KR100760526B1 - 119 119 fusarium oxysporum ef119 strain producing bikaverin microorganism formulation for controlling plant diseases containing bikaverin or ef119 strain and method for controlling plant diseases using same - Google Patents

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최경자
장경수
임희경
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Abstract

A novel Fusarium oxysporum EF119 strain and bikaverin produced by the same are provided to control the plant diseases environment-friendly by inhibiting the growth of various plant pathogens in vivo and in vitro, thereby capable of producing organic agricultural products. A non-pathogenic Fusarium oxysporum EF119 strain producing bikaverin is deposited as a deposition number of KCTC 10926BP. The microorganism preparation for controlling plant diseases such as a plant disease caused by Oomycetes, Colletotrichum crassipes, anthracnose, Plasmodiophora brassicae, and Streptomyces scabies comprises the Fusarium oxysporum EF119 strain, a culture solution thereof, a hypha thereof or a pore thereof as an effective ingredient. To control the plant diseases, a plant is treated with the microorganism preparation.

Description

비카베린을 생산하는 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주, 비카베린 또는 EF119 균주를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법 {FUSARIUM OXYSPORUM EF119 STRAIN PRODUCING BIKAVERIN, MICROORGANISM FORMULATION FOR CONTROLLING PLANT DISEASES CONTAINING BIKAVERIN OR EF119 STRAIN AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING SAME}Microbial preparation for plant disease control, including Fuzarium oxysporum EF119 strain, vicarin or EF119 strain, which produces vicaberine, and method for controlling plant disease using the same DISEASES CONTAINING BIKAVERIN OR EF119 STRAIN AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING SAME}

도 1은 감자덱스트로스 한천 배지에서 자라는 후자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) EF119 균주의 사진이다.Figure 1 is a photograph of the Fusarium oxysporum EF119 strain growing on potato dextrose agar medium.

도 2는 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주와 후자리움 옥시스포룸 Fo47 균주의 염기서열을 비교한 것이다.Figure 2 compares the nucleotide sequences of the Fussium oxysporum EF119 strain and the Fussium oxysporum Fo47 strain.

도 3은 EF119 균주가 오이 모잘록병균의 균사생육을 억제하는 사진이다.Figure 3 is a photograph of the EF119 strain inhibits mycelial growth of cucumber mozzarella bacteria.

도 4는 비카베린에 의한 토마토 역병의 방제 효과를 나타낸 사진이다. 가장 왼편에 있는 식물은 대조약제인 클로로탈로닐(50 ㎍/㎖)을 처리한 것이고, 중간의 세 개의 식물들은 비카베린을 왼쪽부터 33.3, 100 및 300 ㎍/㎖ 수준으로 처리한 것이며, 가장 오른편의 식물은 어떤 약제도 처리하지 않은 것이다. Figure 4 is a photograph showing the control effect of bicaberin tomato late blight. The plant on the left is treated with the control chlorothalonil (50 μg / ml), and the middle three plants are treated with vicaberine at levels 33.3, 100 and 300 μg / ml from the left. Plants are not treated with any drugs.

본 발명은 항균물질인 비카베린을 생산하는 비병원성 후자리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) EF119 균주, 비카베린 또는 EF119 균주를 포함하는 미생물 제제 및 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법에 관한 것이다. The present invention provides a microbial agent comprising a non-pathogenic Fusarium oxysporum EF119 strain, a non-caberine or an EF119 strain, which produces the anti-cababerine, and a method for biologically controlling plant diseases using the microbial agent. It is about.

농작물 경작시 수확량의 증가를 위해서는 농약의 사용이 불가피하나, 농약 중 대다수를 차지하는 합성농약의 오남용으로 인해 토양, 수질 및 농산물 오염, 독성, 생태계 교란, 저항성 균주들의 출현 등 여러 가지 문제점이 제기되고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방편 중의 하나인 길항 미생물을 이용한 생물농약(Biopesticide) 개발에 대한 연구가 최근 전세계적으로 활발하게 진행되고 있다. Pesticide use is inevitable to increase yields in crop cultivation, but misuse of synthetic pesticides, which make up the majority of pesticides, raises various problems such as soil, water and agricultural pollution, toxicity, disturbance of ecosystems, and emergence of resistant strains. . In recent years, research on the development of biopesticides using antagonistic microorganisms, which is one of the methods for solving these problems, has been actively conducted worldwide.

한편, 후자리움 옥시스포룸 균주는 다양한 식물에 토양 전염병인 시들음병(vascular wilt)을 유발하는 식물병원균으로서 많이 알려져 있다. 하지만 최근에는 생물농약으로서 응용되고 있는데, 특히 후자리움 옥시스포룸 Fo47 균주는 미생물 살균제로서 개발되어 현재 후자리움 옥시스포룸, 후자리움 모닐리포메(Fusarium moniliforme), 및 지베렐라 후지쿠로이(Gibberella fujikuroi)에 의해 발생하는 시들음병을 방제하는데 사용되고 있다(Copping, L.G.(ed), The BioPesticide Manual, 3rd Edition (2004)). 비병원성 후자리움 옥시스포룸에 의한 시들음병의 방제 기작으로는 세 가지, 즉, 뿌리 내부에서의 병원균과의 경쟁, 뿌리 표면에서의 병원균과의 경쟁 및 식물에의 유도저항성 유기 등이 보고되어 있다. 또한 비병원성 후자리 움 옥시스포룸 Fo47 균주는 피시움 울티뭄(Pythium ultimum) 균주에 의해 유발되는 오이 모잘록병도 방제하는 것으로 보고되었다(Benhamou, N. 등, Appl. Environ. Microbiol. 68:4044-4060 (2002)). 이 식물병에 대한 활성은 항균작용, 병원균에 대한 비병원성 균주의 기생 및 유도저항성 등의 복합적인 작용에 의해 나타나는 것으로 보고되었다. 벤하모우(Benhamou) 등이 피시움 울티뭄 균에 대한 항균물질의 작용에 대하여 보고한 바 있지만, 어떠한 물질에 의한 것인지는 아직 규명되지 않은 상태이다. On the other hand, Huzirum oxysporum strains are known as phytopathogens that cause vascular wilt, a soil infectious disease in various plants. Recently, however, it has been applied as a biopesticide, in particular the Fuzium oxysporum Fo47 strain has been developed as a microbial fungicide and is currently present in the Fussium oxysporum , Fusarium moniliforme , and Gibberella fujikuroi. It is used to control the wilting disease caused by (Copping, LG (ed), The BioPesticide Manual, 3rd Edition (2004)). Three mechanisms for controlling wilted ill disease by non-pathogenic fusidium oxysporum have been reported: competition with pathogens in the roots, competition with pathogens in the root surface, and resistance to induction to plants. It has also been reported that the non-pathogenic fusidium oxysporum Fo47 strain also controls cucumber mozzarlock disease caused by Pythium ultimum strains (Benhamou, N. et al. , Appl. Environ.Microbiol . 68: 4044-4060). (2002)). Activity against this plant disease is reported to be due to a combination of antimicrobial activity, parasitic and induced resistance of non-pathogenic strains against pathogens. Benhamou et al. Have reported on the action of antimicrobial agents on Pisium Ultimum bacillus, but it is not known which ones.

비카베린은 후자리움 옥시스포룸(Cornforth, J. W. 등, J. Chem. Soc. 2786-2788 (1971); de Boer, J. J. 등, J. Chem. Soc. 2788-2791 (1971); Brewer, D. 등, J. Antibiotic. 26:778-781 (1973); 및 Bell, A. A. 등, Pest. Manag. Sci. 590:736-747 (2003))과 지베렐라 후지쿠로이(Balan, J. 등, Folia Microbiol. 15:479-484 (1969); Kjaer, D. 등, J. Chem. Soc. 2792-2797 (1971) ; Giordano, W. 등, FEMS Microbiol. Lett. 173:389-393 (1999); 및 Escamilla-Silva, E. 등, World J. Microbiol. Biotechnol. 17:469-474 (2001))에 의해 생성되는 붉은 색의 색소이다. 지금까지 비카베린은 레쉬마니아 브라실리엔시스(Leishmania brasiliensis) 원생생물에 대하여 강한 활성을 보이며(Balan, J. 등, Folia Microbiol. 15:479-484 (1969)), 여러가지 암세포에 대하여 시험관내에서 세포독성이 있는 것으로 알려져 있다(Fuska, J. 등, Neoplasma 22:335-338 (1975)). 또한, 비카베린은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)의 균사 정단 부위에서 노화의 증상인 세포내 액포화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Cornforth, J. W. 등, J. Chem. Sco. 2786-2788 (1971)). Bicaberine is described in Cornforth, JW et al. , J. Chem. Soc. 2786-2788 (1971); de Boer, JJ et al. , J. Chem. Soc. 2788-2791 (1971); Brewer, D. Et al., J. Antibiotic. 26: 778-781 (1973); and Bell, AA et al . , Pest. Manag. Sci. 590: 736-747 (2003)) and Gibberella Fujikuroi (Balan, J. et al., Folia) Microbiol. 15: 479-484 (1969); Kjaer, D. et al. , J. Chem. Soc. 2792-2797 (1971); Giordano, W. et al. , FEMS Microbiol. Lett. 173: 389-393 (1999); And Escamilla-Silva, E. et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 17: 469-474 (2001)). To date, vicarberin has shown strong activity against Leishmania brasiliensis protists (Balan, J. et al . , Folia Microbiol. 15: 479-484 (1969)), and in vitro against various cancer cells. It is known to be toxic (Fuska, J. et al., Neoplasma 22: 335-338 (1975)). Bicaberin is also known to promote intracellular vesicles, a symptom of aging, in the mycelial tip of Aspergillus niger (Cornforth, JW et al. , J. Chem. Sco. 2786-2788 (1971). )).

본 연구팀은 다양한 식물체 내에서 분리한 식물내생미생물(endophyte)들 중에서 토마토 역병을 포함한 다양한 식물병에 대하여 우수한 길항력을 보이는 곰팡이를 선발하던 중에 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주가 토마토 역병, 고추 역병, 오이 탄저병 및 배추 뿌리혹병 등에 대하여 높은 활성을 보인다는 사실을 발견하였다. 또한 이 균주가 생산하는 항균물질은 비카베린이며, 비카베린 역시 시험관 내에서 다양한 식물 병원균의 생장을 억제하고, 생체내 실험에서는 토마토 역병에 대해 높은 우수한 활성을 보인다는 사실을 최초로 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.Among the endophytes isolated from various plants, the team selected fungi that showed excellent antagonism against various plant diseases including tomato late blight. It has been found to show high activity against cucumber anthrax and Chinese cabbage root gall disease. In addition, the antimicrobial substance produced by this strain is bicaberine, which inhibits the growth of various plant pathogens in vitro, and invented the present invention by inventing for the first time the high activity against tomato late blight in vivo. Completed.

본 발명의 목적은 비카베린을 생성하는 신규한 후자리움 옥시스포룸 균주를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel Fuzium oxysporum strain that produces vicaberine.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 비카베린을 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a microbial agent for controlling plant diseases comprising the strain or vicarberine.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for controlling plant diseases using the microbial agent.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 화학식 1의 비카베린을 생산하는 후 자리움 옥시스포룸 EF119 균주(KCTC 10926BP)를 제공한다: In accordance with the above object, the present invention provides a viumum oxysporum EF119 strain (KCTC 10926BP) after producing the bicarberine of formula (I):

Figure 112006024128726-pat00001
Figure 112006024128726-pat00001

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 균주 또는 이로부터 유래된 비카베린을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a microbial agent for controlling plant diseases containing the strain or a non-caberine derived therefrom as an active ingredient.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a method for controlling plant diseases using the microbial agent.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주는 다음과 같은 형태학적 및 생화학적 특징을 갖는다. Huzium oxysporum EF119 strain of the present invention has the following morphological and biochemical characteristics.

후자리움 옥시스포룸 EF119 균주는 감자덱스트로스 한천(PDA: potato dextrose agar) 배지 상에서 흰색의 공중 균사를 많이 생성하며, 시간이 경과함에 따라 배지 뒷면의 색은 보라색을 띤다(도 1). 또한 감자덱스트로스 한천 배지에서 오랫동안 배양할 경우 소형분생포자(microconidia), 대형분생포자(macroconidia) 및 후막포자(chlamydospore)를 생성한다. 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주는 ITS1- 5.8S-ITS2의 염기서열(서열번호: 1) 분석에서 GeneBank의 후자리움 옥시스포룸 포마스페셜리스 멜로니스 (Fusarium oxysporum f. sp. melonis) AY188919 균주와 99%의 염기서열 상동성(sequence homology)을 나타낸다.Fuzium oxysporum EF119 strain produces a lot of white aerial hyphae on potato dextrose agar (PDA) medium, and the color of the back side of the medium becomes purple over time (FIG. 1). In addition, long-term incubation in potato dextrose agar medium produces microconidia, macroroconidia and chlamydospore. The Fussium oxysporum EF119 strain was identified with GeneBank's Fusarium oxysporum f. Sponi melonis in the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of ITS1- 5.8S-ITS2 . Sequence homology of% is shown.

본 발명에서 동정한 균주는 고추 뿌리로부터 분리된 것으로, 균주의 형태적 특성 및 ITS1-5.8S-ITS2 서열 데이타를 종합한 결과, 후자리움 옥시스포룸으로 판단되었으며, 따라서 이 균주를 후자리움 옥시스포룸 EF119로 명명하고 2006년 3월 22일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 제KCTC 10926BP호로서 기탁하였다.The strains identified in the present invention were isolated from the red pepper roots and synthesized the morphological characteristics and ITS1-5.8S-ITS2 sequence data of the strains, and were determined to be Fussium oxysporum. It was named Room EF119 and deposited on March 22, 2006 as a deposit No. KCTC 10926BP with the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank.

후자리움 옥시스포룸 EF119 균주는 토마토 역병균(Phytophthora infestans), 고추 역병균(Phytophthora capsici), 오이 모잘록병균(Pythium ultimum), 오이 노균병균(Pseudoperonospora cubensis) 및 포도나무 노균병균(Plasmopara viticola) 등의 난균강균에 의한 식물병 뿐만 아니라, 오이 탄저병균(Colletotrichum lagenarium), 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes, C. gloeosporioides, C. acutatum), 배추 뿌리혹병균(Plasmodiophora brassicae) 및 감자 가루더뎅이병균(Spogospora subterranea) 등에 의한 식물병을 방제한다. 또한, 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주로부터 분리한 비카베린은 상기 병균들 이외에도 벼 도열병균(Magnaporthe grisea), 사과나무 점무늬낙엽병균(Alternaria mali), 및 토마토 잿빛곰팡이균(Botrytis cinerea) 등 다양한 병균들에 의한 식물병을 방제한다.Fuzilium oxysporum EF119 strains include tomato phytophthora infestans , pepper phytophthora capsici , cucumber moss ultimum , cucumber fungi ( Pseudoperonospora cubensis ), and grape vine fungi ( Plasmopara viticola ). As well as plant diseases caused by fungal fungi, cucumbers such as Colletotrichum lagenarium , red pepper anthrax ( C. gloeosporioides, C. acutatum ), Chinese cabbage root ( Plasmodiophora brassicae ) and potato flour ( Spogospora subterranea ) To control plant diseases. In addition to the above pathogens, vicarberin isolated from the Fussium oxysporum EF119 strain is a variety of germs, such as Magnaporthe grisea , Alternaria mali , and Tomato Blight fungus ( Botrytis cinerea ). Control plant diseases by

본 발명의 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주는 균주 자체, 균주의 배양액, 또는 추출물, 또는 균사와 포자 단독으로 담체와 혼합하여 분말, 펠렛, 과립 또는 용 액 등으로 제형화하여 식물병 방제용 미생물 제제로서 사용할 수 있으며, 상기 담체로는 물, 화이트 카본, 카올린 등을 사용할 수 있다. 또한, 비카베린만을 상기와 같이 제형화하여 식물병 방제용 미생물 제제를 제조할 수도 있다. Huzurium oxysporum EF119 strain of the present invention is a microorganism preparation for plant disease control by formulating it as a powder, pellets, granules or solution by mixing the carrier itself, the culture solution, or extract of the strain itself, or mycelia and spores alone It can be used as, the carrier may be used, such as water, white carbon, kaolin. In addition, it is also possible to prepare a microbial preparation for controlling plant diseases by formulating only the vicarberin as described above.

한편, 제형화된 미생물 제제는 식물이 생장하고 있는 토양 또는 성장 중인 식물 표면에 처리함으로써 식물병에 의한 식물 성장의 억제 및 이로 인한 고사를 방제할 수 있다.Formulated microbial agents, on the other hand, can be treated on the soil in which the plant is growing or on the surface of the growing plant to control the growth of the plant caused by plant diseases and thereby kill the dead.

본 발명의 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주는 1×103 프로파귤(propagules)/㎖ 내지 1×108 프로파귤/㎖ 농도의 제제로서 대상식물체에 처리할 수 있다. 또한, 비카베린은 10 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖ 농도의 제제로서 식물체에 처리할 수 있다.Huzalium oxysporum EF119 strain of the present invention can be treated to the target plant as a formulation of 1 × 10 3 propagules / ml to 1 × 10 8 propagules / ml concentration. In addition, vicarinine can be treated to plants as a preparation at a concentration of 10 μg / ml to 500 μg / ml.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1: 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주의 분리Example 1: Isolation of Huzium oxysporum EF119 Strain

2001년 5월에 충청북도 지방을 중심으로 농가에서 재배하고 있는 다수의 고추 포장으로부터 한 포장당 3개의 건전한 고추 식물체를 한 개의 시료로 채취하였다. 총 8개의 포장으로부터 시료를 채취한 후 각 시료를 부위별로, 즉 잎, 줄기 및 뿌리 등 3개 조직으로 나눈 후 식물내생곰팡이(endophytic fungi)를 분리하기 위하 여 24개의 시료에 대하여 두 가지 표면 살균법을 실시하였다. 잎은 2% 차염화나트륨(NaOCl)에 10초간 담근 후 멸균수로 2회 세척한 다음 작게 조각내어 50 ㎍/㎖ 클로람페니콜(입수처: 미국 시그마사)이 첨가된 옥수수가루-맥아추출물-효모추출물 한천배지(CMA배지: cornmeal malt extract agar medium: 17.0 g 옥수수가루, 20.0 g 맥아추출물, 2.0 g 효모추출물, 1.0 리터 증류수)에 치상하였다. 한편, 줄기와 뿌리 조직은 에탄올에 잠깐 담근 다음 화염살균한 후 클로람페니콜(50 ㎍/㎖)이 첨가된 CMA배지에 치상하였다. 25℃ 항온조건 하에서 배양하면서 균 분리를 실시하였다. 분리한 균들은 다시 PDA배지 상에서 단 균사 분리를 실시하였다. 총 89개의 곰팡이를 분리하였으며, 균주의 장기 보관을 위하여 PDA배지에서 7일간 배양한 균주 선단부를 코르크절단기(cork borer, 지름 8 ㎜)로 떼어내어 멸균 증류수와 6% 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO) 용액에 넣은 다음 실온과 -70℃에서 각각 보관하였다.In May 2001, three healthy pepper plants per package were taken from one pepper sample from a number of pepper packages grown in farms around Chungcheongbuk-do. After taking samples from a total of eight packages, each sample was divided into three parts, that is, leaves, stems, and roots, and then two surface sterilizations were performed on 24 samples to separate endophytic fungi. The law was enforced. The leaves were soaked in 2% sodium hypochlorite (NaOCl) for 10 seconds, washed twice with sterile water, and then crushed into small pieces. Corn flour-malt extract-yeast extract agar added with 50 ㎍ / ml chloramphenicol (Sigma, USA) The medium (CMA medium: cornmeal malt extract agar medium: 17.0 g corn flour, 20.0 g malt extract, 2.0 g yeast extract, 1.0 liter distilled water) was dentified. Stem and root tissues were briefly immersed in ethanol and then flame sterilized and then wound on CMA medium to which chloramphenicol (50 ㎍ / ml) was added. The bacteria were isolated while incubated under 25 ° C constant temperature. The isolates were again subjected to single mycelial separation on PDA medium. A total of 89 fungi were isolated, and for the long term storage of the strain, the tip of the strain cultured in PDA medium for 7 days was removed with a cork borer (8 mm in diameter) and sterilized distilled water and 6% dimethylsulfoxide (DMSO). The solution was added and stored at room temperature and -70 ° C, respectively.

실시예 2: 분리한 균주들의 배양 및 생체내(Example 2: Incubation and in vivo of isolated strains in vivoin vivo ) 항균활성 조사 Antimicrobial Activity

분리한 89개 균주들의 토마토 역병, 오이 탄저병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 보리 흰가루병 등 4가지 식물병에 대한 방제활성을 다음과 같이 조사하였다. The control activities of four plant diseases including tomato late blight, cucumber anthrax, tomato ash fungus and barley powdery mildew were investigated as follows.

멸균한 200 ㎖ 감자덱스트로스 배지(PDB: potato dextrose broth)에 PDA배지에서 자라고 있는 균주의 선단부위를 코르크절단기로 떼어낸 조각 4개씩을 접종한 다음 25℃, 150 rpm으로 10일간 진탕 배양하였다. 배양액을 10,000×g에서 15분간 원심 분리한 후 상층액만을 취하여 액체배양 시료로 사용하였다.Sterilized 200 ml potato dextrose broth (PDB) was inoculated with four pieces of the cork-cutter off the tip of the strain growing on the PDA medium and incubated for 10 days at 25 ℃, 150 rpm. The culture solution was centrifuged at 10,000 × g for 15 minutes, and only the supernatant was taken as a liquid culture sample.

항균활성 능력이 있는 균주를 선발하기 위해 상기 4가지 식물병에 대하여 89개 식물내생곰팡이의 액체배양 시료의 생체내 항균활성검정을 실시하였다. 액체배양액을 호모지나이저(homogenizer)로 마쇄한 후, 이 배양액 원액 또는 이의 3배 또는 9배 희석액 30 ㎖에 트윈 20(Tween 20)을 250 ㎍/㎖ 수준으로 첨가한 후 병원균 접종 24시간 전에 첨가하였다. 오이(Cucumis sativus 품종: 백미백다다기), 토마토(Lycopersicon esculentum 품종: 서광) 및 보리(Hordeum sativum 품종: 동보리) 종자를 원예용 상토가 70% 정도 담긴 지름 4.5 ㎝ 플라스틱 포트에 파종하고 온실(25±5℃)에서 1주에서 3주 정도 키웠다. In order to select strains with antimicrobial activity, in vivo antimicrobial activity assays of liquid culture samples of 89 endogenous fungi were carried out on the four plant diseases. After liquid culture was ground with a homogenizer, Tween 20 was added at a concentration of 250 μg / ml to 30 ml of this culture stock solution or its 3-fold or 9-fold dilution, followed by 24 hours prior to inoculation of pathogens. It was. Cucumis ( Cucumis sativus varieties), Tomato (Lycopersicon esculentum varieties: Western light) and Barley ( Hordeum sativum varieties: Eastern barley) seeds are sown in 4.5 cm diameter plastic pots containing about 70% of horticultural soil and grown in greenhouses (25 ± 5 ° C.) for 1 to 3 weeks.

오이 탄저병은 3엽기 오이 유묘에 오이 탄저병균(Colletotrichum obiculare; 입수처: 한국화학연구원)의 분생포자 현탁액(106 포자/㎖)을 분무접종한 후 25℃ 습실상에서 2일간, 25℃ 항온항습실에서 3일간 발병을 유도하였다. 토마토 역병은 2엽기 토마토 유묘에 토마토 역병균(Phytophthora infestans; 입수처: 강릉대학교)의 유주자낭 현탁액(3×104 유주자낭/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무접종한 후 20℃ 습실상에서 발병을 유도하였다. 한편, 토마토 잿빛곰팡이병은 2엽기 토마토 유묘에 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea; 입수처: 한국화학연구원) 포자 현탁액(5×105 포자/㎖)을 처리 한 후에 습실상에서 발병시켰다. 보리 흰가루병은 보리 유묘 1엽기에 숙주식물에서 계대 배양된 보리 흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. hordei; 입수처: 한국화학연구원)의 포자를 접종하고 20℃ 항온실에서 발병시켰다. 대조군으로는 1%의 DMSO가 첨가된 트윈 20 용액(250 ㎍/㎖) 30 ㎖을 사용하 였다. 오이 탄저병은 접종 5일 후에, 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후에, 그리고 보리 흰가루병은 접종 7일 후에 병반면적율을 조사하였고, 이를 대조군과 비교하여 방제가(%)를 계산하였다. Cucumber anthrax was sprayed with conidia spore suspension (10 6 spores / ml) of cucumber anthrax ( colletotrichum obiculare ; obtained by Korea Research Institute of Chemical Technology) on three-leaf cucumber seedlings, and then kept in a 25 ℃ constant temperature chamber for 2 days in a 25 ℃ constant temperature and humidity chamber. Induced onset for 3 days. The tomato late blight was inoculated on a two-layered tomato seedling in a 20 ° C wet room after spraying with a distilled suspension suspension extracted from the rotiferous sap suspension (3 × 10 4 sagittal sac / ml) of Phytophthora infestans (obtained at Gangneung University). Induced. On the other hand, tomato gray mold disease was developed in a wet room after treatment with spore suspension (5 × 10 5 spores / ml) of two-stage tomato seedlings treated with Botrytis cinerea (obtained from Korea Research Institute of Chemical Technology). Barley powdery mildew was inoculated with the spores of the barley powdery mildew ( Blumeria graminis f. Sp. Hordei ; source: Korea Research Institute of Chemical Technology) passaged in host plants at the first stage of barley seedlings. As a control, 30 ml of Tween 20 solution (250 μg / ml) added with 1% DMSO was used. Cucumber anthrax was investigated 5 days after inoculation, tomato gray mold and tomato late blight 3 days after inoculation, and barley powdery disease after 7 days after inoculation.

스크리닝 결과, 토마토 역병과 오이 탄저병에 대해 가장 방제활성이 높은 균주를 분리하여 EF119로 명명하였으며, 이의 방제가(%)는 하기 표 1과 같다.As a result of screening, the most highly active strains for tomato late blight and cucumber anthrax were separated and named as EF119, and their control values (%) are shown in Table 1 below.

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실시예 3: EF119 균주의 동정 Example 3: Identification of EF119 Strain

(1) 배양 및 형태적 특징(1) Culture and Morphological Characteristics

PDA배지에서 배양된 EF119 균주는 도 1에서와 같이 균사의 색은 흰색을 띠었으며 배지 뒷면의 색은 시간의 경과에 따라 자주색으로 변했다. 배양시간이 지나자, 균체 위에서 소형분생포자(microconidia), 대형분생포자(macroconidia) 및 후막포자(chlamydospore)를 생성하였다. The EF119 strain cultured in PDA medium had a white mycelium color as shown in FIG. 1 and the color of the back side of the medium changed to purple over time. After incubation time, microconidia, macroconidia and chlamydospore were produced on the cells.

(2) ITS1-5.8S-ITS2 염기서열 분석(2) ITS1-5.8S-ITS2 sequencing

균주의 정확한 동정을 위하여 EF119 균주를 셀로판지가 깔린 PDA배지 위에 접종하여 25℃에서 4일간 배양한 후, AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit(입수처: 한국 바이오니아사)를 이용하여 균사체로부터 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA로부터 ITS4와 5 프라이머(White, T.J. 등, PCR protocols: a guide to methods and application, pp.315-322 (1990))를 가지고 핵의 리보솜 DNA(nuclear rDNA)의 ITS1-5.8S-ITS2를 증폭한 후 순도를 점검한 다음 ABI3700 자동 DNA 염기서열기(ABI3700 automated DNA sequencer, 입수처: 미국 어플라이드 바이오시스템사)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. ITS1-5.8S-ITS2의 염기서열 분석 결과 GeneBank의 후자리움 옥시스포룸 포마스페셜리스 멜로니스(Fusarium oxysporum f. sp. melonis) AY188919 균주와 99%의 염기서열 상동성(sequence homology)을 보여 상기 균주를 후자리움 옥시스포룸 EF119로 명명하였다. 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주와 비병원성 균주로 사용되고 있는 후자리움 옥시스포룸 Fo47 균주의 ITS1-5.8S-ITS2 염기서열(서열번호: 1 및 2)을 비교하여 도 2에 나타내었다. For accurate identification of the strain, EF119 strain was inoculated on a cellophane-plated PDA medium and incubated at 25 ° C. for 4 days, and DNA was extracted from the mycelium using AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (obtained by Bioneer Korea). From the extracted DNA, ITS4 and 5 primers (White, TJ et al., PCR protocols: a guide to methods and application , pp.315-322 (1990)) were used to prepare ITS1-5.8S-ITS2 of nuclear ribosomal DNA (nuclear rDNA). After amplification, the purity was checked, and then the sequence was determined using an ABI3700 automated DNA sequencer (obtained from Applied Biosystems, USA). Nucleotide sequence analysis of ITS1-5.8S-ITS2 showed 99% sequence homology with Geneusa's Fusarium oxysporum f. Sp. Melonis AY188919 strain . Was named Huzium oxysporum EF119. The ITS1-5.8S-ITS2 nucleotide sequences (SEQ ID NOs: 1 and 2) of the Furizium oxysporum EF119 strain and the Furizium oxysporum Fo47 strain, which are used as non-pathogenic strains, are shown in FIG. 2.

상기 결과에 따라 EF119 균주를 후자리움 옥시스포룸으로 동정하였고, 이를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2006년 3월 22일자로 기탁번호 제KCTC 10926BP호로 기탁하였다.According to the above results, the EF119 strain was identified as Fuzarium oxysporum, and it was deposited with KCTC 10926BP as of March 22, 2006 to the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank.

실시예 4: EF119 균주의 난균강 식물병원균에 대한 시험관내(Example 4 In Vitro of the E.F. in vitroin vitro ) 항균활성Antibacterial activity

EF119 균주의 난균강균에 대한 시험관내 항균활성을 조사하기 위하여, 토마토 역병균(Phytophthora infestans; 구입처: 강릉대학교), 고추 역병균(Phytophthora capsici; 구입처: 충남대학교) 및 오이 모잘록병균(Pythium ultimum; 구입처: 한국화학연구원)을 한천 배지에서 EF119 균주와 대치배양(dual culture)하였다. 즉, 지름 9 cm의 한천배지 플레이트에 약 4 cm 간격으로 두 균주의 아가 플러그(agar plug)를 접종한 후 배양하였다. 토마토 역병균에 대해서는 V-8 쥬스 한천 배지(V-8 juice 200 ㎖, CaCO3 4.6 g, agar 20 g, 증류수 800 ㎖)에서 실시하였고, 고추 역병균과 오이 모잘록병균의 경우에는 PDA배지에서 실시하였다. To investigate the in vitro antimicrobial activity of E. coli strains against fungal mycobacteria, tomato phytophthora infestans (Gangneung University), phytophthora capsici (Chungnam National University) and Pythium ultimum ; : Korea Research Institute of Chemical Technology) was incubated with EF119 strain in agar medium. That is, inoculated with agar plugs (agar plug) of two strains at intervals of about 4 cm in agar medium plate 9 cm in diameter and incubated. Tomato blight was carried out on V-8 juice agar medium (V-8 juice 200 ml, CaCO 3 4.6 g, agar 20 g, distilled water 800 ml), and pepper blight and cucumber mozolox bacterium were carried out on PDA medium. It was.

그 결과, EF119 균주는 토마토 역병균, 고추 역병균 및 오이 모잘록병균에 한천배지에서 길항력을 보여주었다. 도 3은 EF119 균주에 의해 오이 모잘록병균의 균사생육이 억제된 모습을 나타낸다. As a result, the EF119 strain showed antagonistic activity in tomato agar, pepper blight and cucumber mozolox bacteria in agar medium. Figure 3 shows the mycelial growth of cucumber mozzarella bacteria inhibited by the EF119 strain.

실시예 5: EF119 배양액의 배추 뿌리혹병과 고추 역병에 대한 생체내 항균활성Example 5: In Vivo Antimicrobial Activity of Chinese Cabbage Root-knock Disease and Red Pepper Plague Disease of EF119 Culture

EF119 배양액의 배추 뿌리혹병에 대한 효과를 검정하기 위하여, 배추를 원예용 상토에 파종한 다음 2주간 키운 후 배추 뿌리혹병균이 접종된 밭토양이 담긴 플라스틱 포트(지름 7.0 cm)에 이식하였다. 배추 뿌리혹병균은 밭토양 10리터에 포장에서 채취한 발병조직 100 g을 마쇄한 후 잘 섞어줌으로써 접종하였다. 이식 후 실시예 2에서와 같이 준비한 배양액 원액에 트윈 20을 250 ㎍/㎖ 수준으로 첨가한 용액 30 ㎖를 포트에 관주 처리하였다. 무처리구는 트윈 20만을 250 ㎍/㎖ 수준으로 처리하였다. 처리한 식물체를 항온항습실(20℃)에서 4주간 키운 후 뿌리에서의 발병도를 측정하였다.To test the effect of EF119 culture on Chinese cabbage root gall, cabbages were sown in horticultural soil and grown for 2 weeks before transplanting into plastic pots (7.0 cm in diameter) containing field soil inoculated with cabbage root gall bacteria. Chinese cabbage root inoculation was inoculated by mixing 100 g of the diseased tissue collected from the package in 10 liters of field soil and mixing well. After transplanting, 30 ml of the solution in which Tween 20 was added at a level of 250 µg / ml was added to the culture stock prepared as in Example 2, and then irrigated in a pot. Untreated groups were treated with tween 20 million at the 250 μg / ml level. Treated plants were grown for 4 weeks in a constant temperature and humidity room (20 ° C), and the incidence in roots was measured.

그 결과 EF119의 배양액은 50%의 방제효과를 보였다.As a result, the culture solution of EF119 showed a control effect of 50%.

한편, EF119 배양액의 고추 역병에 대한 효과를 검정하기 위하여, 지름이 7.0 cm인 플라스틱 포트에서 자란 1차 분지기의 고추 식물체에 각 포트당 10 ㎖씩 트윈 20이 250 ㎍/㎖ 수준으로 포함된 배양액 원액과 10배 희석액을 관주 처리하였다. 하루 후에 고추 역병균의 유주자낭 현탁액(1×104 유주자낭/㎖)을 각각의 포트에 20 ㎖씩 관주 처리함으로서 식물병원균을 접종하였다. 접종 후 온실에서 저면관수로 8일 동안 발병시킨 후 발병도를 조사하였다.On the other hand, in order to test the effect of EF119 culture on the pepper blight, the culture medium containing 250 ㎍ / ㎖ of Tween 20 at 10 ml per pot in the pepper plant of the primary basin grown in a plastic pot with a diameter of 7.0 cm Stock solutions and 10-fold dilutions were irrigated. One day later, phytopathogens were inoculated by irrigation of 1 × 10 4 sacscapillary suspension (1 × 10 4 sacs / ml) in each port by irrigation. After the inoculation, the incidence was evaluated after 8 days with the bottom irrigation in the greenhouse.

그 결과, 배양액 원액과 10배 희석액은 각각 56%와 22%의 방제효과를 보였다. As a result, the culture stock and 10-fold dilution showed 56% and 22% control effects, respectively.

실시예 6: EF119 균주의 균사체와 배양여액의 항균활성Example 6: Antibacterial Activity of Mycelia and Culture Filtrate of EF119 Strain

EF119 균주의 배양액에서 항균물질이 균체에 존재하는 것인지 아니면 배양여액에 존재하는 것인지를 조사하기 위하여, 500 ㎖ 삼각플라스크에 담긴 200 ㎖의 PDB배지에 PDA배지에서 자라고 있는 균사체의 선단부를 코르크절단기로 떼어낸 4개의 조각을 접종한 후 25℃, 150 rpm으로 14일간 진탕배양하였다. 배양 후 배양액 30 ㎖을 취하여 여과지를 이용하여 균사체와 배양여액으로 나누었다. 균사체는 다시 증류수 30 ㎖로 희석하였다. 배양액, 배양여액 및 균사체 시료를 증류수로 10배와 50배 희석한 다음 트윈 20을 각각 250 ㎍/㎖ 수준으로 첨가하고 실시예 2에서와 같은 방법으로 토마토 역병에 대한 방제효과를 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. In order to investigate whether the antimicrobial material is present in the culture medium or the culture filtrate in EF119 strain, the tip of the mycelium growing in PDA medium in 200 ml PDB medium in 500 ml Erlenmeyer flask was removed with a cork cutter. After inoculating the four pieces were shaken and incubated for 14 days at 25 ℃, 150 rpm. After incubation, 30 ml of the culture solution was taken, and divided into mycelia and culture filtrate using filter paper. Mycelia were diluted again with 30 ml of distilled water. The culture, filtrate and mycelium samples were diluted 10-fold and 50-fold with distilled water, and then Tween 20 was added at a level of 250 ㎍ / ml, respectively, and the control effect against tomato late blight was investigated in the same manner as in Example 2. Is shown in Table 2 below.

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이상의 실험 결과 항균물질은 배양여액 및 균사체에 모두 존재하는 것을 알 수 있다.As a result of the above experiment it can be seen that the antimicrobial material is present in both the culture filtrate and mycelium.

실시예 7: 항균물질의 분리, 정제 및 구조 결정Example 7: Isolation, Purification and Structure Determination of Antimicrobials

PDA배지에서 자라고 있는 균주의 선단부위를 코르크절단기로 떼어낸 조각 4개를 PDB배지 200 ㎖에 접종한 다음 25℃에서 150 rpm으로 5일간 진탕 배양하였다. 배양액을 취하여 5ℓ 자퍼멘터(jar fermentor)내의 3 ℓ PDB배지에 1%(v/v)의 농도로 접종하였다. 접종 후 25℃에서, 150 rpm으로 5일간 진탕배양하였다. 배양체를 여과한 후 여액을 동량의 클로로폼으로 3회 분획한 다음 유기용매층을 감압농축하였다. 농축한 시료를 다시 소량의 클로로폼으로 재용해한 다음 소량의 디에틸에테르(diethyl ether)를 가한 다음 침전시켰다. 침전물을 다시 클로로폼을 이용하여 재결정화를 실시하여 순수한 물질을 약 250 ㎎ 정도 얻었다. 이 물질의 순도를 조사하기 위하여 클로로폼-아세톤-포름산(84:15:1, v/v/v)을 전개용매로 TLC(20×20 ㎝, 두께 0.25 ㎜, Kiesel gel 60 F254; 입수처: 머크사) 분석을 실시한 결과 단일물질인 것으로 나타났다.Four pieces of the tip of the strain growing in the PDA medium with a cork cutter were inoculated into 200 mL of PDB medium, followed by incubation at 25 ° C. for 150 days at 150 rpm. Cultures were taken and inoculated in 3 L PDB medium in 5 L jar fermentor at a concentration of 1% (v / v). After inoculation, the cells were shaken at 25 ° C. for 5 days at 150 rpm. After filtration of the culture, the filtrate was partitioned three times with the same amount of chloroform, and the organic solvent layer was concentrated under reduced pressure. The concentrated sample was redissolved again with a small amount of chloroform, and then a small amount of diethyl ether was added to precipitate. The precipitate was recrystallized with chloroform again to obtain about 250 mg of pure material. To investigate the purity of this material, chloroform-acetone-formic acid (84: 15: 1, v / v / v) was used as a developing solvent and TLC (20 × 20 cm, thickness 0.25 mm, Kiesel gel 60 F254; Merck analysis showed a single substance.

순수 분리 정제된 한 개의 활성물질을 질량분석기(JEOL JMS-DX303; 입수처:일본전자사)로 분석하였다. 그 결과, 분자량은 382 달톤이며, 질량스펙트럼을 윌리 데이타베이스(Wiley database)로 조사한 결과 비카베린과 동일한 것으로 나타났다. 또한 구조를 확인하기 위하여 물질 5 ㎎을 0.5 ㎖의 클로로폼에 녹여 5 mm NMR 튜브에 넣고 NMR 분석[Bruker-AMX 500(500 MHz)]을 하였으며, 1H-NMR은 500 MHz로 측정하였다. 그 결과 1개의 메틸기(3H, 2.86, s), 2개의 메톡시기[3H×2, 3.93(s), 3.95(s)] 및 3개의 방향족고리의 수소[1H×3, 6.77(s), 6.92(s), 6.35(s)] 피크들이 나타남으로서 Kjaer 등(J. Chem. Soc., 2792-2797 (1971))이 밝힌 비카베린의 데이터와 일치하였다. Purely separated and purified one active material was analyzed by mass spectrometry (JEOL JMS-DX303; obtained by Nippon Electronics Co., Ltd.). As a result, the molecular weight was 382 Daltons and the mass spectrum was found to be the same as bicaberin by a Wiley database. Also, to confirm the structure, 5 mg of the material was dissolved in 0.5 ml of chloroform, placed in a 5 mm NMR tube, and subjected to NMR analysis [Bruker-AMX 500 (500 MHz)], and 1 H-NMR was measured at 500 MHz. As a result, one methyl group (3H, 2.86, s), two methoxy groups [3H × 2, 3.93 (s), 3.95 (s)] and three aromatic rings of hydrogen [1H × 3, 6.77 (s), 6.92 (s), 6.35 (s)] peaks were consistent with the data of Bicaverin, as revealed by Kjaer et al. ( J. Chem. Soc. , 2792-2797 (1971)).

실시예 8: 비카베린의 생체내 항균활성Example 8 In Vivo Antimicrobial Activity of Bicaberin

후자리움 옥시스포룸 EF119 균주로부터 분리한 비카베린의 다양한 식물병에 대한 방제활성을 조사하기 위하여, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병 및 토마토 역병 등의 식물병에 대한 실험을 실시하였다. 먼저, 비카베린을 아세톤으로 용해시킨 후 250 ㎍/㎖ 트윈 20 용액으로 희석하여 최종 농도가 300 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 33.3 ㎍/㎖이 되도록 준비하였다. 이때, 아세톤의 최종 농도는 50% 수준이 되도록 하였다. 이때, 증류수 15 ㎖에 15 ㎖의 아세톤(최종 농도 50%)과 7.5 ㎎의 트윈 20(최종 농도 250 ㎍/㎖)을 첨가한 용액을 음성 대조군으로 사용하였다. 이와 같이 제조된 비카베린 시료와 대조군 시료를 각각 병원균 접종 1일전에 식물체 유묘의 엽면에 분무살포한 후 상온에서 24시간 동안 건조시켰다. 토마토 역병에 대한 활성검정은 실시예 2와 같이 실시하였다. In order to investigate the control activities of various plant diseases of vicarberin isolated from the Fuzium oxysporum EF119 strain, experiments were conducted on plant diseases such as rice blast, rice leaf blight and tomato late blight. First, bicaberine was dissolved in acetone and diluted with 250 μg / ml Tween 20 solution to prepare final concentrations of 300 μg / ml, 100 μg / ml and 33.3 μg / ml. At this time, the final concentration of acetone was to be 50% level. At this time, a solution in which 15 ml of acetone (final concentration 50%) and 7.5 mg of Tween 20 (final concentration 250 µg / ml) was added to 15 ml of distilled water was used as a negative control. The non-caberine samples and the control samples thus prepared were sprayed onto the leaf surface of the plant seedlings one day before the inoculation of the pathogen, and then dried at room temperature for 24 hours. Activity test for tomato late blight was carried out as in Example 2.

벼 도열병 및 벼 잎집무늬마름병을 위한 실험에 사용한 벼(Oryza sativa 품종: 낙동)는 지름 4.5 ㎝ 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 후, 종자를 파종하여 25±5℃의 온실에서 1주 내지 4주 동안 재배하였다. 벼 도열병은 3∼4엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5×105 포자/㎖)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 5일 동안 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 잎집무늬마름병은 잎집무늬마름병의 원인균인 타네이트포러스 큐큐메리스(Thanatephorus cucumeris, 한국화학연구원)를 배지(밀기울 90 g, 왕겨 15 g, 증류수 100 ㎖)에서 7일 동안 배양하여 얻은 배양물을 5엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일 동안 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일 동안 배양하여 발병을 유도하였다. The rice used in the experiment for rice blast and rice leaf blight ( Oryza sativa varieties: Nakdong) is filled with a soil pot or horticultural soil in a plastic pot of 4.5 cm in diameter about 70%, and then sowing seeds and greenhouses at 25 ± 5 ° C. Cultivation for 1-4 weeks. Rice blasts are sprayed with 3-4 leaf seedlings and sprayed with a spore suspension (5 × 10 5 spores / ml) of Magnaporthe grisea (Korea Research Institute of Chemical Research), which is the causative agent of blasting disease, After the wet treatment, the incubation was induced by incubation for 5 days in a constant temperature room of 25 ℃. Rice leaf blight is a cultured product obtained by culturing 7 days of cultivation of Thanatephorus cucumeris , a causative agent of leaf blight, in medium (90 g of wheat bran, 15 g of chaff, 100 ml of distilled water). The seedlings were inoculated to 5-leaf seedlings and wet-treated for 4 days on 25 ° C., and then incubated in a constant temperature room at 25 ° C. for 4 days to induce the onset.

대조약제로는 토마토 역병의 대표적인 약제인 클로로탈로닐을 사용하였으며, 벼 도열병은 접종 5일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 7일 후, 그리고 토마토 역병은 접종 3일 후에 병반면적율을 조사하였고, 이로부터 방제가(%)를 계산하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.As a control drug, chlorothalonil, a representative agent of tomato late blight, was used, and the area ratio of rice blast was 5 days after inoculation, 7 days after inoculation of rice leaf blight, and 3 days after inoculation of tomato late blight. From the control value (%) to calculate the results are shown in Table 3 below.

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 비카베린은 토마토 역병에 대해서 특이적으로 높은 활성을 나타내었다. As shown in Table 3 above, vicarberin showed a particularly high activity against tomato late blight.

실시예 9: 비카베린의 시험관내 항균활성Example 9 In Vitro Antimicrobial Activity of Bicaberin

상기 생체내 실험에서 토마토 역병에 대하여 우수한 효과가 확인된 비카베린에 대하여 시험관내 항균활성을 측정하기 위해, 비카베린을 포함하고 있는 고체배지 상에서 벼 도열병균(Magnaporthe grisea; 입수처: 한국화학연구원), 고추 역병균(Phytophthora capsici; 입수처: 충남대학교), 고추 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides; 입수처: 한국화학연구원), 토마토 역병균(Phytophthora infestans; 입수처: 강릉대학교), 사과나무 점무늬낙엽병균(Alternaria mali; 입수처: (주)경농), 토마토 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea; 입수처: 한국화학연구원), 및 오이 모잘록병균(Pythium ultimum; 구입처: 한국화학연구원) 등 7가지 식물병원균에 대한 균사생육 억제 효과를 조사하였다. 토마토 역병균은 V-8 쥬스 한천배지를 이용하였고, 나머지 6가지 식물병원균은 감자한천배지를 이용하였다. 각각의 배지를 멸균한 후 굳기 전에 다이옥산(dioxane)에 용해한 비카베린을 배지에 가하여 최종농도가 9 ㎍/㎖이 되도록 하였다. 무처리구에는 다이옥산을 1% 첨가하였다. 배지 한 가운데에 각각의 균의 균사조각을 치상한 후 토마토 역병균과 토마토 잿빛곰팡이병균은 20℃에서 배양하였고, 나머지 균들은 25℃에서 배양하였다. 2일 내지 6일 동안 배양한 후 균사 생육 길이를 측정하여 무처리구에서의 균사생육 정도를 기준으로 균사 생육억제율을 조사하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. Magnaporthe grisea (obtained from: Korea Research Institute of Chemical Research) on a solid medium containing non-caberine in order to measure the in vitro antimicrobial activity against the non-caberine, which has been found to have an excellent effect against tomato late blight in the in vivo experiment. , Phytophthora capsici (obtained from Chungnam National University), Colletotrichum gloeosporioides (obtained from Korea Research Institute of Chemical Technology), tomato tolerant bacterium ( Phytophthora infestans ; obtained from Gangneung National University), apple tree spotted deciduous bacterium ( Mycelia for seven plant pathogens, including Alternaria mali , Kyung-Nong Co., Ltd., Botrytis cinerea ; KIM, Pythium ultimum , and Korea Research Institute of Chemical Research. Growth inhibition effect was investigated. Tomato blight was used for V-8 juice agar, and the other six phytopathogens were potato agar. After sterilization of each medium, bicaberine dissolved in dioxane (dioxane) was added to the medium to solidify to 9 μg / ml before solidification. 1% of dioxane was added to the untreated section. After killing the mycelia of each bacteria in the middle of the medium, tomato late blight and tomato gray fungus were incubated at 20 ℃, the remaining bacteria were incubated at 25 ℃. After incubating for 2 to 6 days, the mycelial growth was measured, and the mycelial growth inhibition rate was examined based on the degree of mycelial growth in the non-treated group, and the results are shown in Table 4 below.

Figure 112006024128726-pat00005
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상기 표 4에서와 같이 비카베린은 다양한 식물병원균에 대해서 균사 생육 저해 활성을 보였으며, 특히 고추 탄저병균에 대한 저해 활성이 우수함을 알 수 있다. As shown in Table 4, vicarberine showed mycelial growth inhibitory activity against various phytopathogens, and in particular, it can be seen that the inhibitory activity against pepper anthrax was excellent.

한편, 비카베린의 토마토 역병균의 유주자낭 발아에 미치는 영향을 조사하였다. 오트밀(Oatmeal) 한천배지에 12일간 배양한 병원균의 배양체로부터 멸균수를 이용하여 유주자낭을 수확한 다음 거즈로 여과한 후 104 유주자낭/㎖ 수준으로 농도를 조절하였다. 유주자낭 현탁액 990 ㎕에 비카베린 용액 10 ㎕를 가한 다음 잘 혼합한 후 홀-슬라이드 글라스(hole-slide glass)에 50 ㎕씩을 가하였다. 이렇게 하여 다이옥산에 녹인 비카베린을 최종농도 9, 3, 및 1 ㎍/㎖(다이옥산의 최종농도 = 1%) 수준으로 처리하였으며, 대조군의 경우 다이옥산만을 1% 처리하였다. 이렇게 처리된 홀-슬라이드 글라스를 밀폐된 용기에 넣었는데, 이 때 밀폐된 용기 내에는 100%의 습도를 유지하기 위하여 바닥에 물을 함유한 종이를 깔았다. 밀폐된 용기를 20℃에서 6시간 동안 배양한 후 광학현미경으로 유주자낭의 발아를 관찰하였다. 각 처리당 3번 반복하여 처리하였으며, 각 반복당 100개의 유주자낭을 관찰하였다. 비카베린 실험군에서의 유주자낭 발아율을 대조군의 유주자낭 발아율과 비교하여 발아 억제율(%)을 계산하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. On the other hand, the effect of vicarinine tomato late blight on the germination of juvenile sac was investigated. The spermatozoon was harvested using sterile water from the culture of the pathogen cultured in oatmeal agar medium for 12 days, and then filtered with gauze, and then the concentration was adjusted to 10 4 spermatozoa / ml. 10 µl of the vicarinine solution was added to 990 µl of the capsular bag suspension, and then 50 µl was added to the hole-slide glass. Thus, the dicarbane dissolved in dioxane was treated to final concentrations of 9, 3, and 1 μg / ml (final concentration of dioxane = 1%), and in the control group, only 1% of dioxane was treated. The treated hole-slide glass was placed in a sealed container, in which a paper containing water was placed on the bottom to maintain 100% humidity. After incubating the sealed vessel for 6 hours at 20 ° C., germination of the capsular bag was observed under an optical microscope. The treatment was repeated three times for each treatment, and 100 drip sacs were observed for each treatment. The germination rate of the zygote capsule germination rate in the non-caberine experimental group was compared with that of the control group, and the germination inhibition rate (%) was calculated, and the results are shown in Table 5 below.

Figure 112006024128726-pat00006
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상기 표 5에서 보는 바와 같이, 비카베린은 1 ㎍/㎖의 매우 낮은 농도에서도 토마토 역병균의 유주자낭의 발아를 37%정도 저해하였다.As shown in Table 5 above, vicarinin inhibited germination of tomato plaques by about 37% even at very low concentrations of 1 μg / ml.

실시예 10: EF119 균주의 다양한 식물체에 대한 병원성 조사Example 10 Pathogenicity Study of Various Plants of EF119 Strain

EF119 균주의 병원성을 조사하기 위하여 토마토(Lycopersicon esculantum 품종: 서광), 고추(Capsicum annum 품종: 부강), 배추(Brassica campestris 품종: 삼복엇갈이), 오이(Cucumis sativus 품종: 백미백다다기), 무(Raphanus sativus 품종: 희락무), 수박(Citrullus vulgaris 품종: 참수박), 콩(Glycine max 품종: 황금콩) 및 참깨(Sesamum indicum 품종: 남다) 등 8개의 식물에 대한 병원성 실험을 실시하였다. 각각의 식물체를 원예용 상토에 파종한 후 본엽 1엽이 나올 때까지 온실에서 키웠다. 본엽 1엽이 나오면 뿌리를 수돗물로 세척한 후 뿌리의 끝 부분을 잘라 상처를 내었다. EF119 균주를 PDA배지에서 7일간 배양한 후 포자를 수확하여 증류수에 106 포자/㎖의 농도로 현탁시킨 포자용액에 상처 난 식물체 뿌리를 약 10분간 침지하여 접종시켰다. 접종된 유묘들을 새로운 흙이 담긴 포트(지름 7.0 cm)에 이식한 후 28일 동안 키우면서 7일마다 발병도를 조사하였다. To investigate the pathogenicity of the EF119 strain, tomatoes ( Lycopersicon esculantum varieties: Seogwang), red peppers ( Capsicum annum varieties: Bugang), Chinese cabbage ( Brassica campestris varieties: Sambokgut), cucumbers ( Cucumis sativus varieties: whitening tea), radish ( Raphanus) Pathogenicity experiments were carried out on eight plants, including sativus varieties: Heil radish), watermelon ( Citrullus vulgaris varieties: beetroot ), beans ( Glycine max varieties: golden soybean), and sesame seeds ( Sesamum indicum varieties: remaining). Each plant was sown in horticultural soil and grown in a greenhouse until one leaf of the main leaf emerged. When the first leaf came out, the roots were washed with tap water, and the ends of the roots were cut and cut out. After culturing the EF119 strain for 7 days in PDA medium, spores were harvested and inoculated by immersing the wounded plant roots for about 10 minutes in a spore solution suspended in distilled water at a concentration of 10 6 spores / ml. Inoculated seedlings were transplanted into pots containing fresh soil (7.0 cm in diameter) and grown for 28 days and examined for incidence every 7 days.

그 결과, EF119 균주는 실험한 식물체에 대하여 전혀 병원성이 없는 것으로 나타났다.As a result, the EF119 strain was found to be no pathogenic to the tested plants.

이상과 같이, 본 발명의 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주 및 이 균주가 생산하는 비카베린은 시험관 내 및 생체 내에서 다양한 식물 병원균의 생장을 억제하므로, 균주의 배양액, 균사체 또는 포자를 이용하거나 비카베린을 이용하여 식물병을 환경친화적으로 방제함으로써 고부가가치의 유기농산물을 생산할 수 있다. As described above, the Huzurium oxysporum EF119 strain of the present invention and the vicarinine produced by the strain inhibit the growth of various plant pathogens in vitro and in vivo, and thus use the culture medium, mycelium or spores of the strain, or By using environmentally friendly plant disease control can produce high value-added organic products.

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Claims (9)

비카베린을 생산하는 비병원성 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주(KCTC 10926BP).Nonpathogenic Huzium oxysporum EF119 strain (KCTC 10926BP) that produces vicaberin. 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주(KCTC 10926BP), 또는 이의 배양액, 균사체 또는 포자를 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 제제. Huzurium oxysporum EF119 strain (KCTC 10926BP), or its culture, mycelium or spores as an active ingredient, a plant disease control agent. 제2항에 있어서, The method of claim 2, 식물병이 난균강균(Oomycetes)에 의해 발생하는 식물병, 오이 탄저병, 고추 탄저병, 배추 뿌리혹병 또는 감자 가루더뎅이병인 것을 특징으로 하는 제제. Plant disease, characterized in that the plant disease caused by Oomycetes (cucumber anthrax, pepper anthrax, cabbage root gall disease or potato flour beetle disease). 제2항에 있어서,The method of claim 2, 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주를 1×103 프로파귤/㎖ 내지 1×108 프로파귤/㎖의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.Huzurium oxysporum EF119 strain comprising a concentration of 1 × 10 3 propagules / ml to 1 × 10 8 propagules / ml. 삭제delete 삭제delete 제3항에 있어서, The method of claim 3, 난균강균에 의해 발생하는 식물병이 토마토 역병, 고추 역병, 오이 모잘록병, 오이 노균병 또는 포도나무 노균병인 것을 특징으로 하는 제제. The plant disease caused by the bacterium fungi is tomato late blight, pepper late blight, cucumber mozalok disease, cucumber downy mildew or vine downy mildew. 삭제delete 후자리움 옥시스포룸 EF119 균주(KCTC 10926BP), 이의 배양액, 균사체 또는 포자를 식물체에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물병의 방제 방법.Huzurium oxysporum EF119 strain (KCTC 10926BP), its culture, mycelium or spores to the plant, characterized in that the plant treatment method.
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