.(Ii) Since the present invention exhibits excellent antifungal activity against fungi of fungi, it can be applied to various industrial fields that require prevention of fungus removal and occurrence of fungi, and in particular, Therefore, it has an economic advantage in use.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 생물학 제제를 이용하는 농약업계에 있어서 시스 -사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)에 대한 생물학 제제으로서의 기초적인 자료를 제공한다.(Iii) The present invention also provides basic data as biological agents for cis - cyclo (L-phenylalanine-L-proline) in the pesticide industry using biological preparations.

도 1은 식물 추출물에서의 항균 활성을 비교한 결과이다. 배양액이 포함된 디스크를 다음과 같이 준비하였다. 1번 디스크는 웨이셀라 시바리아(W. cibaria) LBP-B06 배양액이 포함된 디스크이며, 2번 디스크는 락토바실러스 사케이(L. sakei) LBP-S02 배양액이 포함된 디스크이고, 3번 디스크는 락토바실러스 김치(L. kimchii) LBP-B02 배양액이 포함된 디스크이며, 4번 디스크는 락토바실러스 플란타룸(Lb . plantarum) LBP-K10 배양액이 포함된 디스크이고, 5번 디스크는 락토바실러스 시트레움 LBP-K11(L. citreum LBP-K11) 배양액이 포함된 디스크이며, 6번 디스크는 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06(L. mesenteroides LBP-K06) 배양이 포함된 디스크이다. 왼쪽 패널은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 지표 균주를 이용한 결과이며, 오른쪽 패널이 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 지표 균주를 이용한 결과이다. 모든 실험은 독립적으로 세 번 실행되었다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 정상적인 생장을 600 nm에서의 흡광도와 pH 변화를 나타낸 그래프이다. 28 시간 후, pH(closed circle)와 OD600(open circle)을 2주 동안 유지시켰으며, pH를 ph 3.8 정도로 계속 유지시켰다(왼쪽 패널). 또한, 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 정상 생장 중 항균 활성의 변화를 디스크 확산법(disk diffusion assay)으로 수행하여 관찰하였으며(오른쪽 패널), 하루 동안 배양시킨 후 pH(closed circle)와 항균 활성(open circle)을 일주일 동안 유지시켰다.
도 3은 병원성균들의 생장 저지능력에 대한 결과이다. 배양액을 이용하여 그람 양성균(B. subtilis , L. monocytogens 및 S. aureus), 그람 음성균(S. typhimurium, S. sonnei 및 E. coli)과 기회성 진균으로 병원성을 가진 칸디다 알비칸스(C. albicans)를 한천 플레이트에서 저지환을 관찰하였다.
도 4는 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액에서 유도된 비단백성 항균 물질의 열 안정성에 대한 결과이다. 그람 양성균(B. subtilis)과 그람 음성균(E. coli)에서 비단백성 물질의 항균 활성은 여러 조건의 열처리한 배양액과 비교해 볼 때 대조군에 비해 큰 차이가 없이 유사하였고, 이를 디스크 확산법을 통한 생육저지환의 직경을 통해 관찰하였다.
도 5는 단백분해 효소를 처리했을 때 비단백성 항균 물질의 효과를 가지는 배양액의 특징을 나타낸 것이다. 여러 가지 다양한 단백분해 효소를 처리하여 항균 활성을 관찰하였다. 프로테이나아제 K와 키모트립신을 배양액에 처리하였고, 이때 배양액은 분자량 1,000을 기준으로 하기 실시예에서 설명한 바와 같이 YM-1 컷-오프(YM1C)와 YM-1 상청액(YM1S), 그리고 대조군으로 나누어 실험하였다.
도 6은 CH2Cl2를 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10 배양액을 추출한 결과이다. a는 CH2Cl2(methylene chloride)을 이용하여 추출한 후의 상청액의 항균활성을 나타낸 것이며, b는 CH2Cl2없는 배양 상청액의 항균활성을 나타낸 것이고, c는 CH2Cl2(methylene chloride)을 이용하여 추출한 하층액의 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 ZORBAX C18 옥타데도실 실리카 하이드로포빅 레진을 이용한 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 세미-프렙 HPLC 분석을 나타낸 결과이다. 각 분획은 액체-액체 추출법에 의해 수집하였다. 이러한 분석 내용은 자외선 파장 210, 260 그리고 280 nm에서 각각 기록하였다. 모든 분획된 물질은 10여개로 각각 나눌 수 있었다. 이렇게 모인 10개의 분획 물질을 하기 실시예에서 기술한 대로 수집하고 농축하였다.
도 8 및 도 9는 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06과 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10으로부터 분리한 물질들의 항진균 활성을 나타낸 것이다. 으로부터 분리한 물질들의 항진균 활성을 나타낸 것이다. 가노더마 보니넨스(Ganoderma boninense)의 균사체(mycelium)를 PDA(potato dextrose agar) 플레이트에 접종한 후, 28℃에서 3일간 생장을 관찰하였다(초기 접종된 가노더마 균사체의 크기는 각 웰당 당 직경 8.0 ㎜의 원형태).
도 10 및 11은 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06과 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10으로부터 분리한 물질들의 기회성/병원성을 가진 진균에 대한 억제 활성을 나타낸 결과이다. 칸디다 알비카스(Candida albicans) 세포를 최소영양배지인 SD 한천 플레이트에 접종한 후, 역시 28℃에서 3일간 생장을 관찰하였다(초기 접종된 칸디다 세포는 각 웰 당 1 x 104개).
도 12는 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10 및 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06에서 분획된 물질들의 크로마토그램에 대한 결과이다. 모든 균주는 CH2Cl2 추출법을 이용하여 분획하였다.
도 13은 분리하여 동정한 여러 유산균에서 분획된 물질들의 크로마토그램에 대한 결과이다. 동일한 추출 방법을 이용하여 동정된 다양한 유산균 균주들의 세미-프렙(semi-prep) HPLC 크로마토그램을 관찰하였다. 이 실험에 사용된 균주로는 페디오코쿠스 펜토사세우스 MCPP, 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06, 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10, 웰이셀라 시바리아(Weissella cibaria) LBP-K15, 웰이셀라 콘푸사(Weissella confusa) LBP-K16, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) LBP-S01, 락토바실러스 플란타룸/펜토스(Lactobacillus plantarum / pentos) LBP-S02, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LBP-S03, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) LBP-S06 및 스타필로코쿠스 시우리(Staphylococcus sciuri) LBP-S07을 이용하였다.
도 14는 전자충격이온화법(electron ionization, EI)을 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 N10을 분석한 결과이다.
도 15는 화학이온화법(chemical ionization, CI)을 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 N10을 분석한 결과이다.
도 16은 1H -핵자기공명법(500MHz, in 100 % DMSO)을 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 N10을 분석한 결과이다.
도 17은 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 N10에서 1H/13C 핵자기공명법 (600MHz, in 100 % MeOD)를 이용하여 2D HSQC 분석을 한 결과이다.
도 18 및 도 19는 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 N10에서 1H/1H 핵자기공명법(600 MHz, 각각 100% DMSO(도 18) 및 10% D2O가 함유된 DMSO(도 19))을 이용하여 2D COSY 분석을 한 결과이다.
도 20 및 도21은 X-선 회절법을 이용하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10에서 N10의 예상 구조식을 나타낸 것이다.
도 22는 도 21은 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10으로부터 분리된 P10의 구조를 최종적으로 나타낸 것이다. 분리된 항진균 물질은 C14H16O2N2 분자식을 가진 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro)로 확인되었다. 1 is a result of comparing the antimicrobial activity in the plant extract. The disk containing the culture solution was prepared as follows. Disc 1 is Wishella Sibaria (W. cibaria) LBP-B06 medium containing the culture medium, disc 2 is Lactobacillus sakei (L. sakei) The disk containing the LBP-S02 culture medium, disk 3 is Lactobacillus kimchi (L. kimchii) LBP-B02 medium containing the medium, disk 4 is Lactobacillus plantarum (Lb . plantarum) The disk containing the LBP-K10 culture medium, disk 5 is Lactobacillus citreum LBP-K11 (L. citreum LBP-K11) disk containing the culture medium, and disk 6 is Leukonostock Mesenteroides LBP-K06 (L. mesenteroides LBP-K06) is a disk containing the culture. The left panel is Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) And the right panel shows Escherichia coli (Escherichia coli) It is the result using the indicator strain. All experiments were performed three times independently.
2 is Lactobacillus plantarum The normal growth of LBP-K10 is a graph showing the absorbance and pH change at 600 nm. After 28 hours, pH (closed circle) and OD600(open circle) was maintained for 2 weeks and the pH was kept at pH 3.8 (left panel). In addition, Lactobacillus plantarum Changes in antimicrobial activity during normal growth of LBP-K10 were observed by a disk diffusion assay (right panel). After incubation for one day, pH (closed circle) and antimicrobial activity (open circle) were maintained for a week. I was.
3 is a result of the growth inhibition ability of pathogenic bacteria. Gram-positive bacteria (B. subtilis , L. monocytogens AndS. aureus), Gram negative bacteria (S. typhimurium, S. sonnei AndE. coli) And Candida albicans with pathogenic fungiC. albicans) Was observed in the agar plate.
4 shows the Lactobacillus plantarum Results of thermal stability of nonproteinaceous antimicrobial agents derived from the culture of LBP-K10. Gram-positive bacteria (B. subtilis) And Gram-negative bacteria (E. coliThe antimicrobial activity of the non-proteinaceous substance was similar to that of the non-protein-treated heat-treated medium without any significant difference compared to the control group, and this was observed through the diameter of the growth-lowering ring through the disk diffusion method.
Figure 5 shows the characteristics of the culture medium having the effect of a non-protein antimicrobial when treated with proteolytic enzymes. Various anti-proteinases were treated to observe antimicrobial activity. Proteinase K and chymotrypsin were treated in the culture medium, wherein the culture medium was treated with YM-1 cut-off (YM1C) and YM-1 supernatant (YM1S), and as a control, as described in the following Examples based on molecular weight 1,000. The experiment was divided.
6 is CH2Cl2Lactobacillus Planta Room This is the result of extracting the LBP-K10 culture solution. a is CH2Cl2Antibacterial activity of the supernatant after extraction with (methylene chloride), b is CH2Cl2Shows the antimicrobial activity of the culture supernatant, c is CH2Cl2It shows the antibacterial activity of the lower layer solution extracted with (methylene chloride).
FIG. 7 shows the results of semi-prep HPLC analysis of Lactobacillus plantarum LBP-K10 using ZORBAX C18 octadedosil silica hydrophobic resin. Each fraction was collected by liquid-liquid extraction. These analyzes were recorded at ultraviolet wavelengths 210, 260 and 280 nm, respectively. All fractionated materials could be divided into about 10 each. The ten fractionated materials thus collected were collected and concentrated as described in the Examples below.
8 and 9 show the antifungal activity of the substances isolated from Leukonostock Mesenteroides LBP-K06 and Lactobacillus plantarum LBP-K10. It shows the antifungal activity of the substances isolated from. Ganoderma BoniniensGanoderma boninenseMycelium) was inoculated on a PDA (potato dextrose agar) plate, and growth was observed at 28 ° C for 3 days (initial inoculated ganoderma). Mycelium size is in the shape of a circle with a diameter of 8.0 mm per well).
Figures 10 and 11 show the inhibitory activity against opportunistic / pathogenic fungi of substances isolated from Leukonostock Mesenteroides LBP-K06 and Lactobacillus plantarum LBP-K10. Candida albicas (Candida albicans) Cells were seeded on SD agar plates, which were minimal nutrient medium, and growth was observed for 3 days at 28 ° C. (initial seeded Candida cells were 1 × 10 per well4dog).
12 is Pediococcus pentosaceus.,Lactobacillus plantarum LBP-K10 And chromatograms of the substances fractionated in Leukonostock Mesenteroides LBP-K06. All strains are CH2Cl2 Fractionation was performed using extraction.
FIG. 13 is a result of chromatograms of substances fractionated from various lactic acid bacteria identified separately. Semi-prep HPLC chromatograms of the various lactic acid bacteria strains identified using the same extraction method were observed. Strains used in this experiment were Pediococcus pentosaceus MCPP, Leukonostock mesenteroides LBP-K06, Lactobacillus plantarum LBP-K10, Weilscilla sibaria (Weissella cibaria) LBP-K15, WelCella Confusa (Weissella confusaLBP-K16, Lactobacillus sakei (Lactobacillus sakei) LBP-S01, Lactobacillus plantarum / pentos (Lactobacillus plantarum / pentosLBP-S02, lactococcus lactis (Lactococcus lactisLBP-S03, lactococcus lactis (Lactococcus lactis) LBP-S06 and Staphylococcus shiuri (Staphylococcus sciuri) LBP-S07 was used.
FIG. 14 shows the results of analyzing N10 of Lactobacillus plantarum LBP-K10 using electron ionization (EI).
FIG. 15 is a result of analyzing N10 of Lactobacillus plantarum LBP-K10 using chemical ionization (CI).
16 is a cross-OneThe N10 of Lactobacillus plantarum LBP-K10 was analyzed by H-nuclear magnetic resonance method (500MHz, in 100% DMSO).
17 is the N10 of Lactobacillus plantarum LBP-K10.OneH /132D HSQC analysis using C nuclear magnetic resonance method (600MHz, in 100% MeOD).
18 and 19 show N10 of Lactobacillus plantarum LBP-K10.OneH /OneH nuclear magnetic resonance method (600 MHz, 100% DMSO (FIG. 18) and 10% D, respectively)22D COSY analysis using DMSO containing O (FIG. 19).
20 and 21 show expected structural formulas of N10 in Lactobacillus plantarum LBP-K10 using X-ray diffraction.
FIG. 22 finally shows the structure of P10 isolated from Lactobacillus plantarum LBP-K10. Isolated antifungal substance is C14H16O2N2 With molecular formulaSheath-Cyclo (L-phenylalanine-L-proline) (cisIt was identified as -cyclo (L-Phe-L-Pro).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for describing the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention.

실시예Example

재료 및 방법Materials and methods

실험 균주 및 유산균 분리Isolation of experimental strains and lactic acid bacteria

갓 김치와 돌나물 김치 및 배추 김치로 다양한 유산균들을 분리하였다. 준비된 각각의 재료를 믹서기로 갈아서, 갓 김치와 돌나물 김치의 경우에는 5% NaCl을 첨가한 것과 첨가하지 않은 것으로 나누었고, 각각 4℃, 22℃ 및 30℃에서 보관하였다. 모든 식물 실험군은 하루 간격으로 30일간 시료를 검체하였고, 각 실험군의 농도를 멸균한 증류수에 적당하게 희석하여 유산균 분리 배지인 MRS(de Mann Rogosa Sharpe) 고체 배지에 도말한 후, 30℃에서 2-3일 정도 배양하였다. 배양 후 잘 분리된 균체를 선별하여 16s rDNA 염기서열법을 수행하였으며, 유전체 정보와 비교하기 위해 액체 MRS 배지에 재배양하였다.
Various lactic acid bacteria were isolated from fresh kimchi, crushed kimchi and Chinese cabbage kimchi. Each of the prepared materials was grinded with a blender, and in the case of freshly prepared kimchi and garlic kimchi, it was divided into those with and without 5% NaCl, and stored at 4 ° C, 22 ° C and 30 ° C, respectively. All plant samples were sampled at intervals of 30 days, and the concentration of each test group was appropriately diluted in sterilized distilled water and plated on a MRS (de Mann Rogosa Sharpe) solid medium, And cultured for about 3 days. 16s rDNA sequencing was performed by selecting well - isolated microorganisms and cultured in liquid MRS medium for comparison with genome information.

분리된 유산균의 동정Identification of isolated lactic acid bacteria

본 실험에서는 발효된 식물에서 분리된 유산균을 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 결정법을 통해 유산균들을 동정하였다. PCR(중합효소연쇄반응)을 위한 프라이머로는 일반적인 진정세균을 대상으로 하는 프라이머로서 27F(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'(서열번호 1))와 1492R(5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'(서열번호 2))을 이용하였다. PCR반응은 94℃에서 5분간 프리-디네이쳐레이션(pre-denaturation) 과정을 거친 후, 94℃에서 1분간 디네이쳐레이션(denaturation), 55℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 익스텐션(extention) 과정을 30회 거쳐 최종적으로 72℃에서 7분간 엑스트라-익스텐션(extra-extention)을 해주었으며, 4℃에서 보관하였다. 중합효소연쇄반응 후 0.7% 아가로오스 젤 전기영동으로 증폭된 16S rDNA를 확인하고 DNA를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 선별된 균주의 16S rDNA 염기서열의 상동관계는 NCBI의 뉴클레오타이드 BLAST 프로그램을 이용하여 비교하였다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
In this experiment, lactic acid bacteria were identified by 16S rDNA sequencing method for identification of lactic acid bacteria isolated from fermented plants. As primers for PCR (polymerase chain reaction), 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '(SEQ ID NO: 1)) and 1492R (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3 '(SEQ ID NO: 2)) was used. PCR was performed by pre-denaturation at 94 ° C for 5 minutes, denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 55 ° C for 1 minute, annealing at 72 ° C for 1 minute The extensions were extruded for 30 minutes at 72 ° C for 7 minutes, and stored at 4 ° C. After PCR, 16S rDNA amplified by 0.7% agarose gel electrophoresis was identified and DNA was isolated and sequenced. The homology of the 16S rDNA sequences of the selected strains was compared using the NCBI nucleotide BLAST program ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).

배지와 배양 조건Medium and culture conditions

본 실험에서는 배추 김치에서 동정한 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10(Lactobacillus plantarum LBP-K10)을 주 균주로 사용하였다. 분리된 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10 유산균을 MRS 브로스(Difco, Laboratories, Detroit, MI)에 계대 배양하였다.In this experiment, Lactobacillus plantarum LBP-K10 ( Lactobacillus plantarum LBP-K10) identified in cabbage kimchi was used as a main strain. The isolated Lactobacillus planta LBP-K10 lactic acid bacteria were subcultured to MRS broth (Difco, Laboratories, Detroit, MI).

항균 물질을 찾기 위해 사용한 유산균으로 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)를 이용하였고, 항균 활성을 측정하기 위한 지표 균주로는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 쉬젤라 소네이(Shigella sonnei), 스타필로코쿠스 아레우스(Staphylococcus areus) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)등을 이용하였다. MRS 브로스에 유산균을 적당량 접종한 근원 균주(seed inoculums)를 이용하였으며, 근원 균주를 다시 MRS 액체 배지에 0.1-0.2% 가 되도록 접종한 후 30℃에서 3일간 정치 배양하였다. 항균 활성 실험을 위하여 리스테리아 속(Listeria spp.)을 제외한 대부분의 병원성 균주들을 루리아-베르타니(Luria-Bertani: LB) 브로스에서 배양하였고, 리스테리아속은 브레인 하트 인퓨젼(Brain Heart infusion) 배양액(Difco, Laboratories, Detroit, MI)에서 따로 배양하였다.
The lactic acid bacteria used to find antimicrobials were Pediococcus pentosaceus , Lactobacillus plantarum , And Leuconostoc mesenteroides ( Leuconostoc We used the mesenteroides), as an indicator strain for measuring antimicrobial activity is E. coli Escherichia (Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis ), Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), NEI rest Gela Small (Shigella sonnei , Staphylococcus areus ) and Listeria innocua were used. MRS broth was inoculated with an appropriate amount of lactic acid bacterium inoculated with seed inoculums. The inoculum was inoculated again to the MRS liquid medium at 0.1-0.2%, and then cultured at 30 ° C for 3 days. Most of pathogenic strains except Listeria spp. Were cultivated in Luria-Bertani (LB) broth for the antimicrobial activity experiment. Listeria spp. Were cultured in Brain Heart infusion culture (Difco, Laboratories, Detroit, MI).

항균 활성 평가Evaluation of antimicrobial activity

항균 활성을 알아보기 위하여 배지희석법(broth microdilution test), 디스크 확산법(disk diffusion assay) 및 길항작용법(antagonism test)을 실시하였다. Broth microdilution test, disk diffusion assay and antagonism test were performed to investigate antimicrobial activity.

각각의 실험 방법은 다음과 같다.Each experimental method is as follows.

배지희석법은 배양액을 농축시켜 준비한 후, 연속 희석을 통해 유산균 배양액의 항균 활성 정도를 알아보았다.The medium dilution method was prepared by concentrating the culture, and the degree of antimicrobial activity of the culture solution of lactic acid bacteria was examined through serial dilution.

길항작용법은 유산균의 항균 활성 유무를 알아보기 위한 실험으로서 실험에 사용 할 유산균을 24시간 배양 후 600 ㎚에서 흡광도를 측정하여 1로 맞춘 후 MRS배지에 1 ㎕씩 점적하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 그 위에 3-5시간 미리 배양해둔 지표 균주를 1%의 소프트 아가(soft agar)와 잘 섞어 오버레이(overlay)시킨 후, 다시 24시간 동안 지표 균주의 적정 온도에서 배양하였다. 배양 후 생성되는 생육 저지환을 확인함으로써 항균 활성의 유무를 확인하였다.The antagonistic method is an experiment to determine the antimicrobial activity of lactic acid bacteria Lactic acid bacteria to be used for the experiment were cultured for 24 hours, and the absorbance at 600 nm was measured to be 1, and then 1 μl was added to the MRS medium and cultured at 30 ° C for 24 hours. The indicator strain pre-cultured for 3 to 5 hours was overlayed with 1% soft agar and incubated for 24 hours at the appropriate temperature of the indicator strain. The presence of antimicrobial activity was confirmed by confirming the inhibition of growth after cultivation.

디스크 확산법은 배양액이나 항균물질을 6 ㎜의 종이 디스크(Toyo Roshi kaisha, ltd)에 점적시키고, 지표 균주는 3-5시간 배양시켜 준비하였다. 액체 상태의 스프트 아가에 지표 균주를 1%로 접종하여 굳힌 뒤에 디스크를 올려 지표 균주의 배양 온도에서 24시간 배양하였다. 배양 후 생성되는 생육 저지환의 지름 (㎜)을 통해 항균 활성을 확인할 수 있었다.
The disk diffusion method was prepared by dropping a culture medium or an antimicrobial substance on a paper disk (Toyo Roshi kaisha, ltd) of 6 mm, and culturing the indicator strain for 3-5 hours. The seeds were inoculated with 1% of the indicator strain in liquid state and incubated for 24 hours at the incubation temperature of the indicator strain. The antimicrobial activity was confirmed by the diameter (mm) of the growth inhibition ring after culturing.

생장에 따른 Growth pHpH 와 항균 활성의 변화And antimicrobial activity

밤사이에 배양해 놓은 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10를 변형 MRS 브로스에 1.0%로 접종하여 30℃에서 정치 배양하였다. 접종 후 휴지기(stationary phase)로 진입할 때까지 4시간 마다 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 원심분리 후 상층액을 얻어 pH와 항균 활성을 측정하였다. 시간에 따른 항균 활성은 접종 후 일주일 동안 24시간마다 한 번씩 시료를 얻어 디스크 확산법을 실시하였다.
Lactobacillus planta room incubated during the night LBP-K10 was inoculated in a modified MRS broth at 1.0% and was subjected to stationary culture at 30 占 폚. After inoculation, the absorbance was measured at 600 nm every 4 hours until entering the stationary phase. After centrifugation, the supernatant was collected and the pH and antimicrobial activity were measured. The antimicrobial activity over time was obtained by disc sampling every 24 hours for one week after inoculation.

효소 처리Enzyme treatment

단백질성 물질과 비단백성 물질의 활성 중 병원성균에 미치는 영향을 비교하기 위하여 아세테이트 막 YM-1(acetate membrane YM-1; Amicon, Inc., USA)을 이용하여 분자량 1000이상과 1000이하를 분리한 배양액에 단백질 분해 효소인 프로테이나아제 K(proteinase K, Sigma-Aldrich, Inc., USA), 키모트립신(chymotrypsin, Boehringer Mannheim GmbH., Germany) 및 트립신(trypsin, Sigma-Aldrich, Inc., USA)을 최종 농도 1 ㎎/㎖로 맞추어 처리하여 민감도를 관찰하였다. 프로테이나아제 K를 제외한 나머지는 실온(25℃)에서, 프로테이나아제 K를 처리한 시료는 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이션한 뒤, 95℃에서 5분간 열처리를 함으로써 효소의 활성을 제거하였으며 디스크 확산법을 통해 항균 활성을 측정하였다.
In order to compare the effect of proteinaceous substances and non-mycobacterial substances on pathogenic bacteria, molecular weight of 1000 or more and 1000 or less were isolated using an acetate membrane YM-1 (acetate membrane YM-1; Amicon, Inc., USA) Proteinase K (Sigma-Aldrich, Inc., USA), chymotrypsin (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) and trypsin (Sigma-Aldrich, Inc., USA) ) Was adjusted to a final concentration of 1 mg / ml to examine the sensitivity. Proteinase K-treated samples were incubated at 37 ° C. for one hour at room temperature (25 ° C.) except for Proteinase K, and the enzyme activity was removed by heat treatment at 95 ° C. for 5 minutes Antimicrobial activity was measured by disk diffusion method.

열처리Heat treatment

항균물질에 열이 미치는 영향을 알아보기 위하여 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 3일째 배양액을 각각 100℃에서 60분과 120분, 그리고 121℃에서 15분간 중탕 가열 혹은 멸균의 방식으로 열처리를 하였다. 또한, 가열 후에는 상온으로 옮긴 후 열처리 하지 않은 배양액을 대조군으로 하였으며, 디스크 확산법를 통해 항균 활성을 측정하였다.
To investigate the effect of heat on antimicrobial substances, Lactobacillus planta The third day of LBP-K10 culture was heat-treated at 100 ° C for 60 minutes and 120 minutes, respectively, and at 121 ° C for 15 minutes by hot-water heating or sterilization. After heating, the medium was transferred to room temperature and then heat-treated. As a control, the antimicrobial activity was measured by disk diffusion method.

항진균 물질의 분리 준비Preparing for separation of antifungal substances

락토바실러스 플란타룸 LBP-K10에서 항진균 물질을 분리하기 위해서 변형 MRS (mMRS)를 사용하였다. mMRS는 1리터 당 펩톤 10 g, (NH4)2HC6H5O7 2 g, NaC2H3O2 5 g, MnSO4 0.1 g, MnSO4(H2O) 0.05 g, K2HPO4 2 g, 효모 추출물 5 g 및 글루코오스 20 g의 조성으로 만들었고, 글루코오스는 분리하여 멸균하였다. 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10을 mMRS에 30℃에서 3일 동안 정치 배양하였고, 8,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 얻은 배양액을 실험에 사용하였다(페디오코쿠스 펜토사세우스 및 류코노스톡 메센테로이데스에서도 같은 방법으로 실험을 진행).Lactobacillus Florata Room Modified MRS (mMRS) was used to isolate antifungal compounds in LBP-K10. mMRS is peptone per liter 10 g, (NH 4) 2 HC 6 H 5 O 7 2 g, NaC 2 H 3 O 2 5 g, MnSO 4 0.1 g, MnSO 4 (H 2 O) 0.05 g, K 2 HPO 4 2 g, yeast extract 5 g, and glucose 20 g, and glucose was isolated and sterilized. Lactobacillus Florata Room LBP-K10 was incubated in mMRS at 30 DEG C for 3 days and centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes. The culture was then used in the experiment (Pediococcus pentosaceus and Ryukono Stokes seneroidesis in the same manner The experiment is carried out).

그 다음, 배양액을 동결 건조하여 10배 정도 농축시킨 후, 농축액 부피의 5배의 CH2Cl2(methylene chloride)로 액체-액체 추출을 수행하였다. 배양액과 CH2Cl2의 혼합물을 실온에서 하루 보관한 후, 분별 깔때기를 이용하여 수용액 층과 유기용매 층이 잘 분리될 때까지 방치하였다. 층이 잘 분리 되면 마개를 열고 CH2Cl2 층을 받아내어 증발기를 이용하여 55℃에서 유기용매를 제거하였다. 수용액 층도 따로 받아 항진균 활성을 비교하는 실험에 이용하였다. 유기용매를 제거하고 남은 추출물(MCK10)은 적당량의 증류수에 용해하여 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 이 용리액은 C18 SPE (Solid phase extraction; Waters Sep-pak C18 plus cartridge, Millipore Corp., Marlborou, MA)법을 이용하여 SPE 카트리지를 통해 100% 메틸알코올로 용리하여 다시 분리하였다. 용리시킬 액상 물질을 통과시키기 전에 SPE 카트리지는 100% 메틸알코올로 활성화시키고 100% 증류수로 세척하였다. 그런 후에 용리시킬 액을 SPE에 통과시키고 다시 100% 증류수로 세척하였다. 마지막으로 100% 메틸알코올로 SPE 콜럼을 통과시켜 용리된 액을 모았고, 증발 건조기를 통해 유기 용매를 증발시켜 농축시킨 후 100% 멸균된 물에 적당량 녹여 준비하였다.
Then, the culture broth was lyophilized, concentrated about 10 times, and subjected to liquid-liquid extraction with CH 2 Cl 2 (methylene chloride) 5 times the volume of the concentrate. The mixture of the culture medium and CH 2 Cl 2 was stored at room temperature for one day, and then allowed to stand until the aqueous solution layer and the organic solvent layer were well separated using a separating funnel. When the layer was well separated, the cap was opened and the CH 2 Cl 2 layer was taken out and the organic solvent was removed at 55 ° C using an evaporator. The aqueous solution layer was also used for the experiment to compare antifungal activity. The organic solvent was removed and the remaining extract (MCK10) was dissolved in an appropriate amount of distilled water and filtered through a 0.22 mu m filter. The eluate was separated again by eluting with 100% methyl alcohol through SPE cartridge using C18 SPE (Waters Sep-pak C18 plus cartridge, Millipore Corp., Marlborough, MA) method. Before passing the liquid material to be eluted, the SPE cartridge was activated with 100% methyl alcohol and washed with 100% distilled water. The eluent was then passed through an SPE and again washed with 100% distilled water. Finally, the eluted liquid was collected by passing through an SPE column with 100% methyl alcohol, and the organic solvent was evaporated through an evaporator to concentrate and dissolved in an appropriate amount of 100% sterilized water.

고성능 액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography ( HPLCHPLC ) 분석을 통한 항진균 물질의 분리Separation of antifungal substances through analysis

여과시킨 MCK10 배양액은 항진균 물질의 분석을 위해 0.22 ㎛ 아세테이트 셀룰로오스 막으로 여과시킨 후 이 여과액을 바탕으로 고성능 액체크로마토그래피(semi-prep HPLC system, Agilent 1200 series, USA) 분석 장비를 통해 분석 및 분리에 이용하였고, ODS C-18 콜럼(octadedosyl-C18 hydrophobic semi-preparative column; 9.4 x 250 ㎜, Agilent, USA)으로 역상 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 콜럼의 온도는 40℃로 일정하게 유지시켰고, 이동상은 3차 증류수 67%, 메탄올 30% 및 아세토니트릴 3%의 조건에서 35분간 작동되었다. 이동상은 1.5 ㎖/분의 유속으로 각각의 210 ㎚, 260 ㎚ 및 280 ㎚ 파장에서 검출하였다. 분석 시 검출된 각 피크를 분획(fraction) 별로 프렙(prep)하여 증발건조기를 이용하여 유기용매를 제거한 후, 동결 건조하여 시료를 얻었다.
The filtrated MCK10 medium was filtered through a 0.22 ㎛ acetate cellulose membrane for analysis of antifungal substances and analyzed and separated by high-performance liquid chromatography (semi-prep HPLC system, Agilent 1200 series, USA) And analyzed by reversed phase high pressure liquid chromatography on an ODS C-18 column (octadedosyl-C18 hydrophobic semi-preparative column; 9.4 x 250 mm, Agilent, USA). The temperature of the column was kept constant at 40 ° C, and the mobile phase was operated for 35 minutes under conditions of 67% of distilled water, 30% of methanol and 3% of acetonitrile. The mobile phase was detected at the wavelengths of 210 nm, 260 nm and 280 nm at a flow rate of 1.5 ml / min. Each peak detected during the analysis was prepilled by fractions, and the organic solvent was removed using an evaporator, followed by lyophilization to obtain a sample.

항진균 활성의 측정Measurement of antifungal activity

고성능액체크로마토그래피 시스템을 통해 분리된 각 분획 물질들을 수집한 후 동결건조기를 사용하여 농축하였고 6웰 세포 배양 플레이트(SPL Lifescience, Korea)를 이용하여 항진균 활성을 측정하였다. 이러한 6-웰 플레이트로 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 가노더마 보니넨스(Ganoderma boninense)의 두 가지 균주를 적용함으로써 항진균 활성을 측정하였다. 먼저 각 웰당 2.5 ㎖의 SD 최소영양배지(2% D-글루코오스, 0.5% (NH4)2SO4, 아미노산과 (NH4)2SO4을 포함하지 않는 0.17% 효모 질소염(yeast nitrogen base: YNB; Becton Dickinson, USA)을 1.8% 마이크로아가(Difco, USA)를 섞어 칸디다 알비칸스에 대한 항진균력을 확인하였다. 가노더마 보니넨스의 경우는 4% PDA(Potato-Dextrose Agar, Kisanbiotech co ltd, Korea)를 사용하여 항진균 활성을 측정하였다. 피크별로 분리된 물질들 중에서 활성이 높은 것은 앞에서 언급한 방법대로 더욱 세밀히 분리하여 단일 피크로 얻은 후 이를 이후의 GC-MS, 원소분석 및 NMR구조 분석 등의 구조적 분석을 위해 사용하였다.
Each fraction separated through a high performance liquid chromatography system was collected, concentrated using a freeze dryer, and the antifungal activity was measured using a 6-well cell culture plate (SPL Lifescience, Korea). Antifungal activity was measured by applying two strains, Candida albicans and Ganoderma boninense , to the 6-well plate. First, 2.5 ml of SD minimal medium (2% D-glucose, 0.5% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.17% yeast nitrogen base without amino acids and (NH 4 ) 2 SO 4 , (Becton Dickinson, USA) were mixed with 1.8% microcrystalline (Difco, USA) to determine antifungal activity against Candida albicans. In case of Ganodermanninense, 4% PDA (Potato-Dextrose Agar, Kisanbiotech co ltd, The activity of the antifungal activity was measured by using the method described in the above-mentioned method. The activity of the antifungal activity was measured by GC-MS, elemental analysis and NMR analysis Were used for structural analysis.

전자충격이온화법(Electron Impact Ionization electronelectron ionizationionization : : EIEI )과 화학이온화법() And chemical ionization chemicalchemical ionizationionization : CI)에 의한 분석: Analysis by CI)

락토바실러스 플란타룸에서 순수 분리한 물질들을 전자충격이온화법과 화학이온화법에 의한 질량수를 관찰하기 위하여 7679 시리즈 오토메틱 리퀴드 샘플러(7679 series automatic liquid sampler)를 장착한 엘지런트 6890 시리즈 GC(Agilent 6890 series GC; Agilent Technologies, Waldron, Germany)를 본 실험에 사용하였다. 또한 질량 분석은 고배율 질량분석기(high-resolution mass spectrometer; JEOL JMS-700, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다. 가스 크로마토그래피와 고배율 질량분석기 두 가지 기기 모두 JMS-700 M 스테이션 소프트웨어(JEOL JMS-700, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
Lactobacillus To elucidate the mass spectrometry by electron impact ionization and chemical ionization of materials purely isolated from the planta room, we used an Agilent 6890 series GC (7690 series automatic liquid sampler) equipped with a 7679 series automatic liquid sampler ; Agilent Technologies, Waldron, Germany) were used in this experiment. Mass spectrometry was performed using a high-resolution mass spectrometer (JEOL JMS-700, Tokyo, Japan). JMS-700 M station software (JEOL JMS-700, Tokyo, Japan) was used for both gas chromatography and high-power mass spectrometer.

1One H, H, 1313 C, C, HSQCHSQC 및 2D- And 2D- COSYCOZY 핵자기공명 분석 Nuclear magnetic resonance analysis

락토바실러스 플란타룸에서 순수 분리한 물질 시료(1.0 mg)를 D2O와 D2O가 함유된 0.6 ㎖ DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹인 후 이를 양성자 및 탄소 구조, 결합, 그리고 결합 순서를 NMR 분광기를 이용하여 확인하였다. 핵자기공명법에 사용되는 파장은 XWIN-NMR 3.5 소프트웨어를 사용하는 300 K 규모의 CryoProbe16을 장착한 Bruker AVANCE-500 분광기를 이용하였다.[20,38,39] 모든 2차원 핵자기공명법에는 Bruker의 스탠다드 펄스 시퀀스(standard pulse sequence)를 수행하였다. 핵자기공명법에 의한 결과는 XWIN-NMR 3.5 소프트웨어 패키지(Karlsruhe, Germany)를 이용하여 분석하였다. 핵자기공명은 Z 그래디언트(gradient)로 5 mm의 BBI(broadband inverse detector)를 이용하여 양성자 핵자기공명법의 경우 500.13 MHz의 주파수에서 탄소 핵자기공명법은 125.77 MHz의 주파수에서 AVANCE 500 분광기(Bruker-Biospin)상에서 기록하였다. 293 K에서 중수와 DMSO를 포함한 중수에서 모든 핵자기공명 파장을 기록하였다.[40]
(1.0 mg) was dissolved in 0.6 ml DMSO (dimethyl sulfoxide) containing D 2 O and D 2 O, and the proton and carbon structure, bonding, and bonding order were measured by NMR spectroscopy Respectively. The wavelengths used in the nuclear magnetic resonance spectroscopy were a Bruker AVANCE-500 spectrometer equipped with a 300 K-scale CryoProbe 16 using XWIN-NMR 3.5 software. [20,38,39] Bruker's standard pulse sequence was performed on all 2-dimensional nuclear magnetic resonance methods. The results of nuclear magnetic resonance were analyzed using XWIN-NMR 3.5 software package (Karlsruhe, Germany). Nuclear magnetic resonance was measured using a broadband inverse detector (BBI) with a Z gradient of 5 mm at the frequency of 500.13 MHz for the proton nuclear magnetic resonance spectrometer and an AVANCE 500 spectrometer at the frequency of 125.77 MHz -Biospin). At 293 K, all nuclear magnetic resonance wavelengths were recorded in heavy water including heavy water and DMSO. [40]

성분원소 분석을 통한 구조 분석Structural analysis through elemental analysis

락토바실러스 플란타룸에서 순수 분리한 물질의 구성 원소 성분을 관찰하기 위하여 원소분석기(elemental analyzer, CE Instruments EA1110, EA1112)를 이용하여 분석하였다. 탄소, 수소, 산소 및 질소 분석을 위해 원소분석기를 수행하였다. 또한 산소 균형(Oxygen balance, OB)을 통해 폭발성 평가에 사용하였다. 탄소, 수소, 산소 및 질소 등의 원소비를 통해 산소 균형을 계산하였다.
Lactobacillus was analyzed using an elemental analyzer (CE Instruments EA1110, EA1112) to observe the constituent elements of the materials purely separated from the planta room. An elemental analyzer was performed for carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen analysis. It was also used for explosive evaluation through oxygen balance (OB). The oxygen balance was calculated from the raw consumption of carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen.

X선 X-ray 회절을Diffraction 이용한 결정 구조 분석 Analysis of crystal structure used

락토바실러스 플란타룸에서 순수 분리한 물질의 3차원적 구조를 규명하기 위하여 다음과 같이 X선 회절을 이용한 결정 구조 분석을 수행하였다. 분리한 물질 시료 20.0 ㎎을 35 % 에틸알코올과 65 % CH2Cl2로 녹인 후 제습용 건조기에 정치하고 결정화 과정을 관찰하였다. 생성된 시료 결정은 포항가속기 연구소 Beamline 6B에서 Bruker Proteum 300 CCD를 통해 1.6 Å 파장에서 얻었다.
In order to clarify the three-dimensional structure of the material purely isolated from Lactobacillus plantarum, crystal structure analysis using X-ray diffraction was carried out as follows. 20.0 ㎎ of the separated material sample was dissolved in 35% ethyl alcohol and 65% CH 2 Cl 2 , then left in a dehumidifying dryer and the crystallization process was observed. The resulting sample crystals were obtained at Beamline 6B of Pohang Accelerator Laboratory through a Bruker Proteum 300 CCD at a wavelength of 1.6 Å.

실험 결과Experiment result

식물에서의 유산균 동정Identification of lactic acid bacteria in plants

다양한 한국의 식물 재료인 갓김치, 돌나물 김치 및 일반 김치로부터 많은 종류의 유산균을 분리하였다. 본 실험에서는 이러한 식물 재료로부터 총 400여 개의 유산균을 분리하였고, 길항작용법(antagonism method)를 통하여 항진균활성이 있는 균주 200여 개를 선별하였다. 선별된 균주는 16S rDNA 염기 서열법을 통해 동정하기 위해 PCR을 수행하였다. 염기 서열 확인 결과, 전체적으로 류코노스톡 속, 락토바실러스 속, 락토코쿠스 속 및 웨이셀라 속의 균주들이 분리 동정되었다(표 1). 이 중 모든 재료에서 주로 류코노스톡 속과 락토바실러스 속이 분리되었으며, 돌나물에서는 락토코쿠스 락티스도 분리되었다. 시간별로는 류코노스톡 속이 발효 초기인 1-2일 사이에 주로 많이 분리 되었으며, 시간이 지날수록(2-3일) 락토바실러스 속이 주요 유산균 균주로써 많이 분리 되었다.Many kinds of lactic acid bacteria were isolated from various Korean vegetable materials such as mustard kimchi, garlic kimchi and ordinary kimchi. A total of 400 lactic acid bacteria were isolated from these plant materials and 200 antifungal strains were selected by antagonism method. The selected strains were subjected to PCR to identify them through 16S rDNA sequencing. As a result of sequencing, strains of Ryukono stock, Lactobacillus, Lactococcus and Weissella were identified (Table 1). In all of these materials, the genus Leuconostoc sp. And Lactobacillus sp. Were isolated. Lactococcus lactis was also isolated from the dung. By time Lactobacillus spp. Was mainly isolated in 1-2 days of fermentation, and Lactobacillus sp. As a major lactic acid bacterium was isolated as time passed (2-3 days).

균주Strain 식물 재료에서의 균주 수Number of strains in plant material 갓 김치Freshly made kimchi 돌나물 김치Sedum kimchi 배추 김치 Kimchi 류코노스톡 속
(Leuconostoc spp.) Ryukono Stock
( Leuconostoc spp.) 93 93 10 10 28 28 락토바실러스 속
(Lactobacillus spp.)Lactobacillus sp.
Lactobacillus spp. 1414 88 1717 락토코쿠스 속
(Lactococcus spp.) Lactococcus genus
Lactococcus spp. -- 1One -- 바이젤라 속
(Weisella spp.) Vizela genus
( Weisella spp.) 22 1414 1818

분리 및 Separation and 동정된Identified 유산균의 항균 활성 비교 Comparison of antibacterial activities of lactic acid bacteria

유산균은 생장에 있어 여러 가지 2차 대사 산물을 생성함으로 항균 활성을 가지게 된다. 동정한 유산균들 중 가장 활성이 높은 균주를 확인하고, 향후의 실험을 진행하기 위해, 길항작용법(antagonism method)과 배지희석법(broth microdilution method)를 통하여 각 균주의 항균 활성을 비교해 보았다(표 2).Lactic acid bacteria have various antimicrobial activities by producing various secondary metabolites in their growth. The antimicrobial activity of each strain was compared using the antagonism method and the broth microdilution method in order to confirm the most active strains among the identified lactic acid bacteria (Table 2) .

또한, 디스크 확산법(disk diffusion assay)을 이용하여 항균 활성 실험을 한 결과, 웨이셀라 시바리아 LBP-B06(W. cibaria LBP-B06), 락토바실러스 사케이 LBP-S01(L. sakei LBP-S01), 락토바실러스 김치 LBP-B02(L. kimchii LBP-B02), 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10(L. plantarum LBP-K10), 락토바실러스 시트레움 LBP-K11(L. citreum LBP-K11) 및 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06(L. mesenteroides LBP-K06)의 항균 활성이 매우 유의적으로 높게 나타남을 관찰하였다(표 2). 유산균의 항균 활성 실험에 사용된 지표 균주인 피검균으로는 그람 음성균인 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)와 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스(Bacillu subtilis)를 사용하였다. 또한 도 1에 나타낸 바와 같이, 위의 실험들을 통하여 동정한 유산균 중 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 활성이 가장 좋음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 실험에서는 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 류코노스톡 메센테로이데스 LBP-K06 및 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10을 실험 균주로 하여 향후의 실험들을 진행하였다.As a result of the antimicrobial activity test using the disk diffusion assay, Wisella cibaria LBP-B06 ( W. cibaria LBP-B06), Lactobacillus saccharum LBP-S01 ( L. sakei LBP-S01), Lactobacillus kimchi LBP-B02 ( L. kimchii LBP-B02), Lactobacillus planta LBP-K10 ( L. plantarum LBP-K10), Lactobacillus citrell LBP-K11 ( L. citreum LBP-K11) and L. pneumoniae LBP-K06 ( L. mesenteroides LBP-K06) were found to be very high (Table 2). Escherichia coli (Gram negative bacteria) and Bacillus subtilis (Gram positive bacteria) were used as the indicator strains used for the antibacterial activity of the lactic acid bacteria. Also, as shown in Fig. 1, among the lactic acid bacteria identified through the above experiments, Lactobacillus planta The activity of LBP-K10 was the best. Therefore, in this experiment, Pediococcus pentosaceus ), Leuconostomensee terroidis LBP-K06 and Lactobacillus planta LBP-K10 was used as an experimental strain for further experiments.

식물 재료 Plant material 균주 Strain 길항 작용 테스트a Antagonism test a MICb ,c MIC b , c 염기서열로 확인한 균체 분류군The bacterial strains identified as the base sequence 갓 김치Freshly made kimchi LBP-B01 LBP-B01 ++ ++ +++ +++ LbLb . . sakeisakei LBP-B02 LBP-B02 ++ ++ ++ ++ L. L. kimchiikimchii LBP-B03 LBP-B03 ++ ++ ++ ++ L. mesenteroides L. mesenteroides LBP-B04 LBP-B04 ++ ++ ++ ++ L. mesenteroides L. mesenteroides LBP-B05 LBP-B05 +++ +++ ++ ++ L. L. paramesenteroidesparamesenteroides LBP-B06 LBP-B06 +++ +++ ++ ++ W. W. cibariacibaria 돌나물 김치Sedum kimchi LBP-S01 LBP-S01 ++ ++ +++ +++ LbLb . . sakeisakei LBP-S02 LBP-S02 +++ +++ +++ +++ LbLb . . plantarumplantarum LBP-S03 LBP-S03 ++ ++ ++ ++ LcLc . . lactislactis LBP-S04 LBP-S04 ++ ++ ++ ++ L. L. citreumcitreum LBP-S05 LBP-S05 ++ ++ ++ ++ L. L. citreumcitreum LBP-S06 LBP-S06 + + ++ ++ L. L. lactislactis LBP-S08 LBP-S08 ++ ++ ++ ++ W. W. hellenicahellenica 배추 김치 Kimchi LBP-K01 LBP-K01 ++ ++ +++ +++ LbLb . . plantarumplantarum LBP-K03 LBP-K03 ++ ++ ++ ++ L. L. citreumcitreum LBP-K04 LBP-K04 ++ ++ - - L. L. citreumcitreum LBP-K05 LBP-K05 ++ ++ ++ ++ L. L. holzapfeliiholzapfelii LBP-K06 LBP-K06 +++ +++ ++ ++ L. mesenteroidesL. mesenteroides LBP-K07 LBP-K07 ++ ++ ++ ++ L. L. pseudomesenteroidespseudomesenteroides LBP-K08 LBP-K08 ++ ++ + + L. mesenteroides L. mesenteroides LBP-K09 LBP-K09 ++ ++ ++ ++ LbLb . . brevisbrevis LBP-K10 LBP-K10 +++ +++ +++ +++ LbLb . . plantarumplantarum LBP-K11 LBP-K11 ++ ++ ++ ++ L. L. citreumcitreum LBP-K12 LBP-K12 +++ +++ ++ ++ L. mesenteroidesL. mesenteroides LBP-K13 LBP-K13 ++ ++ ++ ++ L. mesenteroidesL. mesenteroides LBP-K14 LBP-K14 ++ ++ ++ ++ L. L. pseudomesenteroidespseudomesenteroides LBP-K15 LBP-K15 +++ +++ ++ ++ W. W. cibariacibaria LBP-K16 LBP-K16 ++ ++ ++ ++ W. W. confusaconfusa

a는 항균 활성 범위를 나타내는 지름을 의미한다(지표 균주: 바실러스 서브틸리스). +는 지름이 ＜ 15 ㎜를 의미하고, ++는 지름이 ＜ 22 ㎜를 의미하며, +++는 지름이 ≥ 22 ㎜를 의미한다.a means the diameter indicating the range of antibacterial activity (indicator strain: Bacillus subtilis). + Means diameter <15 mm, ++ means diameter <22 mm and +++ diameter means ≥ 22 mm.

b는 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration:MIC)를 의미한다. b means the minimum inhibitory concentration (MIC).

c는 최소억제농도의 배율을 의미한다. +는 1배를 의미하고, ++는 0.5배를 의미하며, +++는 0.25배를 의미한다(지표 균주: 바실러스 서브틸리스).
c means the magnification of the minimum inhibitory concentration. + Means 1-fold, ++ means 0.5-fold, and +++ means 0.25-fold (indicator strain: Bacillus subtilis).

분리 및 동정한 Isolation and identification 락토바실러스Lactobacillus 플란타룸Flora Room LBPLBP -- K10K10 의 특성Characteristic

락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 16S rDNA 염기서열을 NCBI의 염기서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 비교한 결과, 락토바실러스 플란타룸 IMAU10173의 염기서열과 100% 일치 하는 것으로 나타났다(데이터 미제시). 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 시간에 따른 pH 변화와 생장 곡선을 살펴보기 위해 OD600 값을 28시간 동안 동시에 관찰한 결과 pH와 유산균의 성장에 유의적인 변화가 나타났다(도 2의 왼쪽 패널). 생장과 pH의 변화는 서로 반비례 하며, 생장 곡선의 경우 접종한 지 8시간 후부터 대수기에 진입하게 되었고, 28시간 후에는 정체기로 접어듦을 확인하였다. 정체기에 접어든 후에는 pH 값이 거의 일정하게 유지되었고, 생장도 일정하게 유지됨을 확인할 수 있었다(도 2의 왼쪽 패널).The 16S rDNA sequence of Lactobacillus plantarum LBP-K10 was compared with the nucleotide sequence of Lactobacillus plantarum IMAU10173 by using the BLAST program as a result of comparing the nucleotide sequence of NCBI with that of the Lactobacillus plantarum IMAU10173 (data not shown). To observe the pH change and growth curve of Lactobacillus plantarum LBP-K10 over time, OD 600 Values were observed at the same time for 28 hours resulting in significant changes in pH and growth of lactic acid bacteria (left panel of FIG. 2). Growth and pH changes were inversely proportional to each other. Growth curves were observed from the 8th hour after inoculation to the early stage and after 28 hours, the growth phase was confirmed to be flat. It was confirmed that the pH value remained almost constant after the collapse, and the growth was maintained constant (left panel in FIG. 2).

시간에 따른 항균 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 하루 단위씩 3일간 배양액을 채취하여 실험을 하였다. 그 결과, 1일째부터는 활성이 나타나기 시작하였고, 2일째도 계속 증가하다가 3일째의 항균 활성이 가장 높은 것으로 관찰되었으며, 약 2주간 이 활성이 유지되었다(도 2의 오른쪽 패널). pH의 경우는 정상적인 생장 동안에는 계속 감소하다가 생장이 정체기 전후에 pH 4.1 정도로 나타나며 이후 일정하게 유지됨을 알 수 있었다. In order to investigate the effect of antimicrobial activity over time, the culture was sampled for 3 days. As a result, activity began to appear on day 1, continued to increase on day 2, the highest antimicrobial activity was observed on day 3, and the activity remained for about 2 weeks (right panel of FIG. 2). In the case of pH, it was decreased continuously during normal growth, and the growth appeared to be about pH 4.1 before and after the stagnation period and then maintained constant.

락토바실러스 플란타룸 LBP-K10이 병원성균에 대한 항균 활성이 있는지를 살펴보기 위하여 여러 균주에 대하여 위에서 설명한 방법대로 디스크 확산법을 통해 항균 활성을 확인해 보았다(도 3). 여기서 수행한 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액은 총 3회의 독립적인 디스크 확산법을 수행하여 각 균주에 대한 활성을 생장 저지환(mm)을 계산하여 측정하였다. 락토바실러스 플란타룸 LBP-K10의 배양액은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)와 같은 그람 양성균 뿐만 아니라 살모넬라 티피무루이움(Salmonella typhimuruium), 쉬젤라 소네이(Shigella sonnei), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia) 및 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)와 같은 그람 음성균, 그리고 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 같은 진균류에서도 활성이 관찰되었다(도 3).Lactobacillus Florata Room In order to determine whether LBP-K10 has an antimicrobial activity against pathogenic bacteria, the antimicrobial activity was confirmed through a disk diffusion method as described above for various strains (FIG. 3). The Lactobacillus plantarum The LBP-K10 culture broth was subjected to three independent disk diffusion methods, and the activity of each strain was determined by calculating the growth inhibition ratio (mm). Lactobacillus Florata Room The culture medium of LBP-K10 was Bacillus subtilis subtilis ), Staphylococcus ( Staphylococcus aureus) aureus) and L. Eno Kuah (as well as Gram-positive bacteria, such as Listeria innocua) Salmonella typhimurium muruyi Stadium (Salmonella typhimuruium , Shigella sonnei ), Streptococcus pneumonia And Gram-negative bacteria such as Escherichia coli , and fungi such as Candida albicans (Fig. 3).

또한, 항균 물질이 열에 안정한지 확인하기 위해 다양한 조건하에 열을 가한 후 배양액에 대한 항균 활성 시험을 하였다(도 4). 열처리한 배양액은 항균 활성이 변하지 않았다. 지표 균주로 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스와 그람 음성균인 살모넬라 티피무루이움을 사용하여 배양액의 활성을 관찰한 결과, 열을 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 열을 가한 조건에 관계없이 실험군 모두 대조군과 비슷한 양상을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 항균 활성은 15분간 멸균기에서 121℃로 열을 가해도 그대로 유지되었다. 이 결과로 보아 항균 활성을 가지는 물질이 열에 의해 변성되지 않고 안정함을 확인하였다(도 4).In order to confirm that the antimicrobial substance was stable to heat, heat was applied under various conditions, and the antimicrobial activity test for the culture medium was performed (FIG. 4). The heat treated culture did not change its antimicrobial activity. As a result of observing the activity of the culture broth using Gram positive bacterium Bacillus subtilis and Gram negative bacteria Salmonella typhimurium as an indicator strain, the test group was similar to the control group regardless of the heat treatment condition . In addition, the antimicrobial activity remained unchanged even after heating for 15 minutes at 121 ° C in a sterilizer. As a result, it was confirmed that the substance having antimicrobial activity was stable without being denatured by heat (FIG. 4).

배양액에 있는 항균 물질이 단백분해효소(프로테이나아제 K, 키모트립신 및 트립신)에 영향을 받는지 확인하기 위하여 배양액에 효소를 처리한 후 실험을 진행하였다(도 5). 실험을 위해 72시간 배양한 배양액을 사용하였고, 효소를 처리하기 전에 배양액을 단백질성 부분과 비단백질성 부분으로 나누기 위해 아세테이트 멤브레인 YM-1(Amicon, USA)으로 컷-오프하여 분자량이 1000이하인 것과 이상인 것으로 나누었다. 대조군으로는 배양액(CS)과 실험군으로 분자량이 1000이상인 시료(YM1S)와 분자량이 1000이하인 시료(YM1C)를 준비하여 각 효소들의 최종농도가 1 ㎎/㎖이 되도록 처리하였고 항균 활성을 비교하여 보았다.[55] 단백분해효소를 처리하였을 때, 지표 균주인 바실러스 서브틸리스와 에스케리치아 콜리에서 생장 저지환으로 관찰한 결과 CS와 YM1S의 항균 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 특히 대조군인 CS에서 프로테이나아제 K의 경우 활성이 거의 변하지 않았지만, 트립신을 처리하였을 때 10.5%, 키모트립신의 경우 6.5% 정도 활성이 감소하였다. 바실러스 서브틸리스와 비교하였을 때 에스케리치아 콜리는 프로테이나아제 K와 트립신이 대략 7.0% 정도 대조군에 비해 항균활성이 감소함을 보였다(도 5). 아세테이트 멤브레인 YM-1을 이용하여 분자량 1000을 기준으로 나누었기 때문에 CS와 YM1S에서의 항균 활성 감소는 대부분 단백질성 물질들이 분해되어 나타난 것임을 알 수 있었다. In order to confirm whether the antimicrobial substances in the culture medium are affected by the proteolytic enzymes (Proteinase K, chymotrypsin and trypsin), the culture medium was treated with enzyme and then the experiment was conducted (FIG. 5). For the experiment, a culture medium was used which was cultivated for 72 hours. Before the enzyme treatment, the culture was cut-off with an acetate membrane YM-1 (Amicon, USA) to divide the protein into a proteinaceous portion and a non- Or more. As a control group, a sample (YM1S) with a molecular weight of 1000 or more and a sample (YM1C) with a molecular weight of 1000 or less were prepared as a control group and a test group, and the antimicrobial activity of each enzyme was adjusted to be 1 mg / . [55] When the protease was treated, the growth inhibition of Bacillus subtilis and Escherichia coli, which are indicator strains, showed that the antimicrobial activity of CS and YM1S was reduced (FIG. 5). In the control group CS, the activity was almost unchanged in the case of Proteinase K, but decreased by about 10.5% in trypsin treatment and 6.5% in chymotrypsin treatment. When compared to Bacillus subtilis, Escherichia coli showed approximately 7.0% reduction in antimicrobial activity compared to the control group, with protease K and trypsin (Fig. 5). Acetate membrane YM-1, the reduction of antimicrobial activity in CS and YM1S was mostly due to decomposition of proteinaceous substances.

전체적으로 항균 활성이 감소하는 양상을 확인할 수 있었지만 정도가 미미하였고, 열과 단백분해효소 실험을 통해서 볼 때 대부분의 활성이 유지되는 것으로 보아 항균 활성을 나타내는 물질은 비단백질성 물질임을 추정할 수 있었다(도 4 및 5).
The antimicrobial activity was decreased in the whole, but the degree was small. Most of the activity was maintained by the heat and proteolytic enzyme test, and it was estimated that the substance exhibiting the antimicrobial activity was non-protein 4 and 5).

항진균 물질의 분리 및 특성Isolation and Characterization of Antifungal Substances

락토바실러스 플란타룸의 항균 물질의 순수 분리는 앞서 여러 가지 실험 결과를 토대로 3일간 배양한 상층 배양액을 가지고 실시하였다. 분리 과정은 CH2Cl2를 이용하여 액체-액체 추출법에 의해 배양액으로부터 항균 물질을 분리한 후 세미-프렙(semi-prep)용 HPLC를 이용하여 분획하고, 수집하였고 분획한 결과는 HPLC 크로마토그램으로 확인하였다(도 6 및 도 7). 이러한 실험을 실시하기 위하여 본 실험에서는 항균 물질의 순수 분리 과정에서 일부 불필요한 산성 불순물인 D-젖산이나 아세트산등을 제거하기 위해 CH2Cl2를 이용하여 추출한 하층 배양액, CH2Cl2로 추출한 상층 배양액과 CH2Cl2로 추출하지 않은 배양액의 항균 활성을 액체-액체 추출법으로 비교해 보았고 이후의 실험에 적용하였다(도 6). Pure water isolation of Lactobacillus plantarum was carried out with the upper layer culture solution for 3 days. The separation process was carried out by separating the antimicrobial substance from the culture medium by liquid-liquid extraction method using CH 2 Cl 2 and then fractionating using semi-prep HPLC and collecting the fraction by HPLC chromatography (Figs. 6 and 7). In this experiment, in order to carry out these experiments, a lower layer extracted broth using a CH 2 Cl 2 to remove the unnecessary portion such as the D- lactic acid impurities or acid in a pure separation of the antimicrobial substance, the culture supernatant was extracted with CH 2 Cl 2 And the antimicrobial activity of the culture broth not extracted with CH 2 Cl 2 was compared with the liquid-liquid extraction method (FIG. 6).

이 실험을 통해 배양액의 모든 항균 물질은 CH2Cl2 추출 후 하층액을 가지고 이후의 실험을 수행하였다(도 6). 즉, 앞서 설명한 방법으로 배양액의 CH2Cl2 추출 상층액과 하층액, 그리고 CH2Cl2 추출을 하지 않은 농축 배양액을 가지고 항균 활성 실험을 확인한 결과, CH2Cl2 추출 상층액과 CH2Cl2 추출을 하지 않은 농축 배양액의 항균 활성이 비슷하게 나타났으며 하층액의 경우 다른 두 가지 실험군보다 훨씬 더 높은 항균 활성을 가짐을 관찰하였다(도 6). 따라서 항균 물질의 분리는 CH2Cl2 추출의 하층액을 가지고 실험하는 것이 더욱 효율적임을 알 수 있었다(도 6).All the antimicrobial substances in the culture broth were subjected to the subsequent experiment with CH 2 Cl 2 extraction and the lower layer solution (FIG. 6). That is, the antimicrobial activity experiments were carried out with the culture supernatant of CH 2 Cl 2 and the undiluted solution and the concentrated culture without CH 2 Cl 2 extraction as described above. As a result, the CH 2 Cl 2 extraction supernatant and CH 2 Cl 2 showed similar antimicrobial activity to the undiluted concentrate and the lower layer showed much higher antimicrobial activity than the other two experimental groups (FIG. 6). Therefore, it was found that the separation of the antimicrobial substance was more efficient in the experiment with the lower layer of CH 2 Cl 2 extraction (FIG. 6).

또한, 이러한 전처리 과정을 통해 준비된 실험군은 세미-프렙 HPLC 크로마토그램에서 분획된 물질을 적당한 양으로 농축한 후 항균 활성 실험을 실시하였고 락토바실러스 플란타룸의 크로마토그램에서 10여 개의 분획된 물질이 확인되었으며, 시간대 별로 나오는 피크를 분획화하여 수집하여 각각의 분획에 대한 항균 활성을 확인해 보았다(도 7 및 표 3).In addition, the antimicrobial activity test was carried out by concentrating the fraction separated from the semi-preparative HPLC chromatogram in an appropriate amount by the pretreatment, and 10 fractions were identified in the chromatogram of Lactobacillus plantarum , And peaks emerging by time were fractionated and collected to confirm the antimicrobial activity against each fraction (FIG. 7 and Table 3).

지표 균주 Indicator strain MICa MIC a 분획Fraction 염기서열로 확인된 균체 분류군Mycobacterium tuberculosis 바실러스 서브틸리스 Bacillus Subtilis +++ +++ M8 M8 Lc . mesenteroides LBP-K06 Lc . mesenteroides LBP-K06 +++ +++ N8 N8 Lb . plantarum LBP-K10 Lb. plantarum LBP-K10 +++ +++ P8 P8 P. pentosaceus MCPP P. pentosaceus MCPP 에스케리치아 콜리Escherichia coli ++ ++ M8 M8 LcLc . . mesenteroidesmesenteroides 스타필로코쿠스 아우레우스Staphylococcus aureus ++ ++ M8 M8 LcLc . . mesenteroidesmesenteroides 스트렙토코쿠스 뉴모니아Streptococcus pneumoniae ++ ++ M8 M8 LcLc . . mesenteroidesmesenteroides 쉬젤라 디센테리이Shzella Deccan Terry ++ ++ M8 M8 LcLc .. mesenteroidesmesenteroides

a는 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration:MIC)를 의미한다. +는 1배를 의미하고, ++는 0.5배를 의미하며, +++는 0.25배를 의미한다.a means the minimum inhibitory concentration (MIC). + Means 1 times, ++ means 0.5 times, and +++ means 0.25 times.

항진균 활성에 대한 결과를 도 8 내지 도 11에 나타내었다.Results for antifungal activity are shown in Figures 8-11.

페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스의 모든 분획된 물질에서 공통된 크로마토그램의 각 균주에 해당하는 분획 물질인 분획된 순수 분리 물질이 진균에 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 가노더마 보니넨스(Ganoderma boninense)의 항진균에 미치는 영향을 관찰하였다(도 8 내지 도 9). 10 일간 미리 배양한 가노더마 보니넨스를 8 ㎜ 직경의 원 형태로 준비하고, PDA(potato dextrose agar) 2.5 ㎖을 6-웰 플레이트에 접종한 후 28℃에서 3일간 배양한 후 관찰하였다(도 8 내지 도 9). 실험 결과, M3, M4, M6a, M7b 및 M10의 활성이 유의적으로 높게 나타났으며, 이 중에서도 M10 분획 물질의 항진균 활성이 가장 높음을 확인하였다(도 8 내지 도 9). 이와 더불어 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 최소영양배지에서 항진균 활성을 알아 보기 위하여 하룻밤 배양한 종균 배양(seed culture)을 최소영양배지인 SD 아가 플레이트에 칸디다 알비칸스 세포를 초기 1 x 104 개 정도로 각각 접종하고 28℃에서 3 일간 배양한 후 항진균 활성을 관찰하였다(도 10 및 도 11). 실험 결과, 가노더마 보니넨스의 결과와는 달리 M10 분획물의 활성만 관찰되었고, 그 활성이 매우 유의적으로 높은 것으로 판단되었다(도 10 및 도 11).I understand the effect of the fractionated pure separating material, which is the fraction corresponding to each strain of chromatogram common to all the fractionated substances of Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, and Leuconostomercenteroids, on fungi To observe, the effect of Ganoderma boninense on antifungals was first observed (Figures 8 to 9). Ganoderma boninens cultured for 10 days were prepared in the form of a circle having a diameter of 8 mm, and 2.5 ml of a PDA (potato dextrose agar) was inoculated into a 6-well plate and cultured at 28 ° C for 3 days and observed 9). As a result, the activities of M3, M4, M6a, M7b, and M10 were significantly higher, and among them, M10 fraction had the highest antifungal activity (FIGS. 8 to 9). In addition, in order to examine the antifungal activity of Candida albicans in the minimal nutrient medium, the overnight culture of the seed cultures of the Candida albicans on the SD agar plate of the minimum nutrient medium was 1 × 10 4 . After inoculation and incubation at 28 ° C. for 3 days, antifungal activity was observed (FIGS. 10 and 11). As a result, the activity of the M10 fraction was observed unlike the results of Ganodermanninense, and the activity was judged to be very high (FIGS. 10 and 11).

각 분획된 물질들의 pH는 크로마토그램 앞부분의 분획하여 확인한 산성 물질을 제외하고 모두 중성 pH에 가까웠으며(표 4), 이러한 결과는 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스에서 모두 비슷한 경향성을 보였다(도 8 내지 도 11, 및 표 4).The pH of each fractioned material was close to neutral pH except for the acidic material identified by fractionation at the front of the chromatogram (Table 4). These results indicate that Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, (Fig. 8 to Fig. 11, and Table 4). &Lt; tb &gt; &lt; TABLE &gt;

분획 수Fraction number 구분division P1 P1 P2 P2 P3 P3 P4 P4 P5 P5 P6a P6a P6b P6b P7a P7a P7b P7b P8 P8 P9 P9 P10 P10 g/ℓ g / ℓ - - 5.88 5.88 - - - - - - 14.5 14.5 2.0 2.0 5.0 5.0 7.3 7.3 2.2 2.2 4.2 4.2 10.7 10.7 pH pH - - 3.8 3.8 7.6 7.6 7.9 7.9 9.6 9.6 9.2 9.2 8.9 8.9 8.8 8.8 8.6 8.6 8.5 8.5 8.2 8.2 8.1 8.1 - : 활성 없음.-: No activity.

또한, 최소배지농도법의 결과를 토대로 본 실험에서 동정한 여러 가지 유산균을 가지고 HPLC로 크로마토그램을 비교 분석한 결과, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스에서 분획 물질의 분포가 비슷하다는 사실을 발견하였다(도 5a). 다른 유산균 균주들에서의 크로마토그램도 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스와 유사한 분획 경향성이 보였다(도 12). 이러한 결과를 통해 유산균이 생장을 거치며 항진균 물질을 생성하고 생성된 대사산물이 서로 비슷하다는 것을 알 수 있었다(도 12 및 도 13).
Based on the results of the minimum culture medium concentration method, the chromatograms of various lactic acid bacteria identified in this experiment were analyzed by HPLC. As a result, it was found that Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, (Fig. 5A). &Lt; tb &gt;&lt; TABLE &gt; Chromatograms in other lactic acid bacteria strains showed similar fractionation tendencies to Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, and Leuconostomercenteroids (FIG. 12). These results indicate that the lactic acid bacteria undergo growth and produce antifungal substances and the produced metabolites are similar to each other (FIGS. 12 and 13).

항진균 물질의 구조 분석Structural analysis of antifungal substances

항진균 물질의 구조를 분석하기 위해 HPLC로 분리한 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스의 P10, N10 및 M10은 동결 건조기로 분말 형태로 만들어 준비하였다. 실험 재료 및 방법에서 기술한 대로 분자량은 다이렉트 크로마토그래피(DIP, Direct Insertion Probe)로 크로마토그래피 질량분석기(Agilent 6890 series GC, Agilent Technologies, Waldron, Germany; high-resolution mass spectrometer, JEOL JMS-700, Tokyo, Japan)(GC-MS)를 이용하여 분석하였다(도 14 내지 도 15).P10, N10 and M10 of Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, and Leuconostomyces teneroides, which were separated by HPLC to analyze the structure of the antifungal substance, were prepared in powder form by a freeze dryer. As described in the experimental materials and methods, the molecular weights were determined by chromatography (DIP, Direct Insertion Probe) using a chromatography mass spectrometer (Agilent 6890 series GC, Agilent Technologies, Waldron, Germany; high-resolution mass spectrometer, JEOL JMS-700, Tokyo , Japan) (GC-MS) (Figs. 14 to 15).

전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석을 하였고 참고치와의 연관성을 파악하였다. P10과N10의 분자량의 참고치는 분자량 244로 조사되었고, 전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석 결과 페디오코쿠스 펜토사세우스 및 락토바실러스 플란타룸 모두 244로 나타났다(도 14 내지 도 15).The electron ionization (EI) and chemical ionization (CI) analyzes were performed and the relationship with reference values was determined. The molecular weights of P10 and N10 were determined to be 244 by molecular weight. The molecular weights of P10 and N10 were determined to be 244, and the analysis by electron ionization (EI) and chemical ionization (CI) showed that Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus planta All the rooms were 244 (Fig. 14 to Fig. 15).

보다 정확한 분자 구조를 파악하고 선행 실험인 전자충격이온화법(electron ionization, EI)과 화학이온화법(chemical ionization, CI)에 의한 분석을 비교하기 위해 500 MHz 자기공명법을 이용하여 P10, N10 및 M10의 구조를 관찰하였다(도 16 내지 도 21). 100 % DMSO 가 처리된 P10과 10% 중수(D2O)가 DMSO와 혼합된 P10 분획물을 1H 핵자기공명법과 13C 핵자기공명법으로 분석하였다(도 16 내지 도 21).In order to understand the more accurate molecular structure and to compare the previous experiments with electron ionization (EI) and chemical ionization (CI) analysis, we used P10, N10 and M10 (Fig. 16 to Fig. 21). With a 100% DMSO processing P10 and 10% of heavy water (D 2 O) it was analyzed for the P10 fractions were mixed with DMSO as a 1 H nuclear magnetic resonance method and 13 C nuclear magnetic resonance (16 to 21).

또한 13C/1H 2D HSQC(500 MHz, 100% DMSO와 10% D2O가 함유된 DMSO) 핵자기공명법의 스펙트럼은 분리된 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스의 M10, N10 및 P10의 탄소-수소에 대한 결과가 1H 핵자기공명법과 13C 핵자기공명법으로 분석한 선행 실험 결과와 일치함을 보였다(도 16 및 도 17). 락토바실러스 플란타룸에서 순수 분리한 N10을 100% DMSO로 처리한 P10은 8.0 ppm에서 전형적인 질소-수소 피크를 나타내지만(도 16), 10% D2O가 함유된 M10의 경우질소-수소 피크에서 중수로 치환되어 8.0 ppm의 피크가 사라지는 것을 1H/13C NMR (600MHz, 100% MeOD) HSQC 스펙트라를 통해 확인하였다(도 17).In addition, the spectrum of 13 C / 1 H 2D HSQC (500 MHz, DMSO containing 100% DMSO and 10% D 2 O) nuclear magnetic resonance spectroscopy showed that the separated Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Konostock Messensteroids The results for carbon-hydrogen of M10, N10 and P10 were consistent with the results of previous experiments analyzed by 1 H nuclear magnetic resonance and 13 C nuclear magnetic resonance (FIGS. 16 and 17). In the case of containing a represents a hydrogen peak (Fig. 16), 10% D 2 O M10 N-Lactobacillus plug P10 processes the separated pure N10 from lanthanide room in 100% DMSO are typical nitrogen at 8.0 ppm hydrogen peak Was confirmed by 1 H / 13 C NMR (600 MHz, 100% MeOD) HSQC spectra that the peak of 8.0 ppm was replaced with heavy water in Fig.

P10의 13C 핵자기공명법을 통한 화학적 이동(Chemical shift)은 DMSO와 10% 중수를 함유한 DMSO 시료에서 모두 14개의 탄소를 가진 물질로 나타났다(도 17). 13C 핵자기공명법의 결과로 보아 P10 분획물은 전자충격이온화법과 화학이온화법에 의한 분석 결과에 대한 참고치와 그 결과가 일치하였다(도 17).Chemical shifts through 13 C nuclear magnetic resonance spectroscopy of P10 were 14 carbon atoms in both DMSO and DMSO with 10% water (Fig. 17). From the results of 13 C nuclear magnetic resonance spectroscopy, the results of the analysis of the P10 fraction by the electron impact ionization method and the chemical ionization method were in agreement with the results (FIG. 17).

이와 더불어 1H /1H 2D COSY 핵자기공명법에서 100% DMSO와 10% D2O가 함유된 DMSO에 녹인 시료 분석 수행 후, P10과 N10 구조를 예상할 수 있었다(도 18 및 도 19). 이러한 실험 결과를 바탕으로 원소 성분을 성분 분석기를 통해 분석해 본 결과 표 5와 같은 원소비를 얻을 수 있었다. In addition, P10 and N10 structures were predicted after 1 H / 1 H 2D COZY nuclear magnetic resonance spectroscopy (DMSO) with DMSO containing 100% DMSO and 10% D 2 O (FIGS. 18 and 19) . Based on these experimental results, the elemental components were analyzed through a component analyzer, and the result was as shown in Table 5.

성분 ingredient 비율 (%) ratio (%) 검출된 질량 The detected mass 계산한 수Calculated number 예측한 수Predicted number 계산된 질량Calculated mass 탄소 carbon 66.9970 66.9970 163.4727 163.4727 13.6227 13.6227 14 14 168 168 질소 nitrogen 11.2623 11.2623 27.4800 27.4800 1.9628 1.9628 2 2 28 28 수소 Hydrogen 6.3883 6.3883 15.5875 15.5875 15.5874 15.5874 16 16 16 16 산소 Oxygen 13.1100 13.1100 31.9884 31.9884 1.9992 1.9992 2 2 32 32 황sulfur 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 총합 total 97.7576 97.7576 238.5286 238.5286 -- -- 244 244

또한 X선 회절을 이용한 결정 구조 분석 결과와 여러 구조 분석 결과를 C14H16O2N2의 구조를 가지는 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)(cis-cyclo(L-Phe-L-Pro))임을 확인하였다(도 20 및 도 21). 항진균 물질의 구조를 분석하기 위해 HPLC로 분리한 페디오코쿠스 펜토사세우스, 락토바실러스 플란타룸 및 류코노스톡 메센테로이데스 의 P10, N10 및 M10의 최종 화학구조는 도 22에 제시하였다.In addition, the results of crystal structure analysis and various structural analysis results using X-ray diffraction are shown in Fig. 1 as cis- cyclo (l-Phe-L-proline) having a structure of C 14 H 16 O 2 N 2 -Pro)) (Fig. 20 and Fig. 21). The final chemical structure of P10, N10 and M10 of Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and Leuconostomyces teneroides isolated by HPLC to analyze the structure of the antifungal substance is shown in Fig.

ESI-CID mass spectrum m/z 245 [MH]+ base peak, 153 [MH-C7H8]+, 125 [MH-C7H8-CO]+ ESI-CID mass spectrum m / z 245 [MH] + base peak, 153 [MH-C 7 H 8] +, 125 [MH-C 7 H 8 -CO] +

1H NMR (DMSO-d6) δ 1.41 - 1.45 (1H at C-5, m), 1.69 -1.74 (2H at C-4, m), 1.98 - 2.03 (1H at C-5, m), 3.01 -3.08 (2H at C-10, m), 3.24 - 3.42 (2H at C-3, m), 4.05 - 4.08 (1H at C-6, m), 4.33 - 4.35 (1H at C-9, m), 7.17-7.27 (5H at phenyl group, m) 7.98 (1H at N-8, s). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) δ 1.41-1.45 (1H at C-5 , m), 1.69 -1.74 (2H at C-4 , m), 1.98-2.03 (1H at C-5 , m), 3.01 -3.08 (2H at C-10, m), 3.24 - 3.42 (2H at C-3, m), 4.05 - 4.08 (1H at C-6, m), 4.33 - 4.35 (1H at C-9, m) , 7.17-7.27 (5H at phenyl group , m) 7.98 (1H at N-8 , s).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

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Claims (16)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete (a) 젖산균을 배양하여 젖산균 배양액을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 배양액내 시스-사이클로(L-페닐알라닌-L-프롤린)를 항진균에 효과적인 농도로 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 담자균류(Basidiomycota)의 진균에 대한 항진균제 생산 방법;
여기에서, 상기 젖산균은 류코노스톡 속(Leuconostoc), 바이쎌라 속(Weissella) 및 락토코쿠스(Lactococcus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 젖산균이고,
여기에서, 상기 류코노스톡 속 균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 인해(Leuconostoc inhae), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gelidum), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 류코노스톡 시트륨(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) 및 류코노스톡 홀쯔아펠리(Leuconostoc holzapfelii)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 류코노스톡 속 균이다.
(a) culturing a lactic acid bacterium to prepare a culture solution of lactic acid bacteria; And
(b) a method for producing an antifungal agent against fungi of basidiomycota, comprising the step of concentrating the cis- cyclo (L-phenylalanine-L-proline) in the culture at an effective concentration for antifungal;
Here, the lactic acid bacteria are at least one lactic acid bacteria selected from the group consisting of Leuconostoc , Weissella and Lactococcus ,
Here, the bacteria of the genus Leukonstock is Leuconostoc mesenteroides , Leuconostoc kimchii , Leuconostoc lactis , Leuconostoc lactis , Leuconostoc inhae Leuconostoc gelidum , Leuconostoc paramesenteroides , Leuconostoc citreum , Leuconostoc pseudomesenteroides ( Leuconostoc pseudomesenteroides ) And Leuconostoc holzapfelii .
제 11 항에 있어서, 상기 바이쎌라 속 균은 바이쎌라 시바리아(Weissella cibaria), 바이쎌라 콘퓨사(Weissella confusa) 및 바이쎌라 헬레니카(Weissella hellenica)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이쎌라 속 균인 것을 특징으로 하는 항진균제 생산 방법.
According to claim 11, wherein the genus Bacillus Weissella cibaria ( Weissella cibaria ), A method for producing an antifungal agent, characterized in that it is at least one strain of genus Weissella selected from the group consisting of Weissella confusa and Weissella hellenica .
제 11 항에 있어서, 상기 락토코쿠스 속 균은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코쿠스 플란타룸(Lactococcus plantarum) 및 락토코쿠스 피시움(Lactococcus piscium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 락토코쿠스 속 균인 것을 특징으로 하는 항진균제 생산 방법.
The method of claim 11, wherein the genus Lactococcus is at least one selected from the group consisting of Lactococcus lactis , Lactococcus plantarum and Lactococcus piscium Antifungal production method, characterized in that the genus Lactococcus.
제 11 항에 있어서, 상기 진균은 가노더마 속(Genus Ganoderma)의 진균인 것을 특징으로 하는 항진균제 생산 방법.
12. The method according to claim 11, wherein the fungus is a fungus of genus Ganoderma .
제 14 항에 있어서, 상기 가노더마 속 진균은 가노더마 보니넨스(Ganoderma boninense), 가노더마 아플라나툼(Ganoderma applanatum) 및 가노더마 조나툼(Ganoderma zonatum)으로 이루진 군으로부터 선택된 하나 이상의 가노더마 속 진균인 것을 특징으로 하는 항진균제 생산 방법.
15. The method of claim 14 wherein the organosiloxane Derma in fungi Kano Derma I nenseu (Ganoderma boninense), Kano Derma ah Plastic natum (Ganoderma Applanatum ) and Ganoderma zonatum is an antifungal production method, characterized in that at least one of the genus fungi selected from the group consisting of Ganoderma zonatum .
제 15 항에 있어서, 상기 가노더마 속 진균은 가노더마 보니넨스(Ganoderma boninense)인 것을 특징으로 하는 항진균제 생산 방법.
16. The method of claim 15, wherein the genus fungus is Ganoderma boninense .
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Watthanasakphuban et al. Detection and preliminary characterization of a narrow spectrum bacteriocin produced by Lactobacillus pentosus K2N7 from Thai traditional fermented shrimp (Kung-Som).
Rinto et al. Novel HMG-CoA reductase inhibitor peptide from Lactobacillus acidophilus isolated from Indonesian fermented food bekasam
Badr et al. Characterization of nisin produced by Lactococcus lactis
Wilaipun et al. The two-synergistic peptide bacteriocin produced by Enterococcus faecium NKR-5-3 isolated from Thai fermented fish (Pla-ra)
Hata et al. Characterization of a bacteriocin produced by Enterococcus faecalis N1-33 and its application as a food preservative

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