KR100781472B1 - Microorganism having the characteristic of antagonism to phytopathogenic fungi, desease curing microorganism composition comprising said microorganism and production method thereof - Google Patents

Microorganism having the characteristic of antagonism to phytopathogenic fungi, desease curing microorganism composition comprising said microorganism and production method thereof Download PDF

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Abstract

A novel strain is provided which shows the antagonistic characteristic on phytopathogenic fungi without contaminating soil and water. And a microorganism composition comprising the same for controlling Rhizoctonia solani and Sclerotinia homoeocarpa is provided. A novel microorganism having the antagonistic function on phytopathogenic fungi is at least one selected from the group consisting of Bacillus-amyloliquefaciens KS-4(deposition no. KACC 91247P), Bacillus-agaradhaerens KS-5(deposition no. KACC 91248P), Paenibacillus-lentimorbus KS-6(deposition no. KACC 91249P), Bacillus laevolacticus KS-7(deposition no. KACC 91250P), Leuconostoc paramesenteroides KS-9(deposition no. KACC 91251P), Kurthia-sibirica KS-13(deposition no. KACC 91252P) and Sphingobacterium-spiritivorum KS-18(deposition no. KACC 91253P). A microorganism composition for treating and preventing large patch caused by Rhizoctonia solani and Sclerotinia homeocarpa comprises the microorganism as an effective ingredient. A method for preparing the composition comprises the steps of: (a) after suspending soil in brine to prepare a suspension, culturing the suspension in a culture medium to culture a mixture spawn of soil microorganisms; (b) after mixing 0.001-0.02 parts by weight of the mixture spawn of soil microorganisms, 2-5 parts by weight of rice bran, 2-4 parts by weight of molasses, and 2-4 parts by weight of brown sugar and the remaining parts of water to make a mixture to be 100 parts by weight, culturing the mixture with repetitively aerating the mixture for 1-3 hours 2 to 6 times per day with 5-10 m^3/hour of air with 2-6 hours intervals with maintaining a temperature at 20-25 deg.C for 15-21 days to prepare a mixture microorganism liquid formulation; (c) after mixing 20-30 wt.% of a culturing raw material consisting of rice bran or dried powder of agricultural products with 70-80 wt.% of the mixture microorganism liquid formulation, inoculating 0.01-0.1 wt.% of the mixture spawn of soil microorganisms thereinto; and (d) culturing the mixture obtained from the step(c) at an outside air temperature of 300 deg.C and an inner temperature of 80-85 deg.C for 2-8 hours.

Description

식물성 병원균에 길항작용을 갖는 균주, 상기 균주를 포함하는 방제용 미생물제제 및 그 제조방법{MICROORGANISM HAVING THE CHARACTERISTIC OF ANTAGONISM TO PHYTOPATHOGENIC FUNGI, DESEASE CURING MICROORGANISM COMPOSITION COMPRISING SAID MICROORGANISM AND PRODUCTION METHOD THEREOF}Strains having an antagonistic action against plant pathogens, microorganisms for controlling the same, and a method for producing the same, including the strains

도 1은 본 발명의 미생물제제로부터 분리동정한 신규한 균주의 항균력 테스트의 결과를 보여주는 사진1 is a photograph showing the results of the antimicrobial activity test of a novel strain isolated from the microbial agent of the present invention

도 2는 본 발명의 미생물제제로 각각 처리량을 달리하여 처리한 잔디화분(처리구) 및 미생물제제로 처리하지 않은 잔디화분(대조구)의 10일 후의 생육상태를 보여주는 사진Figure 2 is a photograph showing the growth state after 10 days of turf flower pots (treatment) and turf flower pots (control) not treated with microbial agents, each treated with a different throughput.

도 3은 본 발명의 미생물제제로 각각 처리량을 달리하여 처리한 처리구 및 미생물제제로 처리하지 않은 대조구의 시간에 따라 발병지수를 조사하여 표시한 발병지수 그래프3 is a graph showing the incidence index displayed by investigating the incidence index according to the time of the treatment and non-microbial treatment treatment treated with different throughput of the microbial agent of the present invention, respectively

도 4는 본 발명의 미생물제제로 처리한 곳과 미생물제제로 처리하지 않은 주변인 대조구가 함께 대비되는 잔디밭 사진Figure 4 is a lawn photo contrasted with a control area treated with a microbial agent of the present invention and the surroundings not treated with a microbial agent

도 5는 본 발명의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 신규한 균주인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4)의 16s RNA 염기서열5 is a 16s RNA sequence of Bacillus amyloliquefaciens KS-4, a novel strain having an antagonistic action against the plant pathogens of the present invention.

도 6은 본 발명의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 신규한 균주인 바실러스 -아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5)의 16s RNA 염기서열Figure 6 is a 16s RNA sequence of Bacillus-agaradhaerens KS-5 (Bacillus-agaradhaerens KS-5), a novel strain having an antagonistic action against the plant pathogens of the present invention

도 7은 본 발명의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 신규한 균주인 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6)의 16s RNA 염기서열Figure 7 is a 16s RNA sequence of Paenibacillus-lentimorbus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS-6), a novel strain having an antagonistic action against the plant pathogens of the present invention

도 8는 본 발명의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 신규한 균주인 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7)의 16s RNA 염기서열8 is a 16s RNA sequence of Bacillus laebolaticus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7), a novel strain having an antagonistic action against the plant pathogens of the present invention.

도 9는 본 발명의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 신규한 균주인 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9)의 16s RNA 염기서열Figure 9 is a 16s RNA sequence of the Leuconostoc paramesenteroides KS-9 (Reuconostoc paramesenteroides KS-9), a novel strain having an antagonistic action against the plant pathogens of the present invention

도 10은 본 발명의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 신규한 균주인 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13)의 16s RNA 염기서열10 is a 16s RNA sequence of the Kurthia-sibirica KS-13, a novel strain having an antagonistic activity against the plant pathogens of the present invention.

도 11은 본 발명의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 신규한 균주인 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18)의 16s RNA 염기서열Figure 11 shows the 16s RNA sequence of the sphingoacterium-spiritivorum KS-18 (Sphingobacterium-spiritivorum KS-18), a novel strain having an antagonistic action against the plant pathogens of the present invention

본 발명은 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 신규한 균주, 상기 균주를 포함하는 방제용 미생물제제 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, 기탁번호:KACC 91247P), 바실러스-아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5,기탁번 호:KACC 91248P), 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6, 기탁번호:KACC 91249P), 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7, 기탁번호:KACC 91250P), 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9, 기탁번호:KACC 91251P), 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13, 기탁번호:KACC 91252P) 및 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, 기탁번호:KACC 91253P)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로, 라이족토니아균(Rhizoctonia solani) 또는 스크렐로티나아(Sclerotinia homeocarpa)균의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 균주, 상기 규주를 포함하는 방제용 미생물제제 및 그제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel strain having an antagonistic action against plant pathogens, a microorganism preparation for controlling the same, and a method for preparing the same, and more specifically, Bacillus amyloliquefaciens KS-4 (Bacillus-amyloliquefaciens KS-). 4, accession number: KACC 91247P), Bacillus-agaradhaerens KS-5, accession number: KACC 91248P, Paenibacillus lentimobus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS-6 , Accession No .: KACC 91249P), Bacillus Laevolacticus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7, Accession No .: KACC 91250P), Leukonostok paramesenteroid KS-9 (Leuconostoc paramesenteroides KS-9, Accession No. : KACC 91251P), Kursia-sibirica KS-13 (Accession No.:KACC 91252P) and Spingobacterium Spiriborum KS-18 (Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, Accession No.:KACC 91253P) and at least one selected from the group consisting of Rhizoctoni a solani ) or a strain having an antagonistic action against plant pathogens of Sclerotinia homeocarpa , a microorganism preparation for control, and a method for producing the same.

인구증가와 더불어 작물의 재배환경도 비약적으로 발전을 하였다. 그런데, 이러한 작물의 재배에 많은 영향을 미치는 것은 야생동물 및 벌레에 의한 피해와 식물성 병원균 등에 의한 병해가 있다. 병충해에 대한 구제방법으로는 농약으로 불리우는 화학약품 성분의 방제제가 주종을 이루고 있다. 한편, 국민소득의 증가와 더불어 골프가 대중화되고, 그로 인해 골프장이 많이 건설되고 있다. 그런데, 골프장에 심어지고 있는 한지형 잔디의 경우 라이족토니아균(Rhizoctonia solani)에 의한 라지패치(large patch)병이나 스크렐로티나아(Sclerotinia homeocarpa)균에 의해 발병하는 동전마름병(dollar spot pathogen)에 의한 잔디병해에 취약한 문제가 있다. 이러한 잔디병해를 줄이기 위한 방법으로 대부분의 골프장에서는 농약을 살포하고 있는 실정이나, 농약의 과다한 사용으로 인한 토양 및 수질의 오염과 농약 살포시 비산되거나 살포 후 잔디에 잔류하는 농약으로 인해 골프장 종사자와 골퍼들은 물론 골프장 주변에 거주하는 거주민의 건강에도 매우 좋지 않은 영향을 끼칠 수 있는 문제가 있다. 따라서, 식물병해에 유용한 미생물제제의 필요성이 대두되고 있다. 대한민국 등록특허 제397796호의 등록공보에는 식물의 곰팡이 병원균을 제어함으로써 식물의 생장을 증진시키기 위한 스트렙토마이세스 속 ( Streptomyces spp .)WYE 20 (KCTC 0341BP)과 스트렙토마이세스 속 WYE 324 (KCTC 0342BP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한가지 이상의 미생물 균주를 포함하는 미생물제제를 라이족토니아 솔라니, 피큘레리아 오라이제, 라이족토니아씨렐리스, 스클러로티니아 호메오카파, 콜레토트리컴 그라미니콜라, 콜레토트리컴 니코티아네, 보트리티스 씨네리아 및 스페로쎄카 등의 병원균이 일으키는 질병의 방제에 사용하기 위한 항균성 미생물 제제가 개시되어 있다. 또한, 등록특허공보 제294023호에는 식물병해 방제 효과가 있는 균주로서 토양으로부터 길항미생물인 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)GB - 0365(수탁번호: KFCC - 11071)와 바실러스속(Bacillus sp.) GB - 017(수탁번호: KFCC - 11070)을 분리제공하고, 또한 곰팡이에 의한 작물의 병해, 이를테면 잿빛곰팡이병, 잘록병, 입고병, 시들음병 및 브라운 패취, 라지패취 등의 주요 원인 미생물들에 대해 생육저지 효과와 과채류 수확후 선도유지 효과를 갖는 상기 균주를 함유한 미생물제제가 개시되어 있다. Along with the increase in population, the crop cultivation environment has also developed remarkably. By the way, there is a lot of influence on the cultivation of such crops are damage caused by wild animals and insects and diseases caused by plant pathogens. As a method of controlling pests, chemical agents called pesticides are mainly used. On the other hand, with the increase of national income, golf is popularized, and as a result, many golf courses are being built. However, in the case of cold grass that is planted in a golf course, large patch disease caused by Rhizoctonia solani or sclerotinia homeocarpa bacteria is caused by a dollar spot pathogen. There is a problem vulnerable to turf disease. In order to reduce such turf diseases, most golf courses are spraying pesticides. However, due to soil and water pollution caused by excessive use of pesticides and pesticides scattered or remaining on grass after spraying, Of course, there is a problem that can adversely affect the health of residents living around the golf course. Therefore, there is a need for microbial agents useful for plant diseases. Korean Patent No. 397796 discloses Streptomyces spp. WYE 20 (KCTC 0341BP) and Streptomyces genus WYE 324 (KCTC 0342BP) for controlling plant growth by controlling fungal pathogens. Microbial agents comprising one or more microbial strains selected from the group consisting of lysatonia solani, piculeria aurase, lyctononia cellilis, sclerocthynia homeocapa, choletotricum graminicola, chol Antimicrobial microbial agents for use in the control of diseases caused by pathogens such as totricum nicotiane, botrytis cineria and spheroceca are disclosed. In addition, Korean Patent Publication No. 294023 has a bactericidal effect bacterium, Bacillus subtilis GB-0365 (Accession No .: KFCC-1071) and Bacillus sp. 017 (Accession No .: KFCC-11070), which provides and separates growth against mold-causing diseases such as gray mold, diarrhea, rash, wilting and brown patches, and large patches. A microbial agent containing the strain having the effect and the freshness maintaining effect after the fruit vegetable harvest is disclosed.

그러나, 상기 문헌을 포함한 종래의 미생물제제는 미생물 자체의 변종 등으로 인하여 효과의 지속성이 떨어지고 배양조건이 까다로워 아직까지 화학농약을 대체하지 못하고 있는 실정이다. However, conventional microbial preparations including the above documents have not been able to replace chemical pesticides due to the poor persistence of the effects due to strains of microorganisms and difficult culture conditions.

따라서, 본 발명의 목적은 토지 및 수질오염의 염려가 없으면서도 식물성 병원균에 대하여 길항작용을 갖는 신규한 균주를 제공하고 상기 균주를 포함하는 방제용 미생물제제를 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a novel strain having an antagonistic action against plant pathogens without fear of land and water pollution, and to provide a microorganism preparation for control comprising the strain.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 미생물제제의 경제적인 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an economical method for producing the novel microbial agent.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, 기탁번호:KACC 91247P), 바실러스-아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5,기탁번호:KACC 91248P), 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6, 기탁번호:KACC 91249P), 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7, 기탁번호:KACC 91250P), 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9, 기탁번호:KACC 91251P), 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13, 기탁번호:KACC 91252P) 및 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, 기탁번호:KACC 91253P)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로, 라이족토니아균(Rhizoctonia solani) 또는 스크렐로티나아(Sclerotinia homeocarpa)균의 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 균주를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is Bacillus amyloliquefaciens KS-4 (Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, Accession No .: KACC 91247P), Bacillus- agaradaerens KS-5 (Bacillus-agaradhaerens KS-5 Accession number: KACC 91248P), Paenibacillus lentimobus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS-6, accession number: KACC 91249P), Bacillus Laebolactus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7, Deposit Number: KACC 91250P), Leuconostoc paramesenteroides KS-9 (Accession No .: KACC 91251P), Kursia-sibirica KS-13 (Accession No .: KACC 91252P) And Sphingobacterium-spiritivorum KS-18 (Accession Number: KACC 91253P), at least one selected from the group consisting of Rhizoctonia solani or Sclerotinia homeocarpa ) provides a strain having an antagonistic action against the plant pathogens.

또한, 본 발명은 상기 식물성 병원균이 라이족토니아균(Rhizoctonia solani) 또는 스크렐로티니아(Sclerotinia homeocarpa)균인 것을 특징으로 하는 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 균주를 제공한다.In addition, the present invention provides a strain having an antagonistic action to the plant pathogen, characterized in that the plant pathogen is Rhizoctonia solani or Sclerotinia homeocarpa .

또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, 기탁번호:KACC 91247P), 바실러스-아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5,기탁번호:KACC 91248P), 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6, 기탁번호:KACC 91249P), 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7, 기탁번호:KACC 91250P), 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9, 기탁번호:KACC 91251P), 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13, 기탁번호:KACC 91252P) 및 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, 기탁번호:KACC 91253P)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주를 유효성분으로 포함하며, 식물병원성 균에 길항작용을 갖는 미생물제제를 제공한다.In addition, the present invention is Bacillus amyloliquefaciens KS-4 (Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, accession number: KACC 91247P), Bacillus- agaradaerens KS-5 (Bacillus-agaradhaerens KS-5, accession number: KACC 91248P), Paenibacillus lentimobus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS-6, Accession No .: KACC 91249P), Bacillus Laevolactus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7, Accession No .: KACC 91250P) , Leuconostoc paramesenteroides KS-9 (Accession No .: KACC 91251P), Kursia-sibirica KS-13 (Accession No .: KACC 91252P) and Sphingobacterium It contains one or more strains selected from the group consisting of spiritiborum KS-18 (Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, Accession No .: KACC 91253P) as an active ingredient, and provides a microbial agent having antagonistic activity against phytopathogenic bacteria. .

또한, 본 발명은 상기 식물성 병원균이 라이족토니아균(Rhizoctonia solani) 또는 스크렐로티니아(Sclerotinia homeocarpa)균인 것을 특징으로 하는 미생물제제를 제공한다.In addition, the present invention provides a microbial agent, characterized in that the plant pathogen is Rhizoctonia solani or Sclerotinia homeocarpa .

또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis), 바실러스 TUT1206(Bacillus sp. TUT1206), 바실러스 Q-12(Bacillus sp. Q-12) 및 바실러스 터모아밀로보란스(Bacillus thermoamylovorans)로 구성된 군으로부터 선택된 1종이상의 토양미생물을 유효성분으로 더 포함한 것을 특징으로 하는 미생물제제를 제공한다.In addition, the present invention Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), Bacillus sonorensis (B acillus sonorensis ), Bacillus TUT1206 ( Bacillus sp. TUT1206), Bacillus Q-12 ( Bacillus sp. Q-12) and Bacillus thermoamylo It provides a microbial agent, characterized in that it further comprises one or more soil microorganisms selected from the group consisting of borax ( Bacillus thermoamylovorans ) as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 측면은 ⅰ)토양을 염수에 현탁하여 현탁액을 제조한 다음 배지에서 배양하여 토양미생물 혼합종균을 배양하는 단계; ⅱ)토양미생물 혼합종균 0.001 내지 0.02중량부와, 쌀겨 2 내지 5중량부, 당밀 2 내지 4중량부 및 황설탕 2 내지 4중량부에 나머지 물을 혼합하여 100중량부가 되도록 하여 혼합한 후 20 내지 25℃를 유지하며 2 내지 6시간 간격으로 5 내지 10㎥/h의 공기를 1 내지 3시간 동안 폭기하는 과정을 일일 2 내지 6회 반복적으로 수행하며 15 내지 21일간 배양하여 복합미생물 액제를 제조하는 단계; ⅲ)쌀겨 또는 농산물 부산물 건조분말로 구성된 배양원료 20 내지 30중량% 및 상기 복합미생물 액제 70 내지 80중량%로 구성된 혼합원료를 제조한 후, 상기 토양미생물 혼합종균 0.01 내지 0.1 중량%를 접종하는 접종단계 및 ⅳ)상기 접종된 혼합원료를 외기온도 300℃ 내부온도80 내지 85℃에서 2 내지 8시간동안 배양시키는 고온 배양단계를 포함하는 방법으로 제조되며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, 기탁번호:KACC 91247P), 바실러스-아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5,기탁번호:KACC 91248P), 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6, 기탁번호:KACC 91249P), 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7, 기탁번호:KACC 91250P), 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9, 기탁번호:KACC 91251P), 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13, 기탁번호:KACC 91252P) 및 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, 기탁번호:KACC 91253P)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주를 유효성분으로 포함하는 방제용 미생물제제의 제조방법을 제공한다.Another aspect of the present invention comprises the steps of iii) suspending the soil in saline to prepare a suspension, followed by culturing in a medium to culture soil microbial mixed spawn; Ii) Soil microbial mixed spawn 0.001 to 0.02 parts by weight, 2 to 5 parts by weight of rice bran, 2 to 4 parts by weight molasses and 2 to 4 parts by weight of sugar sugar mixed with the remaining water to 100 parts by weight 20 to 20 Maintaining 25 ℃ and aeration of 5 to 10 ㎥ / h of air for 1 to 3 hours at intervals of 2 to 6 hours repeatedly performed 2 to 6 times a day and incubated for 15 to 21 days to prepare a complex microbial liquid step; Iii) inoculated to inoculate 0.01-0.1 wt% of the soil microbial mixed seed after preparing a mixed raw material consisting of 20-30 wt% of rice bran or agricultural by-product dry powder and 70-80 wt% of the mixed microbial solution. Step and iii) is prepared by a method comprising a high temperature culture step of incubating the inoculated mixed raw material for 2 to 8 hours at an ambient temperature of 300 ℃ internal temperature 80 to 85 ℃, Bacillus amyloliquefaciens KS-4 (Bacillus -amyloliquefaciens KS-4, Accession No .: KACC 91247P), Bacillus-agaradhaerens KS-5 (Bacillus-agaradhaerens KS-5, Accession No .: KACC 91248P), Paenibacillus Lentimobus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS-6, Accession No .: KACC 91249P), Bacillus Laevolacticus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7, Accession No .: KACC 91250P), Leukonostock paramesenteroid KS-9 (Leuconostoc paramesenteroides KS-9 , Accession number: KACC 91251P), Kursi From the group consisting of Ashibirica KS-13 (Kurthia-sibirica KS-13, Accession No .: KACC 91252P) and Sphingobacterium Spiriborum KS-18 (Accession No .: KACC 91253P) It provides a method for producing a microbial agent for controlling the selected one or more strains as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 배양원료가 35 내지 75중량%의 쌀겨 및 25 내지 65중량%의 농산물 부산물 분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물제제의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a microbial preparation, characterized in that the culture material comprises 35 to 75% by weight of rice bran and 25 to 65% by weight of agricultural product by-products.

또한, 본 발명은 상기 고온배양단계 후, 열풍건조 또는 스프레이드라이어를 이용하여 건조하여 분말상으로 제조하는 단계를 더 포함한 것을 특징으로 하는 미생물제제의 제조방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a microbial agent, characterized in that further comprising the step of producing a powder by drying using hot air drying or spray dryer after the high temperature culture step.

또한, 본 발명은 상기 토양미생물 혼합종균이 바실러스 속 균주 또는 유산균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis), 바실러스 TUT1206(Bacillus sp. TUT1206), 바실러스 Q-12(Bacillus sp. Q-12), 바실러스 터모아밀로보란스(Bacillus thermoamylovorans), 류코노스톡 파라메센테로이드(Leuconostoc paramesenteroides) 및 페디오코커스 펜토사세이스 스트레인 LM2632(Pediococcus pentosaceis strain LM2632)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미생물제제의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention, the soil microbial mixed species Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), Bacillus sonorensis ( Bacillus sonorensis ), Bacillus TUT1206 ( Bacillus sp. TUT1206), Bacillus Q-12 ( Bacillus sp. Q-12), Bacillus thermoamylovorans , Leuconostoc paramesenteroides and Pediococcus pentosaceis strain LM2632 It provides a method for producing a microbial agent, characterized in that at least one.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 신규한 균주 및 미생물제제는 식물성 병원균, 특히 라이족토니아균(Rhizoctonia solani) 또는 스크렐로티니아(Sclerotinia homeocarpa)균에 의해 발병하는 병해의 치료 및 예방에 효과가 있는 것이다. 즉, 본 발명의 상기 균주 및 상기 균주를 포함하는 미생물제제를 라이족토니아균 또는 스크렐로티니아균에 의해 발생하는 식물성 병해의 치료 및 예방에 사용할 경우 탁월한 방제효과를 나타내며, 지속성이 우수하다.The novel strains and microbial agents of the present invention are effective for the treatment and prevention of diseases caused by plant pathogens, in particular, Rhizoctonia solani or Sclerotinia homeocarpa . That is, when the strain of the present invention and the microbial agent containing the strain are used for the treatment and prevention of the vegetable diseases caused by Laytonia bacteria or Sterlotini bacteria, it exhibits excellent control effect and excellent durability.

본 발명의 미생물제제를 제조하기 위하여, 본 발명은 토양을 염수에 현탁하 여 현탁액을 제조한 다음 배지에서 배양하여 토양미생물 혼합종균을 배양하고, 상기 토양미생물 혼합종균 0.001 내지 0.02중량부와, 쌀겨 2 내지 5중량부, 당밀 2 내지 4중량부 및 황설탕 2 내지 4중량부에 나머지 물을 혼합하여 100중량부가 되도록 하여 혼합한 후 온도20 내지 25℃를 유지하며 2 내지 6시간 간격으로 5 내지 10㎥/h의 공기를 1 내지 3시간 동안 폭기하는 과정을 일일 2 내지 6회 반복적으로 수행하며 15 내지 21일간 배양하여 복합미생물 액제를 제조하는 단계를 포함한다. 상기 토양미생물 혼합종균은 일반적인 토양에서 자라고 있는 미생물을 배지에서 배양한 결과 얻어지는 미생물을 의미하는 것으로, 본 발명의 일실시예에서는 상기 토양미생물 혼합종균은 바실러스 속 균주 또는 유산균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis), 바실러스 TUT1206(Bacillus sp. TUT1206), 바실러스 Q-12(Bacillus sp. Q-12), 바실러스 터모아밀로보란스(Bacillus thermoamylovorans), 류코노스톡 파라메센테로이드(Leuconostoc paramesenteroides) 및 페디오코커스 펜토사세이스 스트레인 LM2632(Pediococcus pentosaceis strain LM2632)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 배양조건은 본 발명자의 연구결과 최적화된 결과이며, 당업자라면 상기 조건에 다소의 변형을 가할 수 있으나 그러한 변형이 본 발명의 권리범위를 벗어나지 않는다는 것도 알 것이다. In order to prepare the microbial preparation of the present invention, the present invention is prepared by suspending the soil in saline to prepare a suspension and then cultured in the medium to culture soil microbial mixed seed, the soil microbial mixed seed 0.001-0.02 parts by weight, rice bran 2 to 5 parts by weight, molasses 2 to 4 parts by weight and 2 to 4 parts by weight of brown sugar to mix the remaining water to 100 parts by weight after mixing to maintain a temperature of 20 to 25 5 to 5 hours at intervals of 2 to 6 hours Aeration of 10 m 3 / h of air for 1 to 3 hours is carried out repeatedly 2 to 6 times a day and 15 to 21 days of culturing to prepare a microbial liquid preparation. The soil microbial mixed seed means a microorganism obtained by culturing microorganisms grown in a general soil in a medium. In one embodiment of the present invention, the soil microbial mixed seed is Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis) or Bacillus sp. subtilis ), B acillus sonorensis , Bacillus TUT1206 ( Bacillus sp. TUT1206), Bacillus Q-12 ( Bacillus sp. Q-12), Bacillus thermoamylovorans , Leukonostock para At least one member selected from the group consisting of Leuconostoc paramesenteroides and Pediococcus pentosaceis strain LM2632. The culture condition is an optimized result of the study of the inventors, and those skilled in the art can add some modifications to the above conditions, but it will be appreciated that such modifications do not depart from the scope of the present invention.

복합미생물 액제를 제조한 후에는, 쌀겨 또는 농산물 부산물 건조분말로 구성된 배양원료 20 내지 30중량% 및 상기 복합미생물 액제 70 내지 80중량%로 구성된 혼합원료를 제조한 후, 상기 토양미생물 혼합종균 0.01 내지 0.1 중량%를 접종하는 접종단계를 수행하게 된다. 본 발명의 미생물제제는 배양원료로서 비교적 구하기 용이하고 원가부담이 적은 쌀겨 또는 농산물 부산물 등을 사용할 수 있다. 상기 배양원료는 상기 쌀겨 또는 농산물 부산물 단독으로 또는 조합되어 사용되어도 무방하나, 바람직하게는 35 내지 75중량%의 쌀겨 및 25 내지 65중량%의 농산물 부산물로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 배양원료는 미리 100메쉬 정도로 분쇄하여 분말상으로 사용하는 것이 바람직하다. After preparing the composite microbial liquid, the mixed raw material consisting of 20 to 30% by weight of the culture raw material consisting of rice bran or agricultural product by-product dry powder and 70 to 80% by weight of the composite microbial solution, and then 0.01 to 0.01 of the soil microbial mixed seed An inoculation step of inoculating 0.1 wt% is performed. The microbial agent of the present invention may be used as a cultivating material, rice bran or agricultural by-products, etc., which are relatively easy to obtain and have a low cost. The culture raw material may be used alone or in combination with the rice bran or agricultural by-products, but preferably it is made of 35 to 75% by weight of rice bran and 25 to 65% by weight of agricultural by-products. The culture raw material is preferably ground to about 100 mesh to use in powder form.

상기 혼합, 분쇄된 원료 들을 직화배양기에 넣고 미생물 발효에 적절한 환경을 유지하기 위해 액상의 복합미생물제로 수분을 조절한 다음, 바실러스 속 균주 또는 유산균의 3종 이상을 포함하는 혼합종균을 접종한다. 상기 혼합종균은 계절적, 환경적 다양성이 존재하는 토양의 미생물상을 인위적인 여과 없이 그대로 채취하여 천연물배지상에서 6개월간 환경적응과정을 거치면서 유해성을 제거하여 분말상으로 제조한다. 본 발명에 따른 미생물제제의 제조시에는 상기 혼합종균을 원료 총중량의 0.01 내지 0.1 중량%를 접종하는 것이 더 바람직하다. The mixed and pulverized raw materials are put into a direct incubator, and the water is adjusted with a liquid microorganism in order to maintain an environment suitable for microbial fermentation, and then inoculated with a mixed seed comprising three or more kinds of Bacillus strains or lactic acid bacteria. The mixed spawn is produced as a powder by removing the harmful microorganisms of the soil in the presence of seasonal and environmental diversity, without artificial filtration, through the environmental adaptation process for 6 months on the natural product medium. In the preparation of the microbial preparation according to the present invention, the mixed seed is more preferably inoculated with 0.01 to 0.1% by weight of the total weight of the raw material.

상기 접종단계를 수행한 후에는, 상기 접종된 혼합원료를 80 내지 85℃에서 2 내지 8시간동안 배양시키는 고온 배양단계를 거치게 된다. 본 발명의 미생물제제 제조방법은 전술한 바와 같이, 80℃ 이상의 초고온에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 보통의 미생물배양은 20 내지 40℃ 범위에서 이루어지는 것이 일반적인 것임을 고려하면, 본 발명의 미생물제제는 초고온의 조건에서 수행된다는 것을 알 수 있다. 특히, 본 발명의 일실시예에서는 상기 복합종균이 접종된 배양원료는 80 내 지 85℃에서 2 내지 8시간 동안 30 내지 80rpm/min의 속도로 교반하면서 초고온 배양시켰다. 이때 배양온도는 불필요한 미생물의 증식을 억제하기 위해 80℃ 이상에서 수행하나, 본 발명에 따른 미생물 복합균의 활성도를 유지하기 위해 85℃ 이하에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 고온배양 후에는 여과 및 필요에 따라 희석의 과정을 거쳐 액상의 미생물제제를 수득할 수 있으며, 각종 부형제 및 첨가제, 예를 들면 광물(응집제), 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제 등을 첨가할 수 있다.After performing the inoculation step, the inoculated mixed raw material is subjected to a high temperature culture step of incubating for 2 to 8 hours at 80 to 85 ℃. As described above, the microbial preparation method of the present invention is characterized by culturing at ultra high temperature of 80 ℃ or more. Considering that the general microbial culture is generally made in the range of 20 to 40 ℃, it can be seen that the microbial preparation of the present invention is carried out under ultra-high temperature conditions. In particular, in one embodiment of the present invention, the culture material inoculated with the composite spawn was incubated at high temperature while stirring at 80 to 85 ° C. for 2 to 8 hours at a rate of 30 to 80 rpm / min. At this time, the culture temperature is carried out at 80 ℃ or more to suppress the growth of unnecessary microorganisms, it is preferable to perform at 85 ℃ or less to maintain the activity of the microorganism complex according to the present invention. After the high temperature culture, it is possible to obtain a liquid microbial agent through filtration and dilution if necessary, and various excipients and additives, such as minerals (coagulants), alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, etc. Can be added.

상기 고온배양 후에는 상기 배양된 미생물제제를 건조하여 고형 또는 분말상의 미생물제제로 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 건조는 미생물제제가 열변형 등의 우려가 없는 범위에서 공지의 건조방법, 예를 들면 열풍건조, 스프레이 드라이어를 이용한 비산건조 등의 건조방법 모두 사용가능하며 특별한 제한은 없다. 본 발명의 일실시예에서는 50 내지 80℃ 범위에서 열풍건조를 수행하였다. After the high temperature culture may further comprise the step of drying the cultured microbial preparation to a solid or powdered microbial preparation. The drying may be any known drying method, such as hot air drying, scattering drying using a spray dryer, etc. within a range in which the microbial agent does not have a concern such as thermal deformation, and there is no particular limitation. In one embodiment of the present invention was carried out hot air drying in the range of 50 to 80 ℃.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred embodiments of the present invention. However, the following examples are merely to help the understanding of the present invention, the scope of the present invention is not limited only to the following examples.

실시예(복합미생물 균주의 배양)Example (cultivation of complex microbial strain)

미생물이 함유된 토양시료(충북 제천의 산림의 부숙토)를 60℃에서 30분동안 열처리한 후 막자사발에서 곱게 갈아 준비해 둔 다음, 시료 1g을 취하여 0.85 % NaCl 9㎖에 현탁한 후, 100 내지 10-7로 희석하였다. 각각의 희석 현탁액 100 ㎕를 TSA, BL, BBL 배지(DIFCO 사)에 도말하여 28℃에서 배양하여 토양미생물 복합종균을 배양하였다. 상기 토양미생물 혼합종균을 분리동정한 결과 바실러스 속 균주 또는 유산균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis), 바실러스 TUT1206(Bacillus sp. TUT1206), 바실러스 Q-12(Bacillus sp. Q-12), 바실러스 터모아밀로보란스(Bacillus thermoamylovorans), 류코노스톡 파라메센테로이드(Leuconostoc paramesenteroides) 및 페디오코커스 펜토사세이스 스트레인 LM2632(Pediococcus pentosaceis strain LM2632) 등으로 구성되어 있음을 알 수 있었다.After the microorganism-containing soil samples by taking the following, 1g sample prepared based finely ground in a mortar and then heat treatment (composting soil of Chungbuk Jechon Forest) in a 60 ℃ for 30 minutes, suspended in 0.85% NaCl 9㎖, 10 0 Diluted to 10 −7 . 100 μl of each dilution suspension was plated in TSA, BL, BBL medium (DIFCO Co.) and incubated at 28 ° C. to incubate the soil microbial complex seedling. As a result of separating and identifying the mixed soil microorganism, Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), Bacillus sonorensis (B acillus sonorensis ), Bacillus TUT1206 ( Bacillus sp. TUT1206), Bacillus Q-12 ( Bacillus) sp. Q-12), Bacillus thermoamylovorans , Leuconostoc paramesenteroides and Pediococcus pentosaceis strain LM2632. Could know.

실시예 2(미생물제제의 제조)Example 2 (Preparation of Microorganisms)

상기와 같이 배양된 토양미생종균 0.01kg, 쌀겨 4kg, 당밀 2kg 및 황설탕 4kg을 음용수 기준에 적합한 물과 혼합하여 무게가 100kg이 되도록 혼합한 후 20 내지 25℃를 유지하며 4시간 간격으로 10㎥/h의 공기를 2시간 동안 폭기하는 과정을 일일 4회 반복적으로 수행하며 21일간 배양하여 복합미생물 액제를 제조하였다. 상기 복합미생물 액제는 총균수4,3 x 109 cfu/g였다. Soil microbial culture 0.01kg, rice bran 4kg, molasses 2kg and 4kg of brown sugar cultured as described above is mixed with water suitable for drinking water standards and mixed so that the weight is 100kg, maintaining 20 to 25 ℃ and 10㎥ every 4 hours Aeration of the air of / h for 2 hours was repeated four times a day and cultured for 21 days to prepare a complex microbial liquid. The complex microbial solution was 4,3 × 10 9 cfu / g.

이와는 별도로, 미리 분쇄한 65kg의 쌀겨, 35kg의 농산물부산물을 혼합기능이 있는 배양기에 넣고 30분간 혼합하였다. 혼합된 원료에 상기 복합미생물 액제 30kg을 넣어 수분농도 70%로 조절한 다음, 상기 토양미생물 복합종균을 배양원료 전체중량의 0.01%로 접종하였다. 접종된 배양원료를 외기온도300℃, 배양기 내부온도80 내지 85℃,30 내지 80rpm/min으로 교반하면서 초고온 배양을 4시간 진행하였다. Separately, the pre-crushed 65kg rice bran and 35kg agricultural by-products were placed in an incubator with a mixing function and mixed for 30 minutes. 30 kg of the mixed microbial liquid was added to the mixed raw material, and the water concentration was adjusted to 70%. The soil microbial complex spawn was inoculated at 0.01% of the total weight of the culture raw material. Ultra-high temperature culture was performed for 4 hours while stirring the inoculated culture raw material at an outside temperature of 300 ° C., an incubator internal temperature of 80 to 85 ° C., and 30 to 80 rpm / min.

실시예 3(미생물의 동정)Example 3 (Identification of Microorganisms)

상기와 같이 제조한 미생물제제 중 콜로니 형태가 다른 것들을 선발하여 TSA 배지에서 적어도 3회 이상 계대배양하여 단일콜로니로 분리한 후, 분리된 균주는 액체 배양하고 지노믹 DNA(genomic DNA)를 순화하여 16S RNA의 프라이머를 이용하여 증폭한 뒤, 증폭된 부분을 주형(template)으로 하고 519r과 785r 프라이머(primer)를 사용하여 서열을 시퀀싱(sequencing)하였다. 그 결과물을 NCBI DB에서 조사하여 종을 동정하였는 바, 16S RNA로 균을 동정하는 데 쓰인 프라이머 세트는 "Nucleic acid techniques in bacterial systematics (John Wiley and Sons, England)"와 "nucleic acid research (2000) 28(1):173-174를 참고하였다. Among the microorganisms prepared as described above, colonies of different types were selected and passaged at least three times in TSA medium to separate them into single colonies, and the isolated strains were cultured in liquid and purified genomic DNA was purified by 16S. After amplification using a primer of RNA, the amplified portion was used as a template, and the sequence was sequenced using 519r and 785r primers. The resulting species were identified in the NCBI DB to identify species. The primer sets used to identify bacteria with 16S RNA were described in "Nucleic acid techniques in bacterial systematics (John Wiley and Sons, England)" and "nucleic acid research (2000). 28 (1): 173-174.

또한, 상기 16s RNA 시퀀싱 외에 GC-MIDI분석, BIOLOG 분석을 더해 동정을 하였다. 상기 16s RAN 시퀀싱 결과와 GC-MIDI의 결과가 상이한 경우에는 GC-MIDI의 결과를 따르는 방향으로 동정하였다. 하기 표 1은 상기 16s RNA 시퀀싱 결과와 GC-MIDI 및 Biolog 분석 결과를 통해 확인된 본 발명의 미생물제제에 포함된 신규한 균주에 대한 동정결과를 나타낸 것이다. 하기 표 1에 나타난 것과 같이, 본 발명의 미생물제제는 식물성 병원균에 대하여 길항작용을 갖는 총 7종의 신규한 균주를 포함한다. 도 5 내지 도 11은 각각 하기 신규한 균주에 대한 16s RNA 분석결과 이다.In addition, GC-MIDI analysis and BIOLOG analysis were identified in addition to the 16s RNA sequencing. When the results of the 16s RAN sequencing and the results of the GC-MIDI are different, they were identified in a direction following the results of the GC-MIDI. Table 1 below shows the identification results of the novel strains included in the microorganisms of the present invention identified through the 16s RNA sequencing results and GC-MIDI and Biolog analysis results. As shown in Table 1 below, the microbial agent of the present invention includes a total of seven novel strains having antagonism against plant pathogens. 5 to 11 are 16s RNA analysis results for the following novel strains, respectively.

GC 분석GC Analysis 16s RNA sequencing16s RNA sequencing Biolog 분석Biolog analysis NoNo 유사도Similarity ks-4ks-4 0.7690.769 Bacillus-amyloliquefaciensBacillus-amyloliquefaciens ks-5ks-5 0.7610.761 Bacillus-agaradhaerensBacillus-agaradhaerens Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus subtilis C Bacillus subtilis C ks-6ks-6 0.7890.789 Paenibacillus-lentimorbusPaenibacillus-lentimorbus ks-7ks-7 0.7940.794 Bacillus-laevolacticusBacillus-laevolacticus Bacillus sonorensisBacillus sonorensis Bacillus licheniformisBacillus licheniformis ks-9ks-9 Leuconostoc paramesenteroidesLeuconostoc paramesenteroides Leuconostoc paramesenteroidesLeuconostoc paramesenteroides ks-13ks-13 0.2940.294 Kurthia-sibiricaKurthia-sibirica Bacillus oleroniusBacillus oleronius Streptococcus iniaeStreptococcus iniae ks-18ks-18 0.6740.674 Sphingobacterium-spiritivorumSphingobacterium-spiritivorum Uncultured bacterium PE02 Uncultured bacterium PE02 Sphingobacterium spiritovorumSphingobacterium spiritovorum

상기와 같이 분리동정된 미생물에 대하여 각각 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, 기탁번호:KACC 91247P), 바실러스-아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5,기탁번호:KACC 91248P), 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6, 기탁번호:KACC 91249P), 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7, 기탁번호:KACC 91250P), 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9, 기탁번호:KACC 91251P), 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13, 기탁번호:KACC 91252P) 및 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, 기탁번호:KACC 91253P)로 명명하고, 이를 2006년 6월 14일자로 대한민국 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터(KACC)에 기탁하여 상기 기탁번호를 부여받았다. Bacillus amyloliquefaciens KS-4 (Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, Accession No .: KACC 91247P), Bacillus-agarada Eren KS-5 (Bacillus-agaradhaerens KS-5) Accession number: KACC 91248P), Paenibacillus lentimobus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS-6, accession number: KACC 91249P), Bacillus Laebolactus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7, Deposit Number: KACC 91250P), Leuconostoc paramesenteroides KS-9 (Accession No .: KACC 91251P), Kursia-sibirica KS-13 (Accession No .: KACC 91252P) And Sphingobacterium-spiritivorum KS-18 (Accession Number: KACC 91253P), and as of June 14, 2006, the Korean Institute of Agricultural Microbiology The deposit number was assigned to (KACC).

실시예 4(분말상 미생물제제의 제조)Example 4 Preparation of Powdered Microbial Agents

상기 실시예 2에서 제조한 액상의 미생물제제를 실온(20 내지 25℃)으로 냉각한 다음 열풍건조(60℃)의 과정을 거쳐 수분함량 12%의 미생물제제 92kg을 제조하였다.The liquid microbial agent prepared in Example 2 was cooled to room temperature (20 to 25 ° C.), followed by hot air drying (60 ° C.) to prepare 92 kg of the microbial agent having a water content of 12%.

실시예 5(미생물의 항균력 시험)Example 5 (antimicrobial activity test of microorganisms)

상기 실시예에서 분리동정된 미생물에 대하여 알루미늄링 테스트를 통해 항균력을 시험하였다. 상기 실시예에서 분리동정한 균주를 -20℃ 냉동고에서 보관하다가, 트립틱소이아가 배지(trypticsoy agar, TSA)에 옮겨 28℃ 배양기 안에서 24시간 배양한 후, 이 배지에서 자란 균주를 액체배지(tryptic soy broth, TSB)에 옮겨 진탕배양기에서 28℃로 48시간 배양하였다.The microorganisms identified in the above example were tested for antimicrobial activity through an aluminum ring test. The strains isolated and identified in the above example were stored in a -20 ° C. freezer, tryptic soia was transferred to medium (trypticsoy agar, TSA), incubated for 24 hours in a 28 ° C. incubator, and the strains grown in the medium were tryptic soy broth, TSB) and incubated for 48 hours at 28 ℃ in shaking culture.

이와는 별도로, 라지패치병원균인 라이족토니아균(Rhizoctonia solani AG2-2)과 스크렐로티니아균(Sclerotinia homeocarpa)균을 감자한천배지(PDA)에서 배양하였다.Separately, the Rhizoctonia solani AG2-2 and Sclerotinia homeocarpa, which are large patch pathogens, were cultured in potato agar medium (PDA).

지름 2.7mm(D.O 2.9mm, D.I 2.7mm), 높이 10mm인 위아래가 뚫린 링(ring)의 한쪽 면을 호일로 평평하게 감싼 다음, 호일로 싼 방향을 아래로 하여 링을 페트리디쉬에 3개씩 담아 121℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균한 링 안에 감자한천배지(PDA)와 TSA 중층배지를 부어 굳혔다(base agar-PDA 2ml, top agar-TSA 2ml). TSA 위에 상기 실시예에서 동정된 각각의 균주를 접종하고, 28℃에서 48시간 배양하였다. 세균이 충분히 배양된 것을 확인한 다음, 링을 뒤집어 아래에 있던 호일을 제거한 후 PDA 배지위에 상기 배양한 라이족토니아균(Rhizoctonia solani AG2-2)과 스크렐로티니아균(Sclerotinia homeocarpa)균의 균사를 코르크보어(지름 9mm)로 발라내어 올려놓았다. 그 후, 25℃에서 48시간 이상 배양한 후 병원균의 균사생장 유무에 따라 항균력을 검정하였다. 도 1은 본 발명의 미생물제제로부터 분리동정한 신규한 균주의 항균력 테스트의 결과를 보여주는 사진이다. 상기 사진에 나타난 결과를 하기 표 2에 정리하였다. Wrap one side of a ring with a diameter of 2.7 mm (DO 2.9 mm, DI 2.7 mm) and a height of 10 mm flat with a foil, and then wrap the foil in a petri dish with the ring facing down. Sterilization for 15 minutes at 121 ℃. Potato agar medium (PDA) and TSA medium medium were poured into sterile rings (base agar-PDA 2ml, top agar-TSA 2ml). Each strain identified in the above examples was inoculated onto TSA and incubated at 28 ° C. for 48 hours. After confirming that the bacteria were sufficiently incubated, remove the foil under the inverting ring, and then, the hyphae of Rhizoctonia solani AG2-2 and Sclerotinia homeocarpa were cultured on PDA medium. The cork bore (9 mm diameter) was applied and topped off. Then, after incubating for at least 48 hours at 25 ℃ was tested for antimicrobial activity according to the presence or absence of mycelial growth of pathogens. 1 is a photograph showing the results of the antimicrobial test of the novel strain isolated from the microbial agent of the present invention. The results shown in the photograph are summarized in Table 2 below.

균주명Strain name 라이족토니아균 (Rhizoctonia solani AG2-2)Lyzoctonia solani AG2-2 스크렐로티니아균 (Sclerotinia homeocarpa)Sclerotinia homeocarpa Bacillus-amyloliquefaciens KS-4 Bacillus-amyloliquefaciens KS-4 + + Bacillus-agaradhaerens KS-5Bacillus-agaradhaerens KS-5 + + Paenibacillus-lentimorbus KS-6Paenibacillus-lentimorbus KS-6 + + Bacillus-laevolacticus KS-7Bacillus-laevolacticus KS-7 + + Leuconostoc paramesenteroides KS-9 Leuconostoc paramesenteroides KS-9 + -- Kurthia-sibirica K-13Kurthia-sibirica K-13 + + Sphingobacterium-spiritivorum K-18Sphingobacterium-spiritivorum K-18 + --

실시예 6-1(미생물제제의 방제효과 시험)Example 6-1 (Test of Control Effects of Microbial Agents)

상기 실시예 2 및 실시예 3에서 제조한 액상 및 고상의 미생물제제를 실제 라지패치에 감염된 잔디를 대상으로 치료효과를 검정하였다. 우선, 시험은 실내온실에서 이루어졌다. 실내온실 시험은 화분을 사용하였으며, 사용된 화분은 크기 0.5m×0.15m 넓이의 것으로, 화분에 채워진 흙은 강모래를 121℃에서 1시간 동안 멸균하여 사용하였다. 상기 화분에 뉴서울CC의 묘포장에서 라지패치에 이병된 떼를 홀커터로 떼어내어 한 화분당 4포기씩 이식하였다. 떼를 옮겨 심은 후 1일 후 상기 실시예 2 및 실시예 3의 액상 및 고형분의 미생물제제로 처리하였다. 처리량은 하기 도 2에 기재된 것과 같다. 액상 미생물제제는 전체적으로 고루 관주하였으며, 고형분의 미생물제제는 잔디 포기사이에 고루 뿌려주었다. 미생물제제의 처리량은 액제의 경우 2리터/㎡였고, 고형제의 경우 100g/㎡였으며, 각 처리구 당 4반복을 하였으며 온도 25℃, 습도 53% 조건에서 잔디를 키웠다. 도 2 및 도 3은 각각 본 발명의 미생물제제로 각각 처리량을 달리하여 처리한 잔디화분(처리구) 및 미생물제제로 처리하지 않은 잔디화분(대조구)의 10일 후의 생육상태를 보여주는 사진 및 본 발명의 미생물제제로 각각 처리량을 달리하여 처리한 처리구 및 미생물제제로 처리하지 않은 대조구의 시간에 따라 발병지수를 조사하여 표시한 발병지수 그래프이다. 도 2 및 도 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 본 발명의 신규한 균주를 포함한 미생물제제는 그 사용량이 늘어남에 따라 발병지수가 낮고 경시변화가 적음을 알 수 있다. 상기 발병지수는 4반복 평균치로 발병이 없는 경우 0, 10% 미만의 잔디에서 발병이 있는 경우에는 1, 10 내지 30%의 발병이 있는 경우는 2, 30 내지 50%의 발병이 있는 경우는 3, 50 내지 75%의 발병이 있는 경우는 4 및 75%를 초과한 경우는 5로 정의하여 수치화한 것이다.The therapeutic effect of the liquid and solid microbial preparations prepared in Example 2 and Example 3 was examined in grass infected with large patches. First of all, the test was conducted in an indoor greenhouse. The indoor greenhouse test was used for pots, the pots used were 0.5m × 0.15m wide, and the soil filled in pots was sterilized for 1 hour at 121 ° C. The pollen was removed from the seedling packaging of New Seoul CC in the potted plants with a hole cutter and transplanted by four bags per pot. One day after transplanting the herds were treated with the liquid and solid microbial preparation of Examples 2 and 3. The throughput is as described in Figure 2 below. Liquid microbial products were irrigated throughout, and solid microbial products were evenly sprayed between grass aerations. The throughput of the microbial preparation was 2 liters / m 2 for the liquid formulation, 100 g / m 2 for the solid formulation, and 4 repetitions were made for each treatment. The turf was grown at 25 ° C. and 53% humidity. 2 and 3 are photographs showing the state of growth after 10 days of turf flower pots (treatment) and turf flower pots (control) not treated with microbial agents, respectively, with different throughputs of the microbial agent of the present invention. It is a graph of the incidence index displayed by investigating the incidence index according to the time of the treatment group treated with different throughputs and the control group not treated with microbial agents. As can be seen in Figures 2 and 3, it can be seen that the microbial agent including the novel strain of the present invention has a low incidence index and a small change over time as its usage increases. The incidence index is 4 repetition averages, 0 in case of no disease, 1 in cases of less than 10% of grass, 2, 30 in case of 10 to 30% of cases, and 3 in cases of 30 to 50% of cases. In the case of 50-75% of cases, 4 and 75% of cases were defined as 5 and quantified.

실시예Example 6-2(미생물제제의 방제효과 시험) 6-2 (test for controlling effectiveness of microorganisms)

상기 실시예 2 및 실시예 3에서 제조한 액상 및 고상의 미생물제제를 실제 라지패치에 감염된 잔디를 대상으로 치료효과를 검정하였다. 상기 실시예 6-1과는 달리 실외의 잔디밭에서 시험이 이루어졌다. 시험은 잔디밭에 액체 및 고상 형태의 미생물제제를 각각 20리터/100평 및 10Kg/100평을 기준으로 하여 1회 처리하였고, 처리 후 20일 간격으로 병발생도를 확인하였다. 도 4는 본 발명의 미생물제제로 처리한 곳과 미생물제제로 처리하지 않은 주변인 대조구가 함께 대비되는 잔디밭 사진이다. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 본 발명의 신규한 균주를 포함한 미생물제제로 처리한 부분은 라지패치병의 치료 및 예방효과를 나타내는 것을 볼 수 있다. 하기 표 3은 본 발명의 미생물제제를 이용하여 처리한 잔디밭(처리구) 및 미생물제제로 처리하지 않은 잔디밭(대조구, 무처리구)의 발병지수를 20일 간격으로 조사하여 그 결과를 정리한 것이다. The therapeutic effect of the liquid and solid microbial preparations prepared in Example 2 and Example 3 was examined in grass infected with large patches. Unlike Example 6-1, the test was conducted on an outdoor lawn. In the test, the liquid and solid microbial agents were treated once on the basis of 20 liter / 100 pyeong and 10 Kg / 100 pyeong on the lawn, and the incidence was confirmed at 20 days intervals after the treatment. Figure 4 is a lawn photo contrasted with the control area treated with the microbial agent of the present invention and the microbial agent is not surrounding. As can be seen in Figure 4, it can be seen that the part treated with the microbial agent including the novel strain of the present invention exhibits a therapeutic and preventive effect of Rajpatch disease. Table 3 below summarizes the results of investigation of the incidence index of lawns treated with the microbial agent of the present invention (treatment zone) and lawns not treated with the microbial agent (control, untreated zone) at 20-day intervals.

처리후 발병조사일Onset date after treatment 액상 미생물제제Liquid microbial agent 고상 미생물제제Solid Microorganisms 처리구Treatment 무처리구No treatment 처리구Treatment 무처리구No treatment 20일 후After 20 days -- ++++ ++ ++++ 40일 후40 days later -- ++++++ ++ ++++++ 60일 후60 days later -- ++++++ ++ ++++++ 80일 후* After 80 days * -- ++ -- ++ 100일 후In 100 days -- ++++++ ++ ++++++ 120일 후120 days later ++ ++++++ ++ ++++++

(-: 0%, +:〈5%, ++:5-20%, +++:〉20%) 80일 후의 조사에서는 고온전조한 기후로 병이 일시적으로 나타나지 않음.(-: 0%, +: <5%, ++: 5-20%, +++:> 20%) After 80 days of irradiation, the disease is temporarily absent due to the high temperature precursor.

상기 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 본 발명의 미생물제제로 처리한 결과 발병도가 매우 낮고 1회만 처리했음에도 경시변화가 거의 없음을 알 수 있다.As can be seen in Table 3, as a result of the treatment with the microbial agent of the present invention it can be seen that the incidence is very low and there is almost no change over time even if only one treatment.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 식물성 병원균, 특히 라이족토니아균(Rhizoctonia solani) 또는 스크렐로티니아(Sclerotinia homeocarpa)균에 대하여 길항작용을 갖는 신규한 토양 유래 균주 및 상기 균주를 포함하는 미생물제제 및 상기 미생물제제의 제조방법을 제공한다.As described above, the present invention is a novel soil-derived strain having a antagonism against plant pathogens, in particular, Rhizoctonia solani or Sclerotinia homeocarpa , and a microbial agent comprising the strain. And it provides a method for producing the microbial agent.

앞에서 설명된 본 발명의 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 기재된 사항에 의하여만 제한되고, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 변경하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 개량 및 변경은 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속하게 될 것이다.The embodiments of the present invention described above should not be construed as limiting the technical idea of the present invention. The protection scope of the present invention is limited only by the matters described in the claims, and those skilled in the art can change and change the technical idea of the present invention in various forms. Therefore, such improvements and modifications will fall within the protection scope of the present invention, as will be apparent to those skilled in the art.

Claims (9)

바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, 기탁번호:KACC 91247P), 바실러스-아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5,기탁번호:KACC 91248P), 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6, 기탁번호:KACC 91249P), 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7, 기탁번호:KACC 91250P), 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9, 기탁번호:KACC 91251P), 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13, 기탁번호:KACC 91252P) 및 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, 기탁번호:KACC 91253P)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로, 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 균주. Bacillus-amyloliquefaciens KS-4 (Accession No .: KACC 91247P), Bacillus-agaradhaerens KS-5 (Bacillus-agaradhaerens KS-5, Accession No .: KACC 91248P) Bacillus lentibusus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS-6, Accession No .: KACC 91249P), Bacillus Laevolactus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7, Accession No .: KACC 91250P), Leukonostock Para Mesenteroid KS-9 (Leuconostoc paramesenteroides KS-9, Accession No .: KACC 91251P), Kursia-sibirica KS-13 (Accession No .: KACC 91252P) and Sphingobacterium Spiriborum KS At least one selected from the group consisting of -18 (Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, Accession No .: KACC 91253P), the strain having antagonistic activity against vegetable pathogens. 제1항에 있어서, The method of claim 1, 상기 식물성 병원균은 라이족토니아균(Rhizoctonia solani) 또는 스크렐로티니아(Sclerotinia homeocarpa)균인 것을 특징으로 하는 식물성 병원균에 길항작용을 갖는 균주.The plant pathogen is a strain having antagonism to the plant pathogen, characterized in that the Rhizoctonia solani or Sclerotinia homeocarpa . 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, 기탁번호:KACC 91247P), 바실러스-아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5,기탁번호:KACC 91248P), 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6, 기탁번호:KACC 91249P), 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7, 기탁번호:KACC 91250P), 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9, 기탁번호:KACC 91251P), 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13, 기탁번호:KACC 91252P) 및 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, 기탁번호:KACC 91253P)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주를 유효성분으로 포함하며, 식물성 병원균인 라이족토니아균(Rhizoctonia solani) 또는 스크렐로티니아(Sclerotinia homeocarpa)균에 의한 라지패치병의 치료 및 예방효과를 갖는 것을 특징으로 하는 미생물제제.Bacillus-amyloliquefaciens KS-4 (Accession No .: KACC 91247P), Bacillus-agaradhaerens KS-5 (Bacillus-agaradhaerens KS-5, Accession No .: KACC 91248P) Bacillus lentibusus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS-6, Accession No .: KACC 91249P), Bacillus Laevolactus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7, Accession No .: KACC 91250P), Leukonostock Para Mesenteroid KS-9 (Leuconostoc paramesenteroides KS-9, Accession No .: KACC 91251P), Kursia-sibirica KS-13 (Accession No .: KACC 91252P) and Sphingobacterium Spiriborum KS It contains at least one strain selected from the group consisting of -18 (Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, Accession No .: KACC 91253P) as an active ingredient, the plant pathogen Rhizoctonia solani or Sclerotinia homeocarpa It has the effect of the treatment and prevention of large patch disease by the bacteria Microbial agent to a gong. 삭제delete 삭제delete ⅰ)토양을 염수에 현탁하여 현탁액을 제조한 다음 배지에서 배양하여 토양미생물 혼합종균을 배양하는 단계;Iii) suspending the soil in saline to prepare a suspension, and then culturing in a medium to culture soil microbial mixed spawn; ⅱ)토양미생물 혼합종균 0.001 내지 0.02중량부와, 쌀겨 2 내지 5중량부, 당밀 2 내지 4중량부 및 황설탕 2 내지 4중량부에 나머지 물을 혼합하여 100중량부가 되도록 하여 혼합한 후 20 내지 25℃를 유지하며 2 내지 6시간 간격으로 5 내지 10㎥/h의 공기를 1 내지 3시간 동안 폭기하는 과정을 일일 2 내지 6회 반복적으로 수행하며 15 내지 21일간 배양하여 복합미생물 액제를 제조하는 단계; Ii) Soil microbial mixed spawn 0.001 to 0.02 parts by weight, 2 to 5 parts by weight of rice bran, 2 to 4 parts by weight molasses and 2 to 4 parts by weight of sugar sugar mixed with the remaining water to 100 parts by weight 20 to 20 Maintaining 25 ℃ and aeration of 5 to 10 ㎥ / h of air for 1 to 3 hours at intervals of 2 to 6 hours repeatedly performed 2 to 6 times a day and incubated for 15 to 21 days to prepare a complex microbial liquid step; ⅲ)쌀겨 또는 농산물 부산물 건조분말로 구성된 배양원료 20 내지 30중량% 및 상기 복합미생물 액제 70 내지 80중량%로 구성된 혼합원료를 제조한 후, 상기 토양미생물 혼합종균 0.01 내지 0.1 중량%를 접종하는 접종단계; Iii) inoculated to inoculate 0.01-0.1 wt% of the soil microbial mixed seed after preparing a mixed raw material consisting of 20-30 wt% of rice bran or agricultural by-product dry powder and 70-80 wt% of the mixed microbial solution. step; ⅳ)상기 접종된 혼합원료를 외기온도 300℃ 내부온도80 내지 85℃에서 2 내지 8시간동안 배양시키는 고온 배양단계를 포함하는 방법으로 제조되며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KS-4(Bacillus-amyloliquefaciens KS-4, 기탁번호:KACC 91247P), 바실러스-아가라다에렌스 KS-5(Bacillus-agaradhaerens KS-5,기탁번호:KACC 91248P), 파에니바실러스 렌티모부스 KS-6(Paenibacillus-lentimorbus KS-6, 기탁번호:KACC 91249P), 바실러스 라에볼락티쿠스 KS-7(Bacillus-laevolacticus KS-7, 기탁번호:KACC 91250P), 류코노스톡 파라메센테로이드 KS-9(Leuconostoc paramesenteroides KS-9, 기탁번호:KACC 91251P), 쿠르시아 시비리카 KS-13(Kurthia-sibirica KS-13, 기탁번호:KACC 91252P) 및 스핑고박테리움 스피리티보럼 KS-18(Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, 기탁번호:KACC 91253P)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주를 유효성분으로 포함하는 방제용 미생물제제의 제조방법.Iii) the inoculated mixed raw material is prepared by a method comprising a high-temperature culturing step of incubating for 2 to 8 hours at an ambient temperature of 300 ° C. and an internal temperature of 80 to 85 ° C., Bacillus amyloliquefaciens KS-4 (Bacillus-amyloliquefaciens) KS-4, Accession No .: KACC 91247P), Bacillus-agaradhaerens KS-5 (Accession No .: KACC 91248P), Paenibacillus Lentimobus KS-6 (Paenibacillus-lentimorbus KS- 6, accession number: KACC 91249P), Bacillus laevolacticus KS-7 (Bacillus-laevolacticus KS-7, accession number: KACC 91250P), leukonostock paramesenteroid KS-9 (Leuconostoc paramesenteroides KS-9, deposit KACC 91251P), Kurthia-sibirica KS-13 (Accession No .: KACC 91252P) and Spingobacterium Spiriborum KS-18 (Sphingobacterium-spiritivorum KS-18, Accession No .: KACC 91253P) room containing one or more strains selected from the group consisting of The method of microbial preparations. 제6항에 있어서, The method of claim 6, 상기 배양원료는 35 내지 75중량%의 쌀겨 및 25 내지 65중량%의 농산물 부산물 분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물제제의 제조방법.The culture material is a method for producing a microbial agent, characterized in that it comprises 35 to 75% by weight of rice bran and 25 to 65% by weight of the by-product powder. 제6항 또는 제7항에 있어서,The method according to claim 6 or 7, 상기 고온배양단계 후, 열풍건조 또는 스프레이 드라이어를 이용하여 건조하여 분말상으로 제조하는 단계를 더 포함한 것을 특징으로 하는 미생물제제의 제조방법.After the high temperature culture step, using a hot air drying or spray dryer to dry the manufacturing method of the microbial agent further comprising the step of preparing in powder form. 제6항 또는 제7항에 있어서, The method according to claim 6 or 7, 상기 토양미생물 혼합종균은 바실러스 속 균주 또는 유산균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis), 바실러스 TUT1206(Bacillus sp. TUT1206), 바실러스 Q-12(Bacillus sp. Q-12), 바실러스 터모아밀로보란스(Bacillus thermoamylovorans), 류코노스톡 파라메센테로이드(Leuconostoc paramesenteroides) 및 페디오코커스 펜토사세이스 스트레인 LM2632(Pediococcus pentosaceis strain LM2632)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미생물제제의 제조방법.The soil microbial mixed species is Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), Bacillus sonorensis (B acillus sonorensis ), Bacillus TUT1206 ( Bacillus sp. TUT1206), Bacillus Q-12 ( Bacillus sp. Q- 12), Bacillus thermoamylovorans , Leuconostoc paramesenteroides and Pediococcus pentosaceis strain LM2632, characterized in that at least one selected from the group consisting of. Method for producing a microbial agent.
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