KR102375337B1 - Composition for controlling plant diseases using Brevibacillus brevis HK544 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액, 상기 배양여액의 분획물 또는 이데인 B1(edeine B1)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병 등 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내므로, 식물병 방제 용도로 유용하게 사용될 수 있다. The present invention includes any one or more selected from the group consisting of Brevibacillus brevis HK544 strain, the culture medium of the strain, the culture filtrate of the strain, a fraction of the culture filtrate, or edeine B1 as an active ingredient To provide a composition for controlling plant diseases containing Since it exhibits an excellent control effect on diseases, it can be usefully used for controlling plant diseases.
Description
본 발명은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액, 상기 배양여액의 분획물 또는 이데인 B1(edeine B1)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.The present invention includes any one or more selected from the group consisting of Brevibacillus brevis HK544 strain, the culture medium of the strain, the culture filtrate of the strain, a fraction of the culture filtrate, or edeine B1 as an active ingredient To provide a composition for controlling plant diseases containing
과학기술과 산업의 발전에도 불구하고, 현대농업의 가장 큰 숙제는 여전히 식량문제 해결에 있다. 세계 인구는 가파르게 증가하고 있고, 기후 변화로 미래의 안정적인 식량수급에 적신호가 켜진 상황이다. 식물병원균은 농작물에 다양한 병을 일으켜, 작물의 수량을 감소시키는데, 만약 여기에 적절히 대처하지 못하여 식물병이 대발생하게 되면, 1846년 아일랜드 대기근과 같은 심각한 사회문제가 발생할 수 있다. 식물병을 방제하기 위한 주요 수단으로서 화학 농약을 사용해 왔으나, 지나친 화학 농약의 사용은 생태계 교란, 환경오염, 인축독성, 약제저항성 문제 등을 가져왔다. 따라서 화학 농약의 사용을 줄이거나 이를 대체하기 위한 새로운 친환경 식물병 방제수단의 개발이 요구되어지고 있고, 식물추출물, 미생물, 또는 미생물이차대사산물 등의 천연소재를 이용한 친환경 무독성 식물병 방제기술 개발 필요성이 커지고 있다. Despite advances in science and technology and industry, the biggest challenge in modern agriculture is still solving the food problem. The world's population is rapidly increasing, and climate change is a red flag for a stable future food supply. Plant pathogens cause various diseases in crops and reduce the yield of crops. If plant diseases are not properly dealt with, serious social problems such as the Irish Great Famine of 1846 may occur. Chemical pesticides have been used as the main means for controlling plant diseases, but excessive use of chemical pesticides has brought about ecosystem disturbance, environmental pollution, human toxicity, and drug resistance problems. Therefore, the development of new eco-friendly plant disease control means to reduce or replace the use of chemical pesticides is required, and the need to develop eco-friendly non-toxic plant disease control technology using natural materials such as plant extracts, microorganisms, or microbial secondary metabolites this is getting bigger
브레비바실러스(Brevibacillus spp.)는 막대형상의 그람양성세균으로 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 한 계통분석을 통하여 1996년 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 클러스터로부터 브레비바실러스(Brevibacillus) 속으로 재분류되었다. 브레비바실러스 아그리(Brevibaciilus agri), 브레비바실러스 보르스테렌시스(Brevibacillus borstelensis), 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis), 브레비바실러스 센트로스포루스(Brevibacillus centrosporus), 브레비바실러스 조시넨시스(Brevibacillus choshinensis), 브레비바실러스 포르모수스(Brevibacillus formosus), 브레비바실러스 라테로스포루스(Brevibacillus laterosporus), 브레비바실러스 파라브레비스(Brevibacillus parabrevis), 브레비바실러스 레우스제리(Brevibacillus reuszeri), 브레비바실러스 서모루버(Brevibacillus thermoruber) 등 현재 20여종의 브레비바실러스가 존재한다. 임상 항생물질인 선형 펩타이드 그라미시딘 A(gramicidin A)와 환형 펩타이드 그라미시딘 S(gramicidin S)를 포함한 다양한 항미생물 펩타이드(e.g., tostadin, edeine, spergualin, tauramamide, brevistin, Bac-GM100, laterosporulin, laterosporulin 10)이 브레비바실러스(Brevibacillus spp.)에서 발견되었다.Brevibacillus ( Brevibacillus spp.) is a rod-shaped Gram-positive bacterium, and through phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence, it was reclassified from the Bacillus brevis cluster in 1996 to the genus Brevibacillus. . Brevibacillus agri ( Brevibaciilus agri ), Brevibacillus borstelensis , Brevibacillus borstelensis , Brevibacillus brevis ), Brevibacillus centrosporus ) choshinensis ), Brevibacillus formosus ( Brevibacillus formosus ), Brevibacillus laterosporus ( Brevibacillus laterosporus ), Brevibacillus parabrevis ( Brevibacillus parabrevis ), Brevibacillus reuszeri ( Brevibacillus reuszeri ), Currently, about 20 species of Brevibacillus exist, such as Brevibacillus thermoruber . Various antimicrobial peptides (eg, tostadin, edeine, spergualin, tauramamide, brevistin, Bac-GM100, laterosporulin, laterosporulin 10) was found in Brevibacillus spp.
브레비바실러스(Brevibacillus spp.)는 신규항생물질을 탐색하는 연구에 주요 소재로 이용되고 있다. 토마토시들음병균(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)과 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) 균주를 동시에 토마토 식물에 처리했을 때, 토마토 시들음병의 진전이 크게 감소했고, 식물생장촉진효과가 나타났다는 연구결과가 있다(J Phytopathol 2010, 158: 470-478). 또한 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) 균주와 이 균주가 생산하는 항생물질 그라미시딘(gramicidin S)는 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)의 포자발아와 균사생장을 억제하는 우수한 활성을 나타낸 바 있지만, 식물병 방제효과는 제시하지 않고 있다(Journal of Applied Microbiology 2001, 91, 652-659). 또한, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) FJAT-0809-GLX 균주는 항균활성물질 에틸파라벤(ethylparaben)을 생산하는 균주로 에틸파라벤을 함유하는 배양여액을 식물병원균(Lasiodiplodia theobromae)과 같이 식물에 처리했을 때, 사과나무의 식물병 발생을 크게 감소시켰다는 결과가 보고된 바 있다. 상기 언급된 항균활성 효과들은 모든 브레비바실러스(Brevibacillus spp.)에서 나타나는 것은 아니며, 브레비바실러스(Brevibacillus spp.) 균주의 특성에 따라 서로 다른 항균활성 효과를 나타낸다.Brevibacillus ( Brevibacillus spp.) is being used as a main material in research to search for new antibiotics. When tomato plants were treated with Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici and Brevibacillus brevis strains at the same time, the progress of tomato wilt was greatly reduced, and the study results showed that the plant growth promoting effect was shown. (J Phytopathol 2010, 158: 470-478). In addition, the Brevibacillus brevis strain and the antibiotic gramicidin S produced by this strain showed excellent activity in inhibiting the spore germination and mycelial growth of the gray mold fungus ( Botrytis cinerea ), but plants The disease control effect is not suggested (Journal of Applied Microbiology 2001, 91, 652-659). In addition, Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) FJAT-0809-GLX strain is a strain that produces an antibacterial active substance ethylparaben ( ethylparaben ), and the culture filtrate containing ethylparaben was treated with a plant as a plant pathogen ( Lasiodiplodia theobromae ). It has been reported that the occurrence of plant diseases in apple trees was greatly reduced. The above-mentioned antibacterial activity effects are not shown in all Brevibacillus ( Brevibacillus spp. ), and exhibit different antibacterial activity effects depending on the characteristics of the Brevibacillus spp. strain.
이처럼 브레비바실러스는 항균활성을 가진 다양한 종류의 펩타이드 항생물질을 생산하기 때문에 새로운 작물보호제를 개발하는데 적극적으로 이용될 수 있다. 본 발명자들은 주요 식물병에 대하여 방제 효과를 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 발굴하여 동정하였으며, 배양액으로부터 식물병원균에 항균활성을 나타내는 물질을 동정하여 본 발명을 완성하였다.As such, Brevibacillus can be actively used to develop new crop protection agents because it produces various types of peptide antibiotics with antibacterial activity. The present inventors discovered and identified a Brevibacillus brevis HK544 strain showing a control effect on major plant diseases, and completed the present invention by identifying substances exhibiting antibacterial activity against plant pathogens from the culture solution.
본 발명의 목적은 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 식물병 방제 활성을 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a Brevibacillus brevis HK544 strain exhibiting plant disease control activity deposited with accession number KACC 81093BP.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for controlling plant diseases containing as an active ingredient any one or more selected from the group consisting of a culture solution of the strain and a culture filtrate of the strain.
본 발명의 또 다른 목적은 이데인 B1을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a plant disease control composition containing idein B1 as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 또는 이데인 B1을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) HK544 strain, a culture solution of the strain, a composition or ide for controlling plant diseases containing any one or more selected from the group consisting of the culture filtrate of the strain as an active ingredient It is to provide a method for controlling plant diseases comprising the step of treating plants or soil in which plants are grown with a plant disease controlling composition containing phosphorus B1 as an active ingredient.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 식물병 방제 활성을 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 제공한다.In order to achieve the above object, an object of the present invention is to provide a Brevibacillus brevis HK544 strain exhibiting plant disease control activity deposited with accession number KACC 81093BP.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a composition for controlling plant diseases containing, as an active ingredient, any one or more selected from the group consisting of a culture solution of the strain and a culture filtrate of the strain.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 이데인 B1을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a plant disease control composition containing idein B1 as an active ingredient.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 또는 이데인 B1을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention provides any one or more selected from the group consisting of Brevibacillus brevis HK544 strain, the culture medium of the strain, and the culture filtrate of the strain as an active ingredient. Plant disease control containing It provides a plant disease control method comprising the step of treating a plant or soil cultivating a plant with a plant disease control composition containing a composition for use or idein B1 as an active ingredient.
본 발명에 따른 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물은 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병 등 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내므로, 식물병 방제 용도로 유용하게 사용될 수 있다. The composition for controlling plant diseases using the Brevibacillus brevis HK544 strain according to the present invention shows an excellent control effect on various plant diseases such as tomato gray mold, tomato late blight, wheat red rust, red pepper anthrax, etc. It can be usefully used for disease control purposes.
도 1은 콩(tryptic soy agar) 배지에 배양한 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 균총을 나타낸 도이다.
도 2는 16S rRNA 유전자 염기서열 기반으로 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 근연종과 비교하여 작성된 계통수를 나타낸 도이다.
도 3은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양액과 배양여액의 고추 탄저병 방제효과를 확인한 사진이다.
(A) 좌측부터 무처리구, HK544 배양액 10%처리구, HK544 배양액 20%처리구, HK544 배양액 30%처리구, 합성농약 다이티아논(dithianon; 50μg/ml)의 처리구
(B) 좌측부터 무처리구, HK544 배양여액 10%처리구, HK544 배양여액 20%처리구, HK544 배양여액 30%처리구, 합성농약 다이티아논(dithianon; 50μg/ml)의 처리구
도 4는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주로부터 항균활성물질 이데인 B1(edeine B1)를 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 5는 이데인 B1(edeine B1)의 ESI-MS 양이온 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 이데인 B1(edeine B1)의 화학구조를 나타낸 도이다.1 is a view showing the flora of the Brevibacillus brevis HK544 strain cultured in a soybean (tryptic soy agar) medium.
2 is a diagram showing a phylogenetic tree prepared by comparing the Brevibacillus brevis HK544 strain with related species based on the 16S rRNA gene nucleotide sequence.
Figure 3 is a photograph confirming the control effect of pepper anthrax of the Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) HK544 strain culture and the culture filtrate.
(A) From the left, no treatment group, 10% treatment group of HK544 culture solution, 20% treatment group of HK544 culture solution, 30% treatment group of HK544 culture solution, and group treated with synthetic pesticide dithianon (dithianon; 50 μg/ml)
(B) From the left, no treatment group, 10% treatment group of HK544 culture filtrate, 20% treatment group of HK544 culture filtrate, 30% treatment group of HK544 culture filtrate, treatment group of synthetic pesticide dithianon (50μg/ml)
4 is a view showing the process of separating the antibacterial active material edeine B1 (edeine B1) from the Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) HK544 strain.
5 is a diagram showing the results of ESI-MS cation analysis of edeine B1.
6 is a diagram showing the chemical structure of edeine B1 (edeine B1).
본 명세서 중에서 "방제"라고 하는 것은 병이나 해충의 예방, 기피 뿐만 아니라 제거, 사멸의 의미를 포함한다. In the present specification, the term "control" includes the meaning of preventing and avoiding diseases or pests, as well as removing and killing them.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 식물병 방제 활성을 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 제공한다.The present invention provides a Brevibacillus brevis HK544 strain exhibiting plant disease control activity deposited with accession number KACC 81093BP.
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.The strain may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 균주는 토양으로부터 분리된 것일 수 있고, 구체적으로 한국화학연구원 실험포장의 토양으로부터 분리된 것일 수 있다.The strain may be isolated from the soil, specifically, it may be isolated from the soil of the Korea Research Institute of Chemical Technology experimental field.
상기 균주는 식물병 방제 활성을 가질 수 있다.The strain may have plant disease control activity.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추 검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란 세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The plant disease is rice blast (causative bacterium: Magnaporthe oryzae ), tomato late blight ( causative bacterium: Phytophthora infestans ), wheat red rust ( causative bacterium: Puccinia triticina ), barley powdery mildew ( causative bacteria: Blumeria graminis f. sp. : Colletotrichum coccodes ), tomato gray mold disease (causative bacterium : Botrytis cinerea ), cabbage black spot disease (causative bacterium : Alternaria brassicicola ), phalaenopsis bacterial brown spot disease ( causative bacteria: Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), peach bacterial hole disease (causative bacterium: Xanthomonas arboricola ) pv. pruni ), kiwi ulcer disease ( causative bacterium: Pseudomonas syringae pv. actinidiae ), or fruit tree burn disease ( causative bacterium: Erwinia amylovora ), but is not limited thereto.
또한 본 발명은 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling plant diseases containing, as an active ingredient, any one or more selected from the group consisting of a culture solution of the strain and a culture filtrate of the strain.
상기 균주는 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주로 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. The strain may have the characteristics as described above as the Brevibacillus brevis HK544 strain deposited with the accession number KACC 81093BP.
상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 것일 수 있고, 상기 배양여액은 균주를 배양한 배양액을 물리적으로 여과한 것일 수 있다.The culture solution may be obtained by culturing the strain, and the culture filtrate may be a physical filtration of the culture solution culturing the strain.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추 검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란 세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The plant disease is rice blast (causative bacterium: Magnaporthe oryzae ), tomato late blight ( causative bacterium: Phytophthora infestans ), wheat red rust ( causative bacterium: Puccinia triticina ), barley powdery mildew ( causative bacteria: Blumeria graminis f. sp. : Colletotrichum coccodes ), tomato gray mold disease (causative bacterium : Botrytis cinerea ), cabbage black spot disease (causative bacterium : Alternaria brassicicola ), phalaenopsis bacterial brown spot disease ( causative bacteria: Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), peach bacterial hole disease (causative bacterium: Xanthomonas arboricola ) pv. pruni ), kiwi ulcer disease ( causative bacterium: Pseudomonas syringae pv. actinidiae ), or fruit tree burn disease ( causative bacterium: Erwinia amylovora ), but is not limited thereto.
상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀, 고추, 호접란, 복숭아, 키위, 배추, 사과나무 및 배나무로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.The plant may be any one or more selected from the group consisting of rice, tomato, barley, wheat, red pepper, Phalaenopsis, peach, kiwi, Chinese cabbage, apple tree and pear tree.
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양여액에서 분리한 활성 물질의 단순 혼합물일 수 있다. 대안적으로는, 식물병 방제용 조성물은 상기 배양액 또는 상기 배양여액에서 분리한 활성 물질과 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조된다. 상기 언급된 식물병 방제용 조성물은 그 자체로서 또는 다른 불활성 성분을 첨가하여 본 발명은 종자 처리제로도 사용될 수 있다. The composition for controlling plant diseases according to the present invention may be a simple mixture of the active material isolated from the Brevibacillus brevis HK544 strain, its culture medium, or its culture filtrate. Alternatively, the composition for controlling plant diseases is prepared by mixing the active material isolated from the culture medium or the culture filtrate with an inert carrier, and the mixture is an emulsion, emulsion, glidant, wettable powder, granulated wettable powder, powder, It is prepared by adding a surfactant and other necessary adjuvants to the mixture so that it can be formulated into granules or the like. The above-mentioned composition for controlling plant diseases by itself or by adding other inactive ingredients, the present invention can also be used as a seed treatment agent.
제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸타프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름 아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.Examples of liquid carriers that can be used in the formulation include water; alcohols such as methanol and ethanol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, ethylbenzene and methyltaphthalene; aliphatic hydrocarbons such as hexane, cyclohexane, kerosine and light oil; esters such as ethyl acetate and butyl acetate; nitriles such as acetonitrile and isobutyrnitrile; ethers such as diisopropylether and dioxane; acid amides such as N,N-dimethyl formamide and N,N-dimethylacetamide; halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, trichloroethane and carbon tetrachloride; dimethyl sulfoxide; and vegetable oils such as soybean oil and cottonseed oil.
제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 필로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함할 수 있다.Examples of solid carriers that can be used in the formulation include fine powders or granules such as minerals such as kaolin clay, attapulgite clay, bentonite, montmorillonite, acid white clay, phyllophyllite, talc, diatomaceous earth and talcite; natural organic substances such as corn leaf stalk powder and walnut hull powder; synthetic organic materials such as urea; salts such as calcium carbonate and ammonium sulfate; synthetic inorganic materials such as synthetic hydrated silicon oxide; As the liquid carrier, aromatic hydrocarbons such as xylene, alkylbenzene and methylnaphthalene; alcohols such as 2-propanol, ethylene glycol, propylene glycol and ethylene glycol monoethyl ether; ketones such as acetone, cyclohexanone and isophorone; vegetable oils such as soybean oil and cottonseed oil; petroleum aliphatic hydrocarbons, esters, dimethylsulfoxide, acetonitrile and water.
계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함할 수 있다.Examples of surfactants include anionic surfactants such as alkyl sulfate ester salts, alkylaryl sulfonate salts, dialkylsulfosuccinate salts, polyoxyethylene alkylaryl ether phosphate ester salts, lignosulfonate salts and naphthalene sulfonate form aldehyde polycondensates; and nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl aryl ethers, polyoxyethylene alkylpolyoxypropylene block copolymers and sorbitan fatty acid esters and cationic surfactants such as alkyltrimethylammonium salts.
다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알길산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸(alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP(산 포스페이트 이소프로필) 및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함할 수 있다.Examples of other formulation aids include water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol and polyvinylpyrrolidone, polysaccharides such as gum arabic, alginic acid and salts thereof, CMC (carboxymethyl-cellulose), xanthan gum, inorganic substances such as aluminum magnesium silicate and alumina sol (alumina sol), preservatives, colorants and stabilizers such as PAP (acid phosphate isopropyl) and BHT (butylhydroxyrtoluene).
또한 본 발명은 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 이의 배양액 및 이의 배양여액으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제 방법을 제공한다. In addition, the present invention is a step of treating at least one selected from the group consisting of Brevibacillus brevis HK544 strain deposited with accession number KACC 81093BP, its culture solution and its culture filtrate to a plant, its seed or its habitat. It provides a method for controlling plant diseases, characterized in that it comprises.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.The treatment may be indirect spraying of spraying the composition directly on the plant, spraying on the soil in which the plant is growing, or spraying on the medium for culturing the plant.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.The control method of the present invention includes treatment of stems and leaves of plants, treatment of places where plants are grown (eg soil), treatment of seeds such as seed sterilization/seed coating and treatment of roots.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법 가운데 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리계의 토양 내로의 살포 (액체 처리계의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow)주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부분, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물에 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배치(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다. As treatment of stems and leaves with the control method of the present invention, application on the surface of plants, such as, for example, spraying on stems and leaves, in particular can be included. Among the control methods of the present invention, the treatment of soil includes, for example, spraying onto the soil, mixing with the soil, and spraying the liquid treatment system into the soil (irrigation of the liquid treatment system, injection into the soil, dripping of the liquid treatment agent). Examples of places to be treated include planting holes, furrows, around planting furrows, around planting furrows, the entire surface of the growth site, between soil and plants, between roots, under the stems of plants Includes part, main furrow, growing soil, nail bed, seedling box, seedling tray, and seedbed. The treatment may be performed before spraying, during spraying, immediately after spraying, during the simulated cultivation period, before cultivation settlement, at the time of cultivation settlement, and during the growth period after cultivation settlement. In the above-mentioned soil treatment, the active ingredient may be simultaneously applied to the plant, or a solid fertilizer such as a paste fertilizer containing the active ingredient may be applied to the soil. The active ingredient may be mixed in an irrigation liquid, for example injected into an irrigation plant (irrigation tube, irrigation pipe, sprinkler, etc.), mixed in a liquid overflowing between furrows, or mixed in a water culture medium. can Alternatively, the irrigation liquid and active ingredient may be mixed beforehand and used for treatment by suitable irrigation methods, including, for example, the irrigation methods mentioned above and other methods such as spraying and flooding.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다. The volatilization treatment method as the control method of the present invention is, for example, the soil in which the plant is cultured with the composition for controlling plant diseases of the present invention, a hydroponic medium for culturing plants, and the volatilization of the sprayed composition. It is a method of protecting the plant from pests and diseases through the use of the composition, and in addition, the composition can be placed around the plant to expose the plant to the composition in the volatilized gaseous state.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미리 확보하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.The seed treatment method in the control method of the present invention is, for example, a method of treating seeds to be protected from pests with the composition for controlling plant diseases of the present invention, and a specific example thereof is a suspension of the composition for controlling plant diseases of the present invention in advance. a spray treatment method of securing and spraying on the seed surface; a spraying treatment method of applying the wettable powder, emulsion, glidant, etc. of the composition for controlling plant diseases of the present invention by itself or by adding a small amount of water to the seed surface; Impregnation treatment method of impregnating the seeds in the solution of the composition for controlling plant diseases of the present invention for a specific period; including film coating treatment and pellet coating treatment.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.When a plant or soil for plant growth is treated with the compound according to the present invention, the treatment amount may vary depending on the type of plant to be treated, the type and frequency of occurrence of the pest to be controlled, the formulation form, the treatment period, climatic conditions, and the like.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량 %, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석없이 처리에 사용된다.Emulsions, wettable powders, glidants, etc. are usually diluted with water and then applied for treatment. In this case, the concentration of the active ingredient is usually in the range of 0.0001 to 3% by weight, preferably 0.0005 to 1% by weight. Powders, granules, etc. are usually used for treatment without dilution.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다. The control method of the present invention can be used in cultivated land or non-arable land, such as paddy fields.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추 검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란 세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The plant disease is rice blast (causative bacterium: Magnaporthe oryzae ), tomato late blight ( causative bacterium: Phytophthora infestans ), wheat red rust ( causative bacterium: Puccinia triticina ), barley powdery mildew ( causative bacteria: Blumeria graminis f. sp. : Colletotrichum coccodes ), tomato gray mold disease (causative bacterium : Botrytis cinerea ), cabbage black spot disease (causative bacterium : Alternaria brassicicola ), phalaenopsis bacterial brown spot disease ( causative bacteria: Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), peach bacterial hole disease (causative bacterium: Xanthomonas arboricola ) pv. pruni ), kiwi ulcer disease ( causative bacterium: Pseudomonas syringae pv. actinidiae ), or fruit tree burn disease ( causative bacterium: Erwinia amylovora ), but is not limited thereto.
상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀, 고추, 호접란, 복숭아, 키위, 배추, 사과나무 및 배나무로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.The plant may be any one or more selected from the group consisting of rice, tomato, barley, wheat, red pepper, Phalaenopsis, peach, kiwi, Chinese cabbage, apple tree and pear tree.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 한국화학연구원 실험포장의 토양으로부터 분리한 HK544 균주를 동정하여 농촌진흥청 농업유전자원센터에 특허균주(수탁번호: KACC81093BP)로 기탁하였다(도 1 참조).In a specific embodiment of the present invention, the present inventors identified the HK544 strain isolated from the soil of the experimental field at the Korea Research Institute of Chemical Technology and deposited it as a patent strain (accession number: KACC81093BP) at the Agricultural Genetic Resource Center of the Rural Development Administration (see Fig. 1).
또한 본 발명자들은 본 발명의 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 배양여액을 식물에 처리한 후, 식물병원성 곰팡이와 세균들에 대한 생장 억제활성을 조사한 결과, 배추 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 호접란 세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)에 대한 생장 억제 효과를 가짐을 확인하였다(표 1 참조).In addition, the present inventors investigated the growth inhibitory activity against phytopathogenic fungi and bacteria after treating the plant with the culture filtrate of the Brevibacillus brevis HK544 strain of the present invention. , Tomato gray mold fungus ( Botrytis cinerea ), Red pepper anthrax ( Colletotrichum coccodes ), Phalaenopsis bacterial brown spot blight ( Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), Peach bacterial hole bacillus ( Xanthomonas arboraicola pv. pruni ), Kiwi ulcer disease ( Pseudomonas arboricola pv. pruni ) actinidiae ) was confirmed to have a growth inhibitory effect (see Table 1).
또한 본 발명자들은 상기 균주의 배양액 또는 배양여액을 식물에 처리한 후, 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)에 대한 식물병 방제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 균주의 배양액 또는 배양여액은 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 녹병 및 고추 탄저병에 대한 방제 효과를 가짐을 확인하였다(표 2 참조). In addition, the present inventors after treating the culture solution or the culture filtrate of the strain on plants, rice blast disease (pathogen: Magnaporthe oryzae ), tomato gray mold disease (pathogen: Botrytis cinerea ), tomato late blight (pathogen: Phytophthora infestans ), wheat red rust (Pathogen: Puccinia triticina ), barley powdery mildew ( Pathogen: Blumeria graminis f. sp. hordei ), pepper anthrax ( Pathogen: Colletotrichum coccodes ) As a result of confirming the plant disease control effect on, the culture medium or culture filtrate of the strain of the present invention is tomato It was confirmed that it has a control effect on gray mold disease, tomato late blight, wheat rust and red pepper anthrax (see Table 2).
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling plant diseases containing a compound represented by the following formula (1), a stereoisomer thereof, as an active ingredient.
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학물은 이데인 B1(edeine B1)이다.The chemical is edeine B1.
상기 화합물은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주에서 분리된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The compound may be isolated from Brevibacillus brevis HK544 strain, but is not limited thereto.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란 세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The plant disease is rice blast (causative bacterium: Magnaporthe oryzae ), tomato late blight ( causative bacterium: Phytophthora infestans ), wheat red rust ( causative bacterium: Puccinia triticina ), barley powdery mildew ( causative bacteria: Blumeria graminis f. sp. : Colletotrichum coccodes ), tomato gray mold disease ( causative bacterium : Botrytis cinerea ), cabbage black spot disease ( causative bacterium : Alternaria brassicicola ), phalaenopsis bacterial brown spot disease ( causative bacteria: Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), peach bacterial hole disease (causative bacterium: Xanthomonas arboricola ) pv. pruni ), kiwi ulcer disease ( causative bacterium: Pseudomonas syringae pv. actinidiae ), or fruit tree burn disease ( causative bacterium: Erwinia amylovora ), but is not limited thereto.
상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀, 고추, 호접란, 복숭아, 키위, 배추, 사과나무 및 배나무로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.The plant may be any one or more selected from the group consisting of rice, tomato, barley, wheat, red pepper, Phalaenopsis, peach, kiwi, Chinese cabbage, apple tree and pear tree.
상기 조성물은 식물병 방제 활성을 가질 수 있다.The composition may have plant disease control activity.
상기 화합물은 농약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 농약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.The compound may be used in the form of an agrochemically acceptable salt, and may include all salts, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods as well as agrochemically acceptable salts.
또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여 식물병 방제 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for controlling plant diseases using a composition containing the compound as an active ingredient.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.The treatment may be indirect spraying of spraying the composition directly on the plant, spraying on the soil in which the plant is growing, or spraying on the medium for culturing the plant.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.The control method of the present invention includes treatment of stems and leaves of plants, treatment of places where plants are grown (eg soil), treatment of seeds such as seed sterilization/seed coating and treatment of roots.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법 가운데 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리계의 토양 내로의 살포 (액체 처리계의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow)주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부분, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물에 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배치(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다. As treatment of stems and leaves with the control method of the present invention, application on the surface of plants, such as, for example, spraying on stems and leaves, in particular can be included. Among the control methods of the present invention, the treatment of soil includes, for example, spraying onto the soil, mixing with the soil, and spraying the liquid treatment system into the soil (irrigation of the liquid treatment system, injection into the soil, dripping of the liquid treatment agent). Examples of places to be treated include planting holes, furrows, around planting furrows, around planting furrows, the entire surface of the growth site, between soil and plants, between roots, under the stems of plants Includes part, main furrow, growing soil, nail bed, seedling box, seedling tray, and seedbed. The treatment may be performed before spraying, during spraying, immediately after spraying, during the simulated cultivation period, before cultivation settlement, at the time of cultivation settlement, and during the growth period after cultivation settlement. In the above-mentioned soil treatment, the active ingredient may be simultaneously applied to the plant, or a solid fertilizer such as a paste fertilizer containing the active ingredient may be applied to the soil. The active ingredient may be mixed in an irrigation liquid, for example injected into an irrigation plant (irrigation tube, irrigation pipe, sprinkler, etc.), mixed in a liquid overflowing between furrows, or mixed in a water culture medium. can Alternatively, the irrigation liquid and active ingredient may be mixed beforehand and used for treatment by suitable irrigation methods, including, for example, the irrigation methods mentioned above and other methods such as spraying and flooding.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다. The volatilization treatment method as the control method of the present invention is, for example, the soil in which the plant is cultured with the composition for controlling plant diseases of the present invention, a hydroponic medium for culturing plants, and the volatilization of the sprayed composition. It is a method of protecting the plant from pests and diseases through the use of the composition, and in addition, the composition can be placed around the plant to expose the plant to the composition in the volatilized gaseous state.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.The seed treatment method in the control method of the present invention is, for example, a method of treating seeds so as to be protected from pests with the composition for controlling plant diseases of the present invention, and a specific example thereof is a suspension of the composition for controlling plant diseases of the present invention. a spray treatment method of spraying on the surface; a spraying treatment method of applying the wettable powder, emulsion, glidant, etc. of the composition for controlling plant diseases of the present invention by itself or by adding a small amount of water to the seed surface; Impregnation treatment method of impregnating the seeds in the solution of the composition for controlling plant diseases of the present invention for a specific period; including film coating treatment and pellet coating treatment.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.When a plant or soil for plant growth is treated with the compound according to the present invention, the treatment amount may vary depending on the type of plant to be treated, the type and frequency of occurrence of the pest to be controlled, the formulation form, the treatment period, climatic conditions, and the like.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량 %, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석없이 처리에 사용된다.Emulsions, wettable powders, glidants, etc. are usually diluted with water and then applied for treatment. In this case, the concentration of the active ingredient is usually in the range of 0.0001 to 3% by weight, preferably 0.0005 to 1% by weight. Powders, granules, etc. are usually used for treatment without dilution.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다. The control method of the present invention can be used in cultivated land or non-arable land, such as paddy fields.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 배양여액을 부탄올 및 아세톤으로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물로부터 화학식 1로 표시되는 이데인 B1(edeine B1)를 분리하였다(도 4 및 5 참조).In a specific embodiment of the present invention, the present inventors separate the edeine B1 represented by Formula 1 from the fraction obtained by sequentially fractionating the culture filtrate of the Brevibacillus brevis HK544 strain with butanol and acetone. (see FIGS. 4 and 5).
또한, 본 발명자들은 상기 분리한 이데인 B1(edeine B1)이 식물병원성 곰팡이 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 벼도열병균(Magnaporthe oryzae), 토마토역병균(Phytophthora infestans) 및 식물병원성 세균인 과수화상병균(Erwinia amylovora)에 대해 우수한 살균활성 효과를 가짐을 확인하였다(표 4 참조).In addition, the present inventors found that the isolated edeine B1 is a phytopathogenic mold cabbage black blight ( Alternaria brassicicola ), tomato gray mold blight ( Botrytis cinerea ), red pepper anthrax ( Colletotrichum coccodes ), rice blast bacillus ( Magnaporthe ) oryzae ), tomato late blight ( Phytophthora infestans ), and phytopathogenic bacteria Fruit burn ( Erwinia amylovora ) were confirmed to have an excellent bactericidal activity (see Table 4).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples.
다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. However, the following examples only illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.
<실시예 1> HK544 균주의 분리<Example 1> Isolation of strain HK544
HK544 균주를 분리하기 위하여 한국화학연구원 실험포장의 토양으로부터 토양시료를 채취하여 물과 혼합하였다. 25 ㎛체를 이용하여 찌꺼기를 거른 다음 현탁액 0.1 ㎖을 취하여 1/10 농도의 TSA 희석배지(1/10 strength tryptic soy agar; 0.17% tryptone, 0.03% soytone, 0.025% dextrose, 0.05% NaCl, 0.25% K2HPO4, 1.5% agar)에 도말한 후, 25℃ 배양기에서 3일간 배양하였다. 분리한 세균은 3번의 계대배양을 통해 단일 콜로니를 획득하였으며, HK544 균주로 명명하였다. 이후 실험에 사용할 때까지, HK544 균주는 멸균한 20% 글리세롤(glycerol) 수용액에 침지하여 -80°에 보관하였다. To isolate the HK544 strain, a soil sample was collected from the soil of the experimental field at the Korea Research Institute of Chemical Technology and mixed with water. After filtering the residues using a 25 µm sieve, 0.1 ml of the suspension is taken and 1/10 strength tryptic soy agar; 0.17% tryptone, 0.03% soytone, 0.025% dextrose, 0.05% NaCl, 0.25% After smearing on K 2 HPO 4 , 1.5% agar), it was cultured in an incubator at 25° C. for 3 days. The isolated bacteria obtained a single colony through three passages, and was named HK544 strain. Until used in subsequent experiments, the HK544 strain was immersed in a sterile 20% glycerol aqueous solution and stored at -80°.
<실시예 2> HK544 균주의 분자생물학적 동정<Example 2> Molecular biological identification of strain HK544
본 발명에 사용한 HK544 균주는 TSA(tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4, 1.5% agar) 배지에 배양하였을 때 아이보리색의 슬라임 형태의 균총을 형성한다(도 1). HK544 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 분자계통학적 분석을 실시하였다. HK544 균주를 TSA 배지에 접종하여 25°에서 2일 동안 150 rpm으로 진탕배양하여 얻은 균체로부터 CTAB 버퍼를 사용한 다음 DNA 추출법을 사용하여 KH544 균주의 DNA(100 ng/㎕)를 얻었다. 상기 DNA를 주형으로 한쌍의 유니버셜 프라이머 세트(27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'; 1492R, 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')와 Ex Taq polymerase(Takara, Otsu, Japan)를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 16S rRNA 유전자 단편을 얻었다. 0.8% 아가로즈 젤(agarolse gel)에서 확인된 밴드는 GeneAll Expin PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 정제한 후, 염기서열 분석을 위해 시퀀싱 분석 서비스(Macrogen, Daejeon, Korea)를 이용하였다. HK544 strain used in the present invention TSA (tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K 2 HPO 4 , 1.5% agar) When cultured in medium, ivory-colored slime form of the colony (Fig. 1). Molecular phylogenetic analysis was performed based on the 16S rRNA gene nucleotide sequence of the HK544 strain. The HK544 strain was inoculated into TSA medium and cultured with shaking at 150 rpm for 2 days at 25° using CTAB buffer, and then DNA (100 ng/μl) of the KH544 strain was obtained by using a DNA extraction method. Polymerase chain reaction using the DNA as a template and a pair of universal primer sets (27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'; 1492R, 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') and Ex Taq polymerase (Takara, Otsu, Japan) chain reaction) to obtain a 16S rRNA gene fragment. The band identified in 0.8% agarose gel was purified using the GeneAll Expin PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea), and then sequencing analysis service (Macrogen, Daejeon, Korea) was used for sequencing analysis. did.
그 결과, 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻었으며(서열번호 1), NCBI BLASTn (http://www.ncbi. nlm.nih.gov) 데이터베이스에 등록된 다른 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열과 비교 분석하였다. MEGA 4.0 프로그램을 이용하여 Clustal W로 염기서열을 정렬한 다음, 유전자 간의 유사도를 근린 결합법에 의한 계통수(neighbor-joining tree)로 작성하였다(Saitou와 Nei, 1987). 분자계통도는 거리행렬법 중의 하나인 Neighbour-joining 방법을 사용하여 구성하였으며, Bootstrap 분석(1,000 회)은 MEGA 프로그램의 알고리즘을 이용하여 수행하였다. As a result, the 16S rRNA gene sequence of SEQ ID NO: 1 was obtained (SEQ ID NO: 1), and the 16S rRNA gene sequence of other strains registered in the NCBI BLASTn (http://www.ncbi. nlm.nih.gov) database and comparative analysis. After aligning the nucleotide sequences with Clustal W using the MEGA 4.0 program, the similarity between genes was created as a neighbor-joining tree (Saitou and Nei, 1987). The molecular tree was constructed using the neighbor-joining method, one of the distance matrix methods, and Bootstrap analysis (1,000 times) was performed using the MEGA program algorithm.
[서열번호 1][SEQ ID NO: 1]
AGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGTGTCTTCGGACCCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTCTCAGACTGGGATAACATAGGGAAACTTATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATCGCATGATCCGAAAAGAAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTGGGAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGAATAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGTTTCAATACCCTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGACCGCTCTGGAGACAGAGCTTCCCTTCGGGGCAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGGGATGCTACCTCGCGAGAGGACGCCAATCTCTTAAAACCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGTGTCTTCGGACCCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTCTCAGACTGGGATAACATAGGGAAACTTATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATCGCATGATCCGAAAAGAAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTGGGAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGAATAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGTTTCAATACCCTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGACCGCTCTGGAGACAGAGCTTCCCTT CGGGGCAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGGGATGCTACCTCGCGAGAGGACGCCAATCTCTTAAAACCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGACTGGGGTGAAGTCGTA
16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과 HK544 균주는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) DSM 5760 균주와 같은 그룹을 형성하였고(도 2), 높은 상동성(99.9% 이상)을 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 HK544 균주를 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis)로 동정하였고, 농촌진흥청 농업유전자원센터에 특허균주(수탁번호: KACC81093BP)로 기탁하였다.As a result of 16S rRNA gene sequencing, the HK544 strain formed the same group as the Brevibacillus brevis DSM 5760 strain (FIG. 2), and showed high homology (99.9% or more). Based on these results, the HK544 strain was identified as Brevibacillus brevis and deposited as a patent strain (accession number: KACC81093BP) at the Agricultural Genetic Resource Center of the Rural Development Administration.
<실시예 3> HK544 균주의 배양액, 배양여액 및 이들의 희석액의 제조<Example 3> Preparation of culture solution of HK544 strain, culture filtrate and dilutions thereof
브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 TSA 배지(1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4, 1.5% agar)에서 배양한 다음, TSA 한천배지에 형성된 균총을 면전으로 밀봉하여 멸균한 200 ml의 TSB 배지(tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4)가 담긴 1 L-삼각플라스크에 접종하고, 2일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 전배양액을 제조하였다. 전배양액을 새로운 400 ml의 TSB 배지가 담긴 2 L-삼각플라스크에 1% 접종하고, 접종 후 3일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 HK544 배양액을 제조하였다.Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) HK544 strain was cultured in TSA medium (1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K 2 HPO 4 , 1.5% agar), and then on TSA agar medium. 200 ml of sterilized TSB medium (tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K 2 HPO 4 ) by sealing the formed flora with the face 1 L -Inoculated into an Erlenmeyer flask, and cultured with shaking (150 rpm) at 25˚C for 2 days to prepare a pre-culture solution. 1% of the pre-culture solution was inoculated in a 2 L-erlenmeyer flask containing 400 ml of fresh TSB medium, and cultured with shaking at 25 °C (150 rpm) for 3 days after inoculation to prepare a HK544 culture solution.
또한, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양액을 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 후 여과지(Whatman No.1)로 걸러서 배양여액을 제조하였다. 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양액 또는 배양여액을 증류수에 10%, 20%, 30% 농도로 희석한 시료를 식물병 방제 시험에 사용하였다.In addition, Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) HK544 strain culture solution was centrifuged (10,000 × g, 20 min) and filtered through filter paper (Whatman No. 1) to prepare a culture filtrate. Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) HK544 strain culture solution or a sample diluted with distilled water to 10%, 20%, 30% concentration was used for plant disease control test.
<실험예 1> HK544 균주 배양여액의 in vitro 살균활성 효과<Experimental Example 1> In vitro bactericidal activity effect of culture filtrate of HK544 strain
상기 실시예 3에 의해 제조된 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양여액을 식물병원성 곰팡이인 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 벼도열병균(Magnaporthe oryzae), 토마토역병균(Phytophthora infestans)과 식물병원성 세균인 호접란세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 세균성무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 복숭아세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) 등에 대한 생장 억제활성을 96-웰 플레이트를 사용한 액체배지미량희석법으로 최소억제농도(MIC)를 결정하였다.The Brevibacillus brevis HK544 strain culture filtrate prepared in Example 3 was used as a phytopathogenic fungus, Chinese cabbage black mold ( Alternaria brassicicola ), tomato gray mold ( Botrytis cinerea ), red pepper anthrax ( Colletotrichum coccodes ) , Rice blast bacillus ( Magnaporthe oryzae ), tomato blight blight ( Phytophthora infestans ) and phytopathogenic bacteria Phalaenopsis bacterium brown spot blight ( Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), fruit root nodules ( Agroholderia glumaebacterium ), Bacterial rice germ , Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum ), Pseudomonas syringae pv . The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by microdilution in liquid medium using a 96-well plate.
100 μl 웰에 곰팡이의 경우 포자가 1 ×104 spores/ml 또는 세균의 경우 1 ×103 baceterial cells/ml의 농도로 포함하도록 각각 배양하였다. 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양여액이 1.3%, 2.5%, 5%, 10%, 20%의 농도가 되도록 각 웰에 처리하였다. 이 때 무처리구로 멸균수를 사용하였다. 2-3일 동안 미생물 생장이 최적인 온도에서 배양한 다음 육안으로 관찰했을 때, 곰팡이의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도(MIC)로 결정하였다.In 100 μl wells, spores were incubated at a concentration of 1 × 10 4 spores/ml for mold or 1 × 10 3 baceterial cells/ml for bacteria, respectively. Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) HK544 strain culture filtrate was treated in each well so that the concentration of 1.3%, 2.5%, 5%, 10%, 20%. At this time, sterile water was used as an untreated instrument. When observed with the naked eye after culturing at the optimum temperature for microbial growth for 2-3 days, the concentration at which fungal growth was completely inhibited was determined as the minimum inhibitory concentration (MIC).
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이, HK544 균주의 배양여액은 1.3% 농도에서 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes)을 완전히 억제하는 in vitro 살균활성을 나타내었다. 또한, 10―20% 농도의 HK544 균주 배양여액은 3종의 식물병원성 세균(A. avenae subsp. cattleyae, X. arboricola pv. pruni, P. syringae pv. actinidiae)의 생장을 완전히 억제하는 활성을 나타내었다.As a result, as shown in Table 1, the culture filtrate of the HK544 strain was at a concentration of 1.3%, the cabbage black pattern fungus ( Alternaria brassicicola ), the tomato gray mold fungus ( Botrytis cinerea ), the red pepper anthrax ( Colletotrichum coccodes ) in completely inhibiting It showed in vitro bactericidal activity. In addition, the HK544 strain culture filtrate at a concentration of 10-20% exhibits an activity of completely inhibiting the growth of three types of phytopathogenic bacteria ( A. avenae subsp. cattleyae , X. arboricola pv. pruni , P. syringae pv. actinidiae ). it was
<실험예 2> HK544 균주의 배양액, 배양여액 및 이들의 희석액의 식물병 방제효과 확인<Experimental Example 2> Confirmation of plant disease control effect of HK544 strain culture solution, culture filtrate and dilutions thereof
상기 실시예 3에서 제조한 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 배양액, 배양여액 및 이들의 희석액을 대상으로 6가지 주요 식물병인 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)에 대한 식물병 방제 효과를 온실 조건에서 확인하였다. The six major plant diseases, rice blast disease (pathogen: Magnaporthe oryzae ), tomato gray mold disease (pathogen: Botrytis cinerea ), tomato blight (pathogen: Phytophthora infestans ), wheat red rust (pathogen: Puccinia triticina ), barley powdery mildew (pathogen: Blumeria graminis f. sp. hordei ), pepper anthrax (pathogen: Colletotrichum coccodes ) The effect was confirmed under greenhouse conditions.
식물병 방제효과를 평가하기 위해 0.025% (w/v) 트윈 20(Tween 20)을 전착제로서 시료에 첨가하였고, 이때 무처리구는 0.025% (w/v) 트윈 20 수용액을 사용하였다. 시료를 벼, 토마토, 밀, 보리 및 고추 유묘에 분무처리하고, 1일 후 각각의 병원균을 접종하여 배양액 또는 배양여액의 식물병 방제활성을 조사하였다.To evaluate the plant disease control effect, 0.025% (w/v)
구체적으로, 각 식물병 당 4개의 포트를 이용하였고, 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀 식물은 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음, 종자를 파종하여 25℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다.Specifically, 4 pots were used for each plant bottle, and after spraying the sample on the leaf surface, it was air-dried for 24 hours, and then each plant pathogen was inoculated. The rice, tomato, barley and wheat plants used in the experiment were filled with about 70% of water or horticultural tops in a plastic pot with a diameter of 4.5 cm, and then seeds were sown and grown in a greenhouse at 25° C. for 1 to 4 weeks.
토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후에 병반면적율(%)을 조사하였다. 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반면적율(%)을 조사하여 다음과 같은 식에 대입하여 방제가(%)를 구하였다.Tomato gray mold and tomato late blight were investigated 3 days after inoculation,
방제가(%) = [1 - (처리구의 병반면적율 / 무처리구의 병반면적율)] ×100Control value (%) = [1 - (Ratio of lesions in treated areas / Ratio of lesions in untreated areas)] ×100
보리흰가루병; PAN, 고추탄저병 a RCB, rice blast; TGM, tomato gray mold; TLB, tomato blight; WLR, wheat red rust; BPM,
barley powdery mildew; PAN, red pepper anthrax
그 결과, 표 2에서 나타난 바와 같이, HK544 균주의 배양액 또는 배양여액은 10% 농도에서도 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병을 90% 이상 방제하는 우수한 방제활성을 보였으며, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에 대한 방제활성을 나타냈다. HK544 균주의 배양액 또는 배양여액은 30% 농도에서 고추 탄저병을 80% 이상 방제하는 효과를 나타냈고, 이는 합성농약 다이티아논(dithianon)을 50 μg/ml 농도로 처리한 효과에 준하였다(도 3). 또한 HK544 균주의 배양액과 배양여액은 30% 농도에서 밀 붉은녹병을 각각 80%와 53% 방제하는 효과를 나타냈다.As a result, as shown in Table 2, the culture solution or the culture filtrate of the HK544 strain showed excellent control activity in controlling more than 90% of tomato gray mold disease and tomato late blight even at a concentration of 10%, and against wheat red rust and red pepper anthrax. showed inhibitory activity. The culture solution or culture filtrate of the HK544 strain showed an effect of controlling more than 80% of red pepper anthrax at a concentration of 30%, which was equivalent to the effect of treating the synthetic pesticide dithianon at a concentration of 50 μg/ml (Fig. 3) ). In addition, the culture medium and the culture filtrate of the HK544 strain showed an effect of controlling 80% and 53% of wheat red rust, respectively, at a concentration of 30%.
<실시예 4> HK544 균주의 배양여액으로부터 살균활성 물질의 분리<Example 4> Separation of bactericidal active substances from the culture filtrate of strain HK544
브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 TSA 배지(1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4, 1.5% agar)에서 배양한 다음, TSA 배지에 형성된 균총을 면전으로 밀봉하여 멸균한 200 ml의 TSB 배지(tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4)가 담긴 1 L 삼각플라스크에 접종하고, 2일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 전배양액을 제조하였다. 전배양액을 새로운 400 ml의 TSB 배지가 담긴 2 L 삼각플라스크 10개에 1%씩 접종하고, 접종 후 3일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 HK544 배양액(4 L)를 제조하였다. 이후, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양액을 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 후 여과지(Whatman No.1)로 걸러서 배양여액을 제조하였다. Brevibacillus brevis HK544 strain was cultured in TSA medium (1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K 2 HPO 4 , 1.5% agar), and then formed in TSA medium 1 L triangle containing 200 ml of TSB medium (tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K 2 HPO 4 ) sterilized by sealing the flora A preculture was prepared by inoculating the flask and culturing with shaking (150 rpm) at 25 ˚C for 2 days. 1% of the pre-culture solution was inoculated into 10 2 L Erlenmeyer flasks containing 400 ml of new TSB medium, and cultured with shaking (150 rpm) at 25 ° C for 3 days after inoculation to prepare a HK544 culture solution (4 L). Thereafter, the Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) HK544 strain culture solution was centrifuged (10,000 × g, 20 min) and filtered through filter paper (Whatman No. 1) to prepare a culture filtrate.
HK544 배양여액(4 L)을 폴리스티렌 수지(Diaion HP-20, Mitsubishi Chemicals)이 충진된 컬럼(column; Φ 8 cm ×40 cm)에 로딩하고, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 메탄올수용액으로 순차적으로 1 L씩 용출시키고, 마지막으로 100% 아세톤(1 l)으로 용출시켜 F1―F6의 6개 분획물을 제조하였고, 각 분획물을 5% 농도로 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes)에 처리했을 때, F4 분획물이 강한 살균활성이 나타나는 것을 확인하였다.The HK544 culture filtrate (4 L) was loaded into a column ( Φ 8 cm × 40 cm) filled with polystyrene resin (Diaion HP-20, Mitsubishi Chemicals), and 20%, 40%, 60%, 80%, 100 6 fractions of F1-F6 were prepared by eluting 1 L sequentially with % aqueous methanol solution, and finally eluting with 100% acetone (1 l), and each fraction was added to the pepper anthrax at a concentration of 5% ( Colletotrichum coccodes ) When treated, it was confirmed that the F4 fraction showed strong bactericidal activity.
F4 분획물(2 g)을 C18 수지(LiChroprep RP-18, Merck)가 충진된 컬럼(Φ 4 cm ×20 cm)에 로딩하고 진공펌프를 사용하여 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 100% 메탄올수용액(0.l% 개미산 포함)으로 용출시켜 F41―F47의 7개 분획물을 제조하였고, 각 분획물을 200 μg/ml 농도로 고추탄저병균에 처리했을 때, F41 분획물에서 강한 살균활성이 나타나는 것을 확인하였다The F4 fraction (2 g) was loaded into a column (Φ 4 cm × 20 cm) filled with C18 resin (LiChroprep RP-18, Merck) and 20%, 40%, 50%, 60%, 70% using a vacuum pump. Seven fractions of F41-F47 were prepared by eluting with %, 90%, 100% aqueous methanol solution (including 0.1% formic acid), and when each fraction was treated with red pepper anthrax at a concentration of 200 μg/ml, the F41 fraction It was confirmed that strong bactericidal activity appears in
F41 분획물(200 mg)을 소량의 물에 녹여서 교차결합 덱스트란(cross-linked dextran) 수지(Sephadex LH-20, Merck)가 충진된 컬럼(XK16/100, GE Healthcare)에 로딩하고 분당 0.1 ml의 유속으로 물을 통과시켜 나온 분획물을 2 ml씩 분취하였고, 각 분획물을 25 μg/ml 농도로 처리했을 때, 분획물 58번―62번에서 활성이 나타나는 것을 확인하였다.The F41 fraction (200 mg) was dissolved in a small amount of water and loaded onto a column (XK16/100, GE Healthcare) filled with a cross-linked dextran resin (Sephadex LH-20, Merck), and 0.1 ml per minute. The fractions that were passed through water at a flow rate were fractionated by 2 ml each, and when each fraction was treated at a concentration of 25 μg/ml, it was confirmed that the activity appeared in fractions 58-62.
58번―62번 분획물의 1H-NMR 스펙트럼이 동일함을 확인하였고, 이를 합쳐서 117 mg의 화합물 1을 정제하였다. 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양여액으로부터 살균활성 물질의 분리정제 순서 도 4와 같다. 1 H-NMR spectrum of fractions 58-62 was confirmed to be the same, and 117 mg of compound 1 was purified by combining them. Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis ) The separation and purification sequence of the bactericidal active material from the culture filtrate of the HK544 strain is shown in FIG. 4 .
<실시예 5> HK544 배양여액으로부터 분리한 살균활성 물질의 화학구조 동정<Example 5> Chemical structure identification of bactericidal active substances isolated from HK544 culture filtrate
화합물 1의 화학구조 결정을 위하여 MS와 NMR 분석을 실시하기 위해 화합물 1을 D2O(99.9 atom% D; Cambridge Isotope Laboratories)에 녹여 Bruker Avance 500 MHz 핵자기공명장치에서 1H-과 13C-NMR 스펙트럼과 COSY, HSQC, HMBC 스펙트럼을 분석하였다. 그리고 ESI-MS 질량분석기(Waters)를 사용하여 화합물의 분자량을 측정하였다. In order to perform MS and NMR analysis to determine the chemical structure of Compound 1, Compound 1 was dissolved in D 2 O (99.9 atom% D; Cambridge Isotope Laboratories) and 1 H- and 13 C- NMR spectra and COSY, HSQC, and HMBC spectra were analyzed. And the molecular weight of the compound was measured using an ESI-MS mass spectrometer (Waters).
그 결과, 화합물 1은 ESIMS에서 m/z 797 [M + H]+, m/z 819 [M + Na]+, m/z 836 [M + K]+의 양이온으로 검출되었으며, 분자량은 MW 796으로 결정하였다(도 5). 표 3에 나타난 바와 같이, 화합물 1의 13C-NMR 스펙트럼에서 6개의 카보닐 탄소(δ C 179.4, 175.9, 174.4, 172.8, 172.5, 170.3, 157.8), 3개의 쿼터너리 sp2(δ C 157.8, 157.5, 127.9), 4개의 메틴 sp2(δ C 129.8, 117.0; superimposed), 6개의 메틴 sp3(δ C 71.2, 68.5, 56.2, 52.8, 51.5, 48.2), 15개의 메틸렌 sp2(δ C 56.4, 46.0, 43.7, 43.5, 43.3, 41.5, 40.1, 39.0, 37.1, 32.1, 27.6, 26.6, 26.1, 23.9, 22.6) 시그널이 나타났다(표 3). 1H-1H COSY, HSQC, HMBC 분석을 통해 수소 시그널의 위치를 결정하였고, 표 3의 1H-와 13C-NMR 스펙트럼과 문헌 데이터를 종합하여, 화합물 1의 화학구조를 선형 펩타이드 항생물질 이데인 B1(edeine B1)으로 결정하였다(도 6).As a result, compound 1 was detected as a cation at m/z 797 [M + H]+, m/z 819 [M + Na] + , m/z 836 [M + K] + by ESIMS, and the molecular weight was MW 796 was determined as (FIG. 5). As shown in Table 3, in the 13 C-NMR spectrum of Compound 1, six carbonyl carbons ( δ C 179.4, 175.9, 174.4, 172.8, 172.5, 170.3, 157.8), three quaternary sp 2 ( δ C 157.8, 157.5, 127.9), 4 methine sp 2 ( δ C 129.8, 117.0; superimposed), 6 methine sp 3 ( δ C 71.2, 68.5, 56.2, 52.8, 51.5, 48.2), 15 methylene sp 2 ( δ C 56.4) , 46.0, 43.7, 43.5, 43.3, 41.5, 40.1, 39.0, 37.1, 32.1, 27.6, 26.6, 26.1, 23.9, 22.6) signals (Table 3). The position of the hydrogen signal was determined through 1H-1H COSY, HSQC, and HMBC analysis, and by synthesizing the 1 H- and 13 C-NMR spectra in Table 3 and literature data, the chemical structure of Compound 1 was determined as the linear peptide antibiotic idein. B1 (edeine B1) was determined (FIG. 6).
<실험예 3> 다양한 식물병원균에 대한 이데인 B1(edeine B1)의 <Experimental Example 3> Edein B1 (edeine B1) for various plant pathogens in vitroin vitro 살균활성 bactericidal activity
이데인 B1(edeine B1)의 식물병원성 곰팡이 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 벼도열병균(Magnaporthe oryzae),토마토역병균(Phytophthora infestans) 및 식물병원성 세균 과수화상병균(Erwinia amylovora)에 대한 생장 억제활성을 96-웰 플레이트를 사용한 액체배지미량희석법으로 최소억제농도(MIC)를 결정하였다.Phytopathogenic fungi of edeine B1 ( Alternaria brassicicola ), tomato gray mold ( Botrytis cinerea ), red pepper anthrax ( Colletotrichum coccodes ), rice blast bacillus ( Magnaporthe oryzae ), tomato blight ( Phytophthora ) infestans ) and the phytopathogenic bacterium, Erwinia amylovora , the growth inhibitory activity against the 96-well plate was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) by microdilution method.
100 μl 웰에 곰팡이의 경우 포자가 1 Х104 spores/ml 또는 세균의 경우 1 Х103 bacterial cells/ml의 농도로 포함하도록 배양하고, 이데인 B1(edeine B1)가 각각 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/ml의 농도가 되도록 준비하였다. 이 때 메탄올의 함량은 1% 미만이었고, 1% 메탄올만 첨가한 것을 무처리구로 사용하였고, 항생물질 사이클로헥사마이드(cycloheximide)와 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)를 식물병원성 곰팡이와 세균에 대한 각각의 양성대조군으로 사용하였으며, 2-3일 동안 미생물 생장이 최적인 온도에서 배양한 다음 육안으로 관찰했을 때, 곰팡이와 세균의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도(MIC)로 결정하였다.Incubate in 100 μl well to contain spores at a concentration of 1 Х10 4 spores/ml for mold or 1 Х10 3 bacterial cells/ml for bacteria, and edeine B1 is 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, respectively. , 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, and 200 μg/ml were prepared. At this time, the methanol content was less than 1%, and 1% methanol was used as an untreated group, and the antibiotics cycloheximide and oxytetracycline were used as positive controls for phytopathogenic fungi and bacteria, respectively. When observed with the naked eye after culturing at the optimum temperature for microbial growth for 2-3 days, the concentration at which the growth of mold and bacteria was completely inhibited was determined as the minimum inhibitory concentration (MIC).
헥사마이드cyclo
Hexamide
사이클린oxytetra
cyclin
그 결과, 표 4에서 나타난 바와 같이, 이데인 B1(edeine B1)는 다양한 식물병원성 곰팡이에 광범위한 항균활성을 나타내었다. 구체적으로, 이데인 B1(edeine B1)는 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola)을 0.4 μg/ml의 농도에서, 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)을 1.6 μg/ml의 농도에서, 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes)을 12.5 μg/ml의 농도에서, 벼도열병균(Magnaporthe oryzae)을 12.5 μg/ml의 농도에서, 토마토역병균(Phytophthora infestans)을 0.1 μg/ml의 농도에서 완전히 억제하는 광범위한 항균활성이 나타났고, 이는 방선균 유래 천연항생물질 사이클로헥사마이드(cycloheximide) 보다 효과가 좋음을 나타낸다. 또한, 이데인 B1(edeine B1)는 식물병원성 세균인 과수화상병균(Erwinia amylovora)을 1.6 μg/ml의 농도에서 완전히 억제하는 살세균활성이 나타났고, 이는 항생물질 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)과 유사한 효과를 나타낸다.As a result, as shown in Table 4, edeine B1 (edeine B1) exhibited a wide range of antibacterial activity against various phytopathogenic fungi. Specifically, edeine B1 (edeine B1) at a concentration of 0.4 μg/ml of a cabbage black pattern blight ( Alternaria brassicicola ), a tomato gray mold blight ( Botrytis cinerea ) at a concentration of 1.6 μg/ml, Colletotrichum coccodes ) at a concentration of 12.5 μg/ml, rice blast bacillus ( Magnaporthe oryzae ) at a concentration of 12.5 μg/ml, and tomato late blight ( Phytophthora infestans ) at a concentration of 0.1 μg/ml. This indicates that the effect is better than cycloheximide, a natural antibiotic derived from actinomycetes. In addition, edeine B1 showed bactericidal activity to completely inhibit Erwinia amylovora , a phytopathogenic bacterium, at a concentration of 1.6 μg/ml, which is similar to that of the antibiotic oxytetracycline. show the effect.
<실험예 4> HK544 균주와 근연관계에 있는 균주들간의 살균활성 비교<Experimental Example 4> Comparison of bactericidal activity between strains HK544 and closely related strains
HK544 균주의 근연관계에 있는 균주들간의 살균활성 비교를 위하여 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection; KACC)로부터 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) ATCC 8186, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) ATCC 8185, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) DSM 30, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus reuszeri) DSM 9887, 브레비바실러스 속(Brevibacillus sp.) FMR09-05, 브레비바실러스 파나치후미(Brevibacillus panachihumi) DCY35, 브레비바실러스 보르스테렌시스(Brevibacillus borstelensis) DSM 6347, 브레비바실러스 파라브레비스(Brevibacillus parabrevis) NBRC 12334, 브레비바실러스 조시넨시스(Brevibacillus choshinensis) DSM 8552, 브레비바실러스 아그리(Brevibacillus agri) DSM 6348, 브레비바실러스 포르모수스(Brevibacillus formosus) DSM 9885를 분양 받았다. Brevibacillus brevis ATCC 8186, Brevibacillus brevis ATCC 8185 , Brevibacillus brevis ( Brevibacillus brevis )
분양받은 균주는 TSA(tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4, 1.5% agar) 배지에서 배양한 다음, 한천배지에 형성된 단일균총을 면전으로 밀봉하여 멸균한 50 ml의 TSB 배지(tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4)가 담긴 250 ml-삼각플라스크에 접종하고, 3일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 배양액을 제조하였고, 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 다음 여과지(Whatman No.1)로 걸러서 배양여액을 제조하였다. 96-웰 플레이트에 브레비바실러스(Brevibacillus sp.) 균주 배양여액을 5% 또는 10% 농도로 첨가한 YPG 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)를 사용하여 효모균(Saccharomyces cerevisiae)에 대한 브레비바실러스(Brevibacillus sp.) 균주의 항균활성을 평가하였다. 무처리구에는 살균된 증류수를 사용하였다.The received strain was cultured in TSA (tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K 2 HPO 4 , 1.5% agar) medium, and then a single colony formed on an agar medium 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of sterile TSB medium (tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K 2 HPO 4 ) sealed with face A culture solution was prepared by inoculating it in a cell, shaking culture at 25 ˚C for 3 days (150 rpm), centrifugation (10,000 × g, 20 min), and then filtering with filter paper (Whatman No. 1) to prepare a culture filtrate. Using YPG medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) added to the culture filtrate of Brevibacillus sp. at a concentration of 5% or 10% in a 96-well plate, yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) The antibacterial activity of the Brevibacillus sp. strain was evaluated. Sterilized distilled water was used for the untreated section.
YPG 배지(5 ml)에 효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 균총을 접종 후, 30°에서 1일 동안 진탕배양(150 rpm)한 효모균을 접종원으로 사용했고, UV/Vis 분광분석기로 측정했을 때, 600 nm에서의 흡광도가 0.3이 되도록 멸균한 증류수로 희석하였다. 효모균 현탁액은 96-웰 플레이트에 1% 농도로 접종하였다. 효모균 접종 후 30°에서 1일 배양한 후 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 효모균의 생장을 조사하였다. 다음과 같은 식에 대입하여 효모균의 생장억제율(%)을 조사하였다. YPG medium (5 ml) was inoculated with yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) colonies, and yeast bacteria cultured with shaking (150 rpm) for 1 day at 30 ° was used as an inoculum, and when measured with a UV/Vis spectrometer, 600 nm It was diluted with sterilized distilled water to have an absorbance of 0.3. The yeast suspension was inoculated in a 96-well plate at a concentration of 1%. After inoculation of yeast, cultured at 30° for 1 day, absorbance at 600 nm was measured to investigate the growth of yeast. By substituting the following formula, the growth inhibition rate (%) of yeast was investigated.
생장억제율 (%) = (1 - 처리구의 OD600 값 / 무처리구의 OD600 값) ×100Growth inhibition rate (%) = (1 - OD 600 value of treated group / OD 600 value of untreated group) ×100
그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이, 시험한 12종의 브레비바실러스(Brevibacillus) 배양여액 가운데 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 배양여액의 살균활성이 가장 우수했다. HK544 균주의 배양여액을 10% 농도로 처리했을 때, 무처리구 대비 효모균의 생장이 93% 저해되었으나, 다른 균주들은 효모균의 생장을 억제하는 효과가 없었다. 다른 종의 브레비바실러스(Brevibacillus) 뿐만이 아니라 동일 종인 ATCC 8186, ATCC8185, DSM 30의 배양여액들도 살균활성이 나타나지 않았다. 이는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 살균기작은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) 종에서 보편적으로 나타나는 특성이 아니라, 개체(strain 또는 isolate) 수준에서 나타나는 HK544 균주의 고유한 특성임을 시사한다.As a result, as shown in Table 5, the sterilization activity of the culture filtrate of the Brevibacillus brevis HK544 strain among the 12 types of tested Brevibacillus culture filtrate was the best. When the culture filtrate of the HK544 strain was treated at a concentration of 10%, the growth of yeast was inhibited by 93% compared to the untreated group, but other strains had no effect of inhibiting the growth of yeast. Brevibacillus of other species as well as culture filtrates of the same species ATCC 8186, ATCC8185,
<110> KRICT <120> Composition for controlling plant diseases using Brevibacillus brevis HK544 <130> 2020p-06-037 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brevibacillus brevis HK544 DNA sequence <400> 1 aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcgagtgtct tcggacccta 60 gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa cctgcctctc agactgggat aacataggga 120 aacttatgct aataccggat aggtttttgg atcgcatgat ccgaaaagaa aaggcggctt 180 cggctgtcac tgggagatgg gcctgcggcg cattagctag ttggtggggt aacggcctac 240 caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg 300 gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaattttcca caatggacga aagtctgatg 360 gagcaacgcc gcgtgaacga tgaaggtctt cggattgtaa agttctgttg ttagggacga 420 ataagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct gacgagaaag ccacggctaa 480 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540 taaagcgcgc gcaggcggct atgtaagtct ggtgttaaag cccggagctc aactccggtt 600 cgcatcggaa actgtgtagc ttgagtgcag aagaggaaag cggtattcca cgtgtagcgg 660 tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cggctttctg gtctgtaact 720 gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780 gtaaacgatg agtgctaggt gttgggggtt tcaataccct cagtgccgca gctaacgcaa 840 taagcactcc gcctggggag tacgctcgca agagtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960 ttgacatccc gctgaccgct ctggagacag agcttccctt cggggcagcg gtgacaggtg 1020 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080 acccttatct ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta gagagactgc cgtcgacaag 1140 acggaggaag gcggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200 tgctacaatg gttggtacaa cgggatgcta cctcgcgaga ggacgccaat ctcttaaaac 1260 caatctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat 1320 cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380 cacgggagtt tgcaacaccc gaagtcggtg aggtaaccgc aaggagccag ccgccgaagg 1440 tggggtagat gactggggtg aagtcgta 1468 <110> KRICT <120> Composition for controlling plant diseases using Brevibacillus brevis HK544 <130> 2020p-06-037 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brevibacillus brevis HK544 DNA sequence <400> 1 aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcgagtgtct tcggacccta 60 gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa cctgcctctc agactgggat aacataggga 120 aacttatgct aataccggat aggtttttgg atcgcatgat ccgaaaagaa aaggcggctt 180 cggctgtcac tgggagatgg gcctgcggcg cattagctag ttggtggggt aacggcctac 240 caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg 300 gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaattttcca caatggacga aagtctgatg 360 gagcaacgcc gcgtgaacga tgaaggtctt cggattgtaa agttctgttg ttagggacga 420 ataagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct gacgagaaag ccacggctaa 480 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540 taaagcgcgc gcaggcggct atgtaagtct ggtgttaaag cccggagctc aactccggtt 600 cgcatcggaa actgtgtagc ttgagtgcag aagaggaaag cggtattcca cgtgtagcgg 660 tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cggctttctg gtctgtaact 720 gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780 gtaaacgatg agtgctaggt gttgggggtt tcaataccct cagtgccgca gctaacgcaa 840 taagcactcc gcctggggag tacgctcgca agagtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960 ttgacatccc gctgaccgct ctggagacag agcttccctt cggggcagcg gtgacaggtg 1020 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080 acccttatct ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta gagagactgc cgtcgacaag 1140 acggaggaag gcggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200 tgctacaatg gttggtacaa cgggatgcta cctcgcgaga ggacgccaat ctcttaaaac 1260 caatctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacat aagtcggaat cgctagtaat 1320 cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380 cacgggagtt tgcaacaccc gaagtcggtg aggtaaccgc aaggagccag ccgccgaagg 1440 tggggtagat gactggggtg aagtcgta 1468
Claims (4)
[화학식 1]
.
A composition for controlling one or more plant diseases selected from the group consisting of a compound represented by the following formula (1), or a stereoisomer thereof, as an active ingredient:
[Formula 1]
.
화학식 1로 표시되는 화합물은 선형 펩타이드인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
The method of claim 1,
The compound represented by Formula 1 is a composition for controlling plant diseases, characterized in that it is a linear peptide.
상기 배추검은무늬병은 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola), 고추 탄저병은 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 벼 도열병은 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 토마토역병은 파이토퓨쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 과수 화상병은 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)가 원인균인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
The method of claim 1,
The cabbage black pattern disease is Alternaria brassicicola (Alternaria brassicicola), red pepper anthracnose is Colletotrichum coccodes, rice blast disease is Magnaporthe oryzae, and tomato blight is Phytofusola infe. Stans (Phytophthora infestans) and fruit tree burn disease Erwinia amylovora (Erwinia amylovora) is a composition for controlling plant diseases, characterized in that the causative bacteria.
A method for controlling a plant disease comprising the step of treating the composition for controlling a plant disease of claim 1 in a plant or the surrounding environment of the plant.
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