KR102629975B1 - 목화씨 추출물을 포함하는 항바이러스용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
목화씨 추출물을 포함하는 항바이러스용 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 목화씨 추출물을 포함하는 항바이러스용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 목화씨 추출물의 발효물은 항바이러스 활성 및 바이러스 중화 활성을 나타내므로, 이를 효과적으로 항바이러스 및 바이러스 중화 용도로 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 목화씨 추출물을 포함하는 항바이러스용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 목화씨 파우더로부터 미생물을 이용하여 발효시킨 발효물로부터 항바이러스 활성을 도출해내는 기술에 관한 것이다.
사스(SARS)는 사람간의 접촉에 의해 잠재적으로 전파되는 전염성의 질병으로 사스 코로나바이러스에 의해 유발된다. 사스는 변종된 폐렴으로 호흡기관의 물질이나 사람과의 접촉에 의해 일차적으로 감염된다. 사스는 유행성 질병으로 2002~2003년 사이에 발병하였으며 700명 이상의 사망자를 발생시켰다. 중국 광둥성에서 처음으로 출현한 이후로 29개국에 연속적으로 나타났으며 약 20%의 환자들은, 살기 위해 기계호흡이 요구되는 acute respiratory distress syndrome(ARDS)의 증상에서 변형된 사스로 인해 괴로움을 당했다.
더불어 사스의 빠른 확산은 퍼지는 동안 확인된 임상 치료를 할 수 없게 만들었고 그러므로 항 바이러스 물질, 스테로이드, type-I 인터페론 같은 물질들이 경험적 전략으로 환자들 치료를 위해 사용되었다. 그러나 문헌들의 보고서를 되돌아보면 약물들이 실제로 득이 된 환자는 없다는 것을 알 수 있다. 그러므로 사스 환자들을 효과적으로 치료할 수 있는 결정적인 의약품이 아직 존재하지 않으며 차후 사스 출현의 경우에 발전된 항 사스 바이러스 물질을 만들기 위해 더 많은 시도를 해야 한다.
사스 코로나바이러스는 코로나바이러스 분류로 분리되었고 입증되었으며 29,751 염기의 유전자를 갖는 단일 가닥의 RNA 바이러스이다. 유전자 서열은 코로 나바이러스의 전에 알려진 3개의 집단 중 어떤 것과도 엄밀히 유사하지 않은 HCoV-OC43 와 HCoV-229E 인 다른 휴먼 코로나바이러스와 오직 적당히 관련되어 있다는 것을 밝혔다.
코로나바이러스는 외피보유 바이러스 집단에 소속되어 있으며 동물 숙주세포 내로 침투하여 세포질 안에서 자신의 유전물질을 복제(Viral replication)하여 자신과 같은 바이러스를 생산한다. 목표 세포에 감염되면 사스 코로나바이러스의 유전자는 두 개의 큰 복제관련 중합단백질을 만들고 이것은 곧이어 바이러스의 프로테아제에 의해 non-structural proteins(nsPs) 여러 개로 나눠진다. 이 nsPs는 RNA-의존-RNA 중합효소와 헬리케이즈를 포함한다. 이중에서 바이러스 헬리케이즈는 자신의 이중가닥 DNA 또는 RNA 핵산을 풀어주어 바이러스의 복제 및 증식에 중요한 역할을 한다. 따라서, 바이러스 유전자 복제에 필수적인 헬리케이즈는 현재 항바이러스 약물 개발에 대한 잠재적인 목표로서 여겨지고 있다.
COVID-19는 2019년 12월 중국 우한에서 처음 발생한 이후 중국 전역과 전 세계로 확산된, 새로운 유형의 코로나 바이러스에 의한 호흡기 감염질환이다. 신종바이러스인 COVID-19의 경우도 사스 코로나바이러스 헬리케이즈와 아미노산 서열이 99% 이상 동일하여 이 두 종의 헬리케이즈는 활성도 기작이 동일하다 여겨진다.
이에 본 발명자들은 목화씨 파우더로부터의 추출물을 바실러스 속 균주를 이용하여 발효시킨 발효물로부터 나타나는 항바이러스 활성이 추출물 대비 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 목화씨 추출물을 포함하는 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다음 단계를 포함하는 항바이러스용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다:
목화씨에 용매를 가하여 추출물을 제조하는 추출 단계; 및
목화씨 추출물을 미생물을 이용하여 발효시키는 발효 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 목화씨 추출물을 포함하는 바이러스 중화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 목화씨 추출물의 항바이러스 및 바이러스 중화 용도에 관한 것이다.
본 발명은 목화씨 추출물을 포함하는 항바이러스용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 목화씨 추출물의 발효물은 항바이러스 활성 및 바이러스 중화 활성을 나타낸다.
본 발명자들은 목화씨 파우더로부터 용매를 이용하여 함유 단백질을 추출하고, 다른 방법은 목화씨 파우더로부터 미생물을 이용하여 발효물을 제조하였으며, 이로부터 뛰어난 항바이러스 활성이 발휘됨을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 목화씨 추출물을 포함하는 항바이러스용 조성물이다.
본 발명에 있어서 상기 추출물은 용매 조추출물, 상기 조추출물의 분획물, 상기 조추출물의 발효물, 및 상기 조추출물의 발효물의 분획물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 용매는 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것일 수 있고, 예를 들어, 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발효물은 목화씨의 용매 조추출물을 미생물을 이용하여 발효시킨 것일 수 있고, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주인 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조추출물의 발효물의 분획물은 17 내지 63 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있고, 바람직하게는 17 내지 35 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있으며, 예를 들어, 17 내지 20 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 17 내지 20 kDa의 분자량을 갖는 단백질은 목화씨 조추출물의 발효물의 분획물 중 10% 내지 90%의 함량으로 포함되는 것일 수 있고, 바람직하게는 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 20% 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 40% 내지 90%, 40% 내지 80%, 40% 내지 70%, 40% 내지 60%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 또는 50% 내지 70%, 예를 들어, 50% 내지 60%의 함량으로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 항바이러스용 조성물은 소, 돼지, 닭 및 개로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 가축, 및 인간을 대상으로 호흡기감염증을 유발하는 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물인 것일 수 있다.
상기 가축을 대상으로 감염되는 바이러스는 소 코로나바이러스(Bovine coronavirus; BCoV), 돼지 코로나바이러스(Porcine coronavirus; PCoV), 개 코로나바이러스(Canine coronavirus; CCoV), 및 새 코로나바이러스(Avian influenza virus; ACoV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 인간을 대상으로 감염되는 인체 감염형 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 코로나바이러스(Coronavirus), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 인간 리노바이러스(human Rhinovirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 및 인간 보카바이러스(human Bocavirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 대한 항바이러스 활성을 발휘하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 항바이러스용 조성물의 제조 방법이다:
목화씨에 용매를 가하여 추출물을 제조하는 추출 단계; 및
목화씨 추출물을 미생물을 이용하여 발효시키는 발효 단계.
본 발명에 있어서 상기 용매는 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것일 수 있고, 예를 들어, 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출물은 용매 조추출물, 상기 조추출물의 분획물, 상기 조추출물의 발효물, 및 상기 조추출물의 발효물의 분획물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 추출 단계는 10 내지 200시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 20 내지 200시간, 50 내지 200시간, 80 내지 200시간, 100 내지 200시간, 10 내지 150시간, 20 내지 150시간, 50 내지 150시간, 80 내지 150시간, 100 내지 150시간, 10 내지 120시간, 20 내지 120시간, 50 내지 120시간, 또는 80 내지 120시간, 예를 들어, 100 내지 120시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출 단계는 15 내지 50℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 15 내지 45℃, 15 내지 40℃, 15 내지 35℃, 20 내지 50℃, 20 내지 45℃, 20 내지 40℃, 20 내지 35℃, 25 내지 50℃, 25 내지 45℃, 25 내지 40℃, 25 내지 35℃, 30 내지 50℃, 30 내지 45℃, 또는 30 내지 40℃, 예를 들어, 30 내지 35℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 목화씨 추출물의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다: 목화씨를 분쇄하여 파우더(분말)로 준비하고 물에 투입함으로써, 목화씨에 함유된 단백질이 물에 의하여 추출될 수 있도록 한 후, 이를 원심분리하여 상층액을 수득한다.
추출공정은 1회 또는 수회 반복할 수 있으며, 본 발명의 한 바람직한 예에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택할 수 있는데, 이는 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다.
본 발명에 있어서 “추출”은 액체 또는 고체 원료 중에 포함되어 있는 유용한 가용성 성분을 용매에 녹여 분리하는 방법으로, 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예를 들어, 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류 냉각 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 초음파 추출법, 용출법, 압착법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발효물은 목화씨의 용매 조추출물을 미생물을 이용하여 발효시킨 것일 수 있고, 상기 미생물은 바실러스 속 균주인 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조추출물의 발효물의 분획물은 17 내지 63 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있고, 바람직하게는 17 내지 35 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있으며, 예를 들어, 17 내지 20 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 항바이러스용 조성물은 소, 돼지, 닭 및 개로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 가축, 및 인간을 대상으로 호흡기감염증을 유발하는 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물인 것일 수 있다.
상기 가축을 대상으로 감염되는 바이러스는 소 코로나바이러스(BCoV), 돼지 코로나바이러스(PCoV), 개 코로나바이러스(CCoV), 및 새 코로나바이러스(ACoV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 인간을 대상으로 감염되는 인체 감염형 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 인간 리노바이러스, 엔테로바이러스, 메타뉴모바이러스, 및 인간 보카바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 대한 항바이러스 활성을 발휘하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 목화씨 추출물을 포함하는 바이러스 중화용 조성물이다.
본 발명에 있어서 상기 추출물은 용매 조추출물, 상기 조추출물의 분획물, 상기 조추출물의 발효물, 및 상기 조추출물의 발효물의 분획물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 용매는 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것일 수 있고, 예를 들어, 물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발효 단계는 10 내지 200시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 20 내지 200시간, 50 내지 200시간, 80 내지 200시간, 100 내지 200시간, 10 내지 150시간, 20 내지 150시간, 50 내지 150시간, 80 내지 150시간, 100 내지 150시간, 10 내지 120시간, 20 내지 120시간, 50 내지 120시간, 또는 80 내지 120시간, 예를 들어, 100 내지 120시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발효물은 목화씨의 용매 조추출물을 미생물을 이용하여 발효시킨 것일 수 있고, 상기 미생물은 바실러스 속 균주인 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조추출물의 발효물의 분획물은 17 내지 63 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있고, 바람직하게는 17 내지 35 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있으며, 예를 들어, 17 내지 20 kDa의 분자량을 갖는 단백질인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 17 내지 20 kDa의 분자량을 갖는 단백질은 목화씨 조추출물의 발효물의 분획물 중 10% 내지 90%의 함량으로 포함되는 것일 수 있고, 바람직하게는 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 20% 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 40% 내지 90%, 40% 내지 80%, 40% 내지 70%, 40% 내지 60%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 또는 50% 내지 70%, 예를 들어, 50% 내지 60%의 함량으로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 바이러스 중화용 조성물은 소, 돼지, 닭 및 개로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 가축, 및 인간을 대상으로 호흡기감염증을 유발하는 바이러스에 대한 중화용 조성물인 것일 수 있다.
상기 가축을 대상으로 감염되는 바이러스는 소 코로나바이러스(BCoV), 돼지 코로나바이러스(PCoV), 개 코로나바이러스(CCoV), 및 새 코로나바이러스(ACoV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 인간을 대상으로 감염되는 인체 감염형 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 인간 리노바이러스, 엔테로바이러스, 메타뉴모바이러스, 및 인간 보카바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 대한 중화 활성을 발휘하는 것일 수 있다.
본 발명은 목화씨 추출물을 포함하는 항바이러스용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 목화씨 추출물의 발효물은 항바이러스 활성 및 바이러스 중화 활성을 나타내므로, 이를 효과적으로 항바이러스 및 바이러스 중화 용도로 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 목화씨 발효물(cotton seed meal fermentation; 이하 CSMF)에 대한 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인플루엔자 A의 아형인 H1N1(ATCC, VR-1496) 감염에 대한 목화씨 발효물(CSMF)의 세포생존율 증진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 목화씨 추출물(cotton seed meal water extracts; 이하 CSMW) 및 목화씨 발효물(CSMF)로부터 측정한 단백질 크기별 분포 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 목화씨 발효물(CSMF)과 목화씨 추출물(CSMW)의 스파이크 단백질(SARS-CoV-2 RBD spike protein)에 대한 중화력을 비교 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인플루엔자 A의 아형인 H1N1(ATCC, VR-1496) 감염에 대한 목화씨 발효물(CSMF)의 세포생존율 증진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 목화씨 추출물(cotton seed meal water extracts; 이하 CSMW) 및 목화씨 발효물(CSMF)로부터 측정한 단백질 크기별 분포 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 목화씨 발효물(CSMF)과 목화씨 추출물(CSMW)의 스파이크 단백질(SARS-CoV-2 RBD spike protein)에 대한 중화력을 비교 평가한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 목화씨 발효물의 제조
목화씨에 함유되어 있는 단백질의 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 수용성 단백질을 대조군으로 활용하였다.
구체적으로, 건조된 목화씨 파우더 40 g을 2 L의 탈이온 증류수에 넣고 볼텍싱(vortexing) 조작을 수행하여 목화씨 파우더에 함유된 단백질이 추출되도록 5일간 32℃ 조건에서 목화씨 파우더로부터 목화씨 추출물(cotton seed meal water extracts; 이하 CSMW)을 제조하였다. 상기 CSMW를 원심관에 넣고 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 수행하여 상층액을 새로운 시험관으로 옮긴 후, 기공 크기(pore size) 0.20 μm의 실린지 필터 과정을 통해 여과물을 수집하였다.
목화씨에 함유되어 있는 단백질의 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 건조된 목화씨 파우더 40 g을 2 L의 탈이온 증류수에 넣고 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtillus) 균주 1.06×1011 CFU/mL를 1 mL을 접종하고 5일간 발효하여 목화씨 발효물(cotton seed meal fermentation; 이하 CSMF)을 제조하였다. 상기 CSMF를 원심관에 넣고 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 수행하여 상층액을 새로운 시험관으로 옮겨주었다. 기공 크기 0.20 μm의 실린지 필터 과정을 통해 얻은 여과물을 수집하였다.
실시예 2: 목화씨 발효물의 세포독성 평가
목화씨 발효물(CSMF)에 대한 세포독성을 평가하기 위하여 MDCK(Mardin-Dardy canine kidney) 세포주를 사용하였다. MDCK 세포는 페니실린(penicillin) 5 units/mL, 스트렙토마이신(streptomysin) 5 μg/mL 및 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: Gibco, USA)이 첨가된 DMEM10(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Gibco, USA)을 기본 배지로 하여 5% CO2 농도를 유지하며 CO2 인큐베이터(incubator, Thermo Forma, USA)에서 37℃ 조건으로 배양하였다.
96-웰 플레이트의 각 웰에 1.0×105 cells/mL 농도의 MDCK 세포 현탁액을 0.1 mL씩 주입하였고, 24시간 동안 5% CO2 농도를 유지하며 CO2 인큐베이터에서 37℃ 조건으로 배양하였다. 0, 25, 50, 100, 및 200 ppm 농도의 목화씨 발효물(CSMF)을 DMEM10 배지로 희석하여 세포에 처리하여 48시간 동안 배양하였다.
배양 종료 후 10 μL의 CCK-8 시약(reagent)(Dojindo)을 넣고 2시간 동안 37℃에서 배양한 후 450 nm 흡광도를 측정하여 무처리구 대비 세포생존율을 평가하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 200 ppm 농도까지 단계적으로 희석된 목화씨 발효물(CSMF)에 대한 세포독성을 시험한 결과 무독함을 확인하였다.
실시예 3: 목화씨 발효물의 H1N1 감염에 대한 세포생존율 평가
3-1. H1N1 감염 유도
세포생존율 평가에 사용할 MDCK 세포주는 페니실린 5 units/mL, 스트렙토마이신 5 μg/mL 및 10% 우태아 혈청이 첨가된 DMEM을 기본배지로 하여 5% CO2 농도를 유지하며 CO2 인큐베이터에서 37℃ 조건으로 배양하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 1.0×105 cells/mL 농도의 MDCK 세포 현탁액을 0.1 mL씩 주입하였고, 24시간 동안 5% CO2 농도를 유지하며 CO2 인큐베이터에서 37℃ 조건으로 배양하였다.
6.25 ppm 농도의 목화씨 발효물(CSMF)을 세포에 선처리하여 24시간 동안 배양하였다. 바이러스 희석액은 2 μg/mL 농도의 N-토실-L-페닐알알라닐클로로메틸케톤(N-Tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Ketone; TPCK)을 포함하는 DMEM0 배지(TPCK-DMEM0) 950 μL와 인플루엔자 A의 아형인 H1N1(ATCC, VR-1496) 50 μL를 희석하여 준비하였다. 배양된 세포는 PBS로 1회 세척하고, 바이러스 희석액 10 μL 및 배지(TPCK-DMEM0) 90μL를 혼합하여 각 웰에 접종하여 30분 간격으로 간헐적으로 흔들어주면서 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 배양하여 바이러스를 감염시켰다.
3-2. 세포생존율의 평가
이후 MDCK 세포주의 배양 조건에서 30℃로 온도를 낮추어 72시간 동안 배양하였다. 양성 대조구로서는 H1N1 치료제로 알려진 오셀타미비르(oseltamivir)를 목화씨 발효물(CSMF) 대신 사용하였다. 세포생존율의 평가는 CCK-8 시약을 사용하여 O.D 450 nm에서 측정하여 바이러스에 감염시키지 않은 음성 대조구의 O.D 값을 100을 기점으로 하여 상대정량을 수행하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, H1N1을 처리한 MDCK 세포(0 ppm)가 62%의 생존율을 보인 조건에서 양성 대조구인 오셀타미비르는 80%의 생존율을 나타내었다. 6.25 ppm 농도의 목화씨 발효물의 세포생존율은 80%의 생존율로서 오셀타미비르와 유사한 효과를 나타내었다. 반면, 목화씨 추출물(CSMW)의 경우, 같은 농도인 6.25 ppm 수준에서 70%의 세포생존율을 나타내었으므로 목화씨 발효물이 항바이러스 효과를 발휘함을 확인하였다.
실시예 4: 목화씨 발효물의 구성 단백질 확인
실시예 1에서 제조된 목화씨 추출물(CSMW) 및 목화씨 발효물(CSMF)로부터의 각 상층액을 이용하여 함유 단백질을 정량하였다.
구체적으로, BSA 정량법으로 시료의 단백질을 정량한 후 100 μg씩 취하여 10 μL의 버퍼(4X loading buffer, 2M Tris-HCl (pH 6.8) 12.5 mL, glycerol 40 mL, sodium dodecyl sulfate 8 g, bromophenol blue 40 mg, 2-mercaptoethanol 20 mL, deionized water 20 mL)와 함께 95℃에서 5분간 가열하였다.
염색은 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) R-250 용액을 사용하여 염색하였고 10% 아세트산(acetic acid)가 함유된 30% 메탄올(methanol) 용액에 2시간 동안 탈색하였다. SDS-PAGE는 12% 아크릴아마이드 젤에 가열된 시료 30 μL를 로딩하여 100 V에서 1시간 동안 전기영동을 수행하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 목화씨 발효물(CSMF)과 목화씨 추출물(CSMW)에 대한 단백질 분포를 조사한 결과, 균주와 함께 발효된 목화씨 발효물(CSMF)은 63 내지 48 kDa(Band 2), 35 내지 25 kDa(Band 4 및 Band 5), 20 내지 17 kDa(Band 6)의 사이즈에서 총 4개의 밴드가 형성되었고, 그 중 20 내지 17 kDa(Band 6)의 밴드가 목화씨 발효물(CSMF) 전체의 54%에 해당하는 큰 비중을 차지하였다.
반면, 목화씨 추출물(CSMW)에서는 63 내지 48 kDa(Band 1), 48 kDa(Band 3), 35 내지 25 kDa(Band 4), 20 내지 17 kDa(Band 6) 사이즈에서 총 4개의 밴드를 확인할 수 있었으며, 목화씨 발효물(CSMF)에서 관찰되었던 20 내지 17 kDa(Band 6)의 밴드는 목화씨 추출물(CSMW)의 9%의 비중을 차지한 것으로 분석되었다.
따라서, 목화씨 발효 과정에 의해 20 내지 17 kDa(Band 6) 밴드가 주요하게 생성된 것을 확인하였다.
실시예 5: 목화씨 발효물의 바이러스 단백질 중화 효과
목화씨 발효물(CSMF) 및 목화씨 추출물(CSMW)에서 획득한 단백질의 바이러스 중화 효능 분석을 수행하였다. SARS-CoV-2 바이러스의 중화 효과는 COVID-19 중화 항체(Neutralizing Antibody) ELISA Kit(Abnova, Cat. KA6111) 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
50 ppm 농도에 해당하는 목화씨 발효물(CSMF) 및 목화씨 추출물(CSMW)을 취하여 COVID-19 중화 항체 ELISA Kit에서 제공하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(SARS-CoV-2 spike RBD Rabbit Fc-Tag protein)과 37℃에서 2시간 동안 중화반응을 수행하였다.
구체적으로, hACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)가 코팅된 ELISA 플레이트에 상기와 같이 중화반응을 수행한 목화씨 발효물(CSMF) 및 목화씨 추출물(CSMW)에서 획득한 단백질과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 넣고 37℃에서 2시간 동안 hACE2와 반응을 수행하였다. 키트에서 제공된 세척 버퍼(washing buffer)로 4회 세척한 후 항체(HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit Antibody)를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
세척 버퍼로 4회 세척한 후 테트라메틸 벤지딘(N, N'-Tetramethylbenzidin; TMB) 시약을 넣고 5분 동안 반응하고, 종결 용액(stop solution)(1 N HCl)을 넣고 450 nm 흡광도를 측정하였다. 중화반응에서 사용된 대조구는 시료 대신 PBS를 사용하였다. 중화 효과는 대조구 대비 시료의 중화력을 상대비교하였으며 백분율로 산정하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 대조구의 hACE2와 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 결합력(RBD-hACE2 binding)이 100% 일 때, 50 ppm 목화씨 발효물(CSMF)은 스파이크 단백질과 중화되어 hACE와의 결합을 87% 저해하였으며 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과의 중화력이 우수함을 입증하였다. 그러나 50 ppm 목화씨 추출물(CSMW)은 hACE와의 결합을 39% 저해하였으며 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과의 중화력은 있으나 그 효과는 미미한 것을 확인하였다.
SDS-PAGE 상의 결과로부터 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과의 중화력에 기여하는 단백질은 band 6에 해당하는 20 내지 17 kDa 분획에 함유된 단백질인 것으로 판단하였다.
Claims (11)
- 목화씨 물 추출물의 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 발효물을 포함하는 항바이러스용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 것인, 항바이러스용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 발효물은 17 내지 63 kDa의 분자량을 갖는 단백질을 포함하는 것인, 항바이러스용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 항바이러스용 조성물은 H1N1 또는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 발휘하는 것인, 항바이러스용 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 항바이러스용 조성물의 제조 방법:
목화씨에 물을 가하여 물 추출물을 제조하는 추출 단계; 및
목화씨 물 추출물을 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주를 이용하여 발효시키는 발효 단계. - 제5항에 있어서, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 것인, 항바이러스용 조성물의 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 항바이러스용 조성물은 H1N1 또는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 발휘하는 것인, 항바이러스용 조성물의 제조 방법.
- 목화씨 물 추출물의 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 발효물을 포함하는 바이러스 중화용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 것인, 바이러스 중화용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 발효물은 17 내지 63 kDa의 분자량을 갖는 단백질을 포함하는 것인, 바이러스 중화용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 바이러스 중화용 조성물은 H1N1 또는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화 활성을 발휘하는 것인, 바이러스 중화용 조성물.
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