KR102625086B1 - Biomarkers for determining the maturation date of wheat - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따라 규명된 밀의 성숙기에 유의하게 영향을 미치는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs) 마커는 밀의 재배 특성을 재배 품종을 선택하는데 도움을 줄 수 있고, 밀 품종에 따라 적합한 재배 방법을 제시하는 것이 가능하다.The single nucleotide polymorphisms (SNPs) markers that significantly affect the maturity period of wheat identified according to the present invention can help select cultivars for the cultivation characteristics of wheat and suggest appropriate cultivation methods depending on the wheat cultivar. It is possible.
Description
본 발명은 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 밀의 성숙기 판별용 키트, 및 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 밀의 성숙기 판별 방법에 관한 것이다.The present invention provides a SNP marker for determining the maturity stage of wheat, a composition for determining the maturity stage of wheat comprising an agent capable of detecting or amplifying the SNP marker, a kit for determining the maturity stage of wheat comprising the composition, and (a) a Amplifying the SNP marker region of the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 1 from the DNA of the sample; and (b) determining the base of the amplified SNP marker region in step (a).
밀은 동양에서 보조식량으로 쓰이지만 서양에서는 주식량이며, 쌀과 함께 세계의 2대 식량 작물이다. 90% 이상이 제분되어 제면·제빵·제과·공업용으로 사용된다. 세계 밀 생산량은 최근 10년 동안 소비량 증가 추세에 맞추어 꾸준히 증가하고 있지만, 수량성 증대는 밀 육종 프로그램에서 여전히 제일 중요한 목표이다. Wheat is used as a supplementary food in the East, but is a staple food in the West, and is one of the world's two largest food crops along with rice. More than 90% is milled and used for noodle making, baking, confectionery, and industrial purposes. Although world wheat production has steadily increased over the past decade in line with increased consumption, increasing yield remains the most important goal in wheat breeding programs.
이상기후로 인한 재배 환경의 급격한 변화로 인하여 생산성 증진과 안정성을 동시에 확보해야 하기 때문에 세계 각국은 지속적인 관련 연구를 수행하고 있다. 유럽은 최근에 기후 변화 대응을 위한 내건성 증진과 밀 수량 증대에 관한 연구가 활발하다. 그러나, 국내에서의 밀에 대한 연구는 타국과 비교해서 매우 부진한 편이다. Countries around the world are continuously conducting related research because it is necessary to simultaneously increase productivity and ensure stability due to rapid changes in the cultivation environment due to abnormal climate. In Europe, research has recently been active on improving drought tolerance and increasing wheat yield to respond to climate change. However, research on wheat in Korea is very poor compared to other countries.
밀의 수량은 단위면적당 분얼수, 1수립수 및 종자 무게의 영향을 가장 많이 받는 것으로 알려져 있으며, 이러한 측면에서, 밀 수량 증대를 위해 밀의 농업 형질과 유전적 특성을 연구하고, 국내 밀 육종 또는 밀 재배에 적용될 수 있는 한국형 밀 핵심집단의 SNP 분석 및 분자 마커를 개발하는 것이 필요하다. It is known that the yield of wheat is most affected by the number of tillers per unit area, the number of kernels per unit, and the seed weight. In this respect, to increase wheat yield, agricultural traits and genetic characteristics of wheat are studied, and domestic wheat breeding or wheat cultivation is conducted. It is necessary to develop SNP analysis and molecular markers of the Korean wheat core group that can be applied to.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1번의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레이티드에서 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레이드를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, where the 36th base is T or G, and a polynucleotide consisting of 5 to 200 consecutive bases including the 36th base, Alternatively, the present invention provides a SNP (Single Nucleotide Polymorphism) marker composition for determining the maturity stage of wheat, which includes a polynucleate complementary thereto.
본 발명의 다른 하나의 목적은 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for determining the maturity stage of wheat, which includes an agent capable of detecting or amplifying a SNP marker for determining the maturity stage of wheat.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 밀의 성숙기 판별용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for determining the maturity stage of wheat containing the above composition.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 밀 시료의 DNA로부터 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 36번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 성숙기가 빠른 밀 판별 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is (a) amplifying or detecting the 36th base, which is a polymorphic site of a SNP marker for determining the maturity stage of wheat, from the DNA of a wheat sample; and (b) determining the base of the polymorphic site amplified or detected in step (a).
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 서열번호 1번의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레이티드에서 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레이드를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention, in one embodiment, is a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, where the 36th base is T or G, and 5 to 200 consecutive sequences containing the 36th base. Provided is a SNP (Single Nucleotide Polymorphism) marker composition for determining the maturity stage of wheat, comprising a polynucleotide consisting of a complementary base, or a polynucleotide complementary thereto.
상기 마커는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개, 구체적으로 5 내지 150개, 보다 구체적으로 5 내지 100개, 보다 더 구체적으로 5 내지 50개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커일 수 있다. 또한, 상기 마커는 상기 36번째 염기가 T일 경우 성숙기가 빠른 밀인 것으로 판별하는 것일 수 있다.The marker may be all or part of the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 1, and more specifically, the 36th base of the polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 1 is T or G, and 5 to 200 bases containing the 36th base. SNP (Single SNP) for determining the maturity stage of wheat, comprising a polynucleotide consisting of 5 to 150 consecutive bases, more specifically 5 to 100 bases, and even more specifically 5 to 50 consecutive bases, or a complementary polynucleotide thereof. It may be a Nucleotide Polymorphism (Nucleotide Polymorphism) marker. Additionally, if the 36th base is T, the marker may be used to determine that the wheat is of early maturity.
본 발명의 밀의 성숙기를 판별할 수 있는 단일 염기 다형성 마커는 밀 2D번 염색체(genome)의 BA00470958일 수 있으며, 상기 BA00470958는 서열번호 1번의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레이티드에서 36번째 염기가 T 또는 G일 수 있다.The single nucleotide polymorphism marker that can determine the maturity stage of wheat of the present invention may be BA00470958 of the wheat chromosome 2D (genome), wherein the 36th base of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is T. Or it could be G.
즉, 본 발명에 있어서, 밀의 성숙기의 판단은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기가 T인 경우 성숙기가 빨라 출수기도 빠르며, 영양생장기간이 짧고, 식물체의 크기도 작으며 빠른 개화를 나타냈고, 상기 36번째 염기가 G인 경우 성숙기가 늦고 영양생자기간이 길어 식물체의 크기가 대체적으로 큰 것으로 나타났다. 본 발명의 일 실시예에서, 유전자형이 TT인 경우 성숙기가 빠른 것으로 나타냈고, 유전자형이 GG인 경우 TT의 유전자형 보다 성숙기가 늦은 것으로 판별되었다(표 4 및 5).That is, in the present invention, the maturity period of wheat is determined when the 36th base of the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is T, the maturity period is fast, the seeding period is fast, the vegetative growth period is short, and the plant size is small. It showed rapid flowering, and when the 36th base was G, the maturity period was late, the vegetative period was long, and the plant size was generally large. In one embodiment of the present invention, when the genotype was TT, the maturity period was found to be early, and when the genotype was GG, the maturity period was determined to be later than the genotype of TT (Tables 4 and 5).
본 발명에서 용어 "판별"은 고구마 품종 시료로부터, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 품종의 다양성을 판단하여 구별하는 것을 의미하며, '구별'과 혼용하여 사용할 수 있다.In the present invention, the term "discrimination" refers to determining and distinguishing the diversity of varieties from a sweet potato variety sample using the primer set of the present invention, and can be used interchangeably with 'distinction'.
본 발명의 용어 "SNP(Single Nucleotide Polymorphism)"란, 단일염기다형성으로, 게놈에서 단일염기(A, T, C, 또는 G)가 종의 멤버들간 또는 한 개체의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.The term "SNP (Single Nucleotide Polymorphism)" of the present invention refers to a single nucleotide polymorphism that occurs when a single base (A, T, C, or G) in the genome is different between members of a species or between paired chromosomes of an individual. It refers to the diversity of DNA sequences.
본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이와 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.The term "SNP marker" of the present invention refers to a single nucleotide polymorphism allele base pair on a DNA sequence used to identify an individual or species. Since SNPs have a relatively high frequency, are stable, and are distributed throughout the genome, thereby generating genetic diversity in individuals, SNP markers can serve as an indicator of genetic proximity between individuals. SNP markers generally include the phenotypic changes that accompany single nucleotide polymorphisms, but in some cases this may not be the case. In the case of the SNP marker of the present invention, it can indicate differences in the phenotype of an individual, such as variations in amino acid sequence.
본 발명의 용어 "개체"란, 밀의 성숙기를 확인하고자 하는 대상인 밀을 의미하며, 상기 밀로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 밀의 성숙기 시기를 판단할 수 있다.The term "individual" of the present invention refers to wheat, which is the object for which the maturity stage of wheat is to be confirmed, and the maturity stage of the wheat can be determined by analyzing the genotype of the SNP marker using a sample obtained from the wheat.
상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.The specimen may be a sample such as a leaf, root, stem, flower, fruit, isolated tissue, or isolated cell, but is not particularly limited thereto.
본 발명의 용어 "다형성(Polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(Locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(Allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.The term "polymorphism" of the present invention refers to the presence of two or more alleles at one genetic locus. Among the polymorphic sites, only a single base differs depending on the individual. It is called polymorphism. Preferred polymorphic markers have two or more alleles with an occurrence frequency of 1% or more, more preferably 5% or 10% or more in the selected population.
본 발명의 용어 "대립유전자(Allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(Biallele)를 갖는다.The term "allele" in the present invention refers to several types of one gene that exist at the same genetic locus on a homologous chromosome. Alleles are also used to represent polymorphisms, for example, a SNP has two types of alleles (Bialleles).
본 발명은 밀에서 유전자를 분리하고, GWAS 분석결과와 GAPIT을 통해 성숙기에 대하여 LOD값 5이상을 선택하였으며 이를 통하여 SNP 탐색 및 NCBI를 통해 SNP와 연관되어 있는 유전자를 탐색하였다.The present invention isolated genes from wheat, selected LOD values of 5 or more for maturity through GWAS analysis results and GAPIT, and searched for genes associated with SNPs through SNP search and NCBI.
핵심집단 계통 및 SNP chip data를 활용하여 SNP 염기서열을 배열하였으며 출수시기에 연관된 SNP 마커를 선별하였다.SNP base sequences were sequenced using the core population lineage and SNP chip data, and SNP markers related to head-off time were selected.
구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기가 성숙기 결정에 특이적임을 확인하였고, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기가 T로 특이적이고, 성숙시기가 빠르고, 식물체가 작아지거나, 개화기 빠른 것을 확인하였다.Specifically, it was confirmed that the 36th base of the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is specific for determining the maturity period, and specifically, the 36th base of the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is specific to T, and the maturity period It was confirmed that the plants were growing faster, the plants were smaller, and the flowering period was earlier.
본 발명의 다른 하나의 양태로, 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, a composition for determining the maturity stage of wheat is provided, comprising an agent capable of detecting or amplifying a SNP marker for determining the maturity stage of wheat.
본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 검출 또는 증폭을 통해 확인하여 밀의 성숙기를 판별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브를 의미한다. The term "agent capable of detecting or amplifying a SNP marker" in the present invention refers to a composition that can determine the maturity stage of wheat by detecting or amplifying the polymorphic site of the above gene, preferably the SNP. It refers to a primer set or probe that can specifically detect or amplify the polynucleotide of a marker.
상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 2 및 3으로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.Primers used for amplification of the SNP marker are template-directed DNA under appropriate conditions (e.g., four different nucleoside triphosphates and DNA, polymerizer such as RNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and appropriate temperature. It can be a single-stranded oligonucleotide that can serve as a starting point for synthesis. The appropriate length of the primer may vary depending on the purpose of use, but is usually 15 to 30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form stable hybrids with the template. The primer sequence does not need to be completely complementary to the SNP marker, but must be sufficiently complementary to hybridize with the SNP marker, and may preferably include a polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NOs. 2 and 3, but in particular, It is not limited.
일예로, 상기 프라이머는 일 예로 서열번호 2(5'-AGTCTTCTACGCCTTCACC-3') 및 서열번호 3(5'-CATAGACACACCGATACACG-3')의 프라이머 세트일 수 있다.For example, the primers may be a primer set of SEQ ID NO: 2 (5'-AGTCTTTCTACGCCTTCACC-3') and SEQ ID NO: 3 (5'-CATAGACACACCGATACACG-3').
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(Template)와 염기쌍(Base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. The term "primer" of the present invention refers to a base sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group that can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. It refers to a short sequence that functions as a point, and is mainly used in the form of a primer set that amplifies a specific section. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and temperature. At this time, PCR conditions and the length of sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
본 발명에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.The primer set used in the present invention may be composed of the base sequences of SEQ ID NOs: 2 and 3.
본 발명의 용어, "프로브"는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 통해 표지되어 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다.As the term of the present invention, "probe" is a DNA or RNA base sequence of various lengths, labeled with a radioactive label or a fluorescent label, and is composed of a single-stranded base sequence and is specific to a single-stranded DNA or RNA with a complementary sequence. It is characterized by binding and hybridization, and the target can be detected by detecting the label signal of the hybridized probe.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.Primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoamidite solid support method or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphorylates). amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for determining the maturity stage of wheat, including the composition.
상기 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.The kit may be an HRM analysis kit or a DNA chip kit.
본 발명의 HRM 분석 키트는 밀의 성숙기 판단용 마커인 SNP 마커의 유전자형을 증폭하여 판독하거나 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지함으로써 밀의 성숙기를 판단할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 밀의 성숙기 판단용 HRM 분석 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기의 변이에 따른 이중가닥의 해리 정도의 차이를 감지하여 유전자형을 판단하는 키트일 수 있다. The HRM analysis kit of the present invention can determine the maturity stage of wheat by amplifying and reading the genotype of the SNP marker, which is a marker for determining the maturity stage of wheat, or by detecting small differences in the PCR dissociation curve. Specifically, the HRM analysis kit for determining the maturity stage of wheat provided by the present invention is a kit that determines the genotype by detecting the difference in the degree of double-strand dissociation due to the mutation of the 36th base of the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1. It can be.
상기 "고해상도 융해(high resolution melting, HRM) 분석" 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법으로, 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 보다 개선된 이중가닥 DNA(dsDNA)에 의해 가능하게 된다. dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리할 수 있다. 본 발명에서는 밀의 성숙기 판단을 위하여 HRM 분석을 사용하였다.The "high resolution melting (HRM) analysis" technology is a relatively new post-PCR analysis method used to identify variations in nucleic acid sequences. The method is based on detecting small differences in the PCR dissociation curve. do. This is made possible by more improved double-stranded DNA (dsDNA) with dyes used in conjunction with PCR instruments. For HRM analysis of differences in the degree of dissociation of dsDNA depending on temperature, data can be analyzed and processed using specifically designed software. In the present invention, HRM analysis was used to determine the maturity of wheat.
상기 HRM 분석 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), RNAase, DEPC-수(DEPC-water), 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다. The HRM analysis kit includes a pair of primers specific for a polynucleotide containing the SNP marker, DNA polymerase, deoxynucleotides (dNTPs), RNAase, DEPC-water, a test tube, and an appropriate container. may include.
본 발명의 DNA 칩 키트는 밀의 성숙기 판단용 마커인 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 칩을 이용하여 특이적으로 타겟 DNA와 혼성화하여 결합하는 것을 특징으로 하며, SNP의 염기 변이에 따라 혼성화 수준의 변화가 나타나는 것을 이용하여 밀의 성숙기를 판별할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 밀의 성숙기 판단용 DNA 칩 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드를 표지자와 함께 칩에 부착하고 타겟 DNA를 칩에 반응시켜 혼성화 수준을 통해 유전자형을 판단하는 키트인 것인, 밀의 성숙기 판단용 키트일 수 있다.The DNA chip kit of the present invention specifically hybridizes and binds to target DNA using a chip to which an oligonucleotide containing a base sequence complementary to the sequence of a polynucleotide containing a SNP marker, which is a marker for determining the maturity stage of wheat, is attached. It is characterized by a change in hybridization level depending on the base mutation of the SNP, which can be used to determine the maturity stage of wheat. Specifically, the DNA chip kit for determining the maturity stage of wheat provided by the present invention is an oligonucleotide complementary to a polynucleotide sequence consisting of 5 to 200 bases including the 36th base of the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1. It may be a kit for determining the maturity stage of wheat, which is a kit that determines the genotype through the level of hybridization by attaching a marker to a chip and reacting the target DNA to the chip.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 밀 시료의 DNA로부터 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 36번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 밀의 성숙기 판별 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides the steps of (a) amplifying or detecting the 36th base, which is a polymorphic site of a SNP marker for determining the maturity stage of wheat, from the DNA of a wheat sample, and (b) amplifying or detecting the step (a). A method for determining the maturity stage of wheat is provided, including the step of determining the base of the polymorphic site.
상기 판별 방법은 상기 36번째 염기가 T인 경우, 성숙기가 빠른 밀인 것으로 판별할 수 있다.The above determination method can determine that the wheat is of early maturity when the 36th base is T.
상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가아제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(Transcription amplification) 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.The step of amplifying polynucleotides from the DNA sample in step (a) can be performed using any method known to those skilled in the art. For example, target nucleic acid can be amplified through PCR and purified. Additionally, ligase chain reaction (LCR), transcription amplification, and self-sustaining sequence cloning and nucleic acid-based sequence amplification (NASBA) can be used.
상기 (a)단계는 서열번호 2 및 3으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출할 수 있다.In step (a), bases can be amplified or detected using a primer set consisting of SEQ ID NOs: 2 and 3.
상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(Microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(Dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(Mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.Among the above methods, the methods for determining the base of the amplified SNP marker region in step (b) include sequencing analysis, hybridization by microarray, allele specific PCR, and dynamic allele hybridization technique. allele-specific hybridization (DASH), PCR extension analysis, PCR-SSCP, PCR-RFLP analysis, HRM analysis or TaqMan techniques, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (e.g., Sequenom's MassARRAY system), mini-sequencing. (Mini-sequencing) methods, Bio-Plex system (BioRad), CEQ and SNPstream system (Beckman), Molecular Inversion Probe array technology (e.g., Affymetrix GeneChip), and BeadArray Technologies (e.g., Illumina GoldenGate and Infinium assays). ), etc., but is not particularly limited thereto. One or more alleles at the SNP marker can be identified by these methods or other methods available to those skilled in the art.
"HRM 분석" 기술은 앞서 설명한 바와 같다.The “HRM analysis” technology is the same as previously described.
상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.The sequencing analysis can be performed using a conventional method for determining base sequences, or can be performed using an automated genetic analyzer. In addition, allele-specific PCR refers to a PCR method that amplifies the DNA fragment where the mutation is located using a primer set including a primer designed with the base where the mutation site is located as the 3' end. The principle of the method is that, for example, when a specific base is substituted from A to G, PCR is performed by designing a primer containing A as the 3' terminal base and a reverse primer capable of amplifying a DNA fragment of an appropriate size. When performing the reaction, if the base at the mutation position is A, the amplification reaction is performed normally and a band at the desired position is observed, and if the base is replaced with G, the primer can complement the template DNA, but 3 ' It takes advantage of the fact that the amplification reaction is not performed properly due to the failure of complementary bonds at the terminal end. DASH can be performed by conventional methods, preferably by the method by Prince et al.
상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.The TaqMan method includes (1) designing and producing primers and TaqMan probes to amplify the desired DNA fragment; (2) labeling probes of different alleles with FAM dye and VIC dye (Applied Biosystems); (3) using the DNA as a template and performing PCR using the primers and probes; (4) After the above PCR reaction is completed, analyzing and confirming the TaqMan assay plate with a nucleic acid analyzer; and (5) determining the genotypes of the polynucleotides of step (1) from the analysis results.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.Meanwhile, in the PCR extension analysis, a DNA fragment containing the base where the single nucleotide polymorphism is located is first amplified with a pair of primers, and then all nucleotides added to the reaction are inactivated by dephosphorylation, and then a specific extension primer, dNTP, is used to inactivate the DNA fragment. This is accomplished by performing a primer extension reaction by adding the mixture, dideoxynucleotide, reaction buffer, and DNA polymerase. At this time, the extension primer uses the base immediately adjacent to the 5' direction of the base where the mutation site is located as the 3' end, and the dNTP mixture excludes nucleic acids having the same base as the dideoxynucleotide, and the dideoxynucleotide is used for the mutation. It is selected from one of the base types represented. For example, when there is a substitution from A to G and a mixture of dGTP, dCTP and TTP and ddATP are added to the reaction, the primer is extended by DNA polymerase at the base where the substitution occurred, and after a few bases, A The primer extension reaction is terminated by ddATP at the position where the base first appears. If the substitution has not occurred, the extension reaction is terminated at that position, so that the type of base indicating the mutation can be determined by comparing the length of the extended primer.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.At this time, the detection method is to detect the mutation by detecting fluorescence using a genetic analyzer (e.g., ABI's Model 3700, etc.) used for general base sequence determination in the case of fluorescently labeled extension primers or dideoxynucleotides. When using unlabeled extension primers and dideoxynucleotides, the mutation can be detected by measuring the molecular weight using matrix assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) technique.
구체적으로, 상기 (b)단계는 HRM(High resolution melting) 분석을 통해 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정하는 것일 수 있다.Specifically, step (b) may be to determine the base of the polymorphic site by detecting the difference in the degree of dissociation according to base mutation in double-stranded DNA through HRM (high resolution melting) analysis.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는, 밀의 성숙기를 판별할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and capable of determining the maturity stage of wheat.
본 발명자들은 밀의 성숙기 판별하기 위해 전체 유전체 시퀀싱을 통해 SNP를 탐색하였고 탐색 과정에서 벼의 성숙기와 관계가 있는 QTL 주변의 유전자를 발견하였다. 또한, 해당 유전자의 ORF 서열에서 SNP를 발견했으며, 해당 SNP가 밀의 성숙기를 정확하게 판별 가능한 SNP 마커임을 입증하였다. The present inventors searched for SNPs through whole genome sequencing to determine the maturity period of wheat, and during the search process, they discovered genes around QTL that are related to the maturity period of rice. In addition, a SNP was discovered in the ORF sequence of the gene, and it was proven that the SNP is a SNP marker that can accurately determine the maturity stage of wheat.
본 발명에서 있어서, 상기 밀의 성숙기를 판별하기 위한 정보의 제공은 컴퓨터 프로그램을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 밀의 상기 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기 확인 결과를 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 통하여 출력하고, 그 결과, 판별 대상 밀의 성숙기가 빠른지 또는 느린지 확인할 수 있다. 또는, 검사 대상 밀의 판별된 성숙기에 맞추어 재배 방법을 제공할 수 있다. In the present invention, information for determining the maturity of wheat can be provided through a computer program. For example, the result of confirming the base of the polymorphic site of the single nucleotide polymorphism marker of wheat can be output through a computer-readable program, and as a result, it can be confirmed whether the wheat to be determined has a fast or slow maturation period. Alternatively, a cultivation method can be provided according to the determined maturity stage of the wheat being tested.
본 발명의 신규한 SNP 마커 및 이를 이용한 분석방법은 밀의 성숙기를 판별할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 밀의 재배 특성을 고려하여 재배 품종을 선택하는데 도움을 줄 수 있고, 밀 품종에 따라 적합한 재배 방법을 제시할 수 있다.The novel SNP marker of the present invention and the analysis method using the same can be used as a means to determine the maturity stage of wheat, so they can help select cultivars by considering the cultivation characteristics of wheat, and a cultivation method suitable for each wheat variety. can be presented.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 성숙기에 대한 GWAS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 BA00470958에 대한 염기서열을 분석한 결과이다.Figure 1 shows the results of GWAS analysis on maturity performed according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the results of nucleotide sequence analysis for BA00470958 performed according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Below, preferred embodiments are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided only to make the present invention easier to understand, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
[실시예][Example]
준비예 1. 밀 품종의 수집 및 전장유전체 연관분석(GWAS) 수행 Preparation example 1. Collection of wheat varieties and performance of genome-wide association analysis (GWAS)
국립 유전자원센터에서 분양 받은 국내외 재배 및 수집종 밀 1,969점(유전자원센터에서 1,269점, 진흥청 고세대 계통 CB700점)을 대립형질(Allele) 특이적인 SSR마커 37쌍을 이용하여 약 73,000번의 PCR을 수행하고(표 1), Qiagen사의 QIAxcel 프로그램을 이용하여 디지털 전기영동을 수행하여 밴드 양상을 확인하였다.Approximately 73,000 PCRs were performed using 37 pairs of allele-specific SSR markers on 1,969 domestic and foreign cultivated and collected wheat varieties distributed by the National Genetic Resources Center (1,269 from the Genetic Resources Center and 700 items from the Promotion Agency's high-generation lineage CB). (Table 1), and digital electrophoresis was performed using Qiagen's QIAxcel program to confirm the band pattern.
GBS 분석도구로는 GBS-SNP-CROP (Melo et al. 2016)을 사용하였으며, Core Hunter (Crossa et al. 2009), GenoCore (Jeong et al.2017), MSTRAT (Gouesnard et al. 2001)), PowerCore (Kim et al. 2007) 등을 통하여 616점을 밀의 핵심집단으로 선정하였고, 그 중 575점에 대하여 SNP chip 분석을 진행하였다. SNP chip 분석 실험은 Axiom™ BreedWheat 35K Genotyping Array (384HT format)와 Axiom GeneTitan Multi-Channel Instrument를 이용하여 수행하였다.GBS-SNP-CROP (Melo et al. 2016) was used as a GBS analysis tool, Core Hunter (Crossa et al. 2009), GenoCore (Jeong et al. 2017), MSTRAT (Gouesnard et al. 2001), Through PowerCore (Kim et al. 2007), 616 points were selected as the wheat core group, and SNP chip analysis was performed on 575 of them. SNP chip analysis experiments were performed using Axiom™ BreedWheat 35K Genotyping Array (384HT format) and Axiom GeneTitan Multi-Channel Instrument.
준비예 2. 616점의 밀 핵심집단에 대한 농업형질 별 단일 염기 다형성 마커 연관 분석Preparation example 2. Association analysis of single nucleotide polymorphism markers by agricultural trait for 616 wheat core populations
616계통에 대하여 주요농업형질 조사를 진행하였고, GAPIT을 통해 지노타이핑(Genotyping) 데이터와 페노타이핑(Phenotyping) 데이타를 대입하여 전장유전체 연관분석(GWAS)를 수행하였다. A survey of major agricultural traits was conducted for 616 lines, and genome-wide association analysis (GWAS) was performed by substituting genotyping and phenotyping data through GAPIT.
농업형질에 대한 모델 분석은 다음 식 1과 같다:The model analysis for agricultural traits is as follows:
[식 1][Equation 1]
상기 식 1에서, yi+ 값은 각각의 농업특성 형질을 의미하며, β0 은 방정식의 절편, β1 은 추가효과, x1i는 설명변수, β2 는 우월효과, ei 는 확률오차이다. In Equation 1 above, the yi+ value means each agricultural characteristic, β0 is the intercept of the equation, β1 is the additive effect, x1i is the explanatory variable, β2 is the superiority effect, and ei is the random error.
밀 유전자원에 대하여 생육조사와 종실 특성 분석을 진행하였으며, 단일 염기 다형성 마커 분석을 통하여 성숙기를 포함한 19개 농업형질에 대하여 LOD 값 5를 컷오프(Cut-off)로 하여 총 1,248개의 연관마커 후보군을 선발하였다.Growth surveys and seed characteristic analysis were conducted on wheat genetic resources, and through single nucleotide polymorphism marker analysis, a total of 1,248 associated marker candidates were identified using an LOD value of 5 as a cut-off for 19 agricultural traits, including maturity. selected.
실험예 1. 성숙기 관련 단일 염기 다형성 마커 탐색Experimental Example 1. Search for maturation-related single nucleotide polymorphism markers
GWAS 분석결과와 GAPIT을 통해 성숙기에 대하여 LOD값 5이상을 선택하였으며 이를 통하여 SNP 탐색 및 NCBI를 통해 SNP와 연관되어 있는 유전자를 탐색하였다.Through GWAS analysis results and GAPIT, a LOD value of 5 or higher was selected for the maturity stage, and through this, genes associated with SNPs were searched through SNP search and NCBI.
핵심집단 계통 및 SNP chip data를 활용 하여 SNP 염기서열을 배열하였으며 출수시기에 연관된 SNP를 탐색하였다. SNP base sequences were sequenced using the core population lineage and SNP chip data, and SNPs related to head-to-head time were searched.
그 중 1개의 SNP를 확보하였고, 밀 염색체 상의 각 SNP의 위치를 표 2에 나타내었다.Among them, one SNP was secured, and the location of each SNP on the wheat chromosome is shown in Table 2.
(BA00470958)AX-94466528
(BA00470958)
BA00470958 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열번호1(TCTAACTCAGCTGCAATCTTACTGCATCTCATCAG[G/T]GATCACACAGACTGACAGACGCATAATCTACGCAT)로 나타낼 수 있다. 상기에서 [G/T]는 해당 SNP 부위에 염기로 G 또는 T가 존재할 수 있음을 의미한다. The sequence of the polynucleotide containing the BA00470958 SNP can be represented by SEQ ID NO: 1 (TCTAACTCAGCTGCAATCTTACTGCATCTCATCAG[G/T]GATCACACAGACTGACAGACGCATAATCTACGCAT). In the above, [G/T] means that G or T may be present as a base in the corresponding SNP site.
실험예 2. 성숙기 관련 단일 염기 다형성 마커의 특성 규명Experimental Example 2. Characterization of maturation-related single nucleotide polymorphism markers
실험예 1에서 탐색된 단일 염기 다형성 마커가 밀의 성숙기를 판별할 수 있는지 확인하기 위해서, 밀의 핵심집단 내의 품종에 대하여 임의로 선택하여 AX-94466528(BA00470958)의 유전자형과 성숙기를 확인하였고, 국내 품종(금강, 청계, 다홍, 은파, 그루)에 적용하여 BA00470958 SNP 상 염기를 통해 성숙기의 판별이 가능한지 확인하였다(표 5). 또한, 밀의 핵심집단 내의 품종에 대하여 임의로 선택하여 AX-94466528(BA00470958)에서 유전자형과 성숙기를 확인하여 표 4에 나타내었다.In order to confirm whether the single nucleotide polymorphism marker discovered in Experimental Example 1 can determine the maturity stage of wheat, cultivars within the core group of wheat were randomly selected to confirm the genotype and maturity stage of AX-94466528 (BA00470958), and the domestic cultivar (Geumgang , Cheonggye, Dahong, Eunpa, and Groo) to confirm whether it was possible to determine the maturity stage through the bases on the BA00470958 SNP (Table 5). In addition, cultivars within the core group of wheat were randomly selected and their genotypes and maturity stages were confirmed in AX-94466528 (BA00470958), which are shown in Table 4.
또한, BA00470958 SNP를 확인하기 위한 HRM프라이머는 5'-AGTCTTCTACGCCTTCACC-3'(서열번호 2)와 5'-CATAGACACACCGATACACG-3'(서열번호 3)를 이용하였다. 분석을 위한 HRM PCR은 95℃에서 5분 유지 후 95℃ 10초(1step), 65℃ 25초(2step)의 조건으로 1step과 2step을 1cycle로 하여 45번 반복 후에 0.1초마다 PCR증폭과정에서 온도에 따른 형광변화를 탐색하여 수행하였다.In addition, 5'-AGTCTTTCTACGCCTTCACC-3' (SEQ ID NO: 2) and 5'-CATAGACACACCGATACACG-3' (SEQ ID NO: 3) were used as HRM primers to confirm the BA00470958 SNP. HRM PCR for analysis is maintained at 95℃ for 5 minutes, then 1 step and 2 steps are repeated 45 times under the conditions of 95℃ for 10 seconds (1 step) and 65℃ for 25 seconds (2 steps), and the temperature is changed every 0.1 second during the PCR amplification process. This was performed by exploring the fluorescence change according to .
하기의 표 3은 단일 염기 다형성 마커의 특성 규명에 사용된 밀을 나타낸 것이다.Table 3 below shows the wheat used for characterization of single nucleotide polymorphism markers.
(Maturation Date, MD)maturity
(Maturation Date, MD)
표 4에 나타낸 바와 같이, BA00470958 SNP의 유전자형이 TT인 경우, 유전자형이 GG인 경우보다 성숙기가 약 한달 가량 빠른 것을 확인할 수 있다. 즉, 성숙기가 빠르고, 이에 따라 영양생장 기간이 짧아, 식물체의 크기가 작은 것으로 확인되었다.As shown in Table 4, it can be seen that when the genotype of BA00470958 SNP is TT, the maturation period is about a month earlier than when the genotype is GG. In other words, it was confirmed that the maturity period was fast, the vegetative growth period was short, and the plant size was small.
상기 표 5는 상기 SNP를 통해서 성숙기를 판별할 수 있는지 확인하기 위해서, 국내 품종(금강, 청계, 다홍, 그루)에 적용하여 BA00470958 SNP 상의 유전자형을 통해 성숙기의 판별이 가능한지 확인한 결과를 나타낸 것이다.Table 5 above shows the results of confirming whether it is possible to determine the maturity period through the genotype on the BA00470958 SNP by applying it to domestic cultivars (Geumgang, Cheonggye, Dahong, and Groo) to confirm whether the maturity period can be determined through the SNP.
상기 표 5를 참조하면, 그루, 은파, 다홍, 청계, 금강 모두 유전자형은 TT 였고 이의 성숙시기는 모두 6월초로 빠른 것으로 확인되었다. 이는 앞서 확인된 결과 및 SNP를 확인한 각 품종 간의 염기서열을 정렬하여 확인한 결과와도 동일한 경향성을 나타내는 것임을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 단일 염기 다형성 마커는 밀에서 성숙기를 효과적으로 판별할 수 있음을 알 수 있다.Referring to Table 5 above, the genotype of Guru, Eunpa, Dahong, Cheonggye, and Geumgang were all TT, and their maturation time was confirmed to be early in early June. It can be seen that this shows the same tendency as the previously confirmed results and the results confirmed by aligning the base sequences between each variety for which the SNP was confirmed. In other words, it can be seen that the single nucleotide polymorphism marker of the present invention can effectively determine the maturity stage in wheat.
<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarkers for determining the maturation date of wheat <130> DP20210321 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BA00470958 <400> 1 tctaactcag ctgcaatctt actgcatctc atcagngatc acacagactg acagacgcat 60 aatctacgca t 71 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 agtcttctac gccttcacc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 catagacaca ccgatacacg 20 <110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarkers for determining the maturation date of wheat <130> DP20210321 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BA00470958 <400> 1 tctaactcag ctgcaatctt actgcatctc atcagnatc acacagactg acagacgcat 60 aatctacgca t 71 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 agtcttctac gccttcacc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 catagacaca ccgatacacg 20
Claims (11)
상기 36번째 염기가 T일 경우 성숙기가 빠른 밀인 것으로 판별하는 것인,
밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물.According to paragraph 1,
If the 36th base is T, it is determined that it is wheat with a rapid maturity period,
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) marker composition for determining the maturity stage of wheat.
상기 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 밀의 성숙기 판별용 조성물.A composition for determining the maturity stage of wheat, comprising an agent capable of detecting or amplifying a SNP marker for determining the maturity stage of wheat,
The SNP marker for determining the maturity stage of wheat is a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, where the 36th base is T or G, and a polynucleotide consisting of 5 to 200 consecutive bases including the 36th base, or A composition for determining the maturity stage of wheat, comprising a complementary polynucleotide.
상기 제제는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브인 것인, 밀의 성숙기 판별용 조성물.According to paragraph 3,
A composition for determining the maturity stage of wheat, wherein the agent is a primer set or probe capable of detecting or amplifying the SNP marker.
상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 구성되는 것인, 밀의 성숙기 판별용 조성물.According to paragraph 4,
A composition for determining the maturity stage of wheat, wherein the primer set consists of the base sequences of SEQ ID NOs: 2 and 3.
상기 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 밀의 성숙기 판별용 키트.According to clause 6,
The kit is a kit for determining the maturity stage of wheat, which is an HRM analysis kit or a DNA chip kit.
(b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 밀의 성숙기 판별 방법.(a) A step of amplifying or detecting the 36th base, which is the polymorphic site of the SNP marker for determining the maturity stage of wheat, from the DNA of the wheat sample, wherein the SNP marker for determining the maturity stage of wheat is 36 in the polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1. A step wherein the th base is T or G, and comprising a polynucleotide consisting of 5 to 200 consecutive bases including the 36th base, or a polynucleotide complementary thereto; and
(b) A method for determining the maturity stage of wheat, comprising the step of determining the base of the polymorphic site amplified or detected in step (a).
상기 (b)단계는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정하는 것인, 밀의 성숙기 판별 방법.According to clause 8,
The step (b) is a method for determining the maturity stage of wheat, which determines the base of the polymorphic site by detecting the difference in the degree of dissociation due to base mutation in double-stranded DNA through HRM (high resolution melting) analysis.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230068537A (en) | 2023-05-18 |
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