KR102628547B1 - 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물 및 이를 이용한 염소 정장 제거 방법 - Google Patents
유단백질을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물 및 이를 이용한 염소 정장 제거 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 조성물을 이용한 염소 정장 제거 방법 및 염소 정액의 동결보존 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 염소 정장 제거용 조성물은 염소 정액에 포함된 염소 정장을 효과적으로 제거할 수 있으며, 염소 정장이 제거된 염소 정액은 동결 후 융해하더라도 염소 정자의 생존능 및 운동성이 현저히 증가한다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 염소 정장 제거용 조성물이 염소 정자의 동결보존에 효과적이라는 것을 의미하는 바, 체외 인공수정을 비롯한 가축번식 관련 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 조성물을 이용한 염소 정장 제거 방법 및 염소 정액의 동결보존 방법에 관한 것이다.
염소 정액은 우제류에서도 독특하게 염소 정액 성분에 포함되는 인지질 분해 효소가 존재하고 있다. 상기 인지질 분해 효소는 염소 정자를 자극하여 활력을 증진시키고, 사출 염소 정액이 암컷 생식도관 중 질 내에서 자궁으로 이행을 촉진하는 기능이 있다. 그러나 염소 정자 동결 시, 인지질 분해 효소는 세포막 성분을 변화시켜 동결성을 저해한다. 즉, 상기 염소 정액에 포함된 인지질 분해 효소는 염소 정자의 활력은 증진시키나, 노화를 촉진시켜 염소 정자 장수성(longevity)을 감소시킨다. 그러므로 염소 정액에 포함된 인지질 분해 효소를 효율적으로 제거하는 것이 고품질 염소 동결염소 정액을 생산하는데 중요한 요소이다.
종래에는 무기염류를 기본으로 하는 염소 정장 제거액이 있으나, 동결 및 융해 후 염소 정자의 생존율이 50%에 미치지 못하는 경우가 대부분이다. 종래 방법으로 염소의 염소 정액을 동결할 경우 융해된 염소 정자의 생존율이 임신이 가능한 한계 생존율(40%)보다 낮다. 이에, 해동 후 생존율을 보다 향상시킬 수 있는 염소 정자의 동결보존 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 융해 후 염소 정자의 생존율을 증가시키기 위한 염소 정자 동결보존 방법을 개발하기 위해 연구하던 중 유단백질이 염소 정액 내 염소 정장을 효율적으로 제거할 수 있고, 이로 인해 염소 정자의 동결 및 융해 후 생존능 및 운동능이 증가된다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, (a) 유단백질 및 배양액을 혼합하여 염소 정장(seminal plasma) 제거용 조성물을 제조하는 단계; (b) 염소 정액에 상기 단계 (a)에서 제조된 염소 정장 제거용 조성물을 점적(dripping)하여 염소 정장 제거액 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 염소 정장 제거액 혼합물을 원심분리하는 단계;를 포함하는 염소 정장 제거 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, (a) 유단백질 및 배양액을 혼합하여 염소 정장(seminal plasma) 제거용 조성물을 제조하는 단계; (b) 염소 정액에 상기 단계 (a)에서 제조된 염소 정장 제거용 조성물을 점적하여 염소 정장 제거액 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 염소 정장이 제거된 염소 정액 및 동결 희석제를 혼합하는 단계;를 포함하는 염소 정액의 동결보존 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 유단백질 및 배양액을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 유단백질 및 배양액을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물을 포함하는 1구획; 및 동결 희석제를 포함하는 2구획;을 포함하는 염소 정자 동결보존용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 유단백질 및 배양액을 혼합하여 염소 정장(seminal plasma) 제거용 조성물을 제조하는 단계; (b) 염소 정액에 상기 단계 (a)에서 제조된 염소 정장 제거용 조성물을 점적(dripping)하여 염소 정장 제거액 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 염소 정장 제거액 혼합물을 원심분리하는 단계;를 포함하는 염소 정장 제거 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 유단백질 및 배양액을 혼합하여 염소 정장(seminal plasma) 제거용 조성물을 제조하는 단계; (b) 염소 정액에 상기 단계 (a)에서 제조된 염소 정장 제거용 조성물을 점적하여 염소 정장 제거액 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 염소 정장이 제거된 염소 정액 및 동결 희석제를 혼합하는 단계;를 포함하는 염소 정액의 동결보존 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 유단백질 및 배양액을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 유단백질 및 배양액을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물을 포함하는 1구획; 및 동결 희석제를 포함하는 2구획;을 포함하는 염소 정자 동결보존용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 염소 정장 제거용 조성물은 염소 정액에 포함된 염소 정장을 효과적으로 제거할 수 있으며, 염소 정장이 제거된 염소 정액은 동결 후 융해하더라도 염소 정자의 생존능 및 운동성이 현저히 증가한다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 염소 정장 제거용 조성물이 염소 정자의 동결보존에 효과적이라는 것을 의미하는 바, 체외 인공수정을 비롯한 가축번식 관련 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 1부피% 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거액을 이용하여 동결된 염소 정액의 생존성 및 운동성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 2부피% 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거액을 이용하여 동결된 염소 정액의 생존성 및 운동성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 2부피% 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거액을 이용하여 동결된 염소 정액의 생존성 및 운동성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유단백질 및 배양액을 혼합하여 염소 정장(seminal plasma) 제거용 조성물을 제조하는 단계; (b) 염소 정액에 상기 단계 (a)에서 제조된 염소 정장 제거용 조성물을 점적(dripping)하여 염소 정장 제거액 혼합물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 염소 정장 제거액 혼합물을 원심분리하는 단계;를 포함하는 염소 정장 제거 방법을 제공을 제공한다.
본 발명에 있어서, 염소 정장(seminal plasma)은 사출된 염소 정액의 염소 정자를 제외한 액상 부분을 의미하며, 각종 부생식선의 분비물들이다. 염소 정장의 성분은 수분, 점액, 염기(요도의 산성을 중화시켜 주는 작용), 과당(염소 정자의 운동에너지원), 염(salts)와 무기물, 응고제, 프로스타글란딘(자궁과 난관을 수축시키고 염소 정자의 운동을 도와주는 역할), 기타물질로 구성되어 있으며, 그 외 몇몇의 물질은 기능이 알려져 있지않다. 특히 염소의 염소 정액에는 인지질 분해 효소가 포함되어 있는데, 이는 염소의 염소 정액 동결 시 세포막 성분을 변화시켜 동결성을 저해한다.
본 발명에 있어서, 유단백질(milk protein)은 우유 중 약 3%를 차지하는 단백질로, 주로 카제인으로 구성된다. 본 발명에서 사용한 유단백질은 살균유를 원심분리하여 침전된 펠릿을 재부유한 것으로, 유청 및 유지방이 제거된 것이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 유단백질은 0.1 내지 5부피%인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 0.5 내지 3부피%이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 2부피%이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 유단백질은 염소 정장 제거에 의해 염소 정자의 생존성 및 운동성 증가를 유도하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 배양액은 포도당 5 내지 10 mM, NaCl 100 내지 150 mM, KCl 3 내지 8 mM, KH2PO4 1 내지 1.5 mM, Na2HPO4 5 내지 15 mM, MgSO4·7H2O 1 내지 1.8 mM 및 CaCl2·2H2O 0.7 내지 1.3 mM을 포함하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 포도당 10.54 mM, NaCl 130 mM, KCl 5.1 mM, KH2PO4 1.19 mM, Na2HPO4 9.86 mM, MgSO4·7H2O 1.47 mM, CaCl2·2H2O 0.93 mM을 포함하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (b)는 염소 정액 1부피에 대하여 염소 정장 제거액 0.5 내지 10부피를 점적하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 염소 정액 1부피에 대하여 염소 정장 제거액 3 내지 4부피를 점적하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (c)는 염소 정장 제거액 혼합물을 100 내지 1000g로 5 내지 15분 동안 원심분리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 500g로 10분 동안 원심분리하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유단백질 및 배양액을 혼합하여 염소 정장(seminal plasma) 제거용 조성물을 제조하는 단계; (b) 염소 정액에 상기 단계 (a)에서 제조된 염소 정장 제거용 조성물을 점적하여 염소 정장 제거액 혼합물을 제조하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 염소 정장 제거액 혼합물을 원심분리하여 염소 정장이 제거된 염소 정액 펠릿을 제조하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 염소 정액 펠릿 및 동결 희석제를 혼합하여 동결시키는 단계;를 포함하는 염소 정액의 동결보존 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 동결보존은 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다. 본 발명에서 동결보존은 염소 정자의 동결보존으로 해석하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 유단백질은 염소 정장 제거에 의해 염소 정자의 생존성 및 운동성 증가를 유도하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 염소 정액 동결 시 염소 정액 내 인지질 분해 효소는 세포막 성분을 변화시켜 동결성을 저해한다. 본 발명에 따른 유단백질은 ‘염소 정액 내 염소 정장을 세정(즉, 제거)하기 위한 것’으로, 염소 정액에 포함된 고유의 효소를 불활화시켜 유단백질은 동결 후 융해된 염소 정자의 생존성 및 운동성 증가를 유도한다. 이와 달리, 종래 기술인 한국 등록특허 제10-2226182호는 유단백질 및 난황을 포함하는 염소 정자의 동결보존용 조성물을 개시하고 있는데, 상기 조성물을 ‘동결 희석제’로 이용한다. 즉, 종래 기술이 유단백질을 동결보존 단계에서 사용하는 반면, 본 발명은 세척 단계부터 사용하여 염소 정장을 제거한 후 원심분리하여 염소 정장이 제거된 펠릿을 얻는다는 점에서 차이가 있습니다. 이와 같은 차이에 따라 본 발명은 염소 정액의 융해 후에도 염소 정자의 생존성 및 운동성이 우수하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 배양액은 포도당 5 내지 10 mM, NaCl 100 내지 150 mM, KCl 3 내지 8 mM, KH2PO4 1 내지 1.5 mM, Na2HPO4 5 내지 15 mM, MgSO4·7H2O 1 내지 1.8 mM 및 CaCl2·2H2O 0.7 내지 1.3 mM을 포함하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 포도당 10.54 mM, NaCl 130 mM, KCl 5.1 mM, KH2PO4 1.19 mM, Na2HPO4 9.86 mM, MgSO4·7H2O 1.47 mM, CaCl2·2H2O 0.93 mM을 포함하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (d)의 동결 희석제는 난황액 및 트릴라딜 원액이 혼합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 난황액 1부피, 세포배양급 정제수 3부피 및 트릴라딘 원액 1부피가 혼합된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 난황액은 계란으로부터 분리된 난황 1부피에 물 3부피를 가한 후 상온에서 교반 및 원심분리하여 수득한 상층액을 의미한다.
본 발명에 따른 염소 정액의 동결보존 방법은 염소 정액 내에 포함된 염소 정장을 세정(즉, 제거)한 후 동결하는 것인바, 염소 정액을 동결 후 융해하더라도 염소 정자의 생존능 및 운동성이 현저히 증가한다는 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 유단백질 및 배양액을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 염소 정장 제거용 조성물은 유단백질 및 배양액 외에 염소 정자의 생존 및 유지를 위한 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 그 예로는 염류, 항산화제, 당류, 유기산, 항생제 등을 포함하는 완충액이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 유단백질 및 배양액을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물을 포함하는 1구획; 및 동결 희석제를 포함하는 2구획;을 포함하는 염소 정자 동결보존용 키트를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 1구획은 염소 정액 내 염소 정장을 제거하기 위한 목적으로, 유단백질 및 배양액을 포함하는 염소 정장 제거용 조성물을 포함하고, 이를 염소 정액과 혼합하여 염소 정액 내 염소 정장을 제거할 수 있도록 구성되어 있을 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 2구획은 염소 정장이 제거된 염소 정액을 동결보존하기 위한 목적으로, 동결 희석제와 염소 정장이 제거된 염소 정액을 혼합할 수 있도록 구성되어 있을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 동결 희석제는 난황액 및 트릴라딘 원액을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 동결 희석제는 난황액 및 트릴라딘 원액 이외에도 염소 정자를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 첨가시키는 다양한 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 추가되는 보존제는 동해에 의한 염소 정자의 손상을 방지하고, 염소 정액의 농도를 저하시켜서, 동결보존 시 염소 정자 간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 염류, 항산화제, 당류, 유기산, 항생제 등을 포함하는 완충액이 될 수 있는데, 바람직하게는 시트르산염, 바이카보네이트염 등의 염류; 타우린(taurine), 하이포타우린(hypotaurine), 트레할로스(trehalose) 등의 항산화제; 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란 등의 당류; 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 등이 될 수 있는데, 이들 각성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 염소 정자 동결보존 키트는 편리성 및 휴대성을 높이기 위해 1구획의 염소 정장 제거용 조성물 또는 2구획의 동결 희석제를 각각 1회 투여량으로 나누어 한 용기 내에 함유하거나 또는 상이한 여러 개의 소(小)용기 내에 함유할 수 있다. 따라서 각 용기 내에는 배열 방법에 따라 여러 개의 소용기가 존재할 수 있다. 본 발명의 염소 정자 동결보존 키트는 필요에 따라, 사용에 필요한 장비 및 각 성분의 투여 방법을 기재한 지시 자료 등을 포함할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 염소 정장 제거액 제조
1-1. 유단백질의 제조
카제인 성분을 분리하기 위하여, 시유로 판매하고 있는 살균유를 30,000 g 값으로 1시간 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 적절한 크기의 멸균 시약 스푼으로 상층부의 유지방 및 상층액의 유청 단백질을 걷어내어, 하부에서 침전된 유단백질을 확보하였다. 확보된 유단백질을 다시 시약스푼으로 긁어내어 원심분리한 우유의 부피의 약 1/10의 세포배양급 초순수로 천천히 재부유하여, 유청 및 유지방이 제거된 유단백질을 얻었다. 유단백은 세포배양급 초순수 이외 염소 정장을 제거하는 목적으로 사용되는 염소 정장제거액으로 재부유할 수 있으며 본 방법은 농축된 유단백질을 제조하는 방법으로 제안된다.
1-2. 염소 정장 제거액 제조
상기 실시예 1-1에서 얻은 유단백질(1 또는 2부피%) 및 배양액을 혼합하여 염소 정장 제거액을 제조하였다. 상기 배양액은 포도당 10.54 mM, NaCl 130 mM, KCl 5.1 mM, KH2PO4 1.19 mM, Na2HPO4 9.86 mM, MgSO4·7H2O 1.47 mM, CaCl2·2H2O 0.93 mM을 포함한다.
실시예 2. 염소 정액의 염소 정장 제거 및 동결
2-1. 염소의 염소 정액 채취
염소의 신선한 염소 정액은 전기 자극법으로 채취하였다. 채취된 염소의 염소 정액은 염소 정장(seminal plasma)를 포함하고 있다.
2-1. 염소 정액에 포함된 염소 정장 제거
염소 정액에 포함된 염소 정장을 제거하기 위하여, 염소 정액 1부피에 상기 실시예 1-2에서 제조된 염소 정장 제거액 3 내지 4부피를 점적(dripping)하였다. 염소 정액 및 염소 정장 제거액 혼합물을 원심분리(500g, 10분)한 후 상층액을 제거하여, 염소 정장이 제거된 염소 정액 펠릿을 얻었다.
2-3. 염소 정액의 동결보존
동결보존을 위하여, 수득된 펠릿에 동결 희석제를 염소 정자의 농도가 80X106 cells/ml이 되도록 점적하였다. 본 특허에서 상기 동결 희석제는 트릴라딜 난황 희석액으로, 난황 1부피에 물 3부피를 천천히 첨가한 난황액(4부피)을 및 트릴라딜 원액 1부피와 혼합하여 제조된 것이다.
희석된 염소 정액을 중탕냉각기법으로 2 내지 3시간에 걸쳐 5℃까지 냉각시켰다. 냉각된 염소 정액은 5℃로 유지되는 염소 정액 처리장치에서 0.25 ml 스트로우에 충진하였다. 충진된 스트로우를 액체질소 위 8 cm에서 15분 동안 예비동결을 실시한 후 액체질소에 침지하여 동결염소 정액을 제조하였다.
실시예 3. 염소 정장 제거 후 동결된 염소 정액의 생존성 및 운동성 확인
염소 정장 제거 후 동결된 염소 정액의 생존성 및 운동성을 확인하였다. 먼저, 상기 실시예 2-3에서 제조된 동결염소 정액을 37.5℃에서 45초간 융해하였다. 융해된 염소 정액을 염소 정자자동분석기를 이용하여 생존성 및 활력도를 분석하였다. 본 실험의 실험군은 1 또는 2부피% 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거액을 이용한 흑염소(장수 계통, 당진 계통, 통영 계통)의 동결염소 정액이며, 대조군은 유단백질을 포함하지 않는 염소 정장제거액을 이용한 흑염소의 동결염소 정액이다. 1 또는 2부피% 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거액 이용 시 염소 정액의 생존성 및 운동성을 확인한 결과는 각각 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 1부피% 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거액을 이용한 실험군은 대조군에 비해 장수 계통 및 당진 계통 흑염소의 염소 정액 생존성 및 운동성이 유의하게 높은 것을 확인하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 2부피% 유단백질을 포함하는 염소 정장 제거액을 이용한 실험군은 대조군에 비해 장수 계통 및 통영 계통 흑염소의 염소 정액 생존성 및 운동성이 유의하게 높은 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 유단백질이 염소 정액에 포함된 염소 정장을 제거할 수 있으며, 유단백에 의하여 염소 정장이 제거된 염소 정액은 동결 후 융해하더라도 염소 정자의 생존능 및 운동성이 현저히 증가한다는 것을 확인하였다. 이는 유단백질을 활용한 염소 정장제거 방법이 염소 정자의 동결보존에 효과적이라는 것을 의미하는 바, 본 발명의 유단백질은 체외 인공수정 관련 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Claims (11)
- (a) 유단백질 및 배양액을 혼합하여 염소 정장(seminal plasma) 제거용 조성물을 제조하는 단계;
(b) 염소 정액에 상기 단계 (a)에서 제조된 염소 정장 제거용 조성물을 점적(dripping)하여 염소 정장 제거액 혼합물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 염소 정장 제거액 혼합물을 원심분리하는 단계;를 포함하는 염소 정장 제거 방법. - 제1항에 있어서,
상기 유단백질은 0.1 내지 5부피%인, 염소 정장 제거 방법. - 제1항에 있어서,
상기 유단백질은 염소 정장 제거에 의해 염소 정자의 생존성 및 운동성 증가를 유도하는 것인, 염소 정장 제거 방법. - 제1항에 있어서,
상기 배양액은 포도당 5 내지 10 mM, NaCl 100 내지 150 mM, KCl 3 내지 8 mM, KH2PO4 1 내지 1.5 mM, Na2HPO4 5 내지 15 mM, MgSO4·7H2O 1 내지 1.8 mM 및 CaCl2·2H2O 0.7 내지 1.3 mM을 포함하는 것인, 염소 정장 제거 방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (b)는 염소 정액 1부피에 대하여 염소 정장 제거액 0.5 내지 10부피를 점적하는 것인, 염소 정장 제거 방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (c)는 염소 정장 제거액 혼합물을 100 내지 1000g로 5 내지 15분 동안 원심분리하는 것인, 염소 정장 제거 방법. - (a) 유단백질 및 배양액을 혼합하여 염소 정장(seminal plasma) 제거용 조성물을 제조하는 단계;
(b) 염소 정액에 상기 단계 (a)에서 제조된 염소 정장 제거용 조성물을 점적하여 염소 정장 제거액 혼합물을 제조하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 염소 정장 제거액 혼합물을 원심분리하여 염소 정장이 제거된 염소 정액 펠릿을 제조하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 염소 정액 펠릿 및 동결 희석제를 혼합하여 동결시키는 단계;를 포함하는 염소 정액의 동결보존 방법. - 제7항에 있어서,
상기 배양액은 포도당 5 내지 10 mM, NaCl 100 내지 150 mM, KCl 3 내지 8 mM, KH2PO4 1 내지 1.5 mM, Na2HPO4 5 내지 15 mM, MgSO4·7H2O 1 내지 1.8 mM 및 CaCl2·2H2O 0.7 내지 1.3 mM을 포함하는 것인, 염소 정액의 동결보존 방법. - 제7항에 있어서,
상기 단계 (d)의 동결 희석제는 난황액 및 트릴라딜 원액이 혼합된 것인, 염소 정액의 동결보존 방법. - 삭제
- 삭제
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