KR102571768B1 - 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 리기락토바실루스 살리바리우스 idcc 3551 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 리기락토바실루스 살리바리우스 idcc 3551 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
인간의 구강에는 1000여 종이 넘는 미생물이 상호작용을 통해 생태계 균형을 이루고 있으며 구강건강에 큰 기여를 하고 있다. 그러나, 자극적인 화학성분이 함유된 가글액과 항생제의 오남용, 잘못된 식습관 등으로 인한 구강 및 치태 환경의 변화에 의해 구강 내 미생물의 균형이 무너지게 되면 특정 세균종의 분포가 증가하면서 구취, 충치뿐만 아니라 기회성 감염을 유발하여 치아와 치주조직 염증과 같은 치주질환을 일으키게 된다.
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 충치발병의 주요 원인균으로, 치아 표면에 부착하여 치태 형성 및 치조골 부식과 잇몸병을 발생시킨다. 치아우식증이란, 스트렙토코커스 뮤탄스와 같은 충치원인균이 설탕 및 전분과 같은 당을 분해하여 생성된 산에 의해 치아의 법랑질이 손상되는 감염성 세균성 질환이다. 이는 치아의 손상뿐만 아니라 통증, 구취 등을 유발하며 다른 구강질환으로 진행될 수 있다.
구취는 구강 또는 비강을 통하여 나오는 불쾌한 냄새로 정의되며, 주요 원인은 구강 세균에 의한 음식물 부패 또는 그 대사산물인 황화 수소(hydrogen sulfide, H2S) 및 이황화메틸(dimethyl disulfide, C2H6S2)와 같은 휘발성 유황 화합물(volatile sulfur compound, VSC)에 의해 초래된다. 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 니그레신(Prevotella nigrescne)과 같은 구강내 병원성 균들은 휘발성 유황 화합물 생성 능력을 가지고 있어 구취의 주요 원인균으로 알려져 있다.
주요 치주질환 병원균으로 알려져 있는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum) 등이 생성하는 내독소인 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 inducible nitric oxide synthase(iNOS)가 유도되며, 유도된 iNOS는 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2)와 같은 주요 염증 매개체를 생성한다. 이러한 염증 매개체는 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 염증성 사이토카인(cytokines)의 발현을 유발하여 치주조직에서 염증 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다.
현재 사용되는 항생제, 불소제 등은 치태 형성 억제에 효과적이지만 구강 내 미생물 균총을 변화시키거나 색소 침착, 과도한 오남용으로 인한 항생제 내성이 생길 수 있다.
본 발명은 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 본 발명의 목적은 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가지는 조성물에 있어서, 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551[기탁번호: ATCC BAA-2835]를 포함하는 것에 의해 달성된다.
상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551는 건강한 어린이의 타액로부터 분리될 수 있다.
상기 조성물은 상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551를 0.1 내지 50중량% 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가지는 건강기능식품에 있어서, 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551[기탁번호: ATCC BAA-2835]를 포함하는 것에 의해 달성된다.
상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551는 건강한 어린이의 타액로부터 분리될 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551를 0.1 내지 50중량% 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 잇몸 질환을 치료하는 약학적 조성물에 있어서, 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551[기탁번호: ATCC BAA-2835]를 포함하는 것에 의해 달성된다.
본 발명에 따르면 잇몸 질환을 예방하고 구취 생성 억제능을 가지는 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 균주를 포함하는 조성물 및 건강기능식품이 제공된다.
도 1은 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 16s rRNA 염기서열을 나타낸 것이고,
도 2는 구강 병원균 4종에 대한 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 항균 활성을 측정한 결과로써, 1.5 x 108 CFU/mL의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼(Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum), 프레보텔라 니그레신(Prevotella nigrescne)에서 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 항균 활성을 나타낸 그래프이고,
도 3은 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 DPPH 라디칼 소거능(%) 및 ABTS 라디칼 소거능(%)을 통해 항산화 기능을 나타낸 그래프이고,
도 4는 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 처리에 따른 항염증 효과를 나타낸 결과로써, LPS로 유도한 대식세포(Raw 264.7)에서 세포독성 및 염증 관련 사이토카인 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 5는 GC-MS/MS(SPME) 분석을 통해 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 처리에 따른 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼에서의 휘발성 유황화합물(Volatile Sulfur Compound, VSC)의 생성에 대한 상대적 풍부도(Relative abundance)를 나타낸 그래프이다.
도 2는 구강 병원균 4종에 대한 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 항균 활성을 측정한 결과로써, 1.5 x 108 CFU/mL의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼(Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum), 프레보텔라 니그레신(Prevotella nigrescne)에서 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 항균 활성을 나타낸 그래프이고,
도 3은 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 DPPH 라디칼 소거능(%) 및 ABTS 라디칼 소거능(%)을 통해 항산화 기능을 나타낸 그래프이고,
도 4는 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 처리에 따른 항염증 효과를 나타낸 결과로써, LPS로 유도한 대식세포(Raw 264.7)에서 세포독성 및 염증 관련 사이토카인 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 5는 GC-MS/MS(SPME) 분석을 통해 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 처리에 따른 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼에서의 휘발성 유황화합물(Volatile Sulfur Compound, VSC)의 생성에 대한 상대적 풍부도(Relative abundance)를 나타낸 그래프이다.
이하 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
첨부된 도면은 본 발명의 기술적 사상을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 도시한 일 예에 불과하므로 본 발명의 사상이 첨부된 도면에 한정되는 것은 아니다. 또한 첨부된 도면은 각 구성요소 간의 관계를 설명하기 위해 크기와 간격 등이 실제와 달리 과장되어 있을 수 있다.
본 발명은 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가진 유산균을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 유산균은 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551[기탁번호: ATCC BAA-2835]를 포함한다.
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 건강한 어린이의 타액으로부터 분리되었으며, 충치 및 구강 염증 원인의 병원균에 대한 항균력을 가질 수 있다.
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 DPPH 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성과 같은 항산화 능력을 가질 수 있다.
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 염증 관련 바이오마커인 inducible nitric oxide synthase(iNOS), tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-6(IL-6), interleukin-1β(IL-1β)의 발현 감소를 통하여 항염증 능력을 가질 수 있다.
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 구취 원인 물질인 휘발성 유황 화합물(Volatile sulfur compound, VSC)인 Dimethyl disulfide, Dimethyl trisulfide, Dimethyl tetrasulfide의 생성을 억제하여 구강내 구취를 억제할 수 있는 능력을 가질 수 있다.
본 발명에서 '잇몸 질환'은 구강 내 염증을 유발하는 경우라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 치은염, 치주염, 풍치, 충치, 지치우위염(사랑니염), 치주농양, 치은증식증, 부정교합, 치근막염, 마모증 또는 교모증 등을 포함할 수 있다.
조성물에서 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 1중량% 내지 100중량%, 10중량% 내지 90중량%, 1중량% 내지 10중량% 또는 0.1 중량% 내지 50중량%일 수 있다.
본 발명은 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가진 식품 조성물 내지 건강기능식품에 관한 것으로, 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551을 포함한다. 식품 조성물 내지 건강기능식품에서 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 1중량% 내지 100중량%, 10중량% 내지 90중량%, 1중량% 내지 10중량% 또는 0.1 중량% 내지 50중량%일 수 있다.
식품 조성물 내지 건강기능식품은 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551을 0.1억 내지 1000억 또는 1억 내지 100억 CFU/g을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물, 식품조성물 및 건강기능식품은 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551외의 다른 유산균을 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물(또는 건강기능식품)은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태의 식품에 대한 조성물을 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 유산균이 함유된 껌, 비타민 복합체, 차, 주스 및 드링크 형태로 제조할 수 있으며, 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551을 유효성분으로 하는 식품 조성물을 과립화, 캡슐화 또는 분말화하여 섭취할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 추출물을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
다른 예로, 식품 조성물의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품, 음료 또는 건강기능식품의 제조시에 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 사용량은 0.1 내지 50중량%, 0.1 내지 20중량% 또는 0.1 내지 10중량% 포함될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
일 구체예에 따른 식품 조성물 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 일 구체예에 따른 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 잇몸 질환의 치료를 위한 약학적 조성물을 포함하며, 약학적 조성물은 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551를 포함할 수 있다. 약학적 조성물에서 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 함량은 1 내지 100중량%, 1 내지 50중량%, 1 내지 30중량% 또는 1 내지 10중량%일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 또는 0.001-1000 ㎎/kg 범위내이다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 1000 mg/kg, 구체적으로 1 ng 내지 약 100 mg/kg 또는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
다른 예시로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 달라질 수 있으므로, 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.
[실시예 1] 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 동정
NCBI gene bank의 데이터베이스에서 Blast를 이용하여 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석한 결과, 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551이 일동바이오사이언스(주) 고유의 균주임을 확인하였다. 16s rRNA 염기서열은 도 1과 같다.
[실시예 2] 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 및 병원균 배양
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551와 대조군으로 사용한 락토바실러스 람노서스 GG는 MRS배지(BD Difico, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 혐기적 조건으로 37 ℃, 18-24시간 정치 배양하였다. 구강 병원균인 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC 3065는 BHI 배지(MB cell, Seoul, Korea)에서 37 ℃, 혐기적 조건으로 18-24시간 배양하였으며, 포르피로모나스 진지발리스 KCTC 5352는 TSB Hemin Menadione 배지(MB cell)에서 37 ℃, 혐기적 조건으로 18-24시간 배양하였다. 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼 KCTC 2488과 프레보텔라 니그레신 KCTC 15081는 1% Yeast extract, 0.05% L-cysteine, 1% Hemin 및 0.02% Menadione이 포함된 BHI 배지에서 37 ℃, 혐기적 조건으로 48시간 배양하였다.
[실시예 3] 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 구강 병원균 항균 활성 평가
항균 활성 평가를 위해 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 배양 상등액을 4 ℃, 6,000 rpm 조건으로 10분 동안 원심분리 및 필터 과정을 거쳐 준비하였다. 준비된 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 상등액을 1.5 x 108 CFU/mL 세포 수 범위의 구강 병원균과 함께 96-well plates에 100 μL씩 주입한 뒤 초기 흡광도(OD600)와 24시간 또는 48시간 이후의 흡광도(OD600)를 microplate reader(BioTek, Winooski, VT)로 측정하였다. 구강 병원균에 대한 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 항균 활성 결과는 도 2에 나타내었으며, 다음의 식을 통하여 그 결과를 해석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이 병원균 4종 모두 무처리군(non-treated)에서는 세포 생장이 정상적으로 이루어졌으며, 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼(Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum), 프레보텔라 니그레신(Prevotella nigrescne) 4종의 생장 억제에 유의적으로 효과를 보였다.
[실시예 4] 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 항산화 활성 평가
1) DPPH 라디칼 소거능
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 측정을 위해 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 Lysates(1 x 108 CFU/mL)를 400 μM의 DPPH 용액과 혼합하였다. 이후, 혼합물을 암실에서 37 ℃, 30분 동안 배양한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로서 40 μg/mL 농도의 Ascorbic acid(Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능 결과는 도 3에 나타내었다.
2) ABTS 라디칼 소거능
ABTS(2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 라디칼 소거능 측정을 위해 암실에서 16시간 동안 7 mM ABTS와 2.6 mM 과황산칼륨을 1:1 비율로 혼합하여 ABTS 용액을 제조하였다. 이후, ABTS 용액은 734 nm에서 흡광도 값이 0.7 ± 0.02가 되도록 10 mM phosphate-buffered saline으로 희석하였다. 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 Lysates(1 x 108 CFU/mL)를 희석된 ABTS 용액과 혼합하여 암실에서 37 ℃, 10분 동안 배양한 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로서 4 mg/mL 농도의 Ascorbic acid(Sigma-aldrich)를 사용하였으며, 측정 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 양성 대조군 대비 80.34 ± 1.34%의 DPPH 라디칼 소거능 및 84.14 ± 1.00%의 ABTS 라디칼 소거능을 나타내어 높은 항산화능을 보였다.
[실시예 5] 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 처리에 따른 LPS로 유도한 대식세포(Raw 264.7)의 세포독성 및 염증 관련 사이토카인 유전자 발현 측정
1) 세포 배양 및 세포 독성 확인
RAW 264.7 세포(mouse macrophage cell line; Korean cell line bank 40071)는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포는 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; GenDEPOT, Katy, TX, USA)과 1% penicillin/streptomycin(Welgene, Gyeongsan, Korea)이 함유된 high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 37 ℃, 5% CO2 환경에서 confluence가 될 때까지 배양하였으며, 배지는 2일 간격으로 교체하였다.
세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Duchefa, Haarlem, Netherlands) 방법으로 확인하였다. RAW 264.7 세포를 96-well plate에 1 × 105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양시킨 다음, 100 μL의 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 Lysates와 락토바실러스 람노서스 GG Lysates를 2시간 처리하였다. 그 후 각 웰에 1 μg/mL의 LPS를 22시간 처리하였다. 이후, 배지를 제거하고 각 well에 5 mg/mL 농도의 MTT 용액 50 μL를 첨가하여 4시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이후, MTT 용액을 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 넣어 30분 동안 shaker에서 배양한 후, microplate reader(BioTek)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 실험은 3회 반복하여 평균값을 계산하였으며, 상기 측정 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551를 처리한 경우 세포 독성을 나타내지 않았다.
2) Raw 264.7 세포 내 염증 관련 사이토카인 유전자 발현 측정
RAW 264.7 세포 내 염증 관련 바이오마커는 PCR를 통해 측정하였다. RAW 264.7 세포의 RNA는 TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 추출하였다. 이후 Superscript IV First-Strand Synthesis System를 이용하여 total RNA 1 μg로부터 First-Strand cDNA를 합성하였다. Primer로 사용된 유전자는 하기 표 1과 같다.
<표 1>
PCR 조건은 98 ℃에서 initial denaturation 30초, 50-72 ℃에서 annealing 20초, 26-32 cycles, 72℃에서 final extension 2분 진행 후 4-10℃에서 hold하였다. 이후, Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 PCR의 target band 강도를 정량화하였다.
도 4에 나타난 바와 같이 염증 유도 효소인 iNOS와 TNF-α, IL-6, IL-1β를 포함하는 염증성 cytokine의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과, LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 경우 모든 염증 관련 사이토카인 유전자가 과발현되었다. 반면, 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 처리군의 경우 iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현이 유의적으로 감소하여 항염증 효과를 보였다.
[실시예 6] 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 처리에 따른 구취 원인 물질 분석
1) 분석 샘플 제조
구취 원인 물질인 휘발성 유황 화합물(Volatile sulfur compound, VSC) 분석을 위해 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 및 구취 원인 물질을 생성하는 것으로 알려진 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼을 각각 전배양하였다. 이후, 1 x 108 CFU/mL의 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 균주 또는 배양 상등액을 1 x 108 CFU/mL의 푸조박테리움 뉴클레아텀 아종 폴리몰폼과 함께 D-Glucose 및 0.5 mM DL-methionine이 포함된 Gifu anaerobic media(GAM, MB cell)에 접종하여 37 ℃, 24시간 혐기적으로 배양하였다. 24시간 후, 배양액에 6M HCl을 4%(v/v) 첨가하여 pH를 1 이하로 저하시키고, 균체의 물질 대사를 정지시켰다.
2) GC-MS/MS SPME를 이용한 구취 원인 물질 분석
준비된 시료는 서울대학교의 농생명과학공동기기원(NICEM)에서 SPME amber vial에 시료 1g 및 NaCl 1g을 넣어 vortexing 후 Gas chromatograph(TRACETM 1300, Thermo scientific, MA, USA)에 Mass spectrometer(TSQ 8000, Thermo scientific)을 이용하여 휘발성 유황 화합물 생성 여부를 확인하였다. 구체적인 분석조건은 하기 표 2와 같다.
<표 2>
분석에 이용한 Fiber는 Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene(PDMS/DVB, 65 μm, 23 Ga)이며, Column은 DB-Wax column(60 m x 0.25 mm, 0.5 μm, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다. GC 분석으로 분리된 각 peak 성분은 표준물질의 머무름 시간 및 GC-MS에 의한 mass spectrum을 토대로 spectral library(NIST mass spectral search program, version 2.0, USA)로 검색한 자료와 비교하여 동정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 균주 또는 상등액을 처리하였을 때, 대조군(리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551 무처리)에 비해 주요 휘발성 유황 화합물(VSC)인 Dimethyl disulfide, Dimethyl trisulfide, Dimethyl tetrasulfide의 상대적 풍부도(Relative abundance)가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 이러한 휘발성 유황 화합물(VSC)의 상대적 풍부도(Relative abundance)의 감소는 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551이 효과적으로 구취 억제 효능을 가짐을 확인한 것이다.
[실시예 7] 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 Lysozyme 감수성 확인
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551의 Lysozyme 감수성 확인을 위해 MRS broth에서 배양한 배양물을 4 ℃, 6,000 rpm 조건으로 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 제거하고 펠렛을 PBS로 2번 세척 후 동일한 완충액에 재현탁하였다. 이후, Lysozyme을 최종 농도가 100 μg/mL이 되도록 현탁액에 첨가하여 37 ℃, 1시간 배양하였다. Lysozyme 감수성은 0, 1시간 배양액을 MRS plate에 도말 후 37 ℃, 48시간 혐기적으로 배양하여 생성된 콜로니를 계수하였다.
하기 표 3에 나타난 바와 같이 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551은 Lysozyme 처리 전(Log 11.59 ± 0.01 CFU/mL)과 비교하여 1시간 배양 후 Log 11.71 ± 0.04 CFU/mL로 생장에 큰 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.
<표 3>
Claims (7)
- 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가지는 식품 조성물에 있어서,
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551[기탁번호: ATCC BAA-2835]를 포함하며,
상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551는 건강한 어린이의 타액로부터 분리된 식품 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551를 0.1 내지 50중량% 포함하는 식품 조성물. - 잇몸 질환을 예방 및 개선하며 구취를 억제하는 활성을 가지는 건강기능식품에 있어서,
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551[기탁번호: ATCC BAA-2835]를 포함하며,
상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551는 건강한 어린이의 타액로부터 분리된 건강기능식품. - 제4항에 있어서,
상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551를 0.1 내지 50중량% 포함하는 건강기능식품. - 삭제
- 잇몸 질환을 치료하는 약학적 조성물에 있어서,
리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551[기탁번호: ATCC BAA-2835]를 포함하며,
상기 리기락토바실루스 살리바리우스 IDCC 3551는 건강한 어린이의 타액로부터 분리된 약학적 조성물.
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