KR102646766B1 - 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 비피도박테리움 브레베 idcc 4401 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 비피도박테리움 브레베 idcc 4401 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
인간의 구강에는 1000여 종이 넘는 미생물이 상호작용을 통해 생태계 균형을 이루고 있으며 구강건강에 큰 기여를 하고 있다. 그러나, 자극적인 화학성분이 함유된 가글액과 항생제의 오남용, 잘못된 식습관 등으로 인한 구강 및 치태 환경의 변화에 의해 구강 내 미생물의 균형이 무너지게 되면 특정 세균종의 분포가 증가하면서 구취, 충치뿐만 아니라 기회성 감염을 유발하여 치아와 치주조직 염증과 같은 치주질환을 일으키게 된다.
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 충치발병의 주요 원인균으로, 치아 표면에 부착하여 치태 형성 및 치조골 부식과 잇몸병을 발생시킨다. 치아우식증이란, 스트렙토코커스 뮤탄스와 같은 충치원인균이 설탕 및 전분과 같은 당을 분해하여 생성된 산에 의해 치아의 법랑질이 손상되는 감염성 세균성 질환이다. 이는 치아의 손상뿐만 아니라 통증, 구취 등을 유발하며 다른 구강질환으로 진행될 수 있다.
구취는 구강 또는 비강을 통하여 나오는 불쾌한 냄새로 정의되며, 주요 원인은 구강 세균에 의한 음식물 부패 또는 그 대사산물인 황화 수소(hydrogen sulfide, H2S) 및 이황화메틸(dimethyl disulfide, C2H6S2)와 같은 휘발성 유황 화합물(volatile sulfur compound, VSC)에 의해 초래된다. 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 니그레신(Prevotella nigrescne)과 같은 구강내 병원성 균들은 휘발성 유황 화합물 생성 능력을 가지고 있어 구취의 주요 원인균으로 알려져 있다.
현재 사용되는 항생제, 불소제 등은 치태 형성 억제에 효과적이지만 구강 내 미생물 균총을 변화시키거나 색소 침착, 과도한 오남용으로 인한 항생제 내성이 생길 수 있다.
따라서, 충치 예방 및 구취 생성 예방과 같은 구강 건강을 유지하기 위한 효과적이고 안전한 조성물에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명은 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 본 발명의 목적은, 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가지는 조성물에 있어서, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401[기탁번호: ATCC BAA-2849]를 포함하는 것에 의해 달성된다.
상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 모유를 먹인 유아의 대변으로부터 분리될 수 있다.
상기 조성물은 상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 0.1 내지 50중량% 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가지는 건강기능식품에 있어서, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401[기탁번호: ATCC BAA-2849]를 포함하는 것에 의해 달성된다.
상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 모유를 먹인 유아의 대변으로부터 분리될 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 0.1 내지 50중량% 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 잇몸 질환을 치료하는 약학적 조성물에 있어서, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401[기탁번호: ATCC BAA-2849]를 포함하는 것에 의해 달성된다.
본 발명에 따르면 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품이 제공된다.
도 1은 비피도박테리움 브레페 IDCC 4401의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 구강 병원균 4종에 대한 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 항균 활성을 측정한 결과로써, 1.5 x 108 CFU/mL의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼(Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum), 프레보텔라 니그레신(Prevotella nigrescne)에서 비피도박테리움 브레페 IDCC 4401의 항균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 비피도박테리움 브레페 IDCC 4401의 DPPH 라디칼 소거능(%) 및 SOD 유사 활성(%)을 통해 항산화 기능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 스트렙토코커스 뮤탄스의 Biofilm 생성 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 5는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 치면세균막 균체의 부착 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 구강상피세포(KB cell)에 대한 부착능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 GC-MS/MS(SPME) 분석을 통해 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼에서의 휘발성 유황화합물(Volatile Sulfur Compound, VSC)의 생성에 대한 상대적 풍부도(Relative abundance)를 나타낸 그래프이다.
도 2는 구강 병원균 4종에 대한 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 항균 활성을 측정한 결과로써, 1.5 x 108 CFU/mL의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼(Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum), 프레보텔라 니그레신(Prevotella nigrescne)에서 비피도박테리움 브레페 IDCC 4401의 항균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 비피도박테리움 브레페 IDCC 4401의 DPPH 라디칼 소거능(%) 및 SOD 유사 활성(%)을 통해 항산화 기능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 스트렙토코커스 뮤탄스의 Biofilm 생성 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 5는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 치면세균막 균체의 부착 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 구강상피세포(KB cell)에 대한 부착능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 GC-MS/MS(SPME) 분석을 통해 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼에서의 휘발성 유황화합물(Volatile Sulfur Compound, VSC)의 생성에 대한 상대적 풍부도(Relative abundance)를 나타낸 그래프이다.
이하 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
첨부된 도면은 본 발명의 기술적 사상을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 도시한 일 예에 불과하므로 본 발명의 사상이 첨부된 도면에 한정되는 것은 아니다. 또한 첨부된 도면은 각 구성요소 간의 관계를 설명하기 위해 크기와 간격 등이 실제와 달리 과장되어 있을 수 있다.
본 발명은 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가진 유산균을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 유산균은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401[기탁번호: ATCC BAA-2849]를 포함한다.
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 모유를 먹인 유아의 대변으로부터 분리되었으며, 충치 및 구강 염증 원인의 병원균에 대한 항균력을 가질 수 있다.
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP 및 SOD 유사 활성과 같은 항산화 능력을 가질 수 있다.
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 충치 원인균의 Biofilm 생성을 억제하여 구강내 충치를 예방할 수 있는 능력을 가질 수 있다.
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 우수한 구강상피세포 부착능을 가질 수 있다.
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 구강 내 환경에서 생존력에 영향을 받지 않는다.
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 구취 원인 물질인 휘발성 유황 화합물(Volatile sulfur compound, VSC)인 Dimethyl disulfide, Dimethyl trisulfide, Dimethyl tetrasulfide의 생성을 억제하여 구강내 구취를 억제할 수 있는 능력을 가질 수 있다.
본 발명에서 '잇몸 질환'은 구강 내 염증을 유발하는 경우라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 치은염, 치주염, 풍치, 충치, 지치우위염(사랑니염), 치주농양, 치은증식증, 부정교합, 치근막염, 마모증 또는 교모증 등을 포함할 수 있다.
조성물에서 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 1중량% 내지 100중량%, 10중량% 내지 90중량%, 1중량% 내지 10중량% 또는 0.1 중량% 내지 50중량%일 수 있다.
본 발명은 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가진 식품 조성물 내지 건강기능식품에 관한 것으로, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 포함한다. 식품 조성물 내지 건강기능식품에서 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 1중량% 내지 100중량%, 10중량% 내지 90중량%, 1중량% 내지 10중량% 또는 0.1 중량% 내지 50중량%일 수 있다.
식품 조성물 내지 건강기능식품은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 0.1억 내지 1000억 또는 1억 내지 100억 CFU/g을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물, 식품조성물 및 건강기능식품은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401외의 다른 유산균을 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물(또는 건강기능식품)은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태의 식품에 대한 조성물을 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 유산균이 함유된 껌, 비타민 복합체, 차, 주스 및 드링크 형태로 제조할 수 있으며, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 유효성분으로 하는 식품 조성물을 과립화, 캡슐화 또는 분말화하여 섭취할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 추출물을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
다른 예로, 식품 조성물의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품, 음료 또는 건강기능식품의 제조시에 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 사용량은 0.1 내지 50중량%, 0.1 내지 20중량% 또는 0.1 내지 10중량% 포함될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
일 구체예에 따른 식품 조성물 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 일 구체예에 따른 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 잇몸 질환의 치료를 위한 약학적 조성물을 포함하며, 약학적 조성물은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 포함할 수 있다. 약학적 조성물에서 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 함량은 1 내지 100중량%, 1 내지 50중량%, 1 내지 30중량% 또는 1 내지 10중량%일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 또는 0.001-1000 ㎎/kg 범위내이다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 1000 mg/kg, 구체적으로 1 ng 내지 약 100 mg/kg 또는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
다른 예시로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 달라질 수 있으므로, 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.
[실시예 1] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 동정
NCBI gene bank의 데이터베이스에서 Blast를 이용하여 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401이 일동바이오사이언스(주) 고유의 균주임을 확인하였다. 16S rRNA 염기서열은 도 1과 같다.
[실시예 2] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 및 병원균 배양
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401는 MRS배지(BD Difico, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 혐기적 조건으로 37℃, 18-24시간 정치 배양하였다. 구강 병원균인 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC 3065는 BHI 배지(MB cell, Seoul, Korea)에서 37℃, 혐기적 조건으로 18-24시간 배양하였으며, 포르피로모나스 진지발리스 KCTC 5352는 TSB Hemin Menadione 배지(MB cell)에서 37℃, 혐기적 조건으로 18-24시간 배양하였다. 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼 KCTC 2488과 프레보텔라 니그레신 KCTC 15081는 1% Yeast extract, 0.05% L-cysteine, 1% Hemin 및 0.02% Menadione이 포함된 BHI 배지에서 37℃, 혐기적 조건으로 48시간 배양하였다.
[실시예 3] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 구강 병원균 항균 활성 평가
항균 활성 평가를 위해 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 배양 상등액을 4℃, 6,000 rpm 조건으로 10분 동안 원심분리 및 필터 과정을 거쳐 준비하였다. 준비된 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 상등액을 1.5 x 108 CFU/mL 세포 수 범위의 구강 병원균과 함께 96-well plates에 100 μL씩 주입한 뒤 초기 흡광도(OD600)와 24시간 또는 48시간 이후의 흡광도(OD600)를 microplate reader(BioTek, Winooski, VT)로 측정하였다. 구강 병원균에 대한 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 항균 활성 결과는 도 2에 나타내었으며, 다음의 식을 통하여 그 결과를 해석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이 병원균 4종 모두 대조군(비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 무처리)에서는 세포 생장이 정상적으로 이루어졌으며, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼(Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum), 프레보텔라 니그레신(Prevotella nigrescne) 4종의 생장 억제에 유의적으로 효과를 보였다.
[실시예 4] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 항산화 활성 평가
1) DPPH 라디칼 소거능
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 측정을 위해 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 Lysates(1 x 108 CFU/mL)를 400 μM의 DPPH 용액과 혼합하였다. 이후, 혼합물을 암실에서 37℃, 30분 동안 배양한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로서 40 μg/mL 농도의 Ascorbic acid(Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능 결과는 도 3에 나타내었다.
2) FRAP 분석
FRAP(Ferric-reducing anti-oxidant power)은 tripyridyltriazine(TPTZ)의 존재 하에서 Fe3+를 푸른색을 띄는 Fe2+로 환원시키는 항산화능을 평가하는 방법이다. 40 mM HCl에 녹인 10 mM 2,4,6,-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ)와 20 mM Iron(Ⅲ) chloride hexahydrate(FeCl3·6H2O) 및 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.6)를 1:1:10(v/v/v) 비율로 혼합하여 FRAP 용액을 제조하였다. 이후, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 Lysates(1 x 108 CFU/mL)를 FRAP 용액과 혼합하여 암실에서 37℃, 30분 동안 배양한 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FeSO4를 표준물질로 이용하였으며, FRAP 측정 결과는 표 1에 나타내었다.
3) SOD 유사 활성
SOD(Superoxide Dismutase)는 세포 내 활성산소를 과산화수소로 전환시키는 항산화 효소로 SOD assay kit(Dojindo Molecular Technologies, Rockville, USA)를 이용하여 수행하였다. 96-well plates에 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 Lysates(1 x 108 CFU/mL) 20 μL를 WST working solution 200 μL 및 Enzyme working solution 20 μL와 혼합하여 37℃, 20분 동안 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로서 10 mg/mL 농도의 Ascorbic acid(Sigma-aldrich)를 사용하였다. SOD 유사 활성 결과는 도 3에 나타내었다.
하기 표 1 및 도 3에 나타난 바와 같이 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 양성 대조군 대비 70.22 ± 2.22%의 DPPH 라디칼 소거능, 2.75 ± 0.05 mM의 FRAP 및 93.12 ± 1.14%의 SOD 유사 활성을 나타내어 높은 항산화능을 보였다.
| FeSO4 equivalent(mM) | |
| Bifidobacterium breve IDCC 4401 | 2.75 ± 0.05 |
[실시예 5] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 Biofilm 생성 억제능 평가
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 스트렙토코커스 뮤탄스의 Biofilm 생성 억제능 평가를 위해 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 배양 상등액을 4℃, 6,000 rpm 조건으로 10분 동안 원심분리 및 필터 과정을 거쳐 준비하였으며, 1% sucrose가 포함된 BHI broth에 스트렙토코커스 뮤탄스를 1.5 x 108 CFU/mL 세포 수의 범위로 조정하였다. 준비된 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 배양 상등액을 1.5 x 108 CFU/mL 세포 수 범위의 스트렙토코커스 뮤탄스와 함께 96-well plates에 100 μL씩 주입한 뒤 37℃, 24시간 배양하였다. 이후, 상등액은 제거하고 각 웰은 멸균 증류수로 세척 후 100 μL씩 0.5%(v/v) crystal violet solution을 첨가하여 10분 간 염색시켰다. 이후, 멸균 증류수로 각 웰을 세척한 후 건조시켰다. 건조된 96-well plates에 100 μL씩 99% ethanol를 첨가하여 염색된 biofilm을 용해시킨 후 흡광도(OD540)를 microplate reader(BioTek)로 측정하여 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 biofilm 생성 억제능을 확인하였다.
도 4에 나타난 바와 같이 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 처리하였을 때, 대조군(비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 무처리) 대비 16.37 ± 5.82%의 biofilm을 형성하였다. 이러한 biofilm 생성의 감소는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401가 효과적으로 충치 예방 효능을 가짐을 확인한 것이다.
[실시예 6] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 치면세균막 균체 부착 억제능 평가
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 배양 상등액을 1% sucrose가 포함된 BHI broth과 함께 50 mL glass tube에 5 mL씩 주입한 뒤, 1.5 x 108 CFU/mL 세포 수의 범위로 조정한 스트렙토코커스 뮤탄스를 10 μL 접종하였다. Glass tube는 30° 기울인 상태로 37℃, 24시간 배양하였다. 이후, 상등액은 제거하고 5 mL의 0.5 M NaOH를 가하여 벽면에 부착한 균체를 현탁한 후, 흡광도(OD550)를 microplate reader(BioTek)로 측정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 처리하였을 때, 대조군(비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 무처리) 대비 4.21 ± 0.01의 치면세균막 균체의 부착 억제를 나타내어 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401가 스트렙토코커스 뮤탄스의 부착능을 유의적으로 억제함을 확인하였다.
[실시예 7] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 Lysozyme 감수성 확인
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 Lysozyme 감수성 확인을 위해 MRS broth에서 배양한 배양물을 4℃, 6,000 rpm 조건으로 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 제거하고 펠렛을 PBS로 2번 세척 후 동일한 완충액에 재현탁하였다. 이후, Lysozyme을 최종 농도가 100 μg/mL이 되도록 현탁액에 첨가하여 37℃, 1시간 배양하였다. Lysozyme 감수성은 0, 1시간 배양액을 MRS plate에 도말 후 37℃, 48시간 혐기적으로 배양하여 생성된 콜로니를 계수하였다.
하기 표 2에 나타난 바와 같이 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 Lysozyme 처리 전(Log 10.33 ± 0.42 CFU/mL)과 비교하여 1시간 배양 후 Log 9.80 ± 0.12 CFU/mL로 94.79%의 생존율을 나타내어 생장에 큰 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.
| Lysozyme tolerance (CFU/mL, 생존율 %) | ||
| Bifidobacterium breve IDCC 4401 | 0 h | 1 h |
| 10.33 ± 0.42 (100%) | 9.80 ± 0.12 (94.79%) | |
[실시예 8] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 구강상피세포(KB cell) 부착능 평가
1) 세포 배양
KB 세포(human mouth epithelial cell line; Korean cell line bank 10017)는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. KB 세포는 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)과 1% penicillin/streptomycin(Welgene, Gyeongsan, Korea)이 함유된 RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였으며, 배지는 2일 간격으로 교체하였다.
2) 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 구강상피세포(KB cell) 부착능 평가
구강상피세포(KB cell) 부착능 평가를 위해 KB 세포를 24-well plates에 1 × 105 cells/well로 분주하여 배양시킨 다음, 1.5 × 108 CFU/mL 세포 수 범위의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401를 1 mL씩 처리하여 37℃, 1시간 배양하였다. 이후, 상등액을 제거하고 PBS로 세포에 부착되지 않은 균을 세척한 뒤 100 μL의 Trypsin/EDTA(Welgene)를 첨가하여 4분 후 세포 및 부착된 박테리아를 수집하였다. 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401를 MRS agar에 도말한 뒤 37℃, 2일 간 배양하여 생성된 콜로니를 계수하였으며, 부착능은 KB 세포 기준으로 부착된 콜로니 수로 계산하였다.
도 6에 나타난 바와 같이 스트렙토코커스 뮤탄스는 KB 세포 기준 2.09 ± 1.18 × 105 CFU 부착하였으며, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 경우 9.41 ± 0.23 × 105 CFU가 부착하여 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주가 구강상피세포(KB cell)의 부착능이 우수하다는 것을 확인하였다.
[실시예 9] 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 처리에 따른 구취 원인 물질 분석
1) 분석 샘플 제조
구취 원인 물질인 휘발성 유황 화합물(Volatile sulfur compound, VSC) 분석을 위해 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 및 구취 원인 물질을 생성하는 것으로 알려진 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼을 각각 전배양하였다. 이후, 1 x 108 CFU/mL의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주 또는 배양 상등액을 1 x 108 CFU/mL의 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼과 함께 D-Glucose 및 0.5 mM DL-methionine이 포함된 Gifu anaerobic media(GAM, MB cell)에 접종하여 37℃, 24시간 혐기적으로 배양하였다. 24시간 후, 배양액에 6M HCl을 4%(v/v) 첨가하여 pH를 1 이하로 저하시키고, 균체의 물질 대사를 정지시켰다.
2) GC-MS/MS SPME를 이용한 구취 원인 물질 분석
준비된 시료는 서울대학교의 농생명과학공동기기원(NICEM)에서 SPME amber vial에 시료 1g 및 NaCl 1g을 넣어 vortexing 후 Gas chromatograph(TRACETM 1300, Thermo scientific, MA, USA)에 Mass spectrometer(TSQ 8000, Thermo scientific)을 이용하여 휘발성 유황 화합물 생성 여부를 확인하였다. 구체적인 분석조건은 하기 표 3과 같다.
| Condition |
|
| Injection mode(주입모드) | split/splitless |
| Injector temperature(주입구 온도) | 250°C |
| Carrier gas flow(가스 유량) | He, 1.5 mL/min |
| Oven temperature(오븐 온도) | 초기 온도 40°C, 시간 2분 150°C, 시간 10분(4°C/min) 200°C, 시간 5분(4°C/min) 최종 온도 230°C, 시간 5분(10°C/min) |
분석에 이용한 Fiber는 Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene(PDMS/DVB, 65 μm, 23 Ga)이며, Column은 DB-Wax column(60 m x 0.25 mm, 0.5 μm, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다. GC 분석으로 분리된 각 peak 성분은 표준물질의 머무름 시간 및 GC-MS에 의한 mass spectrum을 토대로 spectral library(NIST mass spectral search program, version 2.0, USA)로 검색한 자료와 비교하여 동정하였다.
도 7에 나타난 바와 같이 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주 또는 상등액을 처리하였을 때, 대조군(비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 무처리)에 비해 주요 휘발성 유황 화합물(VSC)인 Dimethyl disulfide, Dimethyl trisulfide, Dimethyl tetrasulfide의 상대적 풍부도(Relative abundance)가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 이러한 휘발성 유황 화합물(VSC)의 상대적 풍부도(Relative abundance)의 감소는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401가 효과적으로 구취 억제 효능을 가짐을 확인한 것이다.
Claims (7)
- 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가지는 조성물에 있어서,
수탁번호 ATCC BAA-2849로 기탁된 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401를 포함하며,
상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 모유를 먹인 유아의 대변으로부터 분리된 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 0.1 내지 50중량% 포함하는 조성물. - 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가지는 건강기능식품에 있어서,
수탁번호 ATCC BAA-2849로 기탁된 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401를 포함하며,
상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401은 모유를 먹인 유아의 대변으로부터 분리된 건강기능식품. - 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401을 0.1 내지 50중량% 포함하는 건강기능식품. - 삭제
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020230075951A KR102646766B1 (ko) | 2023-06-14 | 2023-06-14 | 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 비피도박테리움 브레베 idcc 4401 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품 |
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| KR101340021B1 (ko) | 2013-07-17 | 2013-12-10 | 황태익 | 잇몸질환 개선용 조성물의 제조방법 및 이에 의해 제조된 잇몸질환 개선용 조성물 |
| JP2015043775A (ja) * | 1999-06-21 | 2015-03-12 | アクティアル・ファルマセウティカ・ソシエダデ・ポル・クオタス・デ・レスポンサビリダデ・リミターダ | 乳酸菌の配合物並びに感染症および炎症の予防および／または処置のためのその使用 |
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| KR102438800B1 (ko) * | 2022-02-11 | 2022-08-31 | (주)엔에스티바이오 | 유산균 발효 노니 추출물을 유효성분으로 하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2023
- 2023-06-14 KR KR1020230075951A patent/KR102646766B1/ko active IP Right Grant
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