KR102630982B1 - Pepper transcription factor CaJAZ1-03 gene and method for improving the resistance to the drought stress using CaJAZ1-03 in plants - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고추 유래 신규 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 건조 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 단백질을 암호화하는 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 유전자를 동정하였다. CaJAZ1-03 단백질은 ABA 신호전달의 음성 조절자로 기능하며, 상기 CaJAZ1-03 유전자가 침묵된 식물체에서는 건조 스트레스에 대한 저항성이 증진되는 효과를 확인하였는바, CaJAZ1-03 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a novel CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) gene/protein derived from pepper, and a method for improving drought stress resistance of plants using the same.
The present inventors identified the CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) gene, which encodes a protein that regulates resistance to drying stress. The CaJAZ1-03 protein functions as a negative regulator of ABA signaling, and the effect of improving resistance to drying stress was confirmed in plants in which the CaJAZ1-03 gene is silenced. By regulating the expression of the CaJAZ1-03 gene, humans can It can be used to improve available crops, and is expected to be especially useful in improving plant productivity.
Description
본 발명은 고추 녹광 품종 전사인자 CaJAZ1-03 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to the transcription factor CaJAZ1-03 gene for pepper green light varieties and a method for improving drought stress resistance in plants using the same.
지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적이 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화한다.Global warming causes extreme climate change, causing environmental stress that inhibits the normal growth and development of plants. In response to this, plants have evolved sophisticated defense mechanisms to survive in adverse environments such as cold, high salt, and drought. For example, drought is caused by a moisture-deficient environment and has a serious impact on the normal growth of plants, ultimately leading to a decrease in grain yield. To adapt to this drying stress, plants close stomata and use abscisic acid (hereinafter referred to as abscisic acid). Activates various defense mechanisms such as synthesis and accumulation of ABA).
ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절 인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 ABA를 생성하지 못하거나, ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.ABA is a regulatory factor to protect plants against abiotic stress, especially drying stress, and is known to play a very important role in plant growth and development. Reportedly, plants that were previously treated with ABA and stressed resist stress better than plants that were not treated with ABA, while mutant plants that do not produce ABA or cannot respond to ABA are known to be weak to stress. Therefore, it is expected that plants with improved resistance to environmental stress can be developed by using proteins involved in the ABA response.
ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절한다고 알려졌으나, 완전한 ABA 신호전달 경로는 아직 규명되지 않았다. 식물 세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야 한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려졌다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.ABA signaling is known to regulate the expression of various stress-related genes, such as E3 ligase and transcription factors involved in osmotic adaptation and regulation of root hydraulic conductivity, but the complete ABA signaling pathway has not yet been identified. It didn't work. To initiate ABA signaling in plant cells, an ABA receptor must be present and transmit the signal to downstream proteins. To date, it has been known that PYR/PYL/RCARs play a role in recognizing ABA as ABA receptors. When the receptor recognizes ABA, it promotes the expression of specific genes and the activation of ion channels through phosphorylation of target proteins, allowing plants to adapt to unfavorable environments.
오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 매우 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉, 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.Today, as desertification progresses, water shortage is causing major problems in agriculture and the environment, and there is a need to develop plants that can survive and live in dry environments even when using less water. When these technologies are developed and applied to crops, agricultural production is expected to greatly increase. Especially in dry areas, plants with improved desiccation resistance, that is, plants that can reduce transpiration, are advantageous for survival, thereby improving agricultural productivity. Not only can it contribute, but it can also be useful for environmental cleanup in areas where the environment is very dry.
이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.Accordingly, methods to improve the resistance of plants to drying stress are becoming a major research subject, and in this regard, research is being conducted on genes related to drying stress tolerance and growth promotion and transgenic plants, but is still insufficient. .
본 발명자들은 고추 녹광 품종의 JAZ 유전자 중 탈수 및 ABA(abscisic acid) 처리에 대해 가장 높게 발현된 CaJAZ1-03 유전자를 분리 동정하였으며, 상기 유전자를 억제한 고추 식물에 ABA 또는 건조 스트레스를 주었을 때 저항성이 증진됨에 따라, CaJAZ1-03 유전자가 비생물적 스트레스 저항성 기전에서 음성 조절자 (negative regulator)로서 기능함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors isolated and identified the CaJAZ1-03 gene, which was the most highly expressed in response to dehydration and ABA (abscisic acid) treatment, among the JAZ genes of pepper green light varieties, and showed resistance when ABA or drying stress was applied to pepper plants suppressing the above gene. As a result, the present invention was completed by identifying that the CaJAZ1-03 gene functions as a negative regulator in the abiotic stress resistance mechanism.
이에, 본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자(negative regulator)인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 단백질을 제공하는 것이다.Accordingly, the purpose of the present invention is to provide CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is a negative regulator for drying stress.
본 발명의 다른 목적은 상기 CaJAZ1-03 단백질을 암호화하는 CaJAZ1-03 유전자를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide the CaJAZ1-03 gene encoding the CaJAZ1-03 protein.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CaJAZ1-03 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant vector containing the CaJAZ1-03 gene.
본 발명의 또 다른 목적은 CaJAZ1-03(Capsicum annuum SnRK2.6-interacting protein phosphatase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for improving drought stress resistance in plants, which includes an expression or activity inhibitor of CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum SnRK2.6-interacting protein phosphatase 1) protein as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for enhancing drought stress resistance in plants, comprising the step of inhibiting the expression or activity of CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. .
본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a transgenic plant with improved drought stress resistance by the method for improving the drought stress resistance of the plant.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 단백질을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
또한, 본 발명은 상기 CaJAZ1-03 단백질을 암호화하는 CaJAZ1-03 유전자를 제공한다.Additionally, the present invention provides a CaJAZ1-03 gene encoding the CaJAZ1-03 protein.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CaJAZ1-03 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the CaJAZ1-03 gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 CaJAZ1-03 유전자는 고추로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the CaJAZ1-03 gene can be isolated from pepper, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 상기 CaJAZ1-03 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.Additionally, the present invention provides a recombinant vector containing the CaJAZ1-03 gene.
또한, 본 발명은 CaJAZ1-03(Capsicum annuum SnRK2.6-interacting protein phosphatase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for enhancing drought stress resistance in plants, comprising an expression or activity inhibitor of CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum SnRK2.6-interacting protein phosphatase 1) protein as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CaJAZ1-03 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the CaJAZ1-03 protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for enhancing drought stress resistance in plants, comprising the step of inhibiting the expression or activity of CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transgenic plant with improved drought stress resistance by the method for improving the drought stress resistance of the plant.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the transgenic plant may be pepper or Arabidopsis thaliana, but is not limited thereto.
본 발명자들은 건조 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 단백질을 암호화하는 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 유전자를 동정하였다. CaJAZ1-03 단백질은 ABA 신호전달의 음성 조절자로 기능하며, 상기 CaJAZ1-03 유전자가 침묵된 식물체에서는 건조 스트레스에 대한 저항성이 증진되는 효과를 확인하였는바, CaJAZ1-03 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.The present inventors identified the CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) gene, which encodes a protein that regulates resistance to drying stress. The CaJAZ1-03 protein functions as a negative regulator of ABA signaling, and the effect of improving resistance to drying stress was confirmed in plants in which the CaJAZ1-03 gene is silenced. By regulating the expression of the CaJAZ1-03 gene, humans can It can be used to improve available crops, and is expected to be especially useful in improving plant productivity.
도 1은 CaJAZ 단백질의 계통수 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 고추 JAZ 유전자(CA00g07330, CA03g31030, CA06g14160, CA08g01700, CA09g17240, CA03g35330, 및 CA00g48500)의 도메인 구성을 나타낸 도면이다.
도 2b는 비생물적 스트레스(탈수, ABA, 및 NaCl) 처리 후, 고추 JAZ 유전자(CA00g07330, CA03g31030, CA06g14160, CA08g01700, CA09g17240, CA03g35330, 및 CA00g48500)의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (*P < 0.05, **P < 0.01, 이하 동일).
도 2c는 고추의 잎, 줄기, 꽃, 및 뿌리에서 고추 JAZ 유전자(CA00g07330, CA03g31030, CA06g14160, CA08g01700, CA09g17240, CA03g35330, 및 CA00g48500)의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 고추 JAZ 단백질(CA00g07330, CA03g31030, CA06g14160, CA08g01700, CA09g17240, CA03g35330, 및 CA00g48500)의 세포 내 위치를 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (흰색 바=10 μM).
도 4a는 CaJAZ1-03-침묵(TRV2:CaJAZ1-03) 고추 식물에서 RT-PCR을 이용하여 CaJAZ1-03 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4b는 CaJAZ1-03-침묵(TRV2:CaJAZ1-03) 고추 식물의 건조 민감성에 대한 표현형 및 생존율을 나타낸 도면이다.
도 4c는 CaJAZ1-03-침묵(TRV2:CaJAZ1-03) 고추 식물의 증산(Transpirational) 수분 손실을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4d는 ABA 농도별 CaJAZ1-03-침묵(TRV2:CaJAZ1-03) 고추 식물의 기공 구멍 크기를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4e는 ABA 처리 후 CaJAZ1-03-침묵(TRV2:CaJAZ1-03) 고추 식물의 잎 온도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 CaJAZ1-03-OX 애기장대에서 RT-PCR을 이용하여 CaJAZ1-03 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 ABA 처리 후 CaJAZ1-03-OX 애기장대에서 종자 발아율을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 ABA 처리 후 CaJAZ1-03-OX 애기장대에서 자엽 녹화율을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6c는 ABA 처리 후 발아 단계의 CaJAZ1-03-OX 애기장대의 일차 뿌리 길이를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6d는 ABA 처리 후 발아 후 단계의 CaJAZ1-03-OX 애기장대의 뿌리 길이를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6e는 CaJAZ1-03-OX 애기장대의 건조 민감성에 대한 표현형 및 생존율을 나타낸 도면이다.
도 6f는 CaJAZ1-03-OX 애기장대에서 증산(Transpirational) 수분 손실을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6g는 CaJAZ1-03-OX 애기장대의 잎 온도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a는 탈수(상단) 또는 ABA(하단) 처리된 고추 식물 잎에서 CaJAZ1-03 단백질에 대한 무세포 분해 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b는 MG132 처리 유무에 따른 Nicotiana benthamiana 표피 세포에서 CaJAZ1-03-GFP 융합 단백질의 세포 내 위치를 확인한 결과를 나타낸 도면이다 (스케일 바=10 μm).
도 8a는 CaJAZ1-03 및 CaASRF1의 효모 단백질 잡종 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 8b는 GST-CaJAZ1-03 및 MBP-CaASRF1 융합 단백질의 시험관 내 풀-다운 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 8c는 CaASRF1과 CaJAZ1-03 사이의 상호작용을 확인하기 위한 루시퍼라아제 상보성 이미징 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 8d는 CaJAZ1-03 및 CaASRF1의 이분자 형광 상보성 분석 결과를 나타낸 도면이다 (스케일 바=10 μM).
도 9a는 CaASRF1에 의한 CaJAZ1-03의 시험관 내 유비퀴틴화 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 9b는 CaASRF1-침묵(TRV2:CaASRF1) 고추 식물에 대한 무세포 분해 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 9c는 CaASRF1-OX 애기장대에 대한 무세포 분해 분석 결과를 나타낸 도면이다.Figure 1 is a diagram showing the results of phylogenetic tree analysis of the CaJAZ protein.
Figure 2a is a diagram showing the domain structure of pepper JAZ genes ( CA00g07330 , CA03g31030 , CA06g14160 , CA08g01700 , CA09g17240 , CA03g35330, and CA00g48500 ).
Figure 2b is a diagram showing the results of confirming the expression level of pepper JAZ genes ( CA00g07330 , CA03g31030 , CA06g14160 , CA08g01700 , CA09g17240 , CA03g35330, and CA00g48500 ) after treatment with abiotic stress (dehydration, ABA, and NaCl) (*P < 0.05, **P < 0.01, same hereinafter).
Figure 2c is a diagram showing the results of confirming the expression levels of pepper JAZ genes ( CA00g07330 , CA03g31030 , CA06g14160 , CA08g01700 , CA09g17240 , CA03g35330, and CA00g48500 ) in pepper leaves, stems, flowers, and roots.
Figure 3 is a diagram showing the results of confirming the intracellular location of pepper JAZ proteins (CA00g07330, CA03g31030, CA06g14160, CA08g01700, CA09g17240, CA03g35330, and CA00g48500) (white bar = 10 μM).
Figure 4a is a diagram showing the results of confirming CaJAZ1-03 expression in CaJAZ1-03 -silenced (TRV2: CaJAZ1-03 ) pepper plants using RT-PCR.
Figure 4b is a diagram showing the phenotype and survival rate for drying sensitivity of CaJAZ1-03 -silenced (TRV2: CaJAZ1-03 ) pepper plants.
Figure 4c is a diagram showing the results of measuring transpirational water loss of CaJAZ1-03 -silent (TRV2: CaJAZ1-03 ) pepper plants.
Figure 4d is a diagram showing the results of measuring the pore size of CaJAZ1-03 -silent (TRV2: CaJAZ1-03 ) pepper plants by ABA concentration.
Figure 4e is a diagram showing the results of confirming the leaf temperature of CaJAZ1-03 -silenced (TRV2: CaJAZ1-03 ) pepper plants after ABA treatment.
Figure 5 is a diagram showing the results of confirming CaJAZ1-03 expression in CaJAZ1-03 -OX Arabidopsis thaliana using RT-PCR.
Figure 6a is a diagram showing the results of confirming the seed germination rate in CaJAZ1-03 -OX Arabidopsis thaliana after ABA treatment.
Figure 6b is a diagram showing the results of confirming the cotyledon greening rate in CaJAZ1-03 -OX Arabidopsis thaliana after ABA treatment.
Figure 6c is a diagram showing the results of confirming the primary root length of CaJAZ1-03 -OX Arabidopsis thaliana at the germination stage after ABA treatment.
Figure 6d is a diagram showing the results of confirming the root length of CaJAZ1-03 -OX Arabidopsis thaliana in the post-germination stage after ABA treatment.
Figure 6e is a diagram showing the phenotype and survival rate for desiccation sensitivity of CaJAZ1-03 -OX Arabidopsis thaliana.
Figure 6f is a diagram showing the results of measuring transpirational water loss in CaJAZ1-03 -OX Arabidopsis thaliana.
Figure 6g is a diagram showing the results of checking the leaf temperature of CaJAZ1-03 -OX Arabidopsis thaliana.
Figure 7a is a diagram showing the results of cell-free degradation analysis of CaJAZ1-03 protein in dehydrated (top) or ABA (bottom) treated pepper plant leaves.
Figure 7b is a diagram showing the results of confirming the intracellular location of the CaJAZ1-03-GFP fusion protein in Nicotiana benthamiana epidermal cells with or without MG132 treatment (scale bar = 10 μm).
Figure 8a is a diagram showing the results of yeast protein hybrid analysis of CaJAZ1-03 and CaASRF1.
Figure 8b is a diagram showing the results of in vitro pull-down analysis of GST-CaJAZ1-03 and MBP-CaASRF1 fusion proteins.
Figure 8c is a diagram showing the results of luciferase complementation imaging analysis to confirm the interaction between CaASRF1 and CaJAZ1-03.
Figure 8d is a diagram showing the results of bimolecular fluorescence complementation analysis of CaJAZ1-03 and CaASRF1 (scale bar = 10 μM).
Figure 9a is a diagram showing the results of in vitro ubiquitination analysis of CaJAZ1-03 by CaASRF1.
Figure 9b is a diagram showing the results of cell-free degradation analysis for CaASRF1-silenced (TRV2: CaASRF1 ) pepper plants.
Figure 9c is a diagram showing the results of cell-free degradation analysis for CaASRF1 -OX Arabidopsis thaliana.
식물은 극한의 환경 조건에서도 생존을 위한 방어 메커니즘을 발전시켜 왔으며, 특히 앱시스산(abscisic acid; ABA)은 환경 스트레스에 대한 적응과 관련된 주요 식물 호르몬으로 알려져 있다. 본 발명자들은 고추 유래 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 유전자를 분리하였고, 상기 유전자를 침묵시킨 형질전환 고추 식물에서 건조 스트레스에 대한 저항성 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Plants have developed defense mechanisms for survival even in extreme environmental conditions, and abscisic acid (ABA), in particular, is known to be a major plant hormone involved in adaptation to environmental stress. The present inventors isolated the CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) gene from pepper and completed the present invention by confirming increased resistance to drying stress in transgenic pepper plants in which the gene was silenced.
이에, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자인, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) 단백질 및 이를 암호화하는 CaJAZ1-03 유전자를 제공한다.Accordingly, the present invention provides the CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is a negative regulator for drying stress, and the CaJAZ1-03 gene encoding the same.
본 발명의 유전자인 CaJAZ1-03은 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaJAZ1-03 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. CaJAZ1-03 , the gene of the present invention, preferably consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2, and the protein encoded by the CaJAZ1-03 gene may preferably consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is limited thereto. That is not the case.
본 발명의 유전자인 CaJAZ1-03은 고추로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. CaJAZ1-03 , the gene of the present invention, may be isolated from pepper, but is not limited thereto.
본 명세서에서 "음성 조절인자(positive regulator) 또는 음성 조절자"란 생명현상 조절에서 억제방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaJAZ1-03은 건조 스트레스에 대한 조절에서 억제하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하고, 이로 인해, CaJAZ1-03 유전자가 과발현되는 경우, ABA 민감도 감소 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소될 수 있다.As used herein, “positive regulator or negative regulator” refers to a protein that acts in an inhibitory direction in regulating biological phenomena. That is, CaJAZ1-03 , the gene of the present invention, encodes a protein that has an inhibitory function in the control of drying stress, and as a result, when the CaJAZ1-03 gene is overexpressed, ABA sensitivity and resistance to drying stress are reduced. It can be.
본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, 고추 JAZ 유전자 중 하나인 CaJAZ1-03을 동정하였고, 앱시스산(ABA)의 민감도가 증가할수록 기공 폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스산 또는 건조 스트레스와 CaJAZ1-03 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.While researching genes involved in the desiccation stress response, the present inventors identified CaJAZ1-03 , one of the pepper JAZ genes, and found that as sensitivity to abscisic acid (ABA) increases, it promotes pore closure and improves desiccation resistance. Based on the fact that it can be done, we attempted to identify the relationship between abscisic acid or desiccation stress and the CaJAZ1-03 gene.
우선, 본 발명의 일 실시예에서는, 7개의 고추 JAZ 유전자 중 탈수 및 ABA에 의해 가장 높게 발현된 CaJAZ1-03 유전자를 분리 및 동정하였다 (실시예 1 참조).First, in one example of the present invention, the CaJAZ1-03 gene, which was most highly expressed by dehydration and ABA among the seven pepper JAZ genes, was isolated and identified (see Example 1).
본 발명의 다른 실시예에서는, CaJAZ1-03의 발현이 저해된 고추 및 정상 대조군 고추 식물의 잎에서 잎 온도, 기공 개도, 증산 수분 손실량, 생존율 등을 측정함으로써 CaJAZ1-03 유전자 침묵에 의한 건조 스트레스 저항성 향상 효과를 확인하였다. 또한, CaJAZ1-03가 과발현된 애기장대 식물의 잎에서 증산 수분 손실량, 생존율, 잎 온도, 발아 및 발아 후 단계에서 뿌리 길이 등을 측정함으로써 CaJAZ1-03이 ABA-매개 건조 반응을 음성적으로 조절함을 확인하였으며, 상기 결과들을 종합하여 CaJAZ1-03이 ABA 신호와 가뭄 스트레스 반응을 음성적으로 조절할 수 있음을 규명하였다 (실시예 2 및 3 참조).In another embodiment of the present invention, drying stress resistance by silencing the CaJAZ1-03 gene was measured by measuring leaf temperature, stomatal opening, transpiration water loss, survival rate, etc. in the leaves of pepper plants in which CaJAZ1-03 expression was inhibited and normal control pepper plants. The improvement effect was confirmed. In addition, by measuring transpiration water loss, survival rate, leaf temperature, and root length in the germination and post-germination stages in the leaves of Arabidopsis plants overexpressing CaJAZ1-03 , we found that CaJAZ1-03 negatively regulates the ABA-mediated desiccation response. This was confirmed, and by combining the above results, it was found that CaJAZ1-03 can negatively regulate ABA signaling and drought stress response (see Examples 2 and 3).
본 발명의 또 다른 실시예서는 건조 또는 ABA 처리된 고추 잎을 이용하여 무세포 분해 분석 결과 건강한 잎과 비교하여 탈수 또는 ABA 처리된 고추 잎에서 CaJAZ1-03이 더 빨리 분해되며, MG132를 처리할 경우 CaJAZ1-03 단백질 분해가 억제되 것을 확인함으로써 CaJAZ1-03 단백질 안정성이 26S 프로테아좀 경로에 의해 조절되는 것을 확인하였다 (실시예 4 참조).In another embodiment of the present invention, cell-free degradation analysis using dried or ABA-treated pepper leaves showed that CaJAZ1-03 was decomposed faster in dehydrated or ABA-treated pepper leaves compared to healthy leaves, when treated with MG132. By confirming that CaJAZ1-03 protein degradation was inhibited, it was confirmed that CaJAZ1-03 protein stability is regulated by the 26S proteasome pathway (see Example 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 루리퍼라아제 상보성 이미징 및 이분자 형광 상보성 분석을 통해, CaJAZ1-03 단백질이 고추 RING형 E3 리가제 CaASRF1과 상호작용한다는 것을 확인하였다 (실시예 5 참조).In another example of the present invention, it was confirmed through luliperase complementation imaging and bimolecular fluorescence complementation analysis that the CaJAZ1-03 protein interacts with the pepper RING-type E3 ligase CaASRF1 (see Example 5).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 CaASRF1이 침묵된 고추와 CaASRF1-OX 애기장대를 사용한 무세포 분해 분석 결과 CaASRF1이 CaJAZ1-03을 다중유비퀴틴화하고 유비퀴틴-26S 프로테아좀 시스템을 통해 CaJAZ1-03의 분해에 관여함을 확인하였으며, 이로부터 CaJAZ1-03의 안정성이 CaASRF1에 의해 조절됨을 규명하였다 (실시예 6 참조).In another embodiment of the present invention, cell-free degradation analysis using CaASRF1-silenced pepper and CaASRF1-OX Arabidopsis showed that CaASRF1 polyubiquitinated CaJAZ1-03 and degraded CaJAZ1-03 through the ubiquitin-26S proteasome system. It was confirmed that the stability of CaJAZ1-03 is regulated by CaASRF1 (see Example 6).
바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 기술인 VIGS(virus-induced gene silencing)는 바이러스 유도 RNA 침묵(virus-induced RNA silencing)이라고도 불린다. 다양한 식물과 진균, 곤충류, 선충류, 어류, 쥐 등에서 잘 알려진 전사 후 유전자 침묵 현상의 일종으로 바이러스가 식물체에 침입하여 복제하는 과정에서 감염 식물체에 바이러스 유전체와 상동성이 있는 내성유전자가 발현될 때 내성유전자와 바이러스 유전체의 발현과 복제가 함께 억제되는 현상이라고 할 수 있다. 즉, 바이러스 게놈의 cDNA에 기주에서 유래된 특정 유전자의 일부 혹은 전체를 삽입하고 감염성 RNA로 제작하여 식물체에 감염시키면, 상응하는 기주의 RNA가 목표가 되어, 감염된 기주 식물체에서는 목적 유전자의 발현이 억제되거나 소실된다. 그 결과 목적 유전자의 기능을 간접적으로 추정할 수 있다. 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 기작은 바이러스에 대항하여 RNA가 매개하는 식물 방어 기작의 일종이라고 알려져 있으며, 1) 전사 후 유전자 침묵 2) RNA 전환 3) 뉴클레오티드 서열 특이성이라는 특징을 가진다.VIGS (virus-induced gene silencing), a gene silencing technology induced by a virus, is also called virus-induced RNA silencing. It is a type of post-transcriptional gene silencing phenomenon that is well known in various plants, fungi, insects, nematodes, fish, mice, etc. Resistance occurs when a resistance gene homologous to the viral genome is expressed in the infected plant during the process of virus invasion and replication in the plant. It can be said to be a phenomenon in which the expression and replication of genes and viral genomes are suppressed together. In other words, if part or all of a specific gene derived from the host is inserted into the cDNA of the viral genome and made into infectious RNA to infect a plant, the corresponding host RNA becomes the target, and the expression of the target gene is suppressed or suppressed in the infected host plant. It disappears. As a result, the function of the target gene can be indirectly estimated. Virus-induced gene silencing (VIGS) is known to be a type of RNA-mediated plant defense mechanism against viruses, and has the following characteristics: 1) post-transcriptional gene silencing, 2) RNA conversion, and 3) nucleotide sequence specificity.
본 발명에서는, CaJAZ1-03 유전자 중 일부를 삽입한 VIGS용 형질전환 벡터 TRV(Tobacco Rattle Virus)를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 삽입하고, 상기 아그로박테리움을 식물체에 침투시킴으로써 CaJAZ1-03 유전자의 발현을 성공적으로 억제한 바 있다.In the present invention, the transformation vector TRV (Tobacco Rattle Virus) for VIGS into which part of the CaJAZ1-03 gene is inserted is inserted into Agrobacterium, and the Agrobacterium is infiltrated into the plant to express the CaJAZ1-03 gene. has been successfully suppressed.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CaJAZ1-03 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.In another aspect of the present invention, the present invention provides a recombinant vector containing the CaJAZ1-03 gene.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.As used herein, the term "recombinant" refers to a cell replicating a heterologous nucleic acid, expressing the nucleic acid, or expressing a peptide, a heterologous peptide, or a protein encoded by a heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene segments that are not found in the natural form of the cell, either in sense or antisense form. Additionally, recombinant cells can express genes found in cells in their natural state, but the genes have been modified and reintroduced into the cells by artificial means.
상기 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래 될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. The term “vector” is used to refer to a DNA fragment(s) or nucleic acid molecule that is delivered into a cell. Vectors replicate DNA and can reproduce independently in host cells. A preferred example of a recombinant vector in the present invention may be a plasmid vector, pTRV1 or pTRV2, which can transfer a part of itself to a plant cell when present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens , but is limited thereto. However, other suitable vectors that can be used to introduce the DNA according to the present invention into a plant host include viruses such as those that may be derived from double-stranded plant viruses (e.g., CaMV) and single-stranded viruses, geminiviruses, etc. Vectors may be selected from, for example, non-tactile plant virus vectors. The vector can be advantageously used when it is difficult to properly transform a plant host.
상기 용어 "재조합 벡터" 또는 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.The terms “recombinant vector” or “recombinant expression vector” mean a bacterial plasmid, phage, yeast plasmid, plant cell virus, mammalian cell virus, or other vector. Broadly speaking, any plasmid and vector can be used as long as it can replicate and stabilize within the host. Important characteristics of the expression vector are that it has an origin of replication, a promoter, a marker gene, and a translation control element.
상기 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.An expression vector containing the above gene sequence and appropriate transcription/translation control signals can be constructed by methods well known to those skilled in the art. The methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis technology, and in vivo recombinant technology. The DNA sequence can be effectively linked to an appropriate promoter within an expression vector to drive mRNA synthesis. The expression vector may also include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.
발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Expression vectors may include one or more selectable markers. The marker is a nucleic acid sequence that has characteristics that can be generally selected by chemical methods, and includes all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol. There is a resistance gene, but it is not limited to this.
또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다.Additionally, in the recombinant vector of the present invention, the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS, or histone promoter, but is not limited thereto. The term "promoter" refers to the region of DNA upstream from a structural gene and refers to the DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. A “plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental states or cell differentiation.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.In the recombinant vector of the present invention, common terminators can be used, examples of which include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium tumefaciens ), but is not limited to the terminator of the Octopine gene. Regarding the necessity of terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily require a regeneration and/or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species including both monocots as well as dicots. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Methods include the calcium/polyethylene glycol method for protoplasts, electroporation of protoplasts, microinjection into plant elements, particle bombardment (DNA or RNA-coated) of various plant elements, invasion of plants or characterization of mature pollen or spores. It can be appropriately selected from Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer by conversion, infection by (non-complete) virus (EP 0 301 316), etc. A preferred method according to the invention involves Agrobacterium mediated DNA transfer.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaJAZ1-03 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for enhancing drought stress resistance in plants, comprising an expression or activity inhibitor of the CaJAZ1-03 protein as an active ingredient.
상기 억제제는 CaJAZ1-03 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CaJAZ1-03 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드(Peptide), 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 항체, 또는 앱타머(aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The inhibitor is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), and miRNA that binds complementary to the sequence of the CaJAZ1-03 gene, a sequence complementary to the sequence, or mRNA for a fragment of the gene sequence to inhibit expression. It is preferably one of (microRNA), ribozyme, DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), and antisense nucleotide, and a peptide, a compound that binds complementary to the CaJAZ1-03 protein and inhibits its activity. Peptide minetics, antibodies, or aptamers are preferred, but are not limited thereto.
본 발명의 조성물에서, 상기 CaJAZ1-03 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the composition of the present invention, the CaJAZ1-03 protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaJAZ1-03 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다. 상기 CaJAZ1-03 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계는 전술한 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, DNAzyme, PNA, 안티센스 뉴클레오티드, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 항체, 또는 앱타머 등을 이용하여 제한 없이 이루어질 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 바이러스에 의해 유도되는 유전자 침묵 기술인 VIGS(virus-induced gene silencing)를 이용하여 상기 CaJAZ1-03 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In another aspect of the present invention, the present invention provides a method for enhancing drought stress resistance in plants, comprising the step of inhibiting the expression or activity of the CaJAZ1-03 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The step of inhibiting the expression or activity of the CaJAZ1-03 protein is performed using the above-described siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA, antisense nucleotide, compound, peptide, peptide mimetics, antibody, or aptamer. This can be done without limitation, and according to one embodiment of the present invention, the expression or activity of the CaJAZ1-03 protein can be suppressed using VIGS (virus-induced gene silencing), a gene silencing technology induced by a virus. Not limited.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.In another aspect of the present invention, the present invention provides a transgenic plant with improved drought stress resistance by the above method.
본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the plants (sieves) include food crops including rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, and sorghum; Vegetable crops including Arabidopsis thaliana, Chinese cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot; Specialty crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugarcane, sugar beet, perilla, peanut, and rapeseed; Fruit trees including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, persimmons, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots, and bananas; Flowers including roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies, and tulips; and feed logistics including ryegrass, red clover, orchard grass, alfalfa, tall fescue, and perennial ryegrass, most preferably Arabidopsis thaliana or pepper, but is not limited thereto.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Below, preferred embodiments are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided only to make the present invention easier to understand, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
[실험방법][Experimental method]
1. 식물 재료1. Plant material
Arabidopsis thaliana(ecotype Col-0)의 종자를 2일 동안 4℃에서 춘화처리(vernalization) 후 16시간 명/8시간 암주기로 24℃의 챔버에서 성장시켰다. 고추(Capsicum annuum L. cv. Nockwang) 종자를 29℃의 암실에서 5일 동안 발아시켰다. 담배(Nicotiana benthamiana) 종자와 애기장대 및 고추 묘목을 증기 멸균한 퇴비 토양 혼합물(피트 모스(peat moss), 펄라이트(perlite), 버미큘라이트(vermiculite), 5:3:2, v/v/v)과 모래 및 양토 토양(1:1:1, v/v/v)에 심고, 백색 형광(130 μmol photons m-2 sec-1) 하에 상대 습도 60%, 24℃로 유지하였다. Seeds of Arabidopsis thaliana (ecotype Col-0) were vernalized at 4°C for 2 days and then grown in a chamber at 24°C with a 16-hour light/8-hour dark cycle. Pepper ( Capsicum annuum L. cv. Nockwang) seeds were germinated in a dark room at 29°C for 5 days. Steam-sterilized compost soil mixture (peat moss, perlite, vermiculite, 5:3:2, v/v/v) of tobacco ( Nicotiana benthamiana ) seeds, Arabidopsis thaliana and pepper seedlings. They were planted in sand and loam soil (1:1:1, v/v/v) and maintained at 24°C at 60% relative humidity under white fluorescence (130 μmol photons m -2 sec -1 ).
2. 효모 단백질 잡종 분석(Yeast two-hybrid assay, Y2H)2. Yeast two-hybrid assay (Y2H)
CaJAZ1-03의 전장 코딩 영역을 먹이 단백질(prey)로 pGADT7 벡터에 클로닝(clonig)하였고, CaASRF1을 미끼 단백질(bait)로 pGBKT7 벡터에 삽입하였다. 상기 벡터들을 리튬 아세테이트 방법(lithium acetate method, Ito et al., 1983)을 사용하여 효모 AH109 균주로 형질전환하였다. CaJAZ1-03과 CaASRF1 간의 상호작용을 확인하기 위해, 상기 벡터 작제물을 운반하는 AH109 세포를 선별 배지(SC-adenine-histidine-leucine-tryptophan [-AHLW] 배지)에서 선별하였다.The full-length coding region of CaJAZ1-03 was cloned into the pGADT7 vector as a prey protein (prey), and CaASRF1 was inserted into the pGBKT7 vector as a bait protein. The vectors were transformed into yeast AH109 strain using the lithium acetate method (Ito et al., 1983). To confirm the interaction between CaJAZ1-03 and CaASRF1 , AH109 cells carrying the vector construct were selected in selection medium (SC-adenine-histidine-leucine-tryptophan [-AHLW] medium).
3. 이분자 형광 상보성 분석(bimolecular fluorescence complementation assay; BiFC)3. Bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC)
BiFC 분석을 위해, 정지 코돈이 없는 CaJAZ1-03 및 CaASRF1의 전장 코딩 영역을 각각 35S-VYNE 및 35S-CYCE 벡터에 삽입하였다 (Waadt et al., 2008). 일시적인 발현을 위해, 이러한 벡터 작제물을 운반하는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101을 N. benthamiana 잎의 배축면(abaxial side)에 p19(1:1:1 비율; OD600 = 0.5)와 함께 침투시켰다. 아그로침투(agroinfiltration) 3일 후, 공초점 현미경으로 형광 신호를 분석하였다.For BiFC analysis, the full-length coding regions of CaJAZ1-03 and CaASRF1 without stop codons were inserted into the 35S-VYNE and 35S-CYCE vectors, respectively (Waadt et al., 2008). For transient expression, Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 carrying these vector constructs was infiltrated into the abaxial side of N. benthamiana leaves together with p19 (1:1:1 ratio; OD 600 = 0.5). After 3 days of agroinfiltration, the fluorescence signal was analyzed by confocal microscopy.
4. 4. CaJAZ1-03CaJAZ1-03 -과발현 형질전환 애기장대 식물의 제조-Manufacture of overexpression transgenic Arabidopsis plants
CaJAZ1-03-과발현(OX) 형질전환 애기장대 식물을 제조하기 위해, CaJAZ1-03의 전장 코딩 영역을 pENTR/D-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하였다. Pro35S-CaJAZ1-03 작제물은 pGWB15 바이너리(binary) 벡터를 사용하여 LR 반응을 통해 생산하였으며, A. tumefaciens 균주 GV3101로 형질전환하였다 (Yoon et al., 2022). 그런 다음, 이 작제물을 플로랄 딥 방법(floral dip method, Clough and Bent, 1998)을 사용하여 애기장대로 형질전환하였다. CaJAZ1-03-OX 식물을 선별하기 위해, 종자는 50 μg/ml 카나마이신(kanamycin)을 포함한 MS 고체 배지에서 성장시켰다.To prepare CaJAZ1-03 -overexpression (OX) transgenic Arabidopsis plants, the full-length coding region of CaJAZ1-03 was cloned into the pENTR/D-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The Pro35S- CaJAZ1-03 construct was produced through an LR reaction using the pGWB15 binary vector and transformed into A. tumefaciens strain GV3101 (Yoon et al., 2022). This construct was then transformed into Arabidopsis thaliana using the floral dip method (Clough and Bent, 1998). To select CaJAZ1-03 -OX plants, seeds were grown on MS solid medium containing 50 μg/ml kanamycin.
5. 풀-다운(Pull-down) 분석5. Pull-down analysis
풀-다운 분석을 위해, 5μg의 GST-표지된 CaJAZ1-03 단백질과 5μg의 MBP 또는 MBP-표지된 CaASRF1을 0.5mL 결합 완충액(20mM Tris-HCl [pH 7.5], 200mM NaCl, 1mM EDTA, 및 0.5% Tween-20)에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 풀-다운된 단백질을 60μl 3×SDS-샘플 완충액(150mM Tris-HCl [pH 6.8], 6% SDS, 30% glycerol, 0.003% bromophenol blue G-250, 15% β-mercaptoethanol)과 함께 97℃에서 5분간 끓인 후 SDS-PAGE에 사용하였다. 면역 블롯(Immunoblot) 분석은 항-GST(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, 1:1000) 및 항-MBP(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA, 1:10000) 항체를 사용하여 수행하였다.For pull-down assays, 5 μg of GST-labeled CaJAZ1-03 protein and 5 μg of MBP or MBP-labeled CaASRF1 were incubated in 0.5 mL binding buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 0.5 μg of CaJAZ1-03 protein). % Tween-20) at 4°C for 2 hours. The pulled-down proteins were incubated with 60 μl 3×SDS-sample buffer (150 mM Tris-HCl [pH 6.8], 6% SDS, 30% glycerol, 0.003% bromophenol blue G-250, 15% β-mercaptoethanol) at 97°C. After boiling for 5 minutes, it was used for SDS-PAGE. Immunoblot analysis was performed using anti-GST (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, 1:1000) and anti-MBP (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA, 1:10000) antibodies. did.
6. 루시퍼라아제 상보성 이미징(Luciferase complementation imaging; LCI) 분석6. Luciferase complementation imaging (LCI) analysis
CaASRF1과 CaJAZ1-03 간의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위해, N. benthamiana 잎으로 LCI 분석을 수행하였다. 각 유전자의 전장 코딩 서열을 루시퍼라제 리포터 유전자 LUC의 N- 및 C- 말단 부분에 클로닝하였다. 일시적인 발현을 위해, 각 벡터 작제물을 운반하는 A. tumefaciens 균주 GV3101을 잎의 배축면에 침투시켰다 (각 작제물은 p19 균주와 함께 침투됨; OD600 = 0.5, 비율 1:1:1). 72시간 후, 침투된 잎을 NightSHADE LB 985(Berthold, Bad Wildbad, Germany)를 사용하여 LUC 활성에 대해 분석하였다.To confirm the protein-protein interaction between CaASRF1 and CaJAZ1-03, LCI analysis was performed with N. benthamiana leaves. The full-length coding sequence of each gene was cloned into the N- and C-terminal portions of the luciferase reporter gene LUC . For transient expression, A. tumefaciens strain GV3101 carrying each vector construct was infiltrated into the abaxial side of leaves (each construct was co-infiltrated with strain p19; OD 600 = 0.5, ratio 1:1:1). After 72 hours, infiltrated leaves were analyzed for LUC activity using NightSHADE LB 985 (Berthold, Bad Wildbad, Germany).
7. ABA, 탈수(dehydration), 및 NaCl 처리7. ABA, dehydration, and NaCl treatment
고추 식물에서 CaJAZ1 동족체(homologs)의 발현 수준을 조사하기 위해, six-leaf stage의 고추에 ABA(100 μM) 및 NaCl(200 mM)을 처리하고, 탈수 처리를 위해 첫 번째와 두 번째 잎을 떼어냈다. 잎은 독립적으로 처리하고 0, 3, 및 9시간 후에 샘플링하였다.To investigate the expression level of CaJAZ1 homologs in pepper plants, six-leaf stage peppers were treated with ABA (100 μM) and NaCl (200 mM), and the first and second leaves were removed for dehydration treatment. paid it Leaves were treated independently and sampled after 0, 3, and 9 hours.
8. RNA 분리 및 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(quantitative real time-reverse transcription polymerase chain reaction; q-RT-PCR)8. RNA isolation and quantitative real time-reverse transcription polymerase chain reaction (q-RT-PCR)
TRIzol 시약을 사용하여 고추 잎에서 총 RNA를 분리하였다. 얻어진 RNA는 Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader를 사용하여 정량화하고, iScript™cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 총 RNA 1μg을 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 FX96 Touch™Real-Time PCR detection system (Bio-Rad) 및 iQ™ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 특정 프라이머와 함께 증폭하였다 (Lim and Lee, 2021). 프라이머는 표 1에 나타내었다. 내부 대조군으로는 고추 Actin1 (CaACT1)을 사용하였다.Total RNA was isolated from pepper leaves using TRIzol reagent. The obtained RNA was quantified using Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader, and cDNA was synthesized using 1 μg of total RNA using the iScript™cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). cDNA was amplified with specific primers using the FX96 Touch™ Real-Time PCR detection system (Bio-Rad) and iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) (Lim and Lee, 2021). Primers are shown in Table 1. Pepper Actin1 ( CaACT1 ) was used as an internal control.
9. 세포 내 위치 분석(Subcellular localization)9. Subcellular localization
정지 코돈이 없는 CaJAZ1-03의 전장 코딩 영역을 GFP-융합 바이너리 벡터 p326GFP에 클로닝하였다. 균주 p19와 함께 GFP(green fluorescent protein)-CaJAZ1-03 작제물을 운반하는 A. tumefaciens의 GV3101 균주를 사용하였다 (각 균주, OD600 = 0.5, 1:1 비율). 침투 2일 후, 공초점 현미경을 사용하여 GFP 신호를 검출하였다.The full-length coding region of CaJAZ1-03 without stop codon was cloned into the GFP-fusion binary vector p326GFP. Strain GV3101 of A. tumefaciens carrying the green fluorescent protein (GFP) -CaJAZ1-03 construct was used along with strain p19 (each strain, OD 600 = 0.5, 1:1 ratio). Two days after infiltration, GFP signals were detected using confocal microscopy.
10. 무세포 분해 분석(Cell-free degradation assay)10. Cell-free degradation assay
무세포 분해 분석을 수행하기 위해, 추출 완충액(25mM Tris-HCl [pH 7.5], 10mM MgCl2, 5mM dithiothreitol, 0.1% Triton X-100, 10mM ATP, 및 10mM NaCl)을 사용하여 탈수 및 100-μM-ABA 처리된 4주령 고추 식물로부터 조 추출물(crude extract)을 제조하였다. GST-CaJAZ1-03 단백질(500ng)을 MG132와 함께 또는 MG132 없이 조 추출물(총 단백질 50μg)과 함께 0, 60, 90, 120분 동안 인큐베이션 하였다. 그런 다음, 단백질 분해를 평가하기 위해 항-GST 항체로 면역블롯 분석을 수행하였다. CaASRF1을 사용한 무세포 분해 분석을 위해, 추출 완충액(25mM Tris-HCl [pH 7.5], 10mM MgCl2, 5mM dithiothreitol, 0.1% Triton X-100, 10mM ATP, 10mM NaCl)을 사용하여 CaASRF1-침묵 고추 또는 CaASRF1-OX 애기장대 식물의 잎으로부터 조 단백질을 추출하였다. 조 추출물 샘플(50 μg)을 MG132와 함께 또는 MG132 없이 지정된 시간 동안 GST-CaJAZ1-03과 함께 인큐베이션 하였다. 단백질 분해를 평가하기 위해 항-GST를 사용하여 면역 블롯팅을 수행하였다.To perform cell-free lysis assays, dehydrate and 100-μM NaCl using extraction buffer (25mM Tris-HCl [pH 7.5], 10mM MgCl 2 , 5mM dithiothreitol, 0.1% Triton X-100, 10mM ATP, and 10mM NaCl). -Crude extract was prepared from 4-week-old pepper plants treated with ABA. GST-CaJAZ1-03 protein (500 ng) was incubated with the crude extract (50 μg total protein) with or without MG132 for 0, 60, 90, and 120 min. Immunoblot analysis was then performed with anti-GST antibody to assess protein degradation. For cell-free degradation assays using CaASRF1, extraction buffer (25mM Tris-HCl [pH 7.5], 10mM MgCl 2 , 5mM dithiothreitol, 0.1% Triton Crude protein was extracted from leaves of CaASRF1 -OX Arabidopsis plants. Crude extract samples (50 μg) were incubated with GST-CaJAZ1-03 for the indicated times with or without MG132. Immunoblotting was performed using anti-GST to assess protein degradation.
11. 유비퀴틴화 분석(Ubiquitination assay)11. Ubiquitination assay
시험관 내 유비퀴틴화 분석을 위해, 500ng의 GST-CaJAZ1-03을 30μl 반응 완충액에서 재조합 인간 UBE1(Boston Biochemicals, Cambridge, MA, USA) 250ng, 재조합 인간 H5b(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) 250ng, bovine ubiquitin (Sigma-Aldrich) 10μg과 혼합하였다. 30℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 혼합물을 SDS-PAGE에서 분리하고 항-GST(Santa Cruz Biotechnology), 항-MBP(New England Biolabs), 및 항-Ub(Santa Cruz Biotechnology) 항체를 사용하여 면역블롯 분석을 수행하였다.For in vitro ubiquitination assays, 500 ng of GST-CaJAZ1-03 was mixed with 250 ng of recombinant human UBE1 (Boston Biochemicals, Cambridge, MA, USA) and 250 ng of recombinant human H5b (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) in 30 μl reaction buffer. , mixed with 10 μg of bovine ubiquitin (Sigma-Aldrich). After incubation at 30°C for 12 hours, the mixture was separated on SDS-PAGE and immunostained using anti-GST (Santa Cruz Biotechnology), anti-MBP (New England Biolabs), and anti-Ub (Santa Cruz Biotechnology) antibodies. Blot analysis was performed.
12. 식물 표현형(phenotype) 분석12. Plant phenotype analysis
발아를 위해, 야생형 및 CaJAZ1-03-OX 식물 각각의 종자 36개를 다양한 농도의 ABA가 함유된 MS 한천 배지를 포함하는 플레이트에서 재배하였다 (Huong et al., 2022). 건조 스트레스 분석을 수행하기 위해, four-leaf-stage 고추 및 3주된 애기장대를 사용하였다. 고추는 15일 동안, 애기장대는 12일 동안 물을 주지 않았으며, 2일 동안 다시 물을 준 후 생존율을 계산하였다. 증산(transpirational) 수분 손실을 측정하기 위해, 잎을 분리하여 상대 습도 40%의 페트리(Petri) 접시에 두었다. 잎 생중량(fresh weight)은 8시간 동안 한시간 간격으로 측정하였다.For germination, 36 seeds each of wild-type and CaJAZ1-03 -OX plants were grown on plates containing MS agar medium containing various concentrations of ABA (Huong et al., 2022). To perform the desiccation stress analysis, four-leaf-stage pepper and 3-week-old Arabidopsis thaliana were used. Peppers were not watered for 15 days and Arabidopsis thaliana were not watered for 12 days. After watering again for 2 days, the survival rate was calculated. To measure transpirational water loss, leaves were separated and placed in a Petri dish at 40% relative humidity. Leaf fresh weight was measured every hour for 8 hours.
잎 온도를 측정하기 위해, 고추 잎에 100 μM ABA를 처리하였으며, 애기장대 식물에서 잎을 분리하여 실온에 15분 동안 두었다. 열화상(thermal) 이미지는 FLIR Systems T420 infrared camera로 촬영하고, 잎 온도는 FLIR Tools+ ver. 5.13 software를 사용하여 측정하였다.To measure leaf temperature, pepper leaves were treated with 100 μM ABA, and leaves were separated from Arabidopsis plants and left at room temperature for 15 minutes. Thermal images were taken with a FLIR Systems T420 infrared camera, and leaf temperatures were measured using FLIR Tools+ ver. It was measured using 5.13 software.
기공 개도(stomata aperture) 측정을 위해, 고추와 애기장대 잎으로부터 배축(abaxial) 표피를 분리하여 24℃에서 2.5시간 동안 기공 개방 용액(stomatal opening solution(SOS); 50mM KCl, 10mM MES-KOH, 및 10mM CaCl2, pH 6.5)에 샘플을 부유시켰다. ABA-매개 기공 폐쇄를 유도하기 위해, 잎 껍질을 24℃에서 2.5시간 동안 ABA(10 또는 20 μM)와 함께 또는 ABA 없이 SOS에서 추가적으로 인큐베이션 하였다. 기공을 무작위로 선택하여 Nikon Eclipse 80i 현미경으로 촬영하였다.To measure stomata aperture, abaxial epidermis was separated from pepper and Arabidopsis leaves and incubated with stomatal opening solution (SOS) for 2.5 hours at 24°C; 50mM KCl, 10mM MES-KOH, and The sample was suspended in 10mM CaCl 2 , pH 6.5). To induce ABA-mediated stomatal closure, leaf peels were additionally incubated in SOS with or without ABA (10 or 20 μM) for 2.5 h at 24°C. Stomata were randomly selected and photographed using a Nikon Eclipse 80i microscope.
[실시예][Example]
실시예 1. 고추 JAZ 계열의 분리 및 분자 특성Example 1. Isolation and molecular characteristics of pepper JAZ series
이전 연구에서는 JAZ 단백질이 여러 비생물적 스트레스에 대한 적응 반응과 관련이 있다고 보고하였다 (Wu et al., 2015, Fu et al., 2017). 고추 JAZ 유전자를 분리하기 위해, 13개의 애기장대 JAZ 유전자 계열의 아미노산 서열을 쿼리(query)로 사용하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 참조 고추 게놈(Capsicum annuum cv. CM334, version 1.55)에 기초한 BLASTP 검색 결과 고추에 CA00g07330, CA03g31030, CA06g14160, CA08g01700, CA09g17240, CA03g35330, 및 CA00g48500와 같은 7개의 추정(putative) JAZ 유전자가 있는 것으로 나타났다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, CA06g14160을 제외한 이들 JAZ 유전자는 TIFY와 Jas 도메인을 모두 포함하고 있었다. 비생물학적 스트레스가 이러한 JAZ 유전자의 발현 수준을 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 고추 잎을 탈수, ABA, 및 NaCl로 처리하고 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, JAZ 유전자의 발현 수준은 비생물학적 스트레스에 의해 감소되거나 유도되었으며, 다른 유전자와 비교하여, CA03g31030은 탈수 및 ABA에 의해 가장 높게 발현되었다. 또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이, JAZ 유전자는 다른 기관에서 차별적으로 발현되었다. 다음으로, 7개의 CaJAZ 단백질에 대한 세포 내 위치 분석을 수행하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, CaJAZ 단백질은 GFP(green fluorescent protein)의 N-말단에 융합하여 아그로침투(agroinfiltration)를 통해 N. benthamiana 표피 세포에서 일시적으로 발현하였다. 녹색 형광 신호는 대부분 핵에서 검출되었으며, CA08g01700의 경우 핵과 세포질 모두에서 형광 신호가 검출되었다.Previous studies reported that JAZ protein is involved in adaptive responses to several abiotic stresses (Wu et al., 2015, Fu et al., 2017). To isolate the pepper JAZ gene, the amino acid sequences of 13 Arabidopsis JAZ gene families were used as queries. As shown in Figure 1, a BLASTP search based on the reference pepper genome ( Capsicum annuum cv. CM334, version 1.55) showed that pepper has a number of genes, such as CA00g07330 , CA03g31030 , CA06g14160 , CA08g01700 , CA09g17240 , CA03g35330, and CA00g48500 . 7 putative JAZ It turns out that there is a gene. As shown in Figure 2a, these JAZ genes, except CA06g14160 , contained both TIFY and Jas domains. To determine whether abiotic stress regulates the expression levels of these JAZ genes, pepper leaves were dehydrated, treated with ABA, and NaCl, and qRT-PCR analysis was performed. As shown in Figure 2b, the expression levels of JAZ genes were reduced or induced by abiotic stress, and compared with other genes, CA03g31030 was most highly expressed by dehydration and ABA. Additionally, as shown in Figure 2c, JAZ genes were differentially expressed in different organs. Next, subcellular localization analysis of the seven CaJAZ proteins was performed. As shown in Figure 3, the CaJAZ protein was fused to the N-terminus of GFP (green fluorescent protein) and transiently expressed in N. benthamiana epidermal cells through agroinfiltration. Green fluorescent signals were mostly detected in the nucleus, and in the case of CA08g01700 , fluorescent signals were detected in both the nucleus and cytoplasm.
실시예 2. Example 2. CaJAZ1-03CaJAZ1-03 침묵 고추 식물의 향상된 건조 내성 Enhanced desiccation tolerance of silenced pepper plants
발현 패턴에 기초하여, 추가 연구를 위해 CA03g31030을 선택하고 CaJAZ1-03(Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03)으로 명명하였다. 표 2에 CaJAZ1-03 유전자의 염기 서열 및 CaJAZ1-03 유전자에 의해 암호화된 CaJAZ1-03 단백질의 아미노산 서열을 나타냈다. Based on the expression pattern, CA03g31030 was selected for further study and named CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03). Table 2 shows the base sequence of the CaJAZ1-03 gene and the amino acid sequence of the CaJAZ1-03 protein encoded by the CaJAZ1-03 gene.
스트레스 반응에서 CaJAZ1-03의 생물학적 기능을 분석하기 위해, VIGS(virus-induced gene silencing) 기술을 사용하여 CaJAZ1 녹다운 고추 식물을 제조하였다. VIGS의 효율성을 평가하기 위해 대조군(TRV2:00) 및 CaJAZ1-03-침묵 (TRV2:CaJAZ1-03) 고추 잎을 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, TRV2:CaJAZ1-03에서 CaJAZ1-03의 발현 수준은 TRV2:00에서의 발현 수준보다 더 낮은 것으로 나타났다. CaJAZ1-03이 건조 스트레스에 의해 유의하게 유도되었다는 점을 감안할 때 CaJAZ1-03이 고추 식물에서 건조 내성에 영향을 미칠 것으로 예측되었다. 이러한 가능성을 확인하기 위해, TRV2:CaJAZ1-03 및 TRV2:00 식물에 15일 동안 물을 주지 않은 후 2일 동안 다시 물을 주는 방식으로 건조 스트레스를 주었다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 정상 및 건조-처리 조건에서 TRV2:00과 TRV2:CaJAZ1-03 식물 간에 표현형에서 차이는 나타나지 않았다. 그러나, 물을 다시 준 후 TRV2:00 식물에 비해 TRV2:CaJAZ1-03 고추 식물은 내성 표현형을 보였으며, TRV2:00 식물(30.21%)의 생존율은 TRV2:CaJAZ1-03 식물(52.14%)에 비해 더 낮았다. 다음으로, 수분-보유 능력이 TRV2:CaJAZ1-03 식물의 건조 내성과 관련이 있는지 확인하기 위해 8시간 동안 한시간 간격으로 TRV2:00 및 TRV2:CaJAZ1-03에서 분리된 잎의 생중량을 측정하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 수분 손실 비율은 TRV2:00 잎이 TRV2:CaJAZ1-03 잎보다 더 높았다. TRV2:CaJAZ1-03 식물의 향상된 건조 내성이 ABA 민감성과 관련이 있는지 확인하기 위해, ABA 처리와 함께 또는 ABA 처리 없이 TRV2:CaJAZ1-03 및 TRV2:00 식물의 기공 개도와 잎 온도를 측정하였다. 그 결과, 도 4d에 나타난 바와 같이, ABA를 처리하지 않았을 때 기공 구멍 크기는 두 식물 간에 큰 차이가 없었다. 그러나, 10 μM 또는 20 μM ABA로 처리한 후, CaJAZ1-03-침묵 고추 식물의 기공 개도는 TRV2:00 식물보다 현저히 더 작은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4e에 나타낸 바와 같이, ABA가 존재할 때 TRV2:CaJAZ1-03 식물은 TRV2:00 식물보다 더 높은 표면 온도를 나타냈는데, 이는 더 작아진 기공 개도로 인해 증발 냉각 능력이 TRV2:CaJAZ1-03 잎에서 감소했음을 나타낸다. 이러한 데이터는 기공 폐쇄 측면에서 증가된 ABA 민감도가 CaJAZ1-03-침묵 식물에서 건조 스트레스에 대한 내성을 향상시킨다는 것을 시사하였다.To analyze the biological function of CaJAZ1-03 in stress response, CaJAZ1 knockdown pepper plants were prepared using virus-induced gene silencing (VIGS) technology. To evaluate the efficiency of VIGS, RT-PCR analysis was performed using control (TRV2:00) and CaJAZ1-03 -silenced (TRV2: CaJAZ1-03 ) pepper leaves. As a result, as shown in Figure 4a, the expression level of CaJAZ1-03 in TRV2: CaJAZ1-03 was found to be lower than that in TRV2:00. Given that CaJAZ1-03 was significantly induced by desiccation stress, it was predicted that CaJAZ1-03 would affect desiccation tolerance in pepper plants. To check this possibility, TRV2: CaJAZ1-03 and TRV2:00 plants were subjected to desiccation stress by not watering for 15 days and then watering again for 2 days. As shown in Figure 4b, no differences in phenotype were seen between TRV2:00 and TRV2: CaJAZ1-03 plants under normal and dry-treated conditions. However, after re-watering, TRV2: CaJAZ1-03 pepper plants showed a resistant phenotype compared to TRV2:00 plants, and the survival rate of TRV2:00 plants (30.21%) was higher than that of TRV2: CaJAZ1-03 plants (52.14%). It was lower. Next, to determine whether the water-holding capacity is related to the desiccation tolerance of TRV2: CaJAZ1-03 plants, the fresh weight of leaves isolated from TRV2:00 and TRV2: CaJAZ1-03 was measured at hourly intervals for 8 hours. As a result, as shown in Figure 4c, the water loss rate in TRV2:00 leaves was higher than that in TRV2: CaJAZ1-03 leaves. To determine whether the improved desiccation tolerance of TRV2: CaJAZ1-03 plants was related to ABA sensitivity, stomatal opening and leaf temperature of TRV2: CaJAZ1-03 and TRV2:00 plants were measured with or without ABA treatment. As a result, as shown in Figure 4d, there was no significant difference in stomatal hole size between the two plants when ABA was not treated. However, after treatment with 10 μM or 20 μM ABA, the stomatal opening of CaJAZ1-03 -silenced pepper plants was significantly smaller than that of TRV2:00 plants. Additionally, as shown in Figure 4e, in the presence of ABA, TRV2: CaJAZ1-03 plants showed higher surface temperatures than TRV2:00 plants, which was due to the smaller stomatal opening, which resulted in a lower evaporative cooling capacity in TRV2: CaJAZ1-03 . It indicates a decrease in leaves. These data suggested that increased ABA sensitivity in terms of stomatal closure improved tolerance to desiccation stress in CaJAZ1-03 -silenced plants.
실시예 3. Example 3. CaJAZ1-03CaJAZ1-03 -과발현(OX) 식물의 감소된 ABA 민감도 및 건조 내성-Reduced ABA sensitivity and desiccation tolerance in overexpressing (OX) plants.
CaJAZ1-03의 생물학적 기능을 추가로 조사하기 위해, CaJAZ1-03 유전자를 과발현하는 두 개의 독립적인 애기장대 형질전환주(CaJAZ1-03-OX #2 및 #4)를 제조하였다. RT-PCR 분석 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, CaJAZ1-03은 CaJAZ1-03-OX 형질전환주에서 높게 발현되었으나 야생형 식물에서는 발현되지 않았다. CaJAZ1-03의 과발현이 발아 및 묘목 단계 모두에서 ABA 민감도에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, 야생형 및 CaJAZ1-03-OX 식물의 종자를 다양한 농도의 ABA가 포함된 1/2 MS 배지에 도말하였다. 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, ABA가 없는 경우, 야생형과 CaJAZ1-03-OX 식물 간에 차이는 나타나지 않았다. 그러나, ABA가 존재할 때 발아 속도(도 6a)와 자엽(cotyledon) 녹화율(도 6b)은 야생형 식물보다 CaJAZ1-03-OX 식물에서 더 높았다. 또한, 도 6c 및 도 6d에 나타낸 바와 같이, 일차 뿌리 길이는 발아(도 6c)와 발아 후 단계(도 6d)에서 모두 야생형 식물보다 CaJAZ1-03-OX 식물에서 일관되게 더 길었다. 이러한 결과는 CaJAZ1-03이 종자 발아 및 묘목 성장을 촉진하는 측면에서 ABA 신호를 음성적으로 조절한다는 것을 나타낸다. 다음으로, 건조 표현형 분석을 수행하여 건조 반응에서 CaJAZ1-03의 역할을 확인하였다. 도 6e에 나타낸 바와 같이, 물이 충분한 조건에서는 야생형과 CaJAZ1-03-OX 식물 사이에 차이가 없었다. 12일 동안 물을 중단하고 2일 동안 다시 물을 공급한 후, 야생형 식물은 CaJAZ1-03-OX 식물보다 덜 시들었으며, 야생형 식물의 71.46%가 회복된 반면, CaJAZ1-03-OX 식물은 18.96-30.83% 만이 성장을 재개하였다. 추가적으로, 야생형과 CaJAZ1-03-OX 식물의 증산 수분 손실과 잎 온도를 조사하였다. 증산 분석은 8시간 동안 한시간 간격으로 로제트(rosette) 잎의 생중량을 측정함으로써 수행하였다. 도 6f에 나타낸 바와 같이, 야생형 잎의 중량이 CaJAZ1-03-OX 잎의 중량보다 더 무거웠으며, 이는 CaJAZ1-03-OX 잎이 야생형 잎보다 더 높은 증산량을 가진다는 것을 시사하였다. 잎 온도 분석은 야생형 잎과 CaJAZ1-03-OX 잎을 분리한 후 15분 후에 표면 온도를 측정하는 방식으로 진행하였다. 도 6g에 나타낸 바와 같이, 분리 직후에는 야생형과 CaJAZ1-03-OX 잎 사이에 차이가 없었다. 그러나, 15분 후 야생형 식물의 잎 온도는 CaJAZ1-03-OX 식물보다 더 많이 증가하였다. 상기 결과는 CaJAZ1-03이 ABA-매개 건조 반응을 음성적으로 조절한다는 것을 시사하였다.To further investigate the biological function of CaJAZ1-03, two independent Arabidopsis transformants ( CaJAZ1-03- OX #2 and #4) overexpressing the CaJAZ1-03 gene were prepared. As shown in Figure 5 as a result of RT-PCR analysis, CaJAZ1-03 was highly expressed in the CaJAZ1-03 -OX transformant, but was not expressed in wild-type plants. To analyze how overexpression of CaJAZ1-03 affects ABA sensitivity at both germination and seedling stages, seeds of wild-type and CaJAZ1-03 -OX plants were plated on 1/2 MS medium containing various concentrations of ABA. As shown in Figures 6A and 6B, in the absence of ABA, no differences were seen between wild type and CaJAZ1-03 -OX plants. However, in the presence of ABA, the germination rate (Figure 6a) and cotyledon greening rate (Figure 6b) were higher in CaJAZ1-03 -OX plants than in wild-type plants. Additionally, as shown in Figures 6C and 6D, primary root length was consistently longer in CaJAZ1-03 -OX plants than in wild-type plants at both germination (Figure 6C) and post-germination stages (Figure 6D). These results indicate that CaJAZ1-03 negatively regulates ABA signaling in terms of promoting seed germination and seedling growth. Next, drying phenotype analysis was performed to confirm the role of CaJAZ1-03 in the drying response. As shown in Figure 6e, there was no difference between wild type and CaJAZ1-03 -OX plants under water-sufficient conditions. After stopping water for 12 days and re-watering for 2 days, wild-type plants wilted less than CaJAZ1-03 -OX plants, with 71.46% of wild-type plants recovering, while CaJAZ1-03 -OX plants had 18.96- Only 30.83% resumed growth. Additionally, transpirational water loss and leaf temperature of wild type and CaJAZ1-03 -OX plants were investigated. Transpiration analysis was performed by measuring the fresh weight of rosette leaves at hourly intervals for 8 hours. As shown in Figure 6f, the weight of the wild-type leaf was heavier than that of the CaJAZ1-03 -OX leaf, suggesting that the CaJAZ1-03 -OX leaf had a higher transpiration rate than the wild-type leaf. Leaf temperature analysis was conducted by measuring the surface temperature 15 minutes after separating wild-type leaves and CaJAZ1-03 -OX leaves. As shown in Figure 6g, there was no difference between wild type and CaJAZ1-03 -OX leaves immediately after separation. However, after 15 minutes, the leaf temperature of wild-type plants increased more than that of CaJAZ1-03 -OX plants. The results suggested that CaJAZ1-03 negatively regulates ABA-mediated drying response.
실시예 4. 건조 스트레스 및 ABA 하에서 CaJAZ1-03 안정성의 조절Example 4. Modulation of CaJAZ1-03 stability under drying stress and ABA
여러 연구에서 단백질 안정성 및 분해의 미세 조정이 스트레스 반응 및 ABA 신호와 관련이 있는 것으로 제안하고 있다 (Julian et al., 2019, Ali et al., 2020). 건조 스트레스와 ABA가 CaJAZ1-03 단백질의 안정성을 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 건조 또는 ABA 처리된 고추 잎의 조 추출물과 함께 GST-CaJAZ1-03 융합 단백질을 인큐베이션 함으로써 무세포 분해 분석을 수행하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 여러 시점에서 인큐베이션 및 분석 후, GST-CaJAZ1-03 융합 단백질의 점진적인 분해를 확인할 수 있었다. 또한, 탈수 또는 ABA 처리된 고추 식물 잎의 조 추출물로 인큐베이션 하였을 때, 건강한 식물의 추출물로 인큐베이션 하였을 때보다 GST-CaJAZ1-03 단백질이 더 빨리 분해되는 것으로 나타났다. 이러한 CaJAZ1-03 단백질의 분해는 프로테아좀(proteasome) 억제제 MG132에 의해 완전히 억제되었으며, 이는 CaJAZ1-03 단백질 안정성이 26S 프로테아좀 경로에 의해 조절된다는 것을 시사하였다. 변화된 단백질 안정성이 CaJAZ1-03의 국소화에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해, CaJAZ1-03-GFP 단백질을 일시적으로 발현하는 N. benthamiana의 잎을 MG132로 처리하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, MG132가 없는 경우, 핵에서 GFP 신호가 검출되었다. 그러나, MG132가 존재할 때, CaJAZ1-03 단백질이 세포질과 핵 모두에 위치하고 있는 것을 확인할 수 있었다.Several studies suggest that fine-tuning of protein stability and degradation is associated with stress responses and ABA signaling (Julian et al., 2019, Ali et al., 2020). To determine whether desiccation stress and ABA regulate the stability of CaJAZ1-03 protein, a cell-free degradation assay was performed by incubating the GST-CaJAZ1-03 fusion protein with crude extracts of dried or ABA-treated pepper leaves. As shown in Figure 7a, after incubation and analysis at several time points, gradual degradation of GST-CaJAZ1-03 fusion protein could be confirmed. Additionally, when incubated with crude extracts from dehydrated or ABA-treated pepper plant leaves, GST-CaJAZ1-03 protein was degraded more rapidly than when incubated with extracts from healthy plants. The degradation of CaJAZ1-03 protein was completely inhibited by the proteasome inhibitor MG132, suggesting that CaJAZ1-03 protein stability is regulated by the 26S proteasome pathway. To investigate how altered protein stability affects the localization of CaJAZ1-03, leaves of N. benthamiana transiently expressing CaJAZ1-03-GFP protein were treated with MG132. As shown in Figure 7B, in the absence of MG132, GFP signal was detected in the nucleus. However, when MG132 was present, it was confirmed that CaJAZ1-03 protein was located in both the cytoplasm and nucleus.
실시예 5. CaJAZ1-03과 CaASRF1의 상호작용Example 5. Interaction of CaJAZ1-03 and CaASRF1
CaJAZ1-03 단백질의 26S 프로테아좀-매개 분해를 감안하여 CaJAZ1-03 안정성의 후보 조절자를 찾기 위해 효모 단백질 잡종(Yeast two-hybrid; Y2H) 스크리닝을 수행하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, CaJAZ1-03을 먹이 단백질(prey)로 사용하고, 고추 식물에서 확인된 RING-type E3 ligase 단백질의 작은 라이브러리를 미끼 단백질(bait)로 사용하였다. 상호작용자(interactor) 중에서, 고추 건조 내성에 양성 조절자인 CaASRF1에 집중하였다 (Joo et al., 2019a). 시험관 내에서 CaJAZ1-03과 CaASRF1 간의 상호 작용을 뒷받침하기 위해 풀-다운 분석을 수행하였다. MBP-CaASRF1 및 단일 MBP 단백질을 박테리아에서 발현하고 GST(glutathione S-transferase)-CaJAZ1-03과 공동-인큐베이션 하였다. 그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, MBP-CaASRF1은 GST-CaJAZ1-03에 의해서만 풀-다운되었으나, 단일 GST에 의해서는 풀-다운되지 않았다. 추가적으로, 생체 내에서 두 단백질 간의 상호 작용을 확인하기 위해 루시퍼라아제 상보성 이미징(Luciferase complementation imaging; LCI) 및 이분자 형광 상보성(bimolecular fluorescence complementation; BiFC) 분석을 수행하였다. 도 8c에 나타낸 바와 같이, LCI 분석에서, cLUC-CaASRF1 및 nLUC-CaJAZ1-03이 N. benthamiana 잎에서 공동-발현되었을 때 강한 LUC 활성이 관찰되었다. 도 8d에 나타낸 바와 같이, BiFC 분석에서, MG132 처리의 경우에만 핵에서 노란색 형광 신호를 검출할 수 있었다. 이러한 결과는 CaJAZ1-03이 시험관 내 및 생체 내 모두에서 CaASRF1과 직접 상호 작용한다는 것을 의미하였다.Considering the 26S proteasome-mediated degradation of CaJAZ1-03 protein, a yeast two-hybrid (Y2H) screen was performed to find candidate regulators of CaJAZ1-03 stability. As shown in Figure 8a, CaJAZ1-03 was used as a prey protein (prey), and a small library of RING-type E3 ligase proteins identified in pepper plants was used as a bait protein. Among the interactors, we focused on CaASRF1, a positive regulator of pepper drying tolerance (Joo et al., 2019a). A pull-down assay was performed to support the interaction between CaJAZ1-03 and CaASRF1 in vitro. MBP-CaASRF1 and single MBP proteins were expressed in bacteria and co-incubated with glutathione S-transferase (GST)-CaJAZ1-03. As a result, as shown in Figure 8b, MBP-CaASRF1 was pulled down only by GST-CaJAZ1-03, but not by a single GST. Additionally, luciferase complementation imaging (LCI) and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis were performed to confirm the interaction between the two proteins in vivo. As shown in Figure 8c, in the LCI assay, strong LUC activity was observed when cLUC-CaASRF1 and nLUC-CaJAZ1-03 were co-expressed in N. benthamiana leaves. As shown in Figure 8D, in BiFC analysis, a yellow fluorescence signal could be detected in the nucleus only in the case of MG132 treatment. These results indicated that CaJAZ1-03 directly interacted with CaASRF1 both in vitro and in vivo.
실시예 6. CaASRF1의 기질인 CaJAZ1-03Example 6. CaJAZ1-03, a substrate of CaASRF1
다음으로, 시험관 내 유비퀴틴화 분석을 수행하여 CaJAZ1-03이 CaASRF1에 의해 유비퀴틴화되었는지 여부를 확인하였다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, GST-CaJAZ1-03을 MBP-CaASRF1과 함께 인큐베이션한 후, 상부 스미어(smear) 밴드가 강하게 검출되었으며, 이는 CaJAZ1-03이 CaASRF1에 의해 다중유비퀴틴화(polyubiquitination) 되었음을 나타낸다. 이러한 데이터에 기초하여, 특히 건조 스트레스에 대한 반응으로 CaJAZ1-03 안정성이 CaASRF1에 의해 변경될 수 있는지 확인하고자 하였다. 이를 확인하기 위해, 건조 스트레스를 처리한 TRV2:CaASRF1 또는 CaASRF1-OX 식물 잎의 조 추출물을 사용하여 무세포 분해 분석을 수행하였다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, TRV2:00 조 추출물로 인큐베이션한 단백질과 비교했을 때, TRV2:CaASRF1 잎 조 추출물로 인큐베이션한 CaJAZ1-03 단백질이 현저히 덜 분해되었다. 반면, 도 9c에 나타낸 바와 같이, 야생형 추출물로 인큐베이션한 경우와 비교했을 때, CaASRF1-OX 조 추출물로 인큐베이션한 경우 CaJAZ1-03의 분해가 빠르게 진행되었다. 상기 결과들은 CaASRF1이 CaJAZ1-03을 다중유비퀴틴화하고 유비퀴틴-26S 프로테아좀 시스템을 통해 CaJAZ1-03의 분해에 관여함을 시사하였다.Next, in vitro ubiquitination analysis was performed to determine whether CaJAZ1-03 was ubiquitinated by CaASRF1. As shown in Figure 9A, after incubating GST-CaJAZ1-03 with MBP-CaASRF1, the upper smear band was strongly detected, indicating that CaJAZ1-03 was polyubiquitinated by CaASRF1. Based on these data, we sought to determine whether CaJAZ1-03 stability could be altered by CaASRF1, especially in response to desiccation stress. To confirm this, cell-free degradation assays were performed using crude extracts from leaves of TRV2: CaASRF1 or CaASRF1 -OX plants treated with desiccation stress. As shown in Figure 9b, compared to the protein incubated with TRV2:00 crude extract, the CaJAZ1-03 protein incubated with TRV2: CaASRF1 leaf crude extract was significantly less degraded. On the other hand, as shown in Figure 9c, compared to the case of incubation with the wild-type extract, the degradation of CaJAZ1-03 progressed rapidly when incubated with the CaASRF1 -OX crude extract. The above results suggested that CaASRF1 polyubiquitinated CaJAZ1-03 and was involved in the degradation of CaJAZ1-03 through the ubiquitin-26S proteasome system.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The description of the present invention described above is for illustrative purposes, and those skilled in the art will understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical idea or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive.
Claims (11)
상기 억제제는 상기 CaJAZ1-03 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터인 것을 특징으로 하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
A composition for enhancing dry stress resistance in plants, comprising as an active ingredient an expression or activity inhibitor of the CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum SnRK2.6-interacting protein phosphatase 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
A composition for enhancing drought stress resistance in plants, wherein the inhibitor is a recombinant VIGS (Virus Induced Gene Silencing) vector containing a gene sequence encoding the CaJAZ1-03 protein.
A method for enhancing dry stress resistance in plants, comprising the step of inhibiting the expression or activity of CaJAZ1-03 ( Capsicum annuum JAZ1 from chromosome 03) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by treating the composition of claim 6.
A transgenic plant with improved drought stress resistance by the method of claim 8.
상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대인 것을 특징으로 하는, 식물체.According to clause 9,
A plant, characterized in that the transgenic plant is pepper or Arabidopsis thaliana.
상기 CaJAZ1-03 단백질은 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 CaJAZ1-03 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.According to clause 6,
A composition for enhancing dry stress resistance in plants, wherein the CaJAZ1-03 protein is encoded by the CaJAZ1-03 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
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