KR102616515B1 - Composition for detecting microorganism associated with oral disease and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 프라이머 내지 프로브를 포함하는 조성물을 이용하는 경우 높은 민감도(sensitivity), 직선성(linearity) 및 특이도(specificity) 로 신속하게 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있으므로, 구강질환 유발 세균 검출 내지 구강질환 진단을 위해 효과적으로 사용될 수 있다. The present invention relates to a composition containing a primer and a probe capable of detecting oral disease-causing bacteria and its use.
When using a composition containing the primer or probe of the present invention, oral disease-causing bacteria can be quickly detected with high sensitivity, linearity, and specificity, and thus oral disease-causing bacteria can be detected or oral disease-causing bacteria can be detected. It can be effectively used for disease diagnosis.
Description
본 발명은 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물 내지 이의 용도에 대한 것이다. The present invention relates to a composition containing a primer and a probe capable of detecting oral disease-causing bacteria and its use.
중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 검사는 DNA의 특정 부분을 반복적으로 복제하여 DNA를 증폭시키는 기술로써, 아주 적은 양으로도 특정세균이나 세포내 표적 유전자만 골라내어 다량을 복제할 수 있으므로 유전적 질병이나 바이러스 감염 등 질환의 진단에 폭넓게 활용되고 있다. 최근에는 실시간 PCR(real time PCR)을 활용해 정량적 분석까지 가능한 단계에 이르렀다. 이러한 유전자 증폭기술인 PCR을 이용해 유전자를 직접 검사하여, 바이러스나 세균에 감염된 사람의 타액, 혈액 등에서 병원체의 유전자 정보를 담고 있는 DNA, RNA를 추출한 후 증폭해 질병 감염 여부를 특이적 바이오마커로 확인하는데, 이처럼 질병의 조기 진단을 통한 예방과 효율적인 치료를 가능하게 하는 것이 바로 분자진단 기술이다.The polymerase chain reaction (PCR) test is a technology that amplifies DNA by repeatedly replicating a specific part of the DNA. Even with a very small amount, only the target genes within specific bacteria or cells can be selected and copied in large quantities. It is widely used in the diagnosis of diseases such as genetic diseases and viral infections. Recently, it has reached a stage where quantitative analysis is possible using real-time PCR. PCR, a gene amplification technology, is used to directly test genes, extracting DNA and RNA containing the genetic information of the pathogen from the saliva or blood of a person infected with a virus or bacteria, and then amplifying it to confirm disease infection with a specific biomarker. , Molecular diagnosis technology enables prevention and efficient treatment through early diagnosis of diseases.
이러한 분자진단 기술 중에서도 타액을 이용한 진단 기술은 종래의 혈액을 분석하는 방법에 비하여 비침습적이고 간편하며 효율적인 장점이 있으며, 구강질환의 진단 뿐 아니라 전신질환을 예방하고 조기에 진단할 목적으로 타액 사용의 타당성에 대한 다수의 연구가 보고되고 있다.Among these molecular diagnostic technologies, diagnostic technology using saliva has the advantage of being non-invasive, simple, and efficient compared to conventional blood analysis methods, and the use of saliva is used for the purpose of preventing and early diagnosing systemic diseases as well as diagnosing oral diseases. Numerous studies on feasibility have been reported.
한편, 구강 내에는 약 700여 종의 세균이 존재한다고 보고되었다. 구강 내 세균으로 검출된 종들 중 현재의 세균 배양법으로는 약 50% 정도의 구강 세균만 배양이 가능하며 구강 감염 병소에서 분리 및 동정된 균종은 더욱 부족한 실정이다. 또한, 지금까지의 구강질환 치료는 치석 제거, 치근의 표면 청소, 잇몸을 절개하고 치근을 노출시켜 수술하는 방식으로 이루어져 왔으나, 이는 치료라는 명목의 응급처치일 뿐이어서 근본적인 구강질환의 해결책은 될 수 없다. 구강질환의 원인과 다양한 위험 요인을 조사하고, 같은 질환 경로가 다시 반복되지 않도록 구강질환을 진단 내지 그 치료 방향을 제시할 수 있는 체계적 구강건강 관리 시스템이 요구되고 있다. Meanwhile, it has been reported that about 700 types of bacteria exist in the oral cavity. Among the species detected as oral bacteria, only about 50% of oral bacteria can be cultured using current bacterial culture methods, and the number of bacterial species isolated and identified from oral infection foci is further lacking. In addition, oral disease treatment so far has been done by removing tartar, cleaning the surface of the tooth root, cutting the gums, exposing the tooth root, and performing surgery. However, this is only emergency treatment in the name of treatment, so it cannot be a solution to the fundamental oral disease. does not exist. There is a need for a systematic oral health management system that can investigate the causes and various risk factors of oral diseases, diagnose oral diseases, and suggest treatment directions to prevent the same disease path from recurring.
이에 본 출원인은 구강질환 유발 세균을 현장에서 비침습적인 방법으로 신속하게 검출 내지 진단할 수 있는 조성물 내지 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, PCR 을 이용하여 1시간 이내로 구강질환 유발 세균을 특이적으로 검출 내지 진단할 수 있는 프라이머 및 프로브를 도출하여 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present applicant has made diligent efforts to provide a composition or method that can quickly detect and diagnose oral disease-causing bacteria in a non-invasive on-site manner. As a result, oral disease-causing bacteria have been specifically detected within 1 hour using PCR. The present invention was completed by deriving primers and probes that can be used for diagnosis.
따라서, 본 발명의 목적은 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물 내지 이의 용도를 제공하는 것이다. Therefore, the purpose of the present invention is to provide a composition containing primers and probes capable of detecting oral disease-causing bacteria, and a use thereof.
본 발명은 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제1프라이머 세트; The present invention provides a first primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the base sequence of SEQ ID NO: 2;
서열번호 4 의 염기서열 및 서열번호 5 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제2프라이머 세트; A second primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 4 and the base sequence of SEQ ID NO: 5;
서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제3프라이머 세트; 및A third primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and the base sequence of SEQ ID NO: 8; and
서열번호 10 의 염기서열 및 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제4프라이머 세트; A fourth primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 and the base sequence of SEQ ID NO: 11;
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물을 제공한다. Provided is a composition for detecting oral disease-causing bacteria comprising at least one primer set selected from the group consisting of.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 프로브;According to a preferred embodiment of the present invention, the first primer set further includes a probe comprising the base sequence of SEQ ID NO: 3;
제2프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 6 의 염기서열을 포함하는 프로브; The second primer set additionally includes a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 6;
제3프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프로브; 또는The third primer set additionally includes a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 9; or
제4프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 12 의 염기서열을 포함하는 프로브; 를 포함하는 것이다. The fourth primer set additionally includes a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 12; It includes.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the primer set is used in PCR (polymerase chain reaction).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the PCR is quantitative PCR (quantitative PCR, qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), and solid phase PCR (Solid Phase PCR). , Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR ), ISSR (Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL -PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR), Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, Allele-specific PCR ), assembly PCR, asymmetric PCR, dial-out PCR, digital PCR (dPCR), and helicase-dependent amplification. It is more than one selected.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구강질환 유발 세균은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the oral disease-causing bacteria are Aggregatibacter actinomycetemcomitans , Porphyromonas gingivalis , and Treponema denticola . ) and Tannerella forsythia ( Tannerella forsythia ) is any one or more selected from the group consisting of
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구강질환은 치은염, 침습성 치주염, 임플란트 주위염, 소아성 치주염, 괴사 궤양성 치주염 및 만성염증성 치주질환 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the oral disease is at least one selected from the group consisting of gingivitis, invasive periodontitis, peri-implantitis, juvenile periodontitis, necrotic ulcerative periodontitis, and chronic inflammatory periodontal disease.
본 발명은 또한, 상기 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting oral disease-causing bacteria, including the composition and reagents for PCR amplification reaction.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the PCR is quantitative PCR (quantitative PCR, qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), and solid phase PCR (Solid Phase PCR). , Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR ), ISSR (Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL -PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR), Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, Allele-specific PCR ), assembly PCR, asymmetric PCR, dial-out PCR, digital PCR (dPCR), and helicase-dependent amplification. It is more than one selected.
본 발명은 또한, i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;The present invention also provides a method comprising: i) obtaining a biological sample from an individual;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및ii) isolating bacterial DNA from the biological sample obtained in step i); and
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;iii) detecting oral disease-causing bacteria using the bacterial DNA obtained in step ii) and the composition;
를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출방법을 제공한다. Provides a method for detecting oral disease-causing bacteria including.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 생물학적 시료는 혈액, 소변, 뇌척수액 및 타액 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the biological sample in step i) is one or more selected from the group consisting of blood, urine, cerebrospinal fluid, and saliva.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 검출은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 검출하는 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the detection in step iii) is performed using PCR (polymerase chain reaction).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the PCR is quantitative PCR (quantitative PCR, qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), and solid phase PCR (Solid Phase PCR). , Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR ), ISSR (Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL -PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR), Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, Allele-specific PCR ), assembly PCR, asymmetric PCR, dial-out PCR, digital PCR (dPCR), and helicase-dependent amplification. It is more than one selected.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 구강질환 진단용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for diagnosing oral diseases comprising the composition.
본 발명은 또한, 상기 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 진단용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for diagnosing oral diseases including the composition and reagents for PCR amplification reaction.
본 발명은 또한, i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;The present invention also provides a method comprising: i) obtaining a biological sample from an individual;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및ii) isolating bacterial DNA from the biological sample obtained in step i); and
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;iii) detecting oral disease-causing bacteria using the bacterial DNA obtained in step ii) and the composition;
를 포함하는 구강질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.Provides an information provision method for diagnosing oral diseases, including.
본 발명의 프라이머 내지 프로브를 포함하는 조성물을 이용하는 경우 높은 민감도(sensitivity), 직선성(linearity) 및 특이도(specificity) 로 신속하게 구강질환 유발 세균을 검출할 수 있으므로, 구강질환 유발 세균 검출 내지 구강질환 진단을 위해 효과적으로 사용될 수 있다. When using a composition containing the primer or probe of the present invention, oral disease-causing bacteria can be quickly detected with high sensitivity, linearity, and specificity, and thus oral disease-causing bacteria can be detected or oral disease-causing bacteria can be detected. It can be effectively used for disease diagnosis.
도 1은 실시간 PCR 을 이용한 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 검출 결과를 종합적으로 나타낸다.
도 2는 실시간 PCR 을 이용한 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 검출 결과를 종합적으로 나타낸다.
도 3은 실시간 PCR 을 이용한 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 검출 결과를 종합적으로 나타낸다.
도 4는 실시간 PCR 을 이용한 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 검출 결과를 종합적으로 나타낸다.
도 5는 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa) 검출 효율에 대한 직선성 분석 결과이다.
도 6은 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis, Pg) 검출 효율에 대한 직선성 분석 결과이다.
도 7 은 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola, Td) 검출 효율에 대한 직선성 분석 결과이다.
도 8 은 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia, Tf) 검출 효율에 대한 직선성 분석 결과이다.Figure 1 comprehensively shows the results of Aggregatibacter actinomycetemcomitans detection using real-time PCR.
Figure 2 comprehensively shows the detection results of Porphyromonas gingivalis using real-time PCR.
Figure 3 comprehensively shows the results of Treponema denticola detection using real-time PCR.
Figure 4 comprehensively shows the results of Tannerella forsythia detection using real-time PCR.
Figure 5 shows the linearity analysis results for Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) detection efficiency.
Figure 6 shows the linearity analysis results for Porphyromonas gingivalis (Pg) detection efficiency.
Figure 7 is a linearity analysis result for Treponema denticola (Td) detection efficiency.
Figure 8 is a linearity analysis result for Tannerella forsythia (Tf) detection efficiency.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 '프라이머 및 프로브 세트(프라이머/프로브 세트)'는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브의 3가지 서열이 하나의 세트로 구성된 것을 의미한다. 본 발명에서는 제1프라이머 세트 내지 제4프라이머 세트에 각각 서열번호 3, 6, 9 또는 12의 염기서열을 포함하는 프로브가 포함된 세트를 의미한다.The 'primer and probe set (primer/probe set)' of the present invention means a set of three sequences: a forward primer, a reverse primer, and a probe. In the present invention, it refers to a set in which the first to fourth primer sets include a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 3, 6, 9, or 12, respectively.
본 발명의 '프라이머'는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 즉, 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, DNA 폴리머라제 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성을 개시할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.The 'primer' of the present invention is a nucleic acid sequence with a short free 3' terminal hydroxyl group that can form base pairs with a complementary template and functions as a starting point for copying the template strand. refers to a nucleic acid sequence. That is, a primer is a single-stranded polymer that can initiate template-directed DNA synthesis under appropriate conditions (e.g., four different nucleoside triphosphates and DNA, a polymerizing agent such as a DNA polymerase enzyme) and appropriate temperature in an appropriate buffer. It means oligonucleotide.
본 발명의 '진단(diagnosis)'은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 바람직하게는 세균에 의하여 구강질환 및 이의 발병 위험성을 판단하는 것이다.In a broad sense, 'diagnosis' of the present invention means judging the actual condition of a patient's disease in all aspects. The contents of the judgment include the name of the disease, etiology, type, severity, detailed conditions of the disease, and the presence or absence of complications. In the present invention, diagnosis preferably involves determining oral disease and the risk of developing it based on bacteria.
본 발명은 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제1프라이머 세트; The present invention provides a first primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the base sequence of SEQ ID NO: 2;
서열번호 4 의 염기서열 및 서열번호 5 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제2프라이머 세트; A second primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 4 and the base sequence of SEQ ID NO: 5;
서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제3프라이머 세트; 및A third primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and the base sequence of SEQ ID NO: 8; and
서열번호 10 의 염기서열 및 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제4프라이머 세트; A fourth primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 and the base sequence of SEQ ID NO: 11;
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물을 제공할 수 있다. It is possible to provide a composition for detecting oral disease-causing bacteria including any one or more primer sets selected from the group consisting of.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 프로브;According to a preferred embodiment of the present invention, the first primer set further includes a probe comprising the base sequence of SEQ ID NO: 3;
제2프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 6 의 염기서열을 포함하는 프로브; The second primer set additionally includes a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 6;
제3프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프로브; 또는The third primer set additionally includes a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 9; or
제4프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 12 의 염기서열을 포함하는 프로브; 를 포함하는 것이다. The fourth primer set additionally includes a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 12; It includes.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the primer set is used in PCR (polymerase chain reaction).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 바람직하게는 상기 PCR 은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR) 또는 실시간 PCR(real-time PCR) 일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the PCR is quantitative PCR (quantitative PCR, qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), and solid phase PCR (Solid Phase PCR). , Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR ), ISSR (Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL -PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR), Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, Allele-specific PCR ), assembly PCR, asymmetric PCR, dial-out PCR, digital PCR (dPCR), and helicase-dependent amplification. It is more than one selected. Preferably, the PCR may be quantitative PCR (qPCR) or real-time PCR.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구강질환 유발 세균은 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the oral disease-causing bacteria are Aggregatibacter actinomycetemcomitans , Porphyromonas gingivalis , and Treponema denticola . ) and Tannerella forsythia. It may be any one or more selected from the group consisting of.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구강질환은 치은염, 침습성 치주염, 임플란트 주위염, 소아성 치주염, 괴사 궤양성 치주염 및 만성염증성 치주질환 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the oral disease may be any one or more selected from the group consisting of gingivitis, invasive periodontitis, peri-implantitis, juvenile periodontitis, necrotic ulcerative periodontitis, and chronic inflammatory periodontal disease.
본 발명은 또한, 상기 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 키트를 제공할 수 있다.The present invention can also provide a kit for detecting oral disease-causing bacteria, including the composition and a reagent for a PCR amplification reaction.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 바람직하게는 상기 PCR 은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR) 또는 실시간 PCR(real-time PCR) 일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the PCR is quantitative PCR (quantitative PCR, qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), and solid phase PCR (Solid Phase PCR). , Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR ), ISSR (Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL -PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR), Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, Allele-specific PCR ), assembly PCR, asymmetric PCR, dial-out PCR, digital PCR (dPCR), and helicase-dependent amplification. It is more than one selected. Preferably, the PCR may be quantitative PCR (qPCR) or real-time PCR.
본 발명의 상기 키트는 PCR 증폭 반응을 수행하기 위해 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.The kit of the present invention may include DNA polymerase, dNTPs, buffer solution, etc. to perform a PCR amplification reaction. The kit may also further include a user guide describing optimal reaction performance conditions. The guide is a printed material that explains how to use the kit, for example, how to prepare reverse transcription buffer and PCR buffer, and the suggested reaction conditions. Instructions include information leaflets in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. Additionally, the guide includes information disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명은 또한, i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;The present invention also provides a method comprising: i) obtaining a biological sample from an individual;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및ii) isolating bacterial DNA from the biological sample obtained in step i); and
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;iii) detecting oral disease-causing bacteria using the bacterial DNA obtained in step ii) and the composition;
를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출방법을 제공할 수 있다. It is possible to provide a method for detecting oral disease-causing bacteria including.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 생물학적 시료는 혈액, 소변, 뇌척수액 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 상기 타액은 개체가 가글링으로 뱉어낸 타액일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the biological sample in step i) is one or more selected from the group consisting of blood, urine, cerebrospinal fluid, and saliva. The saliva may be saliva spit out by an individual through gargling.
상기 세균 DNA 는 상기 구강질환 유발 세균의 DNA 를 의미하는 것일 수 있다. The bacterial DNA may refer to the DNA of the oral disease-causing bacteria.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 검출은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 검출하는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the detection in step iii) may be performed using PCR (polymerase chain reaction).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 바람직하게는 상기 PCR 은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR) 또는 실시간 PCR(real-time PCR) 일 수 있다According to a preferred embodiment of the present invention, the PCR is quantitative PCR (quantitative PCR, qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), and solid phase PCR (Solid Phase PCR). , Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR ), ISSR (Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL -PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR), Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, Allele-specific PCR ), assembly PCR, asymmetric PCR, dial-out PCR, digital PCR (dPCR), and helicase-dependent amplification. It is more than one selected. Preferably, the PCR may be quantitative PCR (qPCR) or real-time PCR.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 구강질환 진단용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for diagnosing oral diseases comprising the composition.
본 발명은 또한, 상기 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 구강질환 진단용 키트를 제공한다. 상기 PCR 및 키트는 상기 구강질환 유발 세균 검출용 키트에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다. The present invention also provides a kit for diagnosing oral diseases including the composition and reagents for PCR amplification reaction. Since the PCR and kit are the same as the concept used in the kit for detecting oral disease-causing bacteria, the description is replaced with the description.
본 발명은 또한, i) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;The present invention also provides a method comprising: i) obtaining a biological sample from an individual;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및ii) isolating bacterial DNA from the biological sample obtained in step i); and
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;iii) detecting oral disease-causing bacteria using the bacterial DNA obtained in step ii) and the composition;
를 포함하는 구강질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. Provides an information provision method for diagnosing oral diseases, including.
상기 시료, 구강질환 유발 세균 및 검출은 상기 구강질환 유발 세균 검출방법에서 사용된 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다. Since the sample, oral disease-causing bacteria, and detection are the same as the concept used in the method for detecting oral disease-causing bacteria, the description is replaced with the description.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it is obvious to those skilled in the art that the scope of the present invention should not be construed as limited by these examples.
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작Preparation of primers and probes for detection of Aggregatibacter Actinomycetemcomitans
<1-1> 타겟 영역 선정 <1-1> Select target area
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, 이하 A.a) 검출과 관련하여 공개된 논문들에서는 16s RNA 를 이용한 A.a 검출을 제시하고 있었으나, 본 출원인은 프라이머 및 프로브의 특이도를 높이기 위해 단백질 유전자(cpn60)를 타겟하여 프라이머 및 프로브를 디자인하고자 하였다. Published papers related to the detection of Aggregatibacter actinomycetemcomitans (hereinafter referred to as Aa) suggested detection of Aa using 16s RNA, but the applicant used protein to increase the specificity of primers and probes. We attempted to design primers and probes targeting the gene (cpn60).
GenBank No. AY123712 (Actinobacillus actinomycetemcomitans strain ATCC 33384 (cpn60) gene, partial cds)을 기준으로 이와 유사한 서열을 genious software 11.1.5 를 이용하여 수집하였다. 최종적으로 수집된 총 927 개의 서열을 다중서열정렬(multiple alignment) 방법으로 정렬한 결과, 927 개의 서열 중 12 개가 A.a 임을 확인하였다. GenBank No. Based on AY123712 (Actinobacillus actinomycetemcomitans strain ATCC 33384 (cpn60) gene, partial cds) Similar sequences were collected using genious software 11.1.5. As a result of aligning a total of 927 sequences finally collected using multiple alignment method, 12 of the 927 sequences were Aa. It was confirmed that it was.
<1-2> 프라이머 및 프로브 디자인 <1-2> Primer and probe design
상기 실시예 <1-1> 에서 정렬한 데이터를 기반으로 primer express 3.0.1 을 이용하여 A.a 에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(표 1). Based on the data sorted in Example <1-1>, primers and probes specific to A.a were designed using primer express 3.0.1 (Table 1).
상기 A.a 프로브 서열은 NCBI blast 에서 다시 검증한 결과 모든 A.a 종에 대하여 특이적이고, 다른 세균 종에 대하여는 비특이적인 것을 확인할 수 있었다. The A.a probe sequence was verified again in NCBI blast and was confirmed to be specific for all A.a species and non-specific for other bacterial species.
[NCBI blast searching 조건][NCBI blast searching conditions]
Max target sequences : 1000Max target sequences: 1000
Program selection optimize for Highly similar sequences (blastn)Program selection optimized for Highly similar sequences (blastn)
Database : Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)Database: Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)
Tm 과 self- & hetero- dimer 는 IDT 의 Oligo analyzer 를 이용하여 확인하였다. Tm and self- & hetero-dimer were confirmed using IDT's Oligo analyzer.
[정방향 프라이머_A.a 프라이머 F][Forward Primer_A.a Primer F]
GC 52.4% / Melt temp: 56.5℃/ MOLECULAR WEIGHT: 6304.2 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 194900 L/(mole·cm)GC 52.4% / Melt temp: 56.5℃/ MOLECULAR WEIGHT: 6304.2 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 194900 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 1 개 (Δ0.41)Hairpin str.: 1 piece (Δ0.41)
Self-dimer : Maximum Δ-41.68 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ-41.68 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
[역방향 프라이머_A.a 프라이머 R][Reverse Primer_A.a Primer R]
GC 43.5% / Melt temp: 54.6℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7078.6 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 222500 L/(mole·cm)GC 43.5% / Melt temp: 54.6℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7078.6 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 222500 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 2 개 (Δ-0.56, -0.06)Hairpin str.: 2 (Δ-0.56, -0.06)
Self-dimer : Maximum Δ- 43.2 kcal/mole -> Max. 6 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ- 43.2 kcal/mole -> Max. 6 bases combined
[프로브_A.a 프로브] [Probe_A.a Probe]
GC 46.4% / Melt temp: 61.1℃/ MOLECULAR WEIGHT: 8492.6 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 262600 L/(mole·cm)GC 46.4% / Melt temp: 61.1℃/ MOLECULAR WEIGHT: 8492.6 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 262600 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 4 개 (Δ-0.51, -0.38, -0.32, -0.15)Hairpin str.: 4 (Δ-0.51, -0.38, -0.32, -0.15)
Self-dimer : Maximum Δ- 53.89 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ- 53.89 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
[Dimer analysis][Dimer analysis]
Hetero-dimer(F-R) : Maximum Δ-43.2 kcal/mole -> Max. 5 bases 결합Hetero-dimer(F-R): Maximum Δ-43.2 kcal/mole -> Max. 5 bases combined
Hetero-dimer(F-P) : Maximum Δ-53.89 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Hetero-dimer(F-P): Maximum Δ-53.89 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
Hetero-dimer(R-P) : Maximum Δ-53.89 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Hetero-dimer(R-P): Maximum Δ-53.89 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
양성 대조군(positive control)을 주문함에 있어서 필요로 하는 앰플리콘(amplicon) 을 기준으로 NCBI blast 를 이용하여 재검증한 결과 A.a 종(strain) 에 대해 100% cover, 96.97% 이상의 동일성을 지니는 것을 확인하였고, 그 외의 다른 종 에 대해서는 동일성이 90.62% 이하로 떨어지는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 프라이머 및 프로브는 A.a 양성 대조군을 합성하는 데에도 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다. NCBI blast based on the amplicon required when ordering a positive control As a result of re-verification using , it was confirmed that it had 100% coverage and more than 96.97% identity for the Aa strain, and for other species, it was confirmed that the identity fell below 90.62%. As a result, it was confirmed that the primers and probes of the present invention had no problems in synthesizing the Aa positive control.
포필로모나스 진지발리스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작Preparation of primers and probes for detection of Popillomonas gingivalis
<2-1> 타겟 영역 선정 <2-1> Select target area
해외에서 상용화 되고 있는 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis, 이하 P.g) 를 검출할 수 있는 진단 키트는 P.g 의 fimA 유전자를 이용하여 검출하고 있었으나, 본 출원인이 fimA 를 타겟 유전자로 검출한 결과 특이도가 낮았다. 이에 본 출원인은 프라이머 및 프로브의 특이도를 높이기 위해 단백질 유전자(rgpB)를 타겟하여 프라이머 및 프로브를 디자인하고자 하였다. The diagnostic kit that can detect Porphyromonas gingivalis (Pg), which is being commercialized overseas, detects it using the fimA gene of Pg, but as a result of the applicant detecting fimA as the target gene, the specificity was low. was low. Accordingly, the present applicant attempted to design primers and probes targeting the protein gene (rgpB) to increase the specificity of the primers and probes.
GenBank No. AP009380 (Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 DNA, complete genome)을 기준으로 이와 유사한 서열을 genious software 11.1.5 를 이용하여 수집하였다. 최종적으로 수집된 총 54 개의 서열을 다중서열정렬(multiple alignment) 방법으로 정렬한 결과, 54 개의 서열 모두 P.g 임을 확인하였다. GenBank No. Based on AP009380 (Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 DNA, complete genome), Similar sequences were collected using genious software 11.1.5. As a result of aligning a total of 54 sequences finally collected using multiple alignment method, it was confirmed that all 54 sequences were Pg.
<2-2> 프라이머 및 프로브 디자인 <2-2> Primer and probe design
상기 실시예 <2-1> 에서 정렬한 데이터를 기반으로 primer express 3.0.1 을 이용하여 P.g 에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(표 2). Based on the data sorted in Example <2-1>, primers and probes specific for P.g were designed using primer express 3.0.1 (Table 2).
상기 P.g 프로브 서열은 NCBI blast 에서 다시 검증한 결과 모든 P.g 종에 대하여 특이적이고, 다른 세균 종에 대하여는 비특이적인 것을 확인할 수 있었다. As a result of re-verification of the P.g probe sequence in NCBI blast, it was confirmed that it was specific for all P.g species and non-specific for other bacterial species.
[NCBI blast searching 조건][NCBI blast searching conditions]
Max target sequences : 1000Max target sequences: 1000
Program selection optimize for Highly similar sequences (blastn)Program selection optimized for Highly similar sequences (blastn)
Database : Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)Database: Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)
Tm 과 self- & hetero- dimer 는 IDT 의 Oligo analyzer 를 이용하여 확인하였다. Tm and self- & hetero-dimer were confirmed using IDT's Oligo analyzer.
[정방향 프라이머_P.g 프라이머 F][Forward Primer_P.g Primer F]
GC 50% / Melt temp: 57.8℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7325.8 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 217500 L/(mole·cm)GC 50% / Melt temp: 57.8℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7325.8 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 217500 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 3 개 (Δ-1.7, -1.21, -0.89)Hairpin str.: 3 (Δ-1.7, -1.21, -0.89)
Self-dimer : Maximum Δ-43.34 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ-43.34 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
[역방향 프라이머_P.g 프라이머 R][Reverse Primer_P.g Primer R]
GC 50% / Melt temp: 56.3℃/ MOLECULAR WEIGHT: 6719.4 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 210000 L/(mole·cm)GC 50% / Melt temp: 56.3℃/ MOLECULAR WEIGHT: 6719.4 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 210000 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 3 개 (Δ0.34, 0.84, 0.97)Hairpin str.: 3 (Δ0.34, 0.84, 0.97)
Self-dimer : Maximum Δ- 42.29 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ- 42.29 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
[프로브_P.g 프로브] [Probe_P.g Probe]
GC 59.3% / Melt temp: 64.5℃/ MOLECULAR WEIGHT: 8134.3 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 246200 L/(mole·cm)GC 59.3% / Melt temp: 64.5℃/ MOLECULAR WEIGHT: 8134.3 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 246200 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 4 개 (Δ-0.26, 0.21, 0.35, 0.38)Hairpin str.: 4 (Δ-0.26, 0.21, 0.35, 0.38)
Self-dimer : Maximum Δ- 53.2 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ- 53.2 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
[Dimer analysis][Dimer analysis]
Hetero-dimer(F-R) : Maximum Δ-43.34 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Hetero-dimer(F-R): Maximum Δ-43.34 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
Hetero-dimer(F-P) : Maximum Δ-53.2 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Hetero-dimer(F-P): Maximum Δ-53.2 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
Hetero-dimer(R-P) : Maximum Δ-53.2 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Hetero-dimer(R-P): Maximum Δ-53.2 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
양성 대조군(positive control)을 주문함에 있어서 필요로 하는 앰플리콘(amplicon) 을 기준으로 NCBI blast 를 이용하여 재검증한 결과 P.g 종(strain) 에 대해 99% 이상 커버되는 것을 확인하였고, 그 외의 다른 종 에 대해서는 동일성이 73.3% 이하로 떨어지는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 프라이머 및 프로브는 P.g 양성 대조군을 합성하는 데에도 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다. NCBI blast based on the amplicon required when ordering a positive control As a result of re-verification using , it was confirmed that the Pg strain was covered by more than 99%, and for other species, the identity fell below 73.3%. As a result, it was confirmed that the primers and probes of the present invention had no problems in synthesizing the Pg positive control.
트레포네마 덴티콜라 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작Preparation of primers and probes for detection of Treponema denticola
<3-1> 타겟 영역 선정 <3-1> Select target area
트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola, 이하 T.d) 의 검출을 위하여 본 출원인은 프라이머 및 프로브의 특이도를 높이고자 단백질 유전자(cfpA)를 타겟하여 프라이머 및 프로브를 디자인하고자 하였다.For the detection of Treponema denticola (hereinafter referred to as Td), the applicant attempted to design primers and probes targeting the protein gene (cfpA) to increase the specificity of the primers and probes.
GenBank No. AF062737 (Treponema denticola cytoplasmic filament protein A (cfpA) gene, partial cds)을 기준으로 이와 유사한 서열을 genious software 11.1.5 를 이용하여 수집하였다. 최종적으로 수집된 총 14 개의 서열을 다중서열정렬(multiple alignment) 방법으로 정렬한 결과, 14 개의 서열에는 T.d 이외에 T. putidum, T. pedis, T. phagedenis, T. vincentii 등이 포함되어 있었다. GenBank No. Based on AF062737 (Treponema denticola cytoplasmic filament protein A (cfpA) gene, partial cds), Similar sequences were collected using genious software 11.1.5. As a result of aligning a total of 14 sequences finally collected using multiple alignment method, the 14 sequences included T. putidum, T. pedis, T. phagedenis, T. vincentii, etc. in addition to Td.
<3-2> 프라이머 및 프로브 디자인 <3-2> Primer and probe design
상기 실시예 <3-1> 에서 정렬한 데이터를 기반으로 primer express 3.0.1 을 이용하여 T.d 에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(표 3). Based on the data sorted in Example <3-1>, primers and probes specific for T.d were designed using primer express 3.0.1 (Table 3).
상기 T.d 프로브 서열은 NCBI blast 에서 다시 검증한 결과 모든 T.d 종에 대하여 특이적이고, 다른 세균 종에 대하여는 비특이적인 것을 확인할 수 있었다. As a result of re-verification of the T.d probe sequence in NCBI blast, it was confirmed that it was specific for all T.d species and non-specific for other bacterial species.
[NCBI blast searching 조건][NCBI blast searching conditions]
Max target sequences : 1000Max target sequences: 1000
Program selection optimize for Highly similar sequences (blastn)Program selection optimized for Highly similar sequences (blastn)
Database : Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)Database: Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)
Tm 과 self- & hetero- dimer 는 IDT 의 Oligo analyzer 를 이용하여 확인하였다. Tm and self- & hetero-dimer were confirmed using IDT's Oligo analyzer.
[정방향 프라이머_T.d 프라이머 F][Forward Primer_T.d Primer F]
GC 50% / Melt temp: 55.1℃/ MOLECULAR WEIGHT: 6219.1 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 192500 L/(mole·cm)GC 50% / Melt temp: 55.1℃/ MOLECULAR WEIGHT: 6219.1 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 192500 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 8 개 (Δ0.92, 1.03, 1.46, 1.53, 1.63, 1.79, 1.84, 1.9)Hairpin str.: 8 (Δ0.92, 1.03, 1.46, 1.53, 1.63, 1.79, 1.84, 1.9)
Self-dimer : Maximum Δ-41.45 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ-41.45 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
[역방향 프라이머_T.d 프라이머 R][Reverse Primer_T.d Primer R]
GC 41.7% / Melt temp: 56.9℃ / MOLECULAR WEIGHT: 7333.8 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 227100 L/(mole·cm)GC 41.7% / Melt temp: 56.9℃ / MOLECULAR WEIGHT: 7333.8 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 227100 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 2 개 (Δ-0.28, -0.19)Hairpin str.: 2 (Δ-0.28, -0.19)
Self-dimer : Maximum Δ- 44.27 kcal/mole -> Max. 3 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ- 44.27 kcal/mole -> Max. 3 bases combined
[프로브_T.d 프로브] [Probe_T.d Probe]
GC 59.3% / Melt temp: 65.2℃/ MOLECULAR WEIGHT: 8374.5 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 268600 L/(mole·cm)GC 59.3% / Melt temp: 65.2℃/ MOLECULAR WEIGHT: 8374.5 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 268600 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 1 개 (Δ-2.34)Hairpin str.: 1 (Δ-2.34)
Self-dimer : Maximum Δ- 54.2 kcal/mole -> Max. 5 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ- 54.2 kcal/mole -> Max. 5 bases combined
[Dimer analysis][Dimer analysis]
Hetero-dimer(F-R) : Maximum Δ-44.27 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Hetero-dimer(F-R): Maximum Δ-44.27 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
Hetero-dimer(F-P) : Maximum Δ-54.2 kcal/mole -> Max. 2 bases 결합Hetero-dimer(F-P): Maximum Δ-54.2 kcal/mole -> Max. 2 bases combined
Hetero-dimer(R-P) : Maximum Δ-54.2 kcal/mole -> Max. 5 bases 결합Hetero-dimer(R-P): Maximum Δ-54.2 kcal/mole -> Max. 5 bases combined
양성 대조군(positive control)을 주문함에 있어서 필요로 하는 앰플리콘(amplicon) 을 기준으로 NCBI blast 를 이용하여 재검증한 결과 T.d 종(strain) 에 대하여 특이적이고, 그 외의 다른 종 에 대해서는 동일성이 92.93% 이하로 떨어지는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 프라이머 및 프로브는 T.d 양성 대조군을 합성하는 데에도 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다. NCBI blast based on the amplicon required when ordering a positive control As a result of re-verification using , it was confirmed that it was specific for the Td strain, and for other species, the identity fell below 92.93%. As a result, it was confirmed that the primers and probes of the present invention had no problems in synthesizing the Td positive control.
터너렐라 포시티아 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작Preparation of primers and probes for detection of Turnerella forsythia
<4-1> 타겟 영역 선정 <4-1> Select target area
터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia,이하 T.f) 의 검출을 위하여 본 출원인은 프라이머 및 프로브의 특이도를 높이고자 단백질 유전자(hsp60)를 타겟하여 프라이머 및 프로브를 디자인하고자 하였다.For the detection of Tannerella forsythia (Tf), the present applicant attempted to design primers and probes targeting the protein gene (hsp60) to increase the specificity of the primers and probes.
GenBank No. AB547635 (Tannerella forsythia hsp60 gene for heat shock protein 60, partial cds, strain: JCM 10827)을 기준으로 이와 유사한 서열을 genious software 11.1.5 를 이용하여 수집하였다. 최종적으로 수집된 총 35 개의 서열을 다중서열정렬(multiple alignment) 방법으로 정렬한 결과, 35 개의 서열 중 6 개가 T.f 임을 확인하였다. GenBank No. Based on AB547635 (Tannerella forsythia hsp60 gene for heat shock protein 60, partial cds, strain: JCM 10827) Similar sequences were collected using genious software 11.1.5. As a result of aligning a total of 35 sequences finally collected using multiple alignment method, 6 out of 35 sequences were Tf It was confirmed that it was.
<4-2> 프라이머 및 프로브 디자인 <4-2> Primer and probe design
상기 실시예 <4-1> 에서 정렬한 데이터를 기반으로 primer express 3.0.1 을 이용하여 T.f 에 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(표 4). Based on the data sorted in Example <4-1>, primers and probes specific for T.f were designed using primer express 3.0.1 (Table 4).
상기 T.f 프로브 서열은 NCBI blast 에서 다시 검증한 결과 모든 T.f 종에 대하여 특이적이고, 다른 세균 종에 대하여는 비특이적인 것을 확인할 수 있었다. As a result of re-verification of the T.f probe sequence in NCBI blast, it was confirmed that it was specific for all T.f species and non-specific for other bacterial species.
[NCBI blast searching 조건][NCBI blast searching conditions]
Max target sequences : 1000Max target sequences: 1000
Program selection optimize for Highly similar sequences (blastn)Program selection optimized for Highly similar sequences (blastn)
Database : Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)Database: Others (nr etc.)_nucleotide collection (nr/nt)
Tm 과 self- & hetero- dimer 는 IDT 의 Oligo analyzer 를 이용하여 확인하였다. Tm and self- & hetero-dimer were confirmed using IDT's Oligo analyzer.
[정방향 프라이머_T.f 프라이머 F][Forward Primer_T.f Primer F]
GC 52.2% / Melt temp: 58.6℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7146.7 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 240200 L/(mole·cm)GC 52.2% / Melt temp: 58.6℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7146.7 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 240200 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 1 개 (Δ-1.53)Hairpin str.: 1 (Δ-1.53)
Self-dimer : Maximum Δ-43.45 kcal/mole -> Max. 3 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ-43.45 kcal/mole -> Max. 3 bases combined
[역방향 프라이머_T.f 프라이머 R][Reverse Primer_T.f Primer R]
GC 45.8% / Melt temp: 56.4℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7394.9 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 248000 L/(mole·cm)GC 45.8% / Melt temp: 56.4℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7394.9 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 248000 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 1 개 (Δ-3.72)Hairpin str.: 1 (Δ-3.72)
Self-dimer : Maximum Δ- 46.76 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ- 46.76 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
[프로브_T.f 프로브] [Probe_T.f Probe]
GC 60% / Melt temp: 63.4℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7799.1 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT : 258800 L/(mole·cm)GC 60% / Melt temp: 63.4℃/ MOLECULAR WEIGHT: 7799.1 g/mole / EXTINCTION COEFFICIENT: 258800 L/(mole·cm)
Hairpin str.: 3 개 (Δ-3.21, -2.82, -1.92)Hairpin str.: 3 (Δ-3.21, -2.82, -1.92)
Self-dimer : Maximum Δ- 52.73 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Self-dimer: Maximum Δ- 52.73 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
[Dimer analysis][Dimer analysis]
Hetero-dimer(F-R) : Maximum Δ-46.76 kcal/mole -> Max. 4 bases 결합Hetero-dimer(F-R): Maximum Δ-46.76 kcal/mole -> Max. 4 bases combined
Hetero-dimer(F-P) : Maximum Δ-52.73 kcal/mole -> Max. 6 bases 결합Hetero-dimer(F-P): Maximum Δ-52.73 kcal/mole -> Max. 6 bases combined
Hetero-dimer(R-P) : Maximum Δ-52.73 kcal/mole -> Max. 3 bases 결합Hetero-dimer(R-P): Maximum Δ-52.73 kcal/mole -> Max. 3 bases combined
양성 대조군(positive control)을 주문함에 있어서 필요로 하는 앰플리콘(amplicon) 을 기준으로 NCBI blast 를 이용하여 재검증한 결과 T.f 종(strain) 에 대하여 100% 특이적이고, 그 외의 다른 종 에 대해서는 동일성이 떨어지는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명의 프라이머 및 프로브는 T.f 양성 대조군을 합성하는 데에도 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다. NCBI blast based on the amplicon required when ordering a positive control As a result of re-verification using , it was confirmed that it was 100% specific for the Tf strain, and the identity was low for other species. As a result, it was confirmed that the primers and probes of the present invention had no problems in synthesizing the Tf positive control.
프라이머 및 프로브의 민감도 확인 Check the sensitivity of primers and probes
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브의 분석적 민감도(sensitivity)를 평가하고자 하였다. We attempted to evaluate the analytical sensitivity of the primers and probes prepared in <Example 1> to <Example 4>.
구체적으로, 생물자원센터에서 분양받은 표준균주(Aggregatibacter actinomycetemcomitans KCTC 2581(Aa), Porphyromonas gingivalis KCTC 5352 (Pg), Treponema denticola KCTC 15104 (Td) 및 Tannerella forsythia KCTC 5666 (Tf))는 멸균된 20%의 glycerol stock 과 1:1 로 혼합하여 초저온 냉동고(-70℃ 이하)에 보관하였다. 표준균주를 초저온 냉동고(-70℃ 이하)로부터 꺼내 해동한 후, 제조사(Qiagen) 프로토콜에 따라 QIAamp DNA mini prep kit 으로 핵산을 추출하였다. 추출된 핵산은 NanoDrop 2000 분광분석기 (Thermo Fisher)를 이용하여 수율을 측정한 뒤, copy number 로 단위를 환산하여 106 copies/㎕ 부터 1/10X 배수로 연속희석을 진행하여 100 copy/㎕ 까지 제조하였다 (균주별 농도 구간 상이). 희석/제조된 핵산은 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브를 각각 사용하여 Gene Checker UF-300(PCR thermocycler, Genesystem)로 실시간 PCR(real time PCR) 분석을 수행하였다(표 5). 리포트 창에서 Ct 값 결과를 해석하고, CV(%) 분석값과 검출정도(유무)를 통해 시험 결과가 유효한지 확인하였다. 그 후 IBM SPSS Statistics (Ver. 28.0.0.0) Probit 분석을 통해 민감도를 결정하였다. 최소한의 테스트 수는 60회 이었다(균주별 6개 농도 X 10회 반복). Specifically, the standard strains (Aggregatibacter actinomycetemcomitans KCTC 2581 (Aa), Porphyromonas gingivalis KCTC 5352 (Pg), Treponema denticola KCTC 15104 (Td), and Tannerella forsythia KCTC 5666 (Tf)) distributed from the Biological Resources Center were sterilized at 20%. It was mixed 1:1 with glycerol stock and stored in an ultra-low temperature freezer (below -70°C). The standard strain was taken out of the ultra-low temperature freezer (below -70°C), thawed, and nucleic acids were extracted using the QIAamp DNA mini prep kit according to the manufacturer's (Qiagen) protocol. The yield of the extracted nucleic acid was measured using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher), then the unit was converted to copy number and continuously diluted from 10 6 copies/㎕ to 1/10X to produce 10 0 copies/㎕. (concentration ranges differ for each strain). The diluted/prepared nucleic acid was subjected to real-time PCR analysis using Gene Checker UF-300 (PCR thermocycler, Genesystem) using the primers and probes prepared in <Example 1> to <Example 4>, respectively. (Table 5). The Ct value results were interpreted in the report window, and the test results were confirmed to be valid through the CV (%) analysis value and detection degree (presence or absence). Afterwards, sensitivity was determined through IBM SPSS Statistics (Ver. 28.0.0.0) Probit analysis. The minimum number of tests was 60 (6 concentrations per strain x 10 repetitions).
Oligo (Primer&Probe) : macrogeneEquipment: UF-300 (Genesystem) Reagent: Rapi:Spec Probe Mastermix (Genesystem)
Oligo (Primer&Probe): macrogene
그 결과, Aa 와 Td 의 경우, 10 copies/㎕ 까지 100% 검출되었으며 Pg 는 20%, Tf 는 30% 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 실험 결과의 유효성 정도를 확인할 수 있는 CV(Coefficient of Variation, 변동계수) 역시 모두 5% 이내의 수치를 나타냈으며, PCR 자체의 performance 를 확인할 수 있는 지표인 IPC(Internal Positive Control, 서열번호 13 ~15)는 4 개의 target 에서 100% 검출된 것을 확인할 수 있었다(도 1 ~ 도 4). 상기 데이터를 기반으로 SPSS probit 분석을 진행하여 각 target 별 q-PCR reagents 의 분석적 민감도를 확인한 결과는 하기 [표 6] 에 기재하였다(copies/㎕, 95% 신뢰구간 기준).As a result, in the case of Aa and Td, it was confirmed that up to 10 copies/㎕ were detected in 100%, Pg was detected in 20%, and Tf was detected in 30%. CV (Coefficient of Variation), which can confirm the degree of validity of the experimental results, all showed values within 5%, and IPC (Internal Positive Control, SEQ ID NO: 13 ~ 15), which is an indicator of the performance of PCR itself ) was confirmed to be 100% detected in 4 targets (Figures 1 to 4). Based on the above data, SPSS probit analysis was performed to confirm the analytical sensitivity of q-PCR reagents for each target. The results are shown in [Table 6] below (copies/μl, based on 95% confidence interval).
프라이머 및 프로브의 직선성 확인 Check the linearity of primers and probes
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브의 효율의 직선성(linearity)을 평가하고자 상기 <실시예 5> 와 동일한 방법으로 표준균주들을 정량한 후, 리포트 창에서 Ct 값 결과를 해석하여 직선성을 평가하였다. To evaluate the linearity of the efficiency of the primers and probes prepared in <Example 1> to <Example 4>, standard strains were quantified in the same manner as <Example 5>, and then Ct was calculated in the report window. The linearity was evaluated by interpreting the value results.
그 결과, [도 5] 내지 [도 8] 에서 나타나는 바와 같이 Aa, Td 및 Tf 의 상관계수값이 0.99 이상으로 확인되었으며 Pg 역시 0.9873 의 높은 상관계수값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 표적 핵산의 농도에 따라 일정한 값을 재현성 있게 도출하는 것을 의미하였다. As a result, as shown in [FIGS. 5] to [FIG. 8], the correlation coefficient values of Aa, Td, and Tf were confirmed to be more than 0.99, and it was confirmed that Pg also showed a high correlation coefficient value of 0.9873. This meant reproducibly deriving a constant value depending on the concentration of the target nucleic acid.
프라이머 및 프로브의 특이도 확인Check specificity of primers and probes
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브의 분석적 특이도(specificity)를 평가하고자 하였다. We attempted to evaluate the analytical specificity of the primers and probes prepared in <Example 1> to <Example 4>.
구체적으로, 생물자원센터에서 분양받은 표준균주(표 7) 들은 멸균된 20%의 glycerol stock 과 1:1 로 혼합하여 초저온 냉동고(-70℃ 이하)에 보관하였다. 표준균주를 초저온 냉동고(-70℃ 이하)로부터 꺼내 해동한 후, 제조사(Qiagen)의 프로토콜에 따라 QIAamp DNA mini prep kit 으로 핵산을 추출하였다. 추출된 핵산은 NanoDrop 2000 분광분석기 (Thermo Fisher)를 이용하여 수율을 측정한 뒤, copy number 로 단위를 환산하여 희석하고, 105 copies/㎕ 를 q-PCR 실험에 사용하였다. 희석/제조된 핵산은 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4> 에서 제작한 프라이머 및 프로브를 각각 사용하여 Gene Checker UF-300(PCR thermocycler, Genesystem)에서 실시간 PCR(real time PCR) 분석을 수행하였다. 리포트 창에서 Ct 값 결과를 해석하고, PC(Positive control), NC(Negative control) 및 IPC(Internal Positive Control)의 CV(%) 분석값과 검출정도(유무)를 통해 시험 결과가 유효한지 확인하였다. 각 타겟 별 35 종의 다른 균의 핵산을 주형(template)으로 이용하여 q-PCR 1 회 반복하였다.Specifically, the standard strains (Table 7) distributed from the Biological Resources Center were mixed 1:1 with sterilized 20% glycerol stock and stored in an ultra-low temperature freezer (-70°C or lower). The standard strain was taken out of the ultra-low temperature freezer (below -70°C), thawed, and nucleic acids were extracted using the QIAamp DNA mini prep kit according to the manufacturer's (Qiagen) protocol. The extracted nucleic acid was measured for yield using a NanoDrop 2000 spectrometer (Thermo Fisher), then converted to copy number and diluted, and 10 5 copies/㎕ were used in q-PCR experiments. The diluted/prepared nucleic acid was subjected to real-time PCR analysis in Gene Checker UF-300 (PCR thermocycler, Genesystem) using the primers and probes prepared in <Example 1> to <Example 4>, respectively. did. We interpreted the Ct value results in the report window and confirmed whether the test results were valid through the CV (%) analysis values and detection degree (presence or absence) of PC (Positive control), NC (Negative control), and IPC (Internal Positive Control). . q-PCR was repeated once using nucleic acids from 35 different bacteria for each target as a template.
그 결과, 하기 [표 8] 에서 나타나는 바와 같이 100% 의 특이도를 나타냈으며, 실험 결과에 유효성 정도를 확인할 수 있는 CV(Coefficient of Variation, 변동계수) 역시 모두 5% 이내의 수치를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in [Table 8] below, specificity was 100%, and the CV (Coefficient of Variation), which can confirm the degree of effectiveness in the experimental results, was also confirmed to be within 5%. I was able to.
SEQUENCE LISTING <110> Denomics <120> Composition for detecting microorganism associated with oral disease and uses thereof <130> 1071150 <160> 15 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A.a primer F <400> 1 ctctccaaac catgcgaaac c 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A.a primer R <400> 2 catggcttga gcgattaatt gac 23 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A.a probe <400> 3 cacgatctct gcaaattccg acagcatt 28 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P.g primer F <400> 4 tagcattctc ctctctgttg ggag 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P.g primer R <400> 5 catacggaat tgcaccttgg ac 22 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P.g probe <400> 6 cgcaacccac aagtacgact gctctcc 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.d primer F <400> 7 gcgcggtgtt aatgatttgg 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.d primer R <400> 8 acgattgagt atgcgttttc acct 24 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.d probe <400> 9 aggcagaaga cggacgtagg tgccttc 27 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.f primer F <400> 10 aggcgtcatc acggtagaag aag 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.f primer R <400> 11 ataagcggag atataaccgc gatc 24 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.f probe <400> 12 caagggaacg gaaacgaccg tggag 25 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPC primer F <400> 13 ctcaaakgaa ttgacgggg 19 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPC primer R <400> 14 gtcatccmma ccttcctc 18 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPC probe <400> 15 catggytgtc gtcagctcgt g 21 SEQUENCE LISTING <110> Denomics <120> Composition for detecting microorganism associated with oral disease and uses thereof <130> 1071150 <160> 15 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A.a primer F <400> 1 ctctccaaac catgcgaaac c 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A.a primer R <400> 2 catggcttga gcgattaatt gac 23 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> A.a probe <400> 3 cacgatctct gcaaattccg acagcatt 28 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P.g primer F <400> 4 tagcattctc ctctctgttg ggag 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P.g primer R <400> 5 catacgggaat tgcaccttgg ac 22 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P.g probe <400> 6 cgcaacccac aagtacgact gctctcc 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.d primer F <400> 7 gcgcggtgtt aatgatttgg 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.d primer R <400> 8 acgattgagt atgcgttttc acct 24 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.d probe <400> 9 aggcagaaga cggacgtagg tgccttc 27 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.f primer F <400> 10 aggcgtcatc acggtagaag aag 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.f primer R <400> 11 ataaagcggag atataaccgc gatc 24 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T.f probe <400> 12 caagggacg gaaacgaccg tggag 25 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPC primer F <400> 13 ctcaaaakgaa ttgacgggg 19 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPC primer R <400> 14 gtcatccmma ccttcctc 18 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPC probe <400> 15 catggytgtc gtcagctcgt g 21
Claims (17)
서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제3프라이머 세트; 및
서열번호 10 의 염기서열 및 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제4프라이머 세트;
를 모두 포함하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물로서,
상기 구강질환 유발 세균은 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물.
A second primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 4 and the base sequence of SEQ ID NO: 5;
A third primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and the base sequence of SEQ ID NO: 8; and
A fourth primer set consisting of a primer pair containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 and the base sequence of SEQ ID NO: 11;
A composition for detecting oral disease-causing bacteria containing all of the following:
Oral disease, characterized in that the oral disease-causing bacteria are at least one selected from the group consisting of Porphyromonas gingivalis , Treponema denticola , and Tannerella forsythia . Composition for detecting pathogenic bacteria.
제3프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프로브; 또는
제4프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 12 의 염기서열을 포함하는 프로브;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출용 조성물.
The method of claim 1, wherein the second primer set further comprises a probe comprising the base sequence of SEQ ID NO: 6;
The third primer set additionally includes a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 9; or
The fourth primer set additionally includes a probe containing the base sequence of SEQ ID NO: 12;
A composition for detecting oral disease-causing bacteria, comprising:
The composition of claim 1, wherein the primer set is used for PCR (polymerase chain reaction).
The method of claim 3, wherein the PCR is quantitative PCR (quantitative PCR, qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), solid phase PCR (Solid Phase PCR), competitive PCR ( Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR, ISSR ( Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR (Thermal) asymmetric interlaced PCR, Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, allele-specific PCR, assembly PCR (Assembly PCR), asymmetric PCR (asymmetric PCR), dial-out PCR (Dial-out PCR), digital PCR (dital PCR), and helicase-dependent amplification technology (helicasedependent amplification). A composition for detecting oral disease-causing bacteria, characterized by the above.
The method of claim 1, wherein the oral disease is at least one selected from the group consisting of gingivitis, invasive periodontitis, peri-implantitis, juvenile periodontitis, necrotic ulcerative periodontitis, and chronic inflammatory periodontal disease. Composition.
상기 구강질환 유발 세균은 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
A kit for detecting oral disease-causing bacteria comprising the composition of claim 1 and a reagent for a PCR amplification reaction,
A kit wherein the oral disease-causing bacteria are at least one selected from the group consisting of Porphyromonas gingivalis , Treponema denticola , and Tannerella forsythia.
The method of claim 7, wherein the PCR is quantitative PCR (quantitative PCR, qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), solid phase PCR (Solid Phase PCR), competitive PCR ( Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR, ISSR ( Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR (Thermal) asymmetric interlaced PCR, Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, allele-specific PCR, assembly PCR (Assembly PCR), asymmetric PCR (asymmetric PCR), dial-out PCR (Dial-out PCR), digital PCR (dital PCR), and helicase-dependent amplification technology (helicasedependent amplification). A kit for detecting oral disease-causing bacteria characterized by the above.
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 제1항의 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;
를 포함하는 구강질환 유발 세균 검출방법으로서,
상기 구강질환 유발 세균은 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 유발 세균 검출방법.
i) obtaining a biological sample from the individual;
ii) isolating bacterial DNA from the biological sample obtained in step i); and
iii) detecting oral disease-causing bacteria using the bacterial DNA obtained in step ii) and the composition of paragraph 1;
As a method for detecting oral disease-causing bacteria, including:
Oral disease, characterized in that the oral disease-causing bacteria are at least one selected from the group consisting of Porphyromonas gingivalis , Treponema denticola , and Tannerella forsythia . Method for detecting causative bacteria.
The method of claim 9, wherein the biological sample in step i) is one or more selected from the group consisting of blood, urine, cerebrospinal fluid, and saliva.
The method of claim 9, wherein the detection in step iii) is performed using PCR (polymerase chain reaction).
The method of claim 11, wherein the PCR is quantitative PCR (qPCR), real-time PCR (real-time PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), solid phase PCR (Solid Phase PCR), competitive PCR ( Competitive PCR, Overlap-extension PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR, ISSR ( Intersequence-specific PCR), Methylation-specific PCR (MSP), colony PCR (colony PCR), Miniprimer PCR (Miniprimer PCR), Nano PCR (Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR (Thermal) asymmetric interlaced PCR, Touchdown (Step-down) PCR, Hot start PCR, In silico PCR, allele-specific PCR, assembly PCR (Assembly PCR), asymmetric PCR (asymmetric PCR), dial-out PCR (Dial-out PCR), digital PCR (dital PCR), and helicase-dependent amplification technology (helicasedependent amplification). A method for detecting oral disease-causing bacteria characterized by the above.
A composition for diagnosing oral diseases comprising the composition of claim 1.
A kit for diagnosing oral diseases comprising the composition of claim 13 and a reagent for a PCR amplification reaction.
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 세균 DNA를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 세균 DNA와 상기 제1항의 조성물을 이용하여 구강질환 유발 세균을 검출하는 단계;
를 포함하는 구강질환 진단을 위한 정보제공방법으로서,
상기 구강질환 유발 세균은 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 진단을 위한 정보제공방법.
i) obtaining a biological sample from the individual;
ii) isolating bacterial DNA from the biological sample obtained in step i); and
iii) detecting oral disease-causing bacteria using the bacterial DNA obtained in step ii) and the composition of paragraph 1;
As a method of providing information for diagnosing oral diseases including,
Oral disease, characterized in that the oral disease-causing bacteria are at least one selected from the group consisting of Porphyromonas gingivalis , Treponema denticola , and Tannerella forsythia . Method of providing information for diagnosis.
The composition of claim 1, wherein the composition further comprises a first primer set consisting of a primer pair including the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the base sequence of SEQ ID NO: 2.
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| KR101706070B1 (en) | 2016-06-28 | 2017-02-13 | (주) 와이디생명과학 | Simultaneous detecting composition of multiple oral disease bacteria with multiplex real-time PCR and method thereof |
Non-Patent Citations (2)
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