KR102655121B1 - A Primer set for specifically detecting Lactobacillus sakei K040706 and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물에 관한 것으로서, 다기능성을 갖는 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 검출 및 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물은 저비용, 고효율로 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 이용한 건강기능식품 등의 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있고, 품질을 개선하는데 사용될 수 있다. 또한, 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 활용한 다양한 연구 등에 활용될 수 있다.The present invention relates to a primer set composition for detecting Lactobacillus sakei. The primer set composition for detecting and discriminating multifunctional Lactobacillus sakei K040706 strain is low cost and high efficiency. Since it can specifically detect only , it can be usefully used in various fields such as health functional foods using the Lactobacillus Sakei K040706 strain and can be used to improve quality. In addition, it can be used for various research using Lactobacillus Sakei K040706 strain.
Description
본 발명은 락토바실러스 사케이 K040706 균주 검출용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 락토바실러스 사케이 중에서 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 특이적으로 검출 및 선발하기 위한 프라이머 세트 조성물, 이를 포함하는 검출용 조성물, 이를 이용한 검출방법 및 프라이머 세트 조성물을 포함하는 PCR 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for detecting Lactobacillus sakei K040706 strain, and more specifically, to a primer set composition for specifically detecting and selecting Lactobacillus sakei K040706 strain among Lactobacillus sakei, and a detection composition comprising the same. It relates to a PCR kit including a composition, a detection method using the same, and a primer set composition.
젖산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 유산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품ㅇ김치류ㅇ양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 젖산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실러스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.Lactic acid bacteria are bacteria that produce lactic acid by decomposing sugars such as glucose, and are also called lactic acid bacteria. The property of inhibiting the growth of pathogens and harmful bacteria by lactic acid produced through lactic acid fermentation is used in the production of foods such as dairy products, kimchi, and brewed foods. I'm doing it. In addition, lactic acid bacteria live in the intestines of mammals and are used as a colonizer to prevent abnormal fermentation caused by various bacteria. The lactic acid bacteria are Gram-positive bacteria, have facultative anaerobic or anaerobic properties, and several types are known in the genus Lactobacillus and Streptococcus.
이중에서도 수탁번호 KCCM11472P로 기탁된 락토바실러스 사케이 K040706 균주(Lactobacillus sakei K040706)는 장내 NO 생성능을 증가하여 면역을 증진시키고, 장조직의 손상을 감소시키며, 대장염뿐만 아니라 바이러스 감염 질환에 대한 효과를 갖는 유용 미생물로 알려져 있다. 현재 코로나 19로 인한 건강기능식품 시장 규모가 증가하고 있는 추세에서, 상기 바이러스 감염 질환 억제 효능을 갖는 균주의 품질 관리 및 유지는 매우 중요하다. Among them, the Lactobacillus sakei K040706 strain ( Lactobacillus sakei K040706) deposited under the accession number KCCM11472P improves immunity by increasing NO production ability in the intestine, reduces damage to intestinal tissue, and has an effect on viral infectious diseases as well as colitis. Known as a useful microorganism. As the market size of health functional foods is currently increasing due to COVID-19, quality control and maintenance of strains with the effect of suppressing viral infectious diseases are very important.
그러나, 현재 특정 유산균을 분석하기 위해서는, 시료 내에 존재하는 유산균을 유산균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 시료 내에 존재하는 미생물의 수를 실시간으로 분석할 수 없다는 문제가 있다. 게다가 시료를 준비하고, 이로부터 미생물을 별도로 배양하는 과정이 필요하며, 그 과정에서 균주가 사멸할 경우에는 측정되지 않는다. 또한 미생물이 배양이 된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있다. 또한, 유산균이 함유된 제품에서 유전적으로 비슷한 성질을 가지는 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 정확하게 측정하기 위해서는, 이를 분리 및 동정해야 하며 그 과정에서 많은 시간과 비용이 필요하다는 문제점이 있다.However, currently, in order to analyze specific lactic acid bacteria, the form and number of colonies formed by smearing and culturing the lactic acid bacteria present in the sample under culture conditions specific to the lactic acid bacteria have been confirmed. Smear culture has the problem that it can only measure the number of microorganisms that can survive under artificial culture conditions, so it cannot analyze the number of microorganisms present in the actual sample in real time. In addition, it is necessary to prepare a sample and separately culture the microorganisms from it, and if the strain dies during the process, it is not measured. In addition, even if microorganisms are cultured, it takes some time for the strain to form colonies, and it has the disadvantage of low specificity and sensitivity. In addition, in order to accurately measure only the Lactobacillus sakei K040706 strain that has genetically similar properties in products containing lactic acid bacteria, it must be isolated and identified, and there is a problem in that a lot of time and money are required in the process.
이에 따라, 유전적 성질이 비슷한락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 정확하고 간단하게 동정할 수 있는 새로운 기술 개발의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.Accordingly, there is a need to develop a new technology that can accurately and simply identify only Lactobacillus sakei K040706 strains with similar genetic properties.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 다기능성의 특정 균주만을 효율적으로 검출 및 판별할 수 있는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물을 제공하는 것이다.Therefore, the present invention was developed in consideration of the above problems, and the object of the present invention is to provide a primer set composition for detecting Lactobacillus sakei that can efficiently detect and discriminate only specific multifunctional strains. It is done.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 검출용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for detecting Lactobacillus sakei strains.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting Lactobacillus sakei strains.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 PCR 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a PCR kit for detecting Lactobacillus sakei .
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention includes a primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; and a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. It provides a primer set composition for detecting Lactobacillus sakei containing at least one primer set selected from the group consisting of.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주일 수 있다.The Lactobacillus sakei (Lactobacillus sakei) may be the Lactobacillus sakei K040706 strain.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 특이적으로 검출하는 것일 수 있다.The primer set may specifically detect a gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명은 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 검출용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above other object, the present invention provides a composition for detecting Lactobacillus sakei strains including the primer set composition.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, a) 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 b) 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하여 락토바실러스 사케이 균주의 존재유무를 판별하는 단계;를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법을 제공한다.In order to achieve the other object, the present invention includes the steps of: a) using DNA isolated from a sample as a template and performing an amplification reaction using the primer set composition to amplify a target sequence; and b) detecting the amplification product obtained from the amplification step to determine the presence or absence of the Lactobacillus sakei strain.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주일 수 있다.The Lactobacillus sakei (Lactobacillus sakei) may be the Lactobacillus sakei K040706 strain.
상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간(real-time) PCR, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplificationsystem), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The amplification reaction may be polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, or transcription-based amplification system. based amplification system), strand displacement amplification, and Qβ replicase.
상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.Detection of the amplification product may be any one or more selected from the group consisting of gel electrophoresis, capillary electrophoresis, DNA chip, radioactivity measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement.
상기 증폭 산물의 검출 단계에서, 150 내지 180 bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우, 시료 내 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)가 함유된 것으로 판단하는 것일 수 있다.In the step of detecting the amplification product, if a PCR product of 150 to 180 bp is amplified, it may be determined that the sample contains Lactobacillus sakei.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 키트를 제공한다.In order to achieve the above other object, the present invention provides a kit for detecting Lactobacillus sakei including a primer set composition.
PCR 반응 혼합물은 dNTP, DNA 폴리머라아제 및 버퍼를 포함하는 것일 수 있다.The PCR reaction mixture may include dNTPs, DNA polymerase, and buffer.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 락토바실러스 사케이 K040706 균주일 수 있다.The Lactobacillus sakei ( Lactobacillus sakei ) may be Lactobacillus sakei K040706 strain.
본 발명에 따르면, 다기능성을 갖는 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 검출 및 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물은 저비용, 고효율로 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 이용한 건강기능식품 등의 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있고, 품질을 개선하는데 사용될 수 있다. 또한, 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 활용한 다양한 연구 등에 활용될 수 있다.According to the present invention, the primer set composition for detecting and discriminating the multifunctional Lactobacillus sakei K040706 strain can specifically detect only the Lactobacillus sakei K040706 strain at low cost and high efficiency, and thus the Lactobacillus sakei K040706 strain. It can be useful in various fields such as health functional foods and can be used to improve quality. In addition, it can be used for various research using Lactobacillus Sakei K040706 strain.
게다가 사균 형태의 락토바실러스 사케이 K040706 균주도 검출이 가능하므로, 사균형태의 제품 및 연구에도 광범위하게 적용할 수 있다.In addition, since it is possible to detect Lactobacillus Sakei K040706 strain in the form of dead cells, it can be widely applied to products and research in the form of dead cells.
도 1은 유전체 염기서열의 상관도를 분석하여 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)과의 계통학적 유연관계를 OrthoANI 값을 이용해 클러스터링한 결과이다.
도 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706) 및 표 1에 나타낸 4종의 균주의 범유전체(Pan-Genome) 분석을 통한 Strain specific CDSs를 분석한 결과이다.
도 3은 서열번호 2로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 4는 서열번호 3으로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 5는 서열번호 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.
도 6은 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트를 이용하여 다양한 균종드로부터 추출한 DNA 샘플들에 대해 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Lane L은 마커이고, Lane 1은 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)이고, Lane 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 사균화 샘플(Heat inactivated)이며, Lane 3은 KACC17865 균주이며, Lane 4는 KACC17868 균주이며, Lane 5는 KACC17871 균주이며, Lane 6은 KACC18352 균주이며, Lane 7은 KACC17864 균주이며, Lane 8은 KACC16119 균주이다.
도 7은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용한 락토바실러스 사케이 K040706의 실시간 PCR CT 그래프 결과이다.
도 8은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용하여 측정된 락토바실러스 사케이 K040706에 대한 용융 그래프(melting curve)이다. Figure 1 shows the results of clustering the phylogenetic relationship with Lactobacillus sakei K040706 by analyzing the correlation of the genome base sequence using OrthoANI values.
Figure 2 shows the results of analyzing strain specific CDSs through pan-genome analysis of Lactobacillus sakei K040706 and the four strains shown in Table 1.
Figure 3 shows the results of comparing the target gene of Lactobacillus sakei K040706, represented by SEQ ID NO: 2, with sequence information of all Lactobacillus sakei species present in NCBI.
Figure 4 shows the results of comparing the target gene of Lactobacillus sakei K040706, represented by SEQ ID NO: 3, with the sequence information of all Lactobacillus sakei species present in NCBI.
Figure 5 shows the results of comparing the target gene of Lactobacillus sakei K040706, represented by SEQ ID NO: 4, with sequence information of all Lactobacillus sakei species present in NCBI.
Figure 6 is a diagram showing the results of PCR on DNA samples extracted from various bacterial species using the primer sets of Examples 1 to 3. At this time, Lane L is a marker, Lane 1 is Lactobacillus sakei K040706, Lane 2 is a heat inactivated sample of Lactobacillus sakei K040706, and Lane 3 is KACC17865. Strain, Lane 4 is the KACC17868 strain, Lane 5 is the KACC17871 strain, Lane 6 is the KACC18352 strain, Lane 7 is the KACC17864 strain, and Lane 8 is the KACC16119 strain.
Figure 7 is a real-time PCR C T graph result of Lactobacillus sakei K040706 using the primer set of Example 2.
Figure 8 is a melting curve for Lactobacillus sakei K040706 measured using the primer set of Example 2.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
수탁번호 KCCM11472P로 기탁된 락토바실러스 사케이 K040706 균주(Lactobacillus sakei K040706)는 장내 NO 생성능을 증가하여 면역을 증진시키고, 장조직의 손상을 감소시키며, 대장염뿐만 아니라 바이러스 감염 질환에 대한 효과를 갖는다. 락토바실러스 사케이 K040706 균주는 유용성에 비해 효과적으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 미비하여 실제 산업분야 활용에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 구체적으로 도 1의 계동도를 통해 확인할 수 있듯이 락토바실러스 사케이 및 락토바실러스 균주 중에서 유전체 유사도가 높은 균주가 4종 이상 존재하는 것을 확인할 수 있다. 종래 판별방법으로는 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 특이적으로 검출하는데 여러 문제가 있다. 따라서 락토바실러스 군주 중에서 락토바실러스 사케이 K040706 균주만을 특이적이고, 정확하게 식별, 검출 및 정량할 수 있는 프라이머에 대한 개발이 매우 시급하다.Lactobacillus sakei K040706 strain ( Lactobacillus sakei K040706), deposited with accession number KCCM11472P, improves immunity by increasing NO production ability in the intestine, reduces damage to intestinal tissue, and has effects on viral infectious diseases as well as colitis. Lactobacillus Sakei K040706 strain is experiencing difficulties in actual industrial use due to lack of development of methods for effective detection compared to its usefulness. Specifically, as can be seen through the diagram in Figure 1, it can be confirmed that there are at least four strains with high genome similarity among Lactobacillus sakei and Lactobacillus strains. Conventional identification methods have several problems in specifically detecting only the Lactobacillus sakei K040706 strain. Therefore, the development of primers that can specifically and accurately identify, detect, and quantify only the Lactobacillus sakei K040706 strain among Lactobacillus monarchs is very urgent.
본 발명의 일 측면은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물에 관한 것이다.One aspect of the present invention is to achieve the above object, a primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; and a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. It relates to a primer set composition for detecting Lactobacillus sakei containing at least one primer set selected from the group consisting of.
본 발명의 다른 측면은 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주 검출용 조성물에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a composition for detecting Lactobacillus sakei strains comprising the primer set composition.
상기 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 중에서도 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 특이적이고, 정확하게 높은 민감도로 식별, 검출할 수 있다는 이점이 있다. 상기 락토바실러스 사케이 K040706 균주는 수탁번호 KCCM11472P로 기탁된 락토바실러스 사케이 K040706 균주(Lactobacillus sakei K040706)일 수 있다.The primer set has the advantage of being able to specifically and accurately identify and detect Lactobacillus sakei K040706 strain among Lactobacillus sakei with high sensitivity. The Lactobacillus sakei K040706 strain may be Lactobacillus sakei K040706 strain ( Lactobacillus sakei K040706) deposited with accession number KCCM11472P.
본 발명에 따른 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이 K040706 균주 중에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자 또는 이의 단편을 특이적으로 검출하는 것으로, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 염기서열 중에서 다른 균주에서는 존재하지 않는 영역을 검출하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 2 내지 4로 표시되는 유전자 중에서 선택되는 어느 하나를 특이적으로 검출하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 2 내지 4로 표시되는 유전자는 Hypothesis gene으로 아직 그 기능이 확인되지 않은 영역이다.The primer set according to the present invention specifically detects a gene or a fragment thereof consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 among the Lactobacillus Sakei K040706 strain, and preferably exists in other strains among the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. It may be to detect a region that is not detected, and most preferably, it may be to specifically detect any one selected from genes represented by SEQ ID NOs: 2 to 4. The genes represented by SEQ ID NOs. 2 to 4 are hypothesis genes and are regions whose functions have not yet been confirmed.
구체적으로, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 2로 표시되는 유전자를 증폭시키고, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 3으로 표시되는 유전자를 증폭하며, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 것일 수 있다.Specifically, the primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 amplifies the gene represented by SEQ ID NO: 2, and the primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 amplifies the gene represented by SEQ ID NO: 3. A primer set that amplifies the indicated gene and consists of the base sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 may specifically amplify the gene indicated by SEQ ID NO: 4.
본 명세서에서 "프라이머"란, 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연적으로 발생하는(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. As used herein, “primer” refers to an oligonucleotide, and conditions that induce the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template), that is, the presence of nucleotides and a polymerizing agent such as DNA polymerase, and an appropriate temperature. It can act as a starting point for synthesis under conditions of and pH. Preferably, the primers are deoxyribonucleotides and single stranded. Primers used in the present invention may include naturally occurring dNMP (i.e., dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP), modified nucleotides, or non-natural nucleotides. Additionally, primers may also contain ribonucleotides.
상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.The primer does not have to be exactly complementary to the sequence of the template, but can be used if it is complementary enough to form a hybrid complex with the template.
상기 주형의 서열은 앞서 설명한 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 유전자라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 2 내지 4로 표시되는 유전자 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.As described above, the sequence of the template is not particularly limited as long as it is the gene represented by SEQ ID NO: 1, but may preferably be any one selected from the genes represented by SEQ ID NO: 2 to 4.
또한, 상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 일 예로, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등의 단백질, 아크리딘, 프로랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철, 사화성 금속 등의 킬레이트화제, 알킬화제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P, 32P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학그룹 및 형광성 분자 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Additionally, the primer can be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support method or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, “capsation,” substitution of a native nucleotide with one or more homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidate, carbamate, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), but are not limited thereto. Additionally, if necessary, the primer may contain a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. The labels include, for example, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, proteins such as poly-L-lysine, inserting agents such as acridine and proralene, and chelates such as metals, radioactive metals, iron, and tetragenic metals. It may be a topical agent, an alkylating agent, an enzyme such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc., a radioactive isotope such as 33 P, 32 P, etc., a chemical group such as biotin, or a fluorescent molecule, but is not limited thereto.
상기 프라이머 세트는 현장진단(point-of-care testing, POCT)을 위해 사용될 수 있다. 상기 프라이머 세트는 현장진단용 기기를 이용하여 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있는 현장진단을 위한 프라이머 세트일 수 있다.The primer set can be used for point-of-care testing (POCT). The primer set may be a primer set for on-site diagnosis that can detect Lactobacillus sakei K040706 strain with high sensitivity and specificity using a point-of-care diagnostic device.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.In addition to the primer set, the composition may include reverse transcription polymerase, DNA polymerase, cofactors such as Mg 2+ , dATP, dCTP, dGTP, and dTTP. To amplify the reverse transcribed cDNA, various DNA polymerases can be used in the amplification step of the present invention. Examples of DNA polymerases include the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase, or bacteriophage T7 DNA polymerase. There are enzymes. The polymerase can be isolated from the bacteria themselves, purchased commercially, or obtained from cells expressing high levels of the cloned gene encoding the polymerase.
상기 조성물은 락토바실러스 사케이의 표적 핵산을 증폭하기 위한 것일 수 있다. 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온(isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 실시간 PCR, 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.The composition may be for amplifying the target nucleic acid of Lactobacillus sakei. Amplification may be a known method for amplifying nucleic acids. Amplification may be, for example, DNA amplification or RNA amplification. Amplification methods may require terminal cycling or may be performed isothermal. The amplification method includes polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), ligase chain reaction (LCR), and strand displacement. It may include strand displacement amplification (SDA), rolling circle amplification (RCA), etc. Amplification methods may also include RNA amplification methods. Examples may include reverse transcription (RT) or reverse transcription-PCR. Amplification may mean increasing the copy number of a target nucleic acid sequence or a sequence complementary thereto. “PCR” may be a method of amplifying a target nucleic acid from a primer pair that specifically binds to the target nucleic acid using a polymerase.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 검출방법에 관한 것이다. In order to achieve the above other object, the present invention relates to a method for detecting Lactobacillus sakei strain, comprising the following steps.
a) 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및a) using the DNA isolated from the sample as a template and performing an amplification reaction using the primer set composition to amplify the target sequence; and
b) 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하여 락토바실러스 사케이 균주의 존재유무를 판별하는 단계.b) Determining the presence or absence of the Lactobacillus sakei strain by detecting the amplification product obtained from the amplification step.
상기 시료는 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 함유하거나, 함유할 것으로 예상되는 모든 시료로, 락토바실러스 사케이 K040706 균주의 포함 여부 식별이 필요한 시료라면 특별히 제한되지 않으며, 일예로써 프로바이오틱스 제제, 화장품, 식품, 영양제, 음료, 첨가제, 각종 식이에 포함되는 물질 등을 대상으로 할 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니며 락토바실러스 속 균주의 포함 여부를 확인하고자 하는 것이라면 모두 대상 시료가 될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 시료에 함유된 미생물은 생균뿐만 아니라 사균일 수 있다.The samples are all samples that contain or are expected to contain the Lactobacillus sakei K040706 strain, and are not particularly limited as long as they are samples that require identification of whether they contain the Lactobacillus sakei K040706 strain. Examples include probiotic preparations, cosmetics, food, Nutrients, beverages, additives, substances included in various diets, etc. can be targeted, but are not limited to the above types, and any sample for which it is desired to check whether or not it contains strains of the Lactobacillus genus can be the target sample. Additionally, in the present invention, the microorganisms contained in the sample may be not only live cells but also dead cells.
상기 검출방법을 통해 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 중에서도 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 특이적이고, 정확하게 높은 민감도로 식별, 검출할 수 있다는 이점이 있다. 상기 락토바실러스 사케이 K040706 균주는 수탁번호 KCCM11472P로 기탁된 락토바실러스 사케이 K040706 균주(Lactobacillus sakei K040706)일 수 있다.The above detection method has the advantage of being able to specifically and accurately identify and detect Lactobacillus sakei K040706 strain among Lactobacillus sakei with high sensitivity. The Lactobacillus sakei K040706 strain may be Lactobacillus sakei K040706 strain ( Lactobacillus sakei K040706) deposited with accession number KCCM11472P.
상기 시료로부터 DNA를 분리하는 방법은 단업계에 공지된 방법이라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizardprep 키트(Promega 사), QIAmp 키트(QIAGEN사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.The method of isolating DNA from the sample is not particularly limited as long as it is a method known in the art, but specifically, the CTAB method may be used, or the Wizardprep kit (Promega) or QIAmp kit (QIAGEN) may be used. The target sequence can be amplified by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set according to the present invention.
다음으로, a) 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 수행한다.Next, a) the DNA isolated from the sample is used as a template, and an amplification reaction is performed using the primer set composition to amplify the target sequence.
상기 프라이머 세트 조성물은 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 프라이머 세트 조성물로, 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이 K040706 균주의 서열번호 1로 표시되는 유전자 중 소정의 영역에 상보적인 서열을 가지며, 바람직하게는 시료 DNA에 포함된 락토바실러스 사케이 K040706 균주의 서열번호 2 내지 4로 표시되는 DNA를 증폭할 수 있는 염기서열일 수 있다.The primer set composition includes a primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; and a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. A primer set composition for detecting Lactobacillus sakei comprising at least one primer set selected from the group consisting of, wherein the primer set is lactobacillus sakei. Amplifying DNA having a sequence complementary to a predetermined region of the gene represented by SEQ ID NO. 1 of the Bacillus sakei K040706 strain, preferably represented by SEQ ID NOs. 2 to 4 of the Lactobacillus sakei K040706 strain contained in the sample DNA. It may be a base sequence that can be used.
상기 프라이머 세트는 민감도가 높아 매우 낮은 수준의 타겟 DNA 농도에서도 효과적으로 타겟 DNA를 증폭할 수 있다.The primer set has high sensitivity and can effectively amplify target DNA even at very low target DNA concentrations.
상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간(real-time) PCR, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplificationsystem), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The amplification reaction may be polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, or transcription-based amplification system. based amplification system), strand displacement amplification, and Qβ replicase.
본 발명에서, 상기 "중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)"은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 것으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정 핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다.In the present invention, the "Polymerase Chain Reaction (PCR)" is a method of exponentially amplifying the starting nucleic acid material by sequentially synthesizing nucleic acids using a polymerase, and is widely known in the art, It is a concept that includes both qualitative PCR, which confirms the presence or absence of specific nucleic acids, quantitative PCR, which measures the amount of specific nucleic acids, and real-time PCR, which enables qualitative and quantitative analysis by tracking the PCR process in real time.
상기 중합효소 연쇄반응은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 반응 조건에 따라 수행되거나, 또는 일부 변형되어 수행될 수 있다. 또한, 상기 PCR 반응 혼합물은 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있으며, 이의 수행을 위한 설명서를 포함할 수 있다.The polymerase chain reaction may be performed according to general reaction conditions using conventional PCR equipment known in the art, or may be performed with some modification. Additionally, the PCR reaction mixture may include a reaction buffer, dNTPs, and DNA polymerase, and may include instructions for its performance.
구체적으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time RCR)일 수 있다. 일반적인 PCR의 경우 반응이 완료된 후 최종산물의 양을 알 수 있는 반면, 실시간 PCR은 PCR이 진행하는 동안 DNA 분자가 증폭되는 과정을 정량적으로 관찰할 수 있는 것을 특징으로 한다.Specifically, the polymerase chain reaction may be a real-time polymerase chain reaction (real-time RCR). In the case of general PCR, the amount of the final product can be known after the reaction is completed, whereas real-time PCR is characterized by being able to quantitatively observe the process of DNA molecule amplification during PCR.
본 발명에서 상기 실시간 PCR은 형광 탐침을 이용하는 Taqman 방법 또는 SYBR Green을 사용할 수 있고, 구체적으로는 SYBR Green을 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the real-time PCR may use the Taqman method using a fluorescent probe or SYBR Green, and may specifically use SYBR Green, but is not limited thereto.
상기 SYBR Green을 이용하는 실시간 PCR은, 목적하는 서열이 증폭됨에 따라 DNA 양이 증가하고, 이때 이중 가닥(double stranded) DNA에 끼어 들어가는 성질이 있는 형광 염료인 SYBR Green이 이중가닥 DNA에 끼어들어가게 된다. 상기 SYBR은 DNA에 끼어들어 발광하는 성질을 나타내므로, 발광 정도를 측정하여 증폭된 DNA양의 검출이 가능하다. SYBR Green을 이용하는 실시간 PCR법은 프라이머나 탐침에 형광 염료를 부착하지 않아도 되기 때문에 저렴하다는 장점이 있다. 그러나, SYBR Green을 이용하는 실시간 PCR 방법은 한 종류의 PCR 산물만 증폭되는 조건이어야 하고, 통상적인 PCR에서 일어나는 비특이적 산물이나 프라이머간의 다이머(dimer)의 형성이 일어나지 않는 민감한 프라이머 조건을 요구한다.In real-time PCR using SYBR Green, the amount of DNA increases as the target sequence is amplified, and at this time, SYBR Green, a fluorescent dye that has the property of inserting into double-stranded DNA, inserts into the double-stranded DNA. Since the SYBR exhibits the property of intercalating with DNA and emitting light, it is possible to detect the amount of amplified DNA by measuring the degree of light emission. The real-time PCR method using SYBR Green has the advantage of being inexpensive because it does not require attaching fluorescent dyes to primers or probes. However, the real-time PCR method using SYBR Green must be under conditions in which only one type of PCR product is amplified, and requires sensitive primer conditions that do not cause the formation of non-specific products or dimers between primers that occur in conventional PCR.
상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.Detection of the amplification product may be any one or more selected from the group consisting of gel electrophoresis, capillary electrophoresis, DNA chip, radioactivity measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement.
상기 증폭 산물의 검출 단계에서, 150 내지 180 bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우, 시료 내 락토바실러스 사케이 K040706 균주가 함유된 것으로 판단하는 것일 수 있다.In the detection step of the amplification product, if a PCR product of 150 to 180 bp is amplified, it may be determined that the sample contains Lactobacillus sakei K040706 strain.
구체적으로 상기 증폭 산물의 검출 단계에서, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 158 bp의 PCR 산물을 증폭하고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 160 bp의 PCR 산물을 증폭하며, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 176 bp의 PCR 산물을 증폭하는 것일 수 있다.Specifically, in the detection step of the amplification product, the primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 amplifies a 158 bp PCR product, and the primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 amplifies 160 bp. A bp PCR product is amplified, and a primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 may amplify a 176 bp PCR product.
본 발명의 다른 측면은 프라이머 세트 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 검출용 키트에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a kit for detecting Lactobacillus sakei including a primer set composition.
상기 검출용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.The detection kit may have the form of a solution, lyophilized powder, frozen solution, or strip, and each form can be formulated by a conventional method in the art. For example, a kit for detection in the form of a solution can be formulated by separately or mixing proteins or primers in buffer solutions such as sodium-phosphate, potassium-phosphate, Tris-hydrochloric acid, and various other types of buffers, depending on need. It can also be frozen or freeze-dried.
상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 측방유동분석법은 항원-항체 반응과 같은 두 물질 간의 특이적인 반응을 기본으로 하는 것으로, 민감도와 특이성이 높고, 빠른시간 내에 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있어 질병의 진단 및 빠른 예방 조치를 가능하게 한다.The detection kit may be one using an immunolateral flow strip method. Lateral flow assay is a method for detecting proteins or nucleic acids based on chromatography. This lateral flow analysis method is widely used in various fields such as pregnancy diagnosis, cancer diagnosis, the presence of other specific proteins or genes, or microorganism detection. Lateral flow analysis is based on a specific reaction between two substances, such as an antigen-antibody reaction. It has high sensitivity and specificity, and has the advantage of being able to confirm results in a short time, making it possible to diagnose diseases and take rapid preventive measures. .
본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermusaquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcusliteralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.The detection kit of the present invention includes experiments (e.g., PCR) required to detect the Lactobacillus sakei K040706 strain using the primer set of the present invention and various reagents necessary to confirm the results, such as PCR compositions, restriction enzymes, and agar. Buffer solutions required for loss, hybridization, and electrophoresis may be additionally included. Specifically, the PCR composition contains an appropriate amount of DNA polymerase (e.g., Thermusaquaticus (Taq), Thermusthermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalalis, or It may contain thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu), dNTPs, PCR buffer, and water (dH2O). The PCR buffer solution may include Tris-HCl, MgCl2, KCl, etc.
또한, 상기 검출용 키트는 실시간-PCR(RT-PCR) 키트일 수 있다. 구체적으로, RT-PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 RT-PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다Additionally, the detection kit may be a real-time PCR (RT-PCR) kit. Specifically, the RT-PCR composition may be prepared in a freeze-dried form in a plastic tube, and the kit may further include appropriate reagents and tools used for analysis in addition to the RT-PCR composition. These reagents and tools include suitable carriers, labels capable of producing a detectable signal, solubilizers, detergents, etc. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester. , polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 사케이 K040706 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 칩(chip)을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a biochip capable of specifically detecting Lactobacillus sakei K040706 strain containing the composition.
본 발명에서, 상기 "바이오 칩(chip)"은 DNA 칩이라고도 불리우며, 매우 작은 DNA 조각들이 고체 표면에 집적된 것으로, 플라스틱, 유리, 실리콘 등의 투명 또는 반투명한 재질로 이루어진 기판에 시료용액과 시약을 수용할 수 있는 챔버 및 채널을 포함한 형태일 수 있다.In the present invention, the "biochip", also called a DNA chip, is a product in which very small DNA fragments are integrated on a solid surface, and a sample solution and reagent are placed on a substrate made of a transparent or translucent material such as plastic, glass, or silicon. It may have a form including a chamber and a channel that can accommodate.
바이오 칩은 두께가 얇고 투명하며 히터블록과의 접촉면적이 넓기 때문에 PCR시간을 크게 단축할 수 있고, 동시에 최소한 수백 개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점이 있다. 또한, 고형체를 사용함으로써 아주 적은 양의 유전 물질을 고밀도로 붙일 수 있으며, 동시에 많은 수의 유전자를 검색할 수 있으며, 많은 양의 유전자의 발현 정도를 동시에 측정하거나 게놈의 다양한 부분의 유전자형을 파악하기 위해 사용할 수 있다.Biochips are thin and transparent, and have a large contact area with the heater block, so they can greatly shorten PCR time and have the advantage of being able to search for at least hundreds of genes in a short time. In addition, by using solid materials, very small amounts of genetic material can be attached at high density, large numbers of genes can be searched simultaneously, the expression levels of large amounts of genes can be measured simultaneously, or genotypes of various parts of the genome can be determined. It can be used to do this.
바이오 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA(complementary DNA)칩과 올리고뉴클레오티드 칩(oligonucleotide)으로 분류될 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500bp 이 상의 유전자(full-length open reading frame 또는 EST)가 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 칩에는 약 15 내지 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 접착될 수 있고, 칩 내에 포함되는 용액에 포함될 수 있으나, 상기 형태에 한정되지 않으며 필요에 따라 적절히 변형할 수 있다.Biochips can be classified into cDNA (complementary DNA) chips and oligonucleotide chips depending on the size of the genetic material attached. A cDNA chip may contain a gene (full-length open reading frame, or EST) of at least 500bp or more. An oligonucleotide consisting of about 15 to 25 bases may be attached to an oligonucleotide chip and may be included in a solution contained within the chip, but the form is not limited to the above and may be appropriately modified as needed.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred embodiments. However, these examples are for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited thereto.
실험예 1. EzBioCloud의 비교 유전체(comparative genomics) 분석Experimental Example 1. Comparative genomics analysis of EzBioCloud
대장염뿐만 아니라 바이러스 감염 질환에 대한 치료 또는 개선효과를 갖는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 특이적 검출을 위해, 프라이머를 설계하고자 하였다. We attempted to design primers for specific detection of Lactobacillus sakei K040706, which has a treatment or improvement effect not only on colitis but also on viral infectious diseases.
우선, 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 EZbiocloud( 통해 염기분석을 진행하여, 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)과 Orthologous average nucleotide identity(OrthoANI)에서의 Core size가 95% 이상인 4개의 균주를 선별하였다. Lactobacillus에 속하는 4종 strain(DSM 20017, DSM 15831, DS4, DSM 20019)은 각 균주간의 차이를 거의 확인할 수 없을 정도로 매우 유사하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트 조성물의 정확도를 위한 비교군으로 사용하였다(표 1, 도 1). First, nucleotide analysis of Lactobacillus sakei K040706 ( Lactobacillus sakei K040706) was performed through EZbiocloud, and 4 core sizes of Lactobacillus sakei K040706 ( Lactobacillus sakei K040706) and Orthologous average nucleotide identity (OrthoANI) were greater than 95%. Strains were selected. Four strains belonging to Lactobacillus (DSM 20017, DSM 15831, DS4, DSM 20019) were so similar that differences between each strain could hardly be confirmed, so they were used as a comparison group for the accuracy of the primer set composition of the present invention. was used (Table 1, Figure 1).
도 1은 유전체 염기서열의 상관도를 분석하여 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)과의 계통학적 유연관계를 OrthoANI 값을 이용해 클러스터링한 결과로, 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)와 계통학적으로 매우 유사한 4종의 균주를 확인하였다.Figure 1 shows the results of clustering the phylogenetic relationship with Lactobacillus sakei K040706 (Lactobacillus sakei K040706) using OrthoANI values by analyzing the correlation of the genome base sequence, and showing the phylogenetic relationship with Lactobacillus sakei K040706 (Lactobacillus sakei K040706). Four strains that were scientifically very similar were identified.
균주target
strain
실험예 2. 범유전체(Pan genome) 분석Experimental Example 2. Pan genome analysis
다음, 상기 4종의 균주와 락토바실러스 사케이 K040706의 범유전체(Pan genome) 분석을 수행하여, 락토바실러스 사케이 K040706 만의 특이적인 서열을 확인하였다. 범유전체(Pan genome) 분석은, 상동 유전자(Homologous gene) 분석을 통하여 유사도 95 이상인 CDSs(Coding sequences)를 확인하고, 유사한 유전자는 Core로 표시하고, 유사도 90에서 95 사이인 유전자는 Shell gene으로 표현하여 수행되었다. 상기 Core 또는 Shell gene에 포함되지 않는 낮은 유사도를 갖는 서열을 Strain specific strain인 서열로 확인하였다(도 2)(서열번호 1). Next, pan genome analysis of the above four strains and Lactobacillus sakei K040706 was performed to confirm the specific sequence of Lactobacillus sakei K040706. Pan genome analysis identifies CDSs (Coding sequences) with a similarity of 95 or higher through homologous gene analysis, similar genes are expressed as Core, and genes with a similarity between 90 and 95 are expressed as Shell genes. It was carried out. A sequence with low similarity not included in the Core or Shell gene was confirmed as a strain specific strain sequence (FIG. 2) (SEQ ID NO. 1).
도 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706) 및 표 1에 나타낸 4종의 균주의 범유전체(Pan-Genome) 분석을 통한 Strain specific CDSs를 분석한 결과로, 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)만의 특이적인 81개의 CDS(단백질 코딩 유전자)를 확인하였다.Figure 2 shows the results of analyzing strain specific CDSs through pan-genome analysis of Lactobacillus sakei K040706 (Lactobacillus sakei K040706) and the four strains shown in Table 1. 81 CDS (protein coding genes) specific to K040706) were identified.
실험예 3. 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706) 특이적 유전자 분석Experimental Example 3. Lactobacillus sakei K040706 (Lactobacillus sakei K040706) specific genetic analysis
실험예 2로부터 분석된 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 81개 CDS 서열을 NCBI BLAST() 검색하여, 유의미한 유전자가 있는지 확인하였다.The 81 CDS sequences of Lactobacillus sakei K040706 (Lactobacillus sakei K040706) analyzed in Experimental Example 2 were searched with NCBI BLAST () to determine whether there were significant genes.
NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 검색결과, 다른 균주에서 확인되지 않는 3 가지 서열(K040706_02017, K040706_02018, K040706_02019)을 선별하였다(도 3, 4, 5)(서열번호 2, 3, 4). 상기 서열번호 2, 3, 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자는 모두 Hypothesis gene으로 아직 그 기능이 확인되지 않은 것이다.As a result of NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) search, three sequences (K040706_02017, K040706_02018, K040706_02019) that were not identified in other strains were selected (Figures 3, 4, and 5) (sequences Number 2, 3, 4). The target genes of Lactobacillus sakei K040706 shown in SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 are all hypothesis genes, the functions of which have not yet been confirmed.
도 3은 서열번호 2로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이고, 도 4는 서열번호 3으로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이며, 도 5는 서열번호 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자를 NCBI에 존재하는 모든 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 종 서열정보와 비교한 결과이다.Figure 3 shows the results of comparing the target gene of Lactobacillus sakei K040706, represented by SEQ ID NO: 2, with the sequence information of all Lactobacillus sakei species present in NCBI, and Figure 4 shows the results of comparing the target gene of Lactobacillus sakei, represented by SEQ ID NO: 3, with the sequence information of all Lactobacillus sakei species present in NCBI. This is the result of comparing the target gene of Bacillus sakei K040706 with the sequence information of all Lactobacillus sakei species present in NCBI, and Figure 5 shows the target gene of Lactobacillus sakei K040706, represented by SEQ ID NO: 4, in NCBI. This is the result of comparison with the sequence information of all existing Lactobacillus sakei species.
도 3 내지 5에 나타난 바와 같이 서열번호 2 내지 4로 표시되는 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 유전자와 동일하거나 유사한 서열이 락토바실러스 사케이 종에서는 존재하지 않는 것을 확인하였다.As shown in Figures 3 to 5, it was confirmed that sequences identical or similar to the target genes of Lactobacillus sakei K040706 represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 do not exist in Lactobacillus sakei species.
실험예 6.Experimental Example 6. 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706 ( Lactobacillus sakei Lactobacillus sakei K040706) 검출용 프라이머(primer) 세트 조성물의 분석K040706) Analysis of primer set composition for detection
프라이머(primer) 세트 조성물 제조Preparation of primer set composition
실험예 5에서 확인한, 서열번호 2, 3, 4에 결합하는 특이적인 프라이버 세트를 제작하여 표 2에 나타내었다. 프라이머 디자인은 NCBI의 Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여 디자인하였다. A specific set of primers binding to SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 identified in Experimental Example 5 was prepared and shown in Table 2. Primers were designed using NCBI's Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).
PCR 분석PCR analysis
상기 실시예 1, 2, 3의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)에 대해 PCR을 진행하였다. PCR was performed on Lactobacillus sakei K040706 using the primer set compositions of Examples 1, 2, and 3.
PCR을 진행하기에 앞서, 프라이머 세트 조성물의 정확도를 확인하기 위하여, 본 발명의 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)와 락토바실러스 사케이에 속하는 6종의 균주를 MRS 배지(Difco, 288110)로 37 ℃, 24 시간동안 각각 배양하여 비교대상으로 사용하였다. 또한 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)를 가열하여 비활성한 시료에 대해서도 실험을 진행하였다(표 3).Before proceeding with PCR, in order to confirm the accuracy of the primer set composition, Lactobacillus sakei K040706 ( Lactobacillus sakei K040706) of the present invention and six strains belonging to Lactobacillus sakei were cultured on MRS medium (Difco, 288110). Each was cultured at ℃ for 24 hours and used as a comparison target. In addition, experiments were conducted on inactive samples by heating Lactobacillus sakei K040706 (Table 3).
상기 배양액을 각각 회소한 후, 원심분리(13,000 x g, 10 min)하여 균체를 분리하고 QIAmp DNA mini kit(QIAGEN, USA)를 이용하였고, 추출 조건은 2 g/L Lysozyme buffer를 이용하여 Gram 양성균인 락토바실러스 사케이의 표면을 녹이는 전처리를 수행한 후, 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 각각의 DNA를 추출하였다. 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 사균화 샘플(Heat inactivated)의 경우, Autoclave를 통하여 사멸시킨 다음 DNA를 추출하였다.After each of the above cultures was quenched, the cells were separated by centrifugation (13,000 After pretreatment to dissolve the surface of Lactobacillus sakei, each DNA was extracted according to the protocol provided by the manufacturer. In the case of a heat inactivated sample of Lactobacillus sakei K040706, it was killed through autoclave and then DNA was extracted.
PCR 증폭 반응은 T100™ Thermal Cycler(BIO-RAD, USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 BioFACT™ Pfu DNA Polymerase(BIOFACT, Korea)를 이용하였다. PCR 조성물은 제조사가 제공하는 조건에서 진행하였다. PCR 증폭 반응 조건은 95 ℃에서 30초간 변성하고, 95 ℃ 10초, 55 ℃ 10초, 72 ℃ 40초를 1 사이클로 30회 반복하였다. 전기영동의 경우 2% Agarose(E&S, Korea) 조건에서 MINIE-135(Miulab, China)를 수행하였다. PCR amplification reaction was performed using a T100™ Thermal Cycler (BIO-RAD, USA), and each reaction used BioFACT™ Pfu DNA Polymerase (BIOFACT, Korea). The PCR composition was performed under the conditions provided by the manufacturer. PCR amplification reaction conditions were denaturation at 95°C for 30 seconds, and repeating 30 times in one cycle of 95°C for 10 seconds, 55°C for 10 seconds, and 72°C for 40 seconds. For electrophoresis, MINIE-135 (Miulab, China) was performed under 2% Agarose (E&S, Korea) conditions.
도 6은 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트를 이용하여 다양한 균종드로부터 추출한 DNA 샘플들에 대해 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Lane L은 마커이고, Lane 1은 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)이고, Lane 2는 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 사균화 샘플(Heat inactivated)이며, Lane 3은 KACC17865 균주이며, Lane 4는 KACC17868 균주이며, Lane 5는 KACC17871 균주이며, Lane 6은 KACC18352 균주이며, Lane 7은 KACC17864 균주이며, Lane 8은 KACC16119 균주이다.Figure 6 is a diagram showing the results of PCR on DNA samples extracted from various bacterial species using the primer sets of Examples 1 to 3. At this time, Lane L is a marker, Lane 1 is Lactobacillus sakei K040706, Lane 2 is a heat inactivated sample of Lactobacillus sakei K040706, and Lane 3 is KACC17865. Strain, Lane 4 is the KACC17868 strain, Lane 5 is the KACC17871 strain, Lane 6 is the KACC18352 strain, Lane 7 is the KACC17864 strain, and Lane 8 is the KACC16119 strain.
도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트 조성물 모두 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)를 제외하고는 그 어디에서도 밴드가 관찰되지 않았다. 즉, 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트 조성물 중에서 어느 것을 사용하더라도, 락토바실러스 사케이 K040706에 특이적으로 각각 158, 160, 176 bp 크기의 PCR 산물을 생성한다는 것을 확인할 수 있다.As shown in Figure 6, no bands were observed in any of the primer set compositions of Examples 1 to 3 except for Lactobacillus sakei K040706. That is, it can be confirmed that no matter which primer set composition of Examples 1 to 3 is used, PCR products of 158, 160, and 176 bp in size are generated specifically for Lactobacillus sakei K040706, respectively.
게다가 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트 조성물은 사균화된 샘플 시료에서도 특이적으로 PCR 산물을 증폭함을 확인할 수 있었다. 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트 조성물 중에서도 실시예 2의 프라이머 세트 조성물이 가장 분명한 밴드를 형성한다는 것을 확인하였다. In addition, it was confirmed that the primer set compositions of Examples 1 to 3 according to the present invention specifically amplified PCR products even in sterilized samples. It was confirmed that among the primer set compositions of Examples 1 to 3, the primer set composition of Example 2 formed the clearest band.
실험예 7. 프라이머 세트를 이용한 락토바실러스 사케이 K040706의 실시간 PCR 분석Experimental Example 7. Real-time PCR analysis of Lactobacillus sakei K040706 using primer set
본 발명자들은 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 실시예 2의 조성물을 이용한 정확도를 확인하기 위하여 락토바실러스 사케이 K040706의 DNA 수준에서 검정하였다.The present inventors tested Lactobacillus sakei K040706 at the DNA level to confirm the accuracy of using the composition of Example 2 containing the primer sets represented by SEQ ID NOs: 7 and 8.
구체적으로, 실험예 6에서와 같이 락토바실러스 사케이 K040706(Lactobacillus sakei K040706)의 DNA를 준비한 후, 상기 추출한 DNA 양을 100 μg 내지 10 ng까지 다양하게 희석시킨 후, 실시예 2의 프라이머 세트 조성물을 이용한 실시간 PCR을 수행하였다.Specifically, after preparing the DNA of Lactobacillus sakei K040706 ( Lactobacillus sakei K040706) as in Experimental Example 6, the amount of the extracted DNA was variously diluted from 100 μg to 10 ng, and then the primer set composition of Example 2 was Real-time PCR was performed using
실시간 PCR 증폭반응을 수행하였다. PCR 혼합액은 SYBRㄾ Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo, Japan)를 사용하였고, 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였으며, 플레이트에서 20 ㎕의 총 부피로 수행하였다. 실시간 PCR 증폭 반응(Real-time PCR)은 Applied Biosystems™ 7500(Applied Biosystems, USA)을 사용해서 실시하였으며, 구체적인 반응 조건은 95 ℃에서 30초간 변성하고, 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초간 72 ℃에서 30초를 1 사이클로 40회 반복하였다. 플레이트로부터 방출된 형광 데이터(fluorescence data)는 7500 system SDSsoftware v1.3.0에 의해 분석되었다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72부터 95까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 각각의 Ct 값(Cycle threshold, Ct value)은 세 번씩 수행해서 나온 수치의 평균값을 구하였다.Real-time PCR amplification reaction was performed. The PCR mixture used was SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Japan), and was performed according to the protocol provided by the manufacturer, with a total volume of 20 ㎕ on the plate. Real-time PCR amplification reaction was performed using Applied Biosystems™ 7500 (Applied Biosystems, USA), and the specific reaction conditions were denaturation at 95°C for 30 seconds, 95°C for 30 seconds, and 55°C for 30 seconds. One cycle of 30 seconds was repeated 40 times at 72°C. Fluorescence data emitted from the plate was analyzed by 7500 system SDSsoftware v1.3.0. After the last cycle, melting curve analysis was performed in the range from 72 to 95 for all reactants. Each Ct value (Cycle threshold, Ct value) was calculated three times and the average value was obtained.
도 7은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용한 락토바실러스 사케이 K040706의 실시간 PCR CT 그래프 결과로, 락토바실러스 사케이 K040706에 대한 실시간 PCR의 표준 검량선이다. Figure 7 is a real-time PCR C T graph result of Lactobacillus sakei K040706 using the primer set of Example 2, and is a standard calibration curve of real-time PCR for Lactobacillus sakei K040706.
도 7에 나타난 바와 같이, 표준 검량선의 R2(Regression coefficient) 값이 0.998인 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 표준 검량선은 상관지수(R2)가 1에 가까운 이상적인 그래프라는 것을 알 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 적정범위의 유효한 데이터를 얻을 수 있으며, 100 μg 내지 10 ng까지 측정가능하다는 것을 확인할 수 있다.As shown in Figure 7, it can be seen that the R 2 (Regression coefficient) value of the standard calibration curve is 0.998. It can be seen that the standard calibration curve using the primer set of the present invention is an ideal graph with a correlation index (R 2 ) close to 1. It can be confirmed that by using the primer set of the present invention, valid data in an appropriate range can be obtained and measurement from 100 μg to 10 ng is possible.
도 8은 실시예 2의 프라이머 세트를 이용하여 측정된 락토바실러스 사케이 K040706에 대한 용융 그래프(melting curve)이다. Figure 8 is a melting curve for Lactobacillus sakei K040706 measured using the primer set of Example 2.
도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 프라이머 세트를 이용하여 측정된 락토바실러스 사케이 K040706의 표적 피크는 85.01 ℃에서 검출되는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이 K040706에 대해 PCR 산물이 특이적으로 결합 및 형성됨을 알 수 있다. As shown in Figure 8, it can be confirmed that the target peak of Lactobacillus sakei K040706 measured using the primer set of Example 2 was detected at 85.01 °C. Therefore, it can be seen that the primer set according to the present invention specifically binds and forms a PCR product for Lactobacillus sakei K040706.
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> A Primer set for specifically detecting Lactobacillus sakei K040706 and uses thereof <130> HPC10053 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei K040706 <400> 1 aatacaaaac tgtttttgct tgtctcgtaa gtctgcgtta cttattaaat cagttgttgt 60 tttacttatt tttttagtct cactattaaa aggagcgctc cctttatgtt taggagcgct 120 ccttttgtgt tcttcatccc acttgtcttg ggacttccat tttctaaccg tggaactagt 180 aactccgagc tcttcagcaa tatcctttag tggtcggttc ccaccagagt ctttccataa 240 ctgtagcgcc ttatcccgat taggatttct aggtttgggc actcatatca ccacctcact 300 atctttgttt attgatcatc gcttccgctt caagtaatat tttcaaatca ttagctgttg 360 ttaattttat ctggccgttt ttaaagttac tcacccactg gccaacgccg gcacgtacta 420 tcttttgata ttcatctagt tcttcttcac gcaataattg ttgttctatt tctaaatcaa 480 tgagttcttc atttggattg ctcattgtca acgcctcggc tttcccatat aatggttaac 540 gagatagcgt gctttgtaaa accagcgctg gtcgttacgc tatctcaggc cggaggcgtt 600 tagctgtcgg tttgaatgag gtcgggtgtg tcagcactcg gcctttttca atgcaaaaaa 660 ataggcccaa ctagaattga gtctaaacat attgttcaat atctgcgtat tcttgataag 720 tgattactcc tgcatcccat aatacaagtg caagtctcaa atcaccgaaa gccttaactc 780 tatcgcgaaa tacataagcg cctgccaatt ctaactctct aactaattta gttgctaaaa 840 ctgcagaaca ttgatcatcg aaccaaatat gtgtttcttt acctttaaca ttaaactttg 900 ccatcttcat tattaatcac tccttattcg ttgaccacat catagctctg tatacctgat 960 acatcaacgt ttataagcaa cttaattaat tttaacagct ttgtttccgg taaagtcttc 1020 ccaccgtttg ataatggtgt ccacatatcg cggatctaac tccatcaagt aagcgttgcg 1080 gccattttgc tcacaggcca ttagggttgt tcctgaaccg ccaaaactat ctagtacgtt 1140 gtcgcctgac ttcgtactat ttttaatttg gtaatcaaat aaaggaacag gtttcattgt 1200 gggatgcaac tcactggctg ccggcttatc gaagttcaac accgttgttt gtttacgatc 1260 cgtgaaccat gagtgcgttc cttcgttcca accatacaag caaggttcat gctgccattg 1320 ataatcttgc cgacctagcg taaacatatt tttatgccag ataagcgttt gacgcaattg 1380 ccagttaact tctcttatgg caccttcaaa gttatagcgt tctgtatctg catgccaaat 1440 ataaaaggct gctcccgact tcataacgct cttagctgca gtaaatgcat taacaaggaa 1500 ttgtctaaac gcatcacttt ccatcgagtc attcataatc ttcaaatggt cttctgtttg 1560 accctcgtaa tcaatgttat atggtgggtc cgttagcaat aggtccgctt gttgcccgcc 1620 catgagcttt tcaacatcgt ttgcattggt tgaatcacca cacattaatc tatgattacc 1680 caattgataa atctctccga cctttgaaac aggatcttca acaactgcac catcatactc 1740 atcatctgca acagggatgt cgacatcatt taattcaata tccgtaaatc caaggccgct 1800 taaatcaacg tcatcaatac tattaatttc gacctgcagt ttttctagtt cccaatcagc 1860 aagctctcct gtacgattat ccgctatccg ataagctcgc accttgtctt cggataaatt 1920 agcaactgtt actggtactt catcaaggcc aagtaactta gcagccttta atcgcgtatg 1980 gccaactaca atcacacctt cgttatcaac cacaattggt tgctgccatc cgaactcttt 2040 aatagactgc gccgtgggtt caacagcggc ttcgttatta cgtggattgt tctcataagg 2100 aacaacctta tctattggcc actcttctat tttcatcttg accctcactc ttcttttttg 2160 agttatccgc tttcttttca ttactgagcc acttatcaag ccttgcaaac attccagtcg 2220 cctcacgcgt ctcgtaccca tatttcgagt gaatcatttt acccatgatt aatcacccac 2280 cacttgccaa tcttctctaa acagttcgat gttggtttct ttccaaggta cccgaccaaa 2340 tcgactttca acatacaaat aaggtgctgt catcttacta tatttatctg gtttctgaac 2400 ccgtactaca acatcttttg accactgcgg caatcgcatc ccttttccaa cctttactgc 2460 ttcaaacgcc tgtccaaaat tcatagtgac ttctccttat agatcatatt taatattttt 2520 ccatttttta tatgcatcga agtacaattc ttttttatcc ccgttatacg taacttcgta 2580 atacatccca tcgctaagtg gcgtacttaa taatgccttg ttgttttgca aagctttaac 2640 tgaccaaact acaaacacat catcaggtgt aatgctaatc ccatctgttt tgtcg 2695 <210> 2 <211> 1155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei K040706 <400> 2 atgaaaatag aagagtggcc aatagataag gttgttcctt atgagaacaa tccacgtaat 60 aacgaagccg ctgttgaacc cacggcgcag tctattaaag agttcggatg gcagcaacca 120 attgtggttg ataacgaagg tgtgattgta gttggccata cgcgattaaa ggctgctaag 180 ttacttggcc ttgatgaagt accagtaaca gttgctaatt tatccgaaga caaggtgcga 240 gcttatcgga tagcggataa tcgtacagga gagcttgctg attgggaact agaaaaactg 300 caggtcgaaa ttaatagtat tgatgacgtt gatttaagcg gccttggatt tacggatatt 360 gaattaaatg atgtcgacat ccctgttgca gatgatgagt atgatggtgc agttgttgaa 420 gatcctgttt caaaggtcgg agagatttat caattgggta atcatagatt aatgtgtggt 480 gattcaacca atgcaaacga tgttgaaaag ctcatgggcg ggcaacaagc ggacctattg 540 ctaacggacc caccatataa cattgattac gagggtcaaa cagaagacca tttgaagatt 600 atgaatgact cgatggaaag tgatgcgttt agacaattcc ttgttaatgc atttactgca 660 gctaagagcg ttatgaagtc gggagcagcc ttttatattt ggcatgcaga tacagaacgc 720 tataactttg aaggtgccat aagagaagtt aactggcaat tgcgtcaaac gcttatctgg 780 cataaaaata tgtttacgct aggtcggcaa gattatcaat ggcagcatga accttgcttg 840 tatggttgga acgaaggaac gcactcatgg ttcacggatc gtaaacaaac aacggtgttg 900 aacttcgata agccggcagc cagtgagttg catcccacaa tgaaacctgt tcctttattt 960 gattaccaaa ttaaaaatag tacgaagtca ggcgacaacg tactagatag ttttggcggt 1020 tcaggaacaa ccctaatggc ctgtgagcaa aatggccgca acgcttactt gatggagtta 1080 gatccgcgat atgtggacac cattatcaaa cggtgggaag actttaccgg aaacaaagct 1140 gttaaaatta attaa 1155 <210> 3 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei K040706 <400> 3 atgggtaaaa tgattcactc gaaatatggg tacgagacgc gtgaggcgac tggaatgttt 60 gcaaggcttg ataagtggct cagtaatgaa aagaaagcgg ataactcaaa aaagaagagt 120 gagggtcaag atgaaaatag aagagtggcc aatagataa 159 <210> 4 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei K040706 <400> 4 atgaattttg gacaggcgtt tgaagcagta aaggttggaa aagggatgcg attgccgcag 60 tggtcaaaag atgttgtagt acgggttcag aaaccagata aatatagtaa gatgacagca 120 ccttatttgt atgttgaaag tcgatttggt cgggtacctt ggaaagaaac caacatcgaa 180 ctgtttagag aagattggca agtggtgggt gattaa 216 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2017_F <400> 5 aagagttcgg atggcagcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2017_R <400> 6 cgctatccga taagctcgca 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2018_F <400> 7 aatagaagag tggccaatag ataa 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2018_R <400> 8 ttatctattg gccactcttc tatt 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2019_F <400> 9 gaaaagggat gcgattgccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2019_R <400> 10 atcacccacc acttgccaat 20 <110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> A Primer set for specifically detecting Lactobacillus sakei K040706 and uses it <130>HPC10053 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei K040706 <400> 1 aatacaaaac tgtttttgct tgtctcgtaa gtctgcgtta cttattaaat cagttgttgt 60 tttacttatt tttttagtct cactattaaa aggagcgctc cctttatgtt taggagcgct 120 ccttttgtgt tcttcatccc acttgtcttg ggacttccat tttctaaccg tggaactagt 180 aactccgagc tcttcagcaa tatcctttag tggtcggttc ccaccagagt ctttccataa 240 ctgtagcgcc ttatcccgat taggatttct aggtttgggc actcatatca ccacctcact 300 atctttgttt attgatcatc gcttccgctt caagtaatat tttcaaatca ttagctgttg 360 ttaattttat ctggccgttt ttaaagttac tcacccactg gccaacgccg gcacgtacta 420 tcttttgata ttcatctagt tcttcttcac gcaataattg ttgttctatt tctaaatcaa 480 tgagttcttc atttggattg ctcattgtca acgcctcggc tttcccatat aatggttaac 540 gagatagcgt gctttgtaaa accagcgctg gtcgttacgc tatctcaggc cggaggcgtt 600 tagctgtcgg tttgaatgag gtcgggtgtg tcagcactcg gcctttttca atgcaaaaaa 660 ataggcccaa ctagaattga gtctaaacat attgttcaat atctgcgtat tcttgataag 720 tgattactcc tgcatcccat aatacaagtg caagtctcaa atcaccgaaa gccttaactc 780 tatcgcgaaa tacataagcg cctgccaatt ctaactctct aactaattta gttgctaaaa 840 ctgcagaaca ttgatcatcg aaccaaatat gtgtttcttt acctttaaca ttaaactttg 900 ccatcttcat tattaatcac tccttattcg ttgaccacat catagctctg tatacctgat 960 acatcaacgt ttataagcaa cttaattaat tttaacagct ttgtttccgg taaagtcttc 1020 ccaccgtttg ataatggtgt ccacatatcg cggatctaac tccatcaagt aagcgttgcg 1080 gccattttgc tcacaggcca ttagggttgt tcctgaaccg ccaaaactat ctagtacgtt 1140 gtcgcctgac ttcgtactat ttttaatttg gtaatcaaat aaaggaacag gtttcattgt 1200 gggatgcaac tcactggctg ccggcttatc gaagttcaac accgttgttt gtttacgatc 1260 cgtgaaccat gagtgcgttc cttcgttcca accatacaag caaggttcat gctgccattg 1320 ataatcttgc cgacctagcg taaacatatt tttatgccag ataagcgttt gacgcaattg 1380 ccagttaact tctcttatgg caccttcaaa gttatagcgt tctgtatctg catgccaaat 1440 ataaaaggct gctcccgact tcataacgct cttagctgca gtaaatgcat taacaaggaa 1500 ttgtctaaac gcatcacttt ccatcgagtc attcataatc ttcaaatggt cttctgtttg 1560 accctcgtaa tcaatgttat atggtgggtc cgttagcaat aggtccgctt gttgcccgcc 1620 catgagcttt tcaacatcgt ttgcattggt tgaatcacca cacattaatc tatgattacc 1680 caattgataa atctctccga cctttgaaac aggatcttca acaactgcac catcatactc 1740 atcatctgca acagggatgt cgacatcatt taattcaata tccgtaaaatc caaggccgct 1800 taaatcaacg tcatcaatac tattaatttc gacctgcagt ttttctagtt cccaatcagc 1860 aagctctcct gtacgattat ccgctatccg ataagctcgc accttgtctt cggataaatt 1920 agcaactgtt actggtactt catcaaggcc aagtaactta gcagccttta atcgcgtatg 1980 gccaactaca atcacacctt cgttatcaac cacaattggt tgctgccatc cgaactcttt 2040 aatagactgc gccgtgggtt caacagcggc ttcgttatta cgtggattgt tctcataagg 2100 aacaacctta tctattggcc actcttctat tttcatcttg accctcactc ttcttttttg 2160 agttatccgc tttcttttca ttactgagcc acttatcaag ccttgcaaac attccagtcg 2220 cctcacgcgt ctcgtaccca tatttcgagt gaatcatttt acccatgatt aatcacccac 2280 cacttgccaa tcttctctaa acagttcgat gttggtttct ttccaaggta cccgaccaaa 2340 tcgactttca acatacaaat aaggtgctgt catcttacta tatttatctg gtttctgaac 2400 ccgtactaca acatcttttg accactgcgg caatcgcatc ccttttccaa cctttactgc 2460 ttcaaacgcc tgtccaaaat tcatagtgac ttctccttat agatcatatt taatattttt 2520 ccatttttta tatgcatcga agtacaattc ttttttatcc ccgttatacg taacttcgta 2580 atacatccca tcgctaagtg gcgtacttaa taatgccttg ttgttttgca aagctttaac 2640 tgaccaaact acaaacacat catcaggtgt aatgctaatc ccatctgttt tgtcg 2695 <210> 2 <211> 1155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei K040706 <400> 2 atgaaaatag aagagtggcc aatagataag gttgttcctt atgagaacaa tccacgtaat 60 aacgaagccg ctgttgaacc cacggcgcag tctattaaag agttcggatg gcagcaacca 120 attgtggttg ataacgaagg tgtgattgta gttggccata cgcgattaaa ggctgctaag 180 ttacttggcc ttgatgaagt accagtaaca gttgctaatt tatccgaaga caaggtgcga 240 gcttatcgga tagcggataa tcgtacagga gagcttgctg attgggaact agaaaaactg 300 caggtcgaaa ttaatagtat tgatgacgtt gatttaagcg gccttggatt tacggatatt 360 gaattaaatg atgtcgacat ccctgttgca gatgatgagt atgatggtgc agttgttgaa 420 gatcctgttt caaaggtcgg agagatttat caattgggta atcatagatt aatgtgtggt 480 gattcaacca atgcaaacga tgttgaaaag ctcatgggcg ggcaacaagc ggacctattg 540 ctaacggacc caccatataa cattgattac gagggtcaaa cagaagacca tttgaagatt 600 atgaatgact cgatggaaag tgatgcgttt agacaattcc ttgttaatgc atttactgca 660 gctaagagcg ttatgaagtc gggagcagcc ttttatattt ggcatgcaga tacagaacgc 720 tataactttg aaggtgccat aagagaagtt aactggcaat tgcgtcaaac gcttatctgg 780 cataaaaata tgtttacgct aggtcggcaa gattatcaat ggcagcatga accttgcttg 840 tatggttgga acgaaggaac gcactcatgg ttcacggatc gtaaacaaaac aacggtgttg 900 aacttcgata agccggcagc cagtgagttg catcccacaa tgaaacctgt tcctttattt 960 gattaccaaa ttaaaaatag tacgaagtca ggcgacaacg tactagatag ttttggcggt 1020 tcaggaacaa ccctaatggc ctgtgagcaa aatggccgca acgcttactt gatggagtta 1080 gatccgcgat atgtggacac cattatcaaa cggtgggaag actttaccgg aaacaaagct 1140 gttaaaatta attaa 1155 <210> 3 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei K040706 <400> 3 atgggtaaaa tgattcactc gaaatatggg tacgagacgc gtgaggcgac tggaatgttt 60 gcaaggcttg ataagtggct cagtaatgaa aagaaagcgg ataactcaaa aaagaagagt 120 gagggtcaag atgaaaatag aagagtggcc aatagataa 159 <210> 4 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei K040706 <400> 4 atgaattttg gacaggcgtt tgaagcagta aaggttggaa aagggatgcg attgccgcag 60 tggtcaaaag atgttgtagt acgggttcag aaaccagata aatatagtaa gatgacagca 120 ccttatttgt atgttgaaag tcgatttggt cgggtacctt ggaaagaaac caacatcgaa 180 ctgtttagag aagattggca agtggtgggt gattaa 216 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2017_F <400> 5 aagagttcgg atggcagcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2017_R <400> 6 cgctatccga taagctcgca 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2018_F <400> 7 aatagaagag tggccaatag ataa 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2018_R <400> 8 ttatctattg gccactcttc tatt 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2019_F <400> 9 gaaaagggat gcgattgccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K040706_2019_R <400> 10 atcacccacc acttgccaat 20
Claims (11)
A primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; And a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; A primer set composition for detecting Lactobacillus sakei K040706 strain comprising at least one primer set selected from the group consisting of.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트 조성물.According to paragraph 1,
A primer set composition characterized in that the primer set specifically detects a gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
b) 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하여 락토바실러스 사케이 균주의 존재유무를 판별하는 단계;를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) K040706 균주의 검출방법.
a) using the DNA isolated from the sample as a template and performing an amplification reaction using the primer set composition according to claim 1 or 3 to amplify the target sequence; and
b) detecting the amplification product obtained from the amplification step to determine the presence or absence of the Lactobacillus sakei strain. A method for detecting the Lactobacillus sakei K040706 strain.
상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간(real-time) PCR, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplificationsystem), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) K040706 균주의 검출방법.According to clause 5,
The amplification reaction may be polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, or transcription-based amplification system. A detection method of Lactobacillus sakei K040706 strain, characterized in that it is selected from the group consisting of (strand displacement amplification), strand displacement amplification, and Qβ replicase.
상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) K040706 균주의 검출방법.According to clause 5,
Detection of the amplification product is performed by at least one selected from the group consisting of gel electrophoresis, capillary electrophoresis, DNA chip, radioactivity measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement. Detection of Lactobacillus sakei K040706 strain. method.
상기 증폭 산물의 검출 단계에서, 150 내지 180 bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우, 시료 내 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)가 함유된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) K040706 균주의 검출방법.According to clause 5,
In the detection step of the amplification product, when a PCR product of 150 to 180 bp is amplified, the sample is determined to contain Lactobacillus sakei (Lactobacillus sakei) K040706 strain Detection method.
A kit for detecting Lactobacillus sakei K040706 strain, comprising the primer set composition according to claim 1 or 3.
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| KR102301527B1 (en) | 2020-06-04 | 2021-09-13 | 한국식품연구원 | A Primer composition for specifically detecting Lactobacillus plantarum and uses thereof |
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