KR102649731B1 - 혈액을 이용한 바이오 활성 소재 생산 방법 및 그 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 a) 0.32% 구연산 삼나트륨을 처리한 동물 혈액을 수거하여 그 혈액을 원심분리하여 혈장을 획득하고, b) 상기 혈장에 단백질 분해 효소를 처리하여 단백질을 분해하고, 분해된 혈장에 활성탄 1~2%를 첨가하여 인큐베이션 후 원심분리하여 침전물을 제거하고, 90~95℃에서 30분 이상 인큐베이션하여 효소 불활성화 및 살균한 후 필터로 순차적으로 여과하여 제균하고, c) 상기 여과액을 분무건조기로 분무건조하여 분말을 획득하는 단계를 포함하는 혈액을 이용한 바이오 활성 소재 생산 방법 및 그 방법으로 얻어진 생산물의 응용에 관한 것이다. 본 발명의 생산물은 단백질 식품 및 식품 첨가물, 단백질 화장품 소재 및/또는 탈모완화 기능성 샴푸 등 다양한 모발 관련 화장품 제품화에 사용될 수 있다.

Description

혈액을 이용한 바이오 활성 소재 생산 방법 및 그 응용{Method for producing bioactive material using blood and its application}

본 발명은 혈액을 이용한 바이오 활성 소재 생산 방법 및 그 응용에 관한 것이다.

최근 생활수준의 향상과 현대 의학의 진보에 따른 인간의 평균수명이 증가하고 있으며, 이에 따라 건강에 대한 관심과 함께 젊음과 아름다움에 대한 욕구가 증가하고 있는 실정이다. 이와 같은 분위기는 미용분야 외에 의학, 식생활분야에서까지 이어져 다양한 미용기술, 의술, 식품들이 개발되고 있으며, 또한 관련 분야의 많은 연구가 진행되고 있다.

천연 화장품소재는 인공합성한 화장품과 달리 생물이 자연적으로 만들어내는 성분을 활용한 소재를 의미하며, 화학성분과 약물성분의 유해성 논란과 마케팅적 필요에 따라 천연물 화장품소재에 대한 관심 증가하고 있다.

최근 다양한 식물추출물 또는 허브추출물들이 선호되면서 난립하고 있으나 효능과 성분이 불분명한 경우가 많으며, 효능 논란에도 불구하고 여전히 천연물로부터 새로운 효능을 갖는 소재 발굴 여지가 많다.

우수한 효능을 갖고 안전한 성분이라면 동식물 구분이 불필요하며 소비자 선택권 확장에도 유의미하다.

따라서 희귀하고 값비싼 소재보다는 구하기 쉽고 가성비 좋은 천연물 발굴에 대한 기술개발이 보다 공익적이며, 필요하다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허 공개번호 제10-2013-0029294호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 동물 혈액으로부터 고부가가치 소재를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 동물 혈액으로부터 고부가가치 소재를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 0.32% 항응고제를 처리한 동물 혈액을 수거하여 그 혈액을 원심분리하여 혈장을 획득하고,

b) 상기 혈장에 단백질 분해 효소를 처리하여 단백질을 분해하고, 분해된 혈장에 활성탄 1~2%를 첨가하여 인큐베이션 후 원심분리하여 침전물을 제거하고, 90~95℃에서 30분 이상 인큐베이션하여 효소 불활성화 및 살균한 후 필터로 순차적으로 여과하여 제균하고,

c) 상기 여과액을 분무건조기로 분무건조하여 분말을 획득하는 단계를 포함하는 혈액을 이용한 바이오 활성 소재 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항응고제는 구연산 삼나트륨인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 Subtilisin인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 상기 혈장에 0.7% 이상 더욱 바람직하게는 1%(w/v) 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 혈장 분리 시 적혈구의 용혈이 발생하지 않고 분리되는 경우는 활성탄을 처리하지 않는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 제조된 생산물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 생산물을 유효성분으로 포함하는 식품 또는 식품 첨가물 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 생산물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명 일 구현예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 노화방지용 화장품, 두발 및 두피화장품, 마사지용 화장품, 마스크팩, 스킨용 화장품, 태양광선 피부보호용 화장품 및 헤어샴푸인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 화장료 조성물은 샴푸, 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션으로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매,용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제,물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다. 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 생산물을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

도축 혈액은 각종 단백질과 미네랄이 풍부하게 함유되어 있어 이용 가치가 매우 높은 생명자원으로, 혈액 내 단백질 함량 평균 18~20% 내외, 각종 미네랄 등 1~2%, 나머지는 대부분 수분이다.

동물 혈액단백질은 20여 종의 아미노산이 골고루 분포되어 있는 '완전 단백질'으로 돈혈은 오래전부터 식용으로도 애용되며 위생적 취급 시 안전한 '식품'이며, 도축부산물인 도축혈액은 식품법 상 '식품'으로 분류된다.

유럽은 돼지혈액을 활용하여 알부민 등 의약품과 식품첨가물 생산하기도 한다.

또한 누에고치, 달팽이, 태반, 마유, 장어, 지렁이, 사슴유 등 동물성 원료는 화장품 전반에 활용 중이며, 동물성 단백질은 식물성 단백질 대비 아미노산 함량, 분포 및 종류 등에서 우월하다.

인체혈액은 활용하기 어려우나 돈혈은 활용 가능하며 위생적이고 양질의 원료수급도 용이하며, 화장품 성분 중 인체태반 대체재로 널리 쓰이는'플라센타'는 돼지의 태반을 가수분해한 안전한 소재이다.

본 발명은 그 동안 버려져 왔던 고영양 생명자원의 높은 효용가치에 주목하여, 비료나 사료 등 저부가가치 자원화에서 탈피하여 기능성화장품소재 및 식품소재 등 고부가가치 소재화 가능하며, 동물성원료 중 20여 종의 아미노산과 필수와 비필수 아미노산이 골고루 함유된 완전단백질 자원이며, 단백질 외에도 각종 성장인자와 미네랄 성분이 풍부한 동물 혈액으로부터 고부가가치 소재를 생산하는 방법을 제공한다.

최근 런던 협약 발효로 육상폐기물의 해양투기가 전면 금지된 이후 육상 폐기물이 다시금 증가하는 추세로 전 세계적인 친환경 정책 및 환경규제 강화 추세에 발맞추어 도축 혈액의 자원화를 통한 폐기물 감소가 절실하여, 본 발명의 방법은 폐기물 저감에 따른 처리비용 감소로 도축장의 경제적 부담 완화 및 환경오염 감소 효과를 가진다.

현재 도축 혈액은 단순 액비 또는 혈분 사료를 제조하는 수준에 그치고 있으나, 혈액 (전혈)은 다양한 단백질 및 유용한 성분들을 다량 함유하고 있어 이용 범위가 다양할 뿐만 아니라 혈장에는 알부민, 면역 단백질, 각종 펩타이드와 유리 아미노산 등이 많아 활용가치가 매우 뛰어나다.

따라서 이러한 고영양 생명자원의 단순 재활용 (비료, 혈분 등)이 아닌 고부가가치 이용 방안 개발 (소재) 필요하다.

본 발명의 제조공정의 특징은 하기와 같다.

항응고제 전처리를 통한 혈액 응고 방지

혈액이 혈관 밖으로 유출되면 지속적인 손실을 방지하기 위하여 곧바로 혈소판이 활성화되고 응고인자들과의 상호작용을 통하여 혈액 응고 반응이 발생한다. 따라서 혈액 응고 방지를 위해 0.32%의 구연산삼나트륨을 처리하여 응고되지 않은 혈액을 확보한다.

연속성 원심분리기를 이용한 혈장 분리

혈액은 혈구와 혈장 성분으로 구성되어 있으며 실험실에서 일반적인 원심분리기를 이용하면 손쉽게 각각의 성분을 분리할 수 있다. 연구용 원심분리기를 이용하여 3200 rpm으로 25분간 원심분리를 하여 혈장 분획을 얻는다.

또한 산업용 소재를 생산하기 위해선 혈장과 혈구의 연속 분리가 요구됨에 따라 산업용 연속성 원심분리기를 사용할 수도 있다. 다양한 타입의 원심분리기 중 3상 분리가 가능한 tubular type 또는 disk 타입의 원심분리기가 적합하나 이에 한정되지 아니한다.

효소 분해 공법을 이용한 단백질 가수 분해

단백질은 아미노산들이 펩타이드 결합을 통하여 결합한 일차 구조, 다수의 비공유 결합에 의한 2차, 3차 구조를 형성하고 있다. 각 종에 따라 같은 기능을 하는 단백질이라도 구조가 다르고 이는 개체에 특이적인 알러지 반응 유발의 가능성이 있다. 따라서, 단백질을 미리 효소로 가수분해하여 알러지 반응을 예방하고 흡수를 도와 그 효능을 증가시키고자 분리한 혈장에 단백질 가수분해 효소를 적당량 처리하여 50~55℃에서 12 시간 이상 반응시킨다.

원심분리와 여과 공정을 통한 혈장 가수분해 추출물 정제

혈장은 적혈구를 제거한 분획으로 혈액 특유의 붉은 빛과 피 비린내는 풍기지 않는다. 그러나, 가수분해 시 혈장에 단백질과 함께 녹아져 있던 소수성 성분들이 단백질이 분해됨에 따라 수용액상에서 용출되어 침전되는 현상이 발생한다. 이를 원심분리하여 1차 제거 후 filter로 여과한다.

산업용 원심분리기를 사용하여 혈장 분리 시 약간의 적혈구가 용해될 수 있다. 붉은 빛이 도는 혈장을 사용한 경우 원심분리 전 적당양의 활성탄을 이용하여 탈색한다.

혈장 가수분해 추출물 분말 소재 생산

혈장 가수분해 추출물은 고농도의 영양성분으로 인해 미생물 번식에 취약하여 보관 시 방부 처리가 불가피하다. 또한, 원료의 상태에 따라 생산된 추출물의 농도 변화 가능성이 있고 이는 유효 성분의 정량적인 사용을 어렵게 만든다. 이러한 문제점들을 극복하기 위하여 가수분해 추출물을 90℃에서 30분간 살균 또는 제균 필터로 멸균한 후 분무건조 또는 동결건조를 통해 수분을 제거, 분말화한다.

본 발명은 기존의 방법과 대비하여 하기와 같은 차별성을 가진다.

액상화(분쇄)공정 제거:

기존의 방법은 혈액 그대로 수거해와야 해서 입고 즉시 강력 분쇄날로 응고혈액을 액상화해야 했고 이로인해 다량의 거품 발생, 분쇄공정 상 혈액의 불필요한 열접촉으로 인한 신선도 위협, 혈액 내 털 등도 잘게 부숴지면서 금속망 필터링에서 여과의 어려이 있고, 시간단축을 위해 대형모터 채택으로 인한 작업장내 큰 소음 등이 발생 불가피하다.

본 발명은 기존 방법과는 채혈 시 항응고제 처리로 응고를 방지하고, 빠른 처리가 필요한 혈액에서 공정슬림화, 시간 및 에너지절감, 및 신선도 유지 등 측면에서 장점이 있다.

원심분리 공정:

기존의 방법은 전혈 그대로 재활용했기에 혈장, 헴철 같은 다양한 분야의 재활용에 기술적 한계. 혈구로 인하여 여과에 막대한 부담 발생하고. 분리한 혈장은 전혈과 달리 노란색이며 특이취도 매우 적어 여과가 용이한 반면 혈구도 포함된 전혈은 분해 후 검은색을 띄며 강렬한 특이취로 인해 탈색과 탈취에 큰 부담이며 강력한 여과공정으로 인해 비용과 시간은 물론 유효성분 손실도 30~40%에 이를 정도로 적지 않았다.

본 발명은 원심분리 공정 도입을 통해 여과부담을 대폭 줄이고 유효성분 손실도 최소화하는 동시에 다양한 분야로의 재활용을 기대할 수 있으며, 혈장 혈구 응용한 활용분야 다양화, 혈액재활용 가치제고 및 불순물 완벽제거로 순도 증가 효과를 가진다.

여과 공정 일원화:

이전에는 전혈을 분해한 용액에 직접 활성탄을 투입(3~5%)한 후 코팅한 규조토로 여과하였으며 1회 여과로는 부족하여 최소 2회 이상 동일한 과정으로 여과해야 했으며, 첫회 여과 후 세척, 규조토 재코팅 등의 반복적인 수작업으로 인해 오염우려, 및 여과에 사용한 활성탄과 규조토는 폐기물로서 이의 처리 역시 많은 불편을 야기하였다.

본 발명은 3단계 필터링으로 활성탄이 불필요하거나 이전 사용량 대비 대폭 줄어들어 이에 따른 2차 폐기물이 미발생 또는 감소시키고, 공정 단순화로 시간 및 일손도 단축된다.

분무건조:

이전 공정에서는 건조부담을 줄이기 위해 건조 전 탈수작업을 해야 했으며 이 때 함수율은 약 70%, 탈수액은 별도의 재활용이 곤란하여 그대로 폐수처리해야 했다. 분무건조는 별도의 탈수과정이 없으며 건조부담은 농축으로 상당량 경감이 가능하고, 건조 전 살균과정이 있으며 건조 중에도 100도 이상의 고열처리, 건조 후 즉시 포장 가능 등으로 이전 공정에 비해 위생적으로 별도의 탈수 공정이 불필요하여 폐수 발생을 최소화하고, 크기가 고르지 않았던 입상형태를 재분쇄해야하는 작업도 불필요하며, 고열 건조 및 건조 즉시 포장으로 공정 중 세균 오염 위험 요인 감소 효과 등이 있다.

본 발명은 폐기 처리되는 고영양 생명자원인 도축 혈액을 이용한 고부가가치 소재 생산 및 기술을 보급하고, 비료와 사료 자원화에서 탈피, 고부가가치 소재화하여 국내 혈액 자원화 영역의 지평을 확장할 수 있으며, 단백질 식품 및 식품 첨가물, 단백질 화장품소재 등에 사용되는 아미노산의 수입 대체 효과를 가지며, 건강보조식품, 음료 등 다양한 파생 제품의 원료로 개발하여 천연 아미노산의 활용 범위를 확대할 수 있고, 탈모완화 기능성 샴푸 등 다양한 모발 관련 화장품 제품화에 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 공정을 기존의 방법과 비교한 그림,
도 2는 본 발명의 혈장을 이용한 바이오 활성 소재 제조 공정도,
도 3은 0.32% 구연산삼나트륨이 처리된 혈액을 동량으로 분주하여 상온에서 25분간 3000 g, break 0 컨디션으로 원심분리 한 혈액을 나타낸 그림,
도 4는 혈장에 효소를 농도 별로 처리하고 shaking incubator에 넣어 55℃에서 반응 시키며 시간대별로 색 변화를 관찰하고 단백질 분해정도를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 그림,
도 5는 단백질 분해 후 침전물이 생긴 혈장을 25분간 3000 g로 원심분리한 모습을 나타낸 그림,
도 6은 원심분리로 1차 불순물 제거 후 침전 필터와 활성탄 필터링을 거친 혈장과 최종 분무 건조한 분말을 나타낸 그림,
도 7은 연속성 원심분리기로 분리한 혈장과 단백질 분해 후 혈장을 나타낸 그림,
도 8은 활성탄을 농도별로 처리하여 탈색 정도를 비교한 그림,
도 9는 2% 활성탄을 처리하여 탈색한 혈장 및 동결건조한 분말을 나타낸 그림,
도 10은 HPLC를 이용하여 분해하지 않은 혈장과 효소 분해한 혈장의 단백질 분자량 분포를 비교한 그래프.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예:혈장을 이용한 바이오 활성 소재 제조 공정

도축장에서 0.32% 구연산 삼나트륨을 처리한 혈액 400리터를 탱크로리로 공장에 입고하여 알파라발의 클라라 20을 이용하여 8,000~,9000 RPM, 주입속도 1,200~1,500 ml/min, discharge 100~300 s, 압력 2~3 bar의 조건으로 원심분리하여 혈장을 약 200 L를 획득하였다.

혈장에 endopeptidase (Subtilisin;상표명 alcalase) 1%를 처리하여 50~56℃에서 14~18시간 동안 단백질을 분해하고, 분해된 혈장에 활성탄 1~2%를 첨가하여 50~56℃에서 1~3시간 동안 인큐베이션 후 8,000~9,000 rpm, 주입속도 1,200~1,700 ml/min, discharge 200~500 s, 압력 2~3 bar의 조건하에서 원심분리하여 침전물을 제거하고 90~95℃에서 30분 이상 인큐베이션하여 효소 불활성화 및 살균 후 1 μm, 0.45 μm, 0.2 μm 필터로 순차적으로 여과하여 제균하였다.

여과액 약 150리터를 춘천바이오산업진흥원의 대형분무건조기 (아인시스템)로 inlet 180~190℃, outlet 90~100℃, feed flow 25~32% 조건으로 분무건조하여 약 15 Kg의 분말을 획득하였다.

실시예 2: 효소 농도에 따른 혈장 단백질 분해율 비교

구연산삼나트륨의 경우 항응고제로써 사용 시 0.32%~0.6%까지 다양하게 사용된다. 혈액 검사 시 주로 0.38%로 코팅된 튜브를 사용하며 용액으로 사용시 4% 용액을 혈액과 1:9의 비율로 섞어 최종 0.4%를 사용하기도 한다.

예비 실험에서 돈혈에 0.32%로 사용하였을 때 혈액 응고가 발생하지 않음을 확인하였기에 본 혈장 소재 생산에서 구연산삼나트륨의 사용 농도는 0.32%를 사용하는 것이 상업적인 측면에서 바람직하다.

0.32% 구연산삼나트륨이 처리된 혈액을 동량으로 분주하여 상온에서 25분간 3,000~3,200 rpm으로 원심분리하여 혈장을 분리한 후 효소를 농도 별로 처리하고 shaking incubator에서 50~56℃로 반응 시키며 시간대별로 색 변화를 관찰하고 단백질 분해 정도를 gradient SDS-PAGE를 통해 확인하였다.

그 결과, 0.5%이상의 효소를 18시간 이상 처리 시 100 kDa 이상의 단백질 밴드가 현저히 감소하였으며 1%의 경우 4시간 이후부터 급격히 감소함을 확인하였다. 효소의 농도를 더 세분화하여 재실험 한 결과 0.7%로 14 시간 이상 반응 시 100 kDa 이상의 밴드가 확연히 감소하였으며 농도 의존적인 경향을 보이고, 1% 효소 처리 시 가장 분해율이 좋은 것으로 확인하였다.

AL-zyme의 권장 농도는 단백질 양의 1~3%로 이론적으로 혈장 단백질 (약 8%) 분해 시 0. 0.08~0.24%가 적당하나 실험 결과, 0.7% 이상의 처리가 요구된다.

실시예 3: HPLC를 이용한 단백질 분자량 분포 분석

예비 실험에서 alcalase와 같은 endopeptidase인 protamex를 처리하여 단백질 분해 활성을 비교해본 결과 alcalase의 활성이 10배 가량 뛰어남을 확인하였으므로 본 혈장 소재 생산에는 alcalase를 사용하는 것이 적절하다.

혈장에 효소를 1% 또는 1.2%를 처리하여 50~56℃에서 14시간 이상 단백질을 분해한 후 침전물을 제거하고 한국기초과학지원연구원 서울센터에서 HPLC (Alliance e2695, Waters)를 이용하여 펩타이드의 분자량 분포 분석을 실시하였다.

그 결과, 0.9 kDa 이하의 small peptide의 함량은 1% (76.2%)와 1.2% (75.3%) 처리 샘플간의 차이가 없음이 확인되었다. 따라서 효소는 1%를 사용하는 것이 적절하다.

실시예 4: lab scale에서 효소 분해 혈장 분말 생산

노란색의 투명한 액체인 혈장에 효소를 처리하여 단백질을 분해하면 불용성의 침전물이 생김을 확인하였다. 이를 실험실용 원심분리기를 이용하여 2,800~3,200 rpm으로 20~30분 간 spin-down 하여 1차 제거 후 정수기용 침전 필터 및 활성탄 필터를 이용하여 2차 제거하였다. 이를 실험실용 소형 분무건조기를 이용하여 Inlet 180~200℃, Outlet 90~100℃, feed flow 15~25%의 조건으로 분무건조 하였다.

분무건조 시 inlet 또는 Outlet 온도가 너무 높으면 단백질 분말이 눌러 붙어 탄화가 발생하며 Outlet 온도가 낮을 시 건조가 제대로 되지 않는 현상이 발생한다. 분무건조 조건은 분무건조기의 타입, 용액의 성분, 점도 등에 따라 변경하여야 하며 장치의 크기에 따라 입자의 입도, 건조 정도가 다르기 때문에 이 조건으로 한정할 수 없으나 본 효소분해 혈장 소재의 경우 소형 분무건조기 사용 시는 Inlet 180~200℃, Outlet 90~100℃, feed flow 15~25%, 중형을 사용 시 Inlet 180~200℃, Outlet 90~100℃, feed flow 25~40%, 대형 사용 시는 실시예 1과 같은 조건이 적절하다.

실시예 5: 연속성 원심분리기를 이용하여 분리한 혈장 분해 및 활성탄 농도 비교

0.32% 구연산삼나트륨을 처리한 혈액 100 L를 클라라 20을 이용하여 8,000~9,000 RPM, 주입속도 1,200~1,500 ml/min, discharge 100~300 s, 압력 2~3 bar의 조건으로 원심분리하여 획득한 혈장을 동량 분주하고 alcalase 1%를 처리하여 쉐이킹 인큐베이터에서 50~56℃, 230~270 rpm의 조건하에 14시간 이상 단백질을 분해하였다.

분해한 혈장을 50 ml 튜브에 15 ml 씩 분주하여 분말활성탄을 1, 2, 4, 8% 처리하고 쉐이킹 인큐베이터에서 50~56℃, 230~270 rpm의 조건하에 1시간 동안 탈색 및 탈취한 후 실험실용 원심분리기로 2,800~3,200 rpm으로 30분 간 spin-down 하여 활성탄과 불순물을 제거, 최종 0.2 μm 필터로 여과하였다.

각 용액의 고형물 농도를 측정하고 색과 냄새를 비교한 결과, 2%만 처리하여도 상당한 탈색 효과가 있었으며 1% 처리 시에 남아 있던 특이취가 말끔히 제거 되었으며 고형물의 농도도 높았다.

8% 활성탄을 사용할 시 가장 탈색 효과가 좋음을 확인하였으나 고농도의 활성탄에 의해 혈장의 유기물들이 너무 많이 제거되므로 혈장 소재 생산에는 1~2%를 처리하는 것이 가장 적절하였다. 혈장 분리 시 적혈구의 용혈이 발생하지 않고 분리되는 경우는 활성탄을 처리하지 않는 것이 바람직하였다.

Claims (10)

1. a) 0.32 중량% 항응고제를 처리한 동물 혈액을 수거하여 그 혈액을 1차 원심분리하여 혈장을 획득하고,
   b) 상기 혈장에 단백질 분해 효소를 처리하여 단백질을 분해하고, 분해된 혈장에 활성탄 1~2 중량%를 첨가하여 인큐베이션 후 2차 원심분리하여 불순물로서 소수성 침전물이 제거된 친수성 혈장 가수분해 추출물을 수득한 이후, 90~95℃에서 30분 이상 인큐베이션하여 효소 불활성화 및 살균한 후 필터로 순차적으로 여과하여 제균하고,
   c) 상기 여과액을 분무건조기로 분무건조하여 분말을 획득하는 단계를 포함하는 혈장 유래 단백질을 이용한 바이오 활성 소재 생산 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 항응고제는 구연산 삼나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 Subtilisin인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 상기 혈장에 1%(w/v) 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 방법은 혈장 분리 시 적혈구의 용혈이 발생하지 않고 분리되는 경우는 활성탄을 처리하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 생산물.
7. 제6항의 생산물을 유효성분으로 포함하는 식품 또는 식품 첨가물 조성물.
8. 제6항의 생산물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 노화방지용 화장품, 두발 및 두피화장품, 마사지용 화장품, 마스크팩, 스킨용 화장품, 태양광선 피부보호용 화장품 및 헤어샴푸 중 선택되는 적어도 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
10. 제6항의 생산물을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물.