JP5048622B2 - PCR primers for detection of lactic acid bacteria - Google Patents
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Description
本発明は、アルコール発酵乳であるケフィアの生産にスターターとして使用されるケフィアグレイン（乳酸菌と酵母の共生体）の構成乳酸菌の検出・識別及び／又は定量に用いるＰＣＲプライマーセット、その増幅領域ＤＮＡ、及びそれらを用いた乳酸菌の簡便な検出・識別及び／又は定量方法に関するものである。 The present invention relates to a PCR primer set used for detection and identification and / or quantification of lactic acid bacteria constituting kefir grains (symbiotic lactic acid bacteria and yeast) used as a starter for the production of kefir that is alcohol-fermented milk, amplification region DNA thereof, And a simple detection / identification and / or quantification method of lactic acid bacteria using them.
ケフィアは、長寿者の多いことで知られる旧ソビエト連邦のコーカサス地方（現在のグルジア共和国、アルメニア共和国、アゼルバイジャン共和国にまたがる地域）に古くから伝わるアルコール発酵乳であり、ケフィールとも呼ばれている。このケフィアは、一般的な乳酸発酵乳とは異なり、乳酸菌による乳酸醗酵と酵母によるアルコール発酵を同時に進めることにより、独特の風味をもつ発酵乳となる。このケフィアの生産（発酵）には、ケフィアグレインと称されるスターターを使用する。 Kefir is an alcoholic fermented milk that has long been transmitted to the Caucasus region of the former Soviet Union, which is known for its longevity (currently the region spanning the Republic of Georgia, Armenia, and Azerbaijan), and is also known as Kefir. Unlike general lactic acid fermented milk, kefir becomes fermented milk having a unique flavor by simultaneously proceeding lactic acid fermentation with lactic acid bacteria and alcohol fermentation with yeast. For the production (fermentation) of kefir, a starter called kefir grain is used.
ケフィアグレインとは、複数の乳酸菌と酵母が共生する共生体であり、ケフィア粒又はケフィア種とも呼ばれている。形状及び色彩は、弾性のある塊であり、乳白色、半透明で、数ミリから数センチの大きさがある。またケフィアグレイン自体は、代々乳に植え継がれることで今日まで伝えられてきている。一般的なケフィアグレインは、１０種類以上もの乳酸菌と酵母で構成されており、これらが複合発酵することで多種類の微生物が有用菌として働き、ケフィアが様々な健康効果をもたらすと考えられている。また、ケフィアグレインはケフィランと呼ばれる粘性多糖類が糊のような役割をして、各乳酸菌と酵母をからめて共生体を構築していると考えられており、このケフィランにも抗腫瘍効果などの様々な有効性が報告されている。 Kefir grains are symbiotic organisms in which a plurality of lactic acid bacteria and yeast coexist, and are also called kefir grains or kefir species. The shape and color is an elastic mass, milky white, translucent, and several millimeters to several centimeters in size. Kefir grains themselves have been handed down to this day by being planted in milk for generations. General kefir grains are composed of 10 or more types of lactic acid bacteria and yeasts, and these are complex fermented so that many types of microorganisms work as useful bacteria, and kefir is thought to bring about various health effects. . In addition, kefirgrain is thought to have a viscous polysaccharide called kefiran, which acts like a paste and entangles each lactic acid bacterium and yeast to build a symbiosis. Various effectiveness has been reported.
ケフィアグレイン構成乳酸菌としては、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）が主なものとして例示される。この中で、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスはケフィランを産出することから、ケフィアグレインの形成に最も重要な役割がある乳酸菌であるとされている。さらにラクトバシルス・ケフィラノファシエンスは、２つの亜種、ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ケフィアグラナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）に分類される。 Examples of kefirgrain-containing lactic acid bacteria include Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri (Lactobacillus kefiri), Lactobacillus kefiren (Lactobacillus kefiri), The Among them, Lactobacillus kefiranofaciens produces kefiran and is considered to be a lactic acid bacterium having the most important role in the formation of kefir grains. Furthermore, Lactobacillus kefiranofaciens is classified into two subspecies, Lactobacillus kefiranofaciens subclass, Kefirafumenum, and Lactobacillus kefiranofaciens.
例えば、株式会社不二家で保有するケフィアグレイン（Ｋｅｆｉｒ ｇｒａｉｎ Ｆ２０）には、上述の乳酸菌が全て含まれていることが培養検査等で明らかにされている。また、Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５，４９２−５０１（２００８）（非特許文献１）に報告されているケフィアグレインも、これに近い乳酸菌の構成となっている。 For example, it has been clarified by culture examination and the like that kefir grain F20 possessed by Fujiya Co., Ltd. contains all the above-mentioned lactic acid bacteria. Further, kefir grains reported in Food Microbiology, 25, 492-501 (2008) (Non-patent Document 1) have a structure of lactic acid bacteria similar to this.
しかし、近年ケフィアが世界各国へ広がったことや、ケフィアが発酵するごとに菌叢が変化していくことなどから、現在では産地等の条件により含まれる菌の種類、数、バランスが大きく異なってきている。中には、ケフィアには元来含まれない菌を含んでいたり、上述の有用な乳酸菌の一部あるいは全部を含んでいない、というものも見受けられる。したがって、ケフィアやケフィア製造の際に使用するケフィアグレインなどに、上述の有用乳酸菌が確実に一定の菌数含まれていることを検査等により確認することが非常に重要である。 However, due to the recent spread of kefir around the world and the fact that the bacterial flora changes each time kefir is fermented, the type, number, and balance of the fungi that are present vary greatly depending on conditions such as the place of production. ing. In some cases, kefir contains bacteria that are not originally contained or does not contain some or all of the above-mentioned useful lactic acid bacteria. Therefore, it is very important to confirm by inspection or the like that kefir or kefir grains used in the production of kefir surely contain the above-mentioned useful lactic acid bacteria in a certain number.
ケフィアグレイン構成乳酸菌の検査を行う場合、これまでの技術では、例えばラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの培養には特別な培地を必要とするのに加え、この培地を使用しても単菌培養自体の難しさがあり、コロニーが出現するまで１〜２週間と長期間を要していた（特許文献１）。そのため、多種の乳酸菌が含まれるケフィアやケフィアグレインなどから、特定のケフィアグレイン構成乳酸菌の検出や、得られた乳酸菌の菌株の識別、菌数の定量などを短時間で簡便に行うことは非常に困難であり、品質管理上などでの問題が生じていた。 When testing kefirgrain-containing lactic acid bacteria, conventional techniques require a special medium for culturing Lactobacillus kefiranofaciens, for example. There was difficulty, and it took a long time of 1 to 2 weeks until colonies appeared (Patent Document 1). Therefore, it is very easy to detect a specific kefirgrain-constituting lactic acid bacterium, identify the obtained lactic acid bacterium strain, determine the number of bacteria, etc. in a short time from kefir and kefir grains containing various lactic acid bacteria. It was difficult and a problem in quality control occurred.
近年、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列のＰＣＲ検査によって、ロイコノストック属の検出を行う簡便な検査法が報告されている（特許文献２）。しかし、この検出方法では、例えばラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの２つの亜種については１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が１００％一致するため、これら２つの亜種を識別することはできない。つまり、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は近縁の菌種間での配列保存領域が極めて多く、この同定方法では属などの識別は可能であっても、近縁種や亜種の識別は困難であると考えられる。 In recent years, there has been reported a simple test method for detecting Leuconostoc genus by PCR test of 16S rRNA gene sequence (Patent Document 2). However, in this detection method, for example, the two subspecies of Lactobacillus kefiranofaciens cannot be distinguished because the 16S rRNA gene sequences are 100% identical. In other words, the 16S rRNA gene sequence has an extremely large number of sequence conserved regions between closely related bacterial species, and although it is possible to identify genera and the like by this identification method, it is difficult to identify related species and subspecies. It is done.
また、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子よりも配列多型が多いＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）の配列について、多くの細菌の遺伝子配列の急速な蓄積が行われており、この配列を利用した細菌同定法も報告されている（特許文献３、４）。しかし、特許文献３で開示の方法は、ｇｙｒＢ配列中の細菌種間で保存性の高い配列を利用しているため、特定の菌株の識別には適さない。また、特許文献４に開示の方法は、ビール混濁性に関与するラクトバシルス・ブレビスの菌株に関する方法であるが、ＰＣＲ増幅産物をさらに制限酵素処理してビール混濁性の基準株との制限酵素切断パターンを比較することでその菌株のビール混濁性を判断するのみであり、菌株の同定までを行うものではない。
In addition, regarding the sequence of the DNA gyrase subunit B gene (gyrB), which has more sequence polymorphism than the 16S rRNA gene, many bacterial gene sequences are rapidly accumulated, and bacterial identification methods using this sequence are also available. It has been reported (
特に、ケフィアグレイン構成乳酸菌は上述の培養の特殊性、困難性などから、簡便で検査時間が短時間ですむ検出・識別及び定量法の開発が望まれているが、上述のような従来技術ではこの課題を解決することはできなかった。
本発明は、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムについて、ＰＣＲ検査によって簡便に短時間に検出・識別及び／又は定量するためのＰＣＲプライマーセット、その増幅領域ＤＮＡ、及びこれらを用いた検査方法の提供を目的としてなされたものである。 The present invention relates to kefirgrain-constituting lactic acid bacteria, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefieri, Lactobacillus parakefieri, Leuconostoc mesenteroides, and subspecies kefiranofaciens, subspecies kefirgranum of Lactobacillus kefiranofaciens. The present invention has been made for the purpose of providing a PCR primer set for easily detecting, identifying and / or quantifying in a short time by PCR inspection, its amplified region DNA, and an inspection method using them.
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、上述のケフィアグレイン構成乳酸菌のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）に着目し、この遺伝子配列と他の乳酸菌の配列を比較・解析して、この遺伝子配列中の他の菌株にはない検出・識別に最適な領域及びこの領域の増幅用ＰＣＲプライマーセットを設計し、これを検査に用いることで、目的の菌の検出・識別及び定量が可能であることを見出し、本発明に至った。 In order to achieve the above object, as a result of intensive studies, the present inventors paid attention to the above-mentioned DNA gyrase subunit B gene (gyrB) of kefirgrain-constituting lactic acid bacteria, and compared this gene sequence with the sequences of other lactic acid bacteria. By analyzing and designing the optimal region for detection and identification in other gene strains in this gene sequence and the PCR primer set for amplification of this region, and using this for testing, detection and identification of the target bacteria And it discovered that fixed_quantity | quantitative_assay was possible and came to this invention.
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１及び２に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号１）とＲ−プライマー（配列番号２）のセット）、及び配列番号３に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（２）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号４及び５に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号４）とＲ−プライマー（配列番号５）のセット）、及び配列番号６に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（３）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号７）とＲ−プライマー（配列番号８）のセット）、及び配列番号９に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（４）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１０及び１１に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号１０）とＲ−プライマー（配列番号１１）のセット）、及び配列番号１２に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（５）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号１３）とＲ−プライマー（配列番号１４）のセット）、及び配列番号１５に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（６）ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィアグラナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子の一部をＰＣＲ反応により増幅することで、当該菌株の検出・識別及び／又は定量をすることを特徴とする、配列番号１４及び１６に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマー（配列番号１６）とＲ−プライマー（配列番号１４）のセット）、及び配列番号１７に記載の塩基配列からなる該遺伝子の増幅領域ＤＮＡ。
（７）（１）〜（６）に記載のＰＣＲプライマーセット（ＰＣＲ用のＦ−プライマーとＲ−プライマーのセット）を少なくとも１種以上含む、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、その亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のうち少なくとも１種以上の乳酸菌の検出・識別及び／又は定量用ＰＣＲ検査キット。
（８）（１）〜（６）に記載のＰＣＲプライマーセット（ＰＣＲ用のＦ−プライマーとＲ−プライマーのセット）を少なくとも１種以上使用して、検体のＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅することで、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、その亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）、ラクトバシルス・ケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシルス・パラケフィーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のうち少なくとも１種以上の乳酸菌を検出・識別及び／又は定量する方法。
（９）（７）に記載のＰＣＲ検査キットを使用することを特徴とする、（８）に記載の乳酸菌を検出・識別及び／又は定量する方法。
That is, the embodiment of the present invention is as follows.
(1) A part of the DNA gyrase subunit B gene of the kefirgrain-constituting lactic acid bacterium, Lactobacillus kefiranofaciens is amplified by PCR reaction to detect, identify and / or quantify the strain. A PCR primer set (set of F-primer (SEQ ID NO: 1) and R-primer (SEQ ID NO: 2)) consisting of the base sequences described in SEQ ID NOS: 1 and 2, and SEQ ID NO: 3 Amplified region DNA of the gene consisting of a base sequence.
(2) It is characterized by detecting, distinguishing and / or quantifying the strain by amplifying a part of the DNA gyrase subunit B gene of kefirgrain-constituting lactic acid bacteria, Lactobacillus kefiri, by PCR reaction. From the PCR primer set (set of F-primer (SEQ ID NO: 4) and R-primer (SEQ ID NO: 5)) consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 4 and 5, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 The amplified region DNA of the gene.
(3) A part of the DNA gyrase subunit B gene of a kefirgrain-constituting lactic acid bacterium, Lactobacillus parakefili is amplified by a PCR reaction to detect, identify and / or quantify the strain. From the PCR primer set (set of F-primer (SEQ ID NO: 7) and R-primer (SEQ ID NO: 8)) consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 7 and 8, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 The amplified region DNA of the gene.
(4) Detection, identification and / or quantification of the strain by amplifying a part of the DNA gyrase subunit B gene of kefirgrain-constituting lactic acid bacteria, Leuconostoc mesenteroides (Leuconostoc mesenteroides) by PCR reaction. PCR primer set (set of F-primer (SEQ ID NO: 10) and R-primer (SEQ ID NO: 11)) consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 10 and 11, and the base set forth in SEQ ID NO: 12 An amplified region DNA of the gene consisting of a sequence.
(5) Amplifying a part of the DNA gyrase subunit B gene of the kefirgrain-constituting lactic acid bacterium, Lactobacillus kefiranofaciens subtype Kefiranofaciens by a PCR reaction, PCR primer sets (F-primer (SEQ ID NO: 13) and R-primer (SEQ ID NO: 14) consisting of the base sequences of SEQ ID NOS: 13 and 14, characterized in that detection, identification and / or quantification of Set), and the amplified region DNA of the gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
(6) A portion of the DNA gyrase subunit B gene of the kefirgrain-constituting lactic acid bacterium, Lactobacillus kefiranofaciens subspecies Kefirranium subsp. Kefirranum, is amplified by PCR reaction, A set of PCR primer sets (F-primer (SEQ ID NO: 16) and R-primers (SEQ ID NO: 14) consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 14 and 16, wherein detection / identification and / or quantification are performed And the amplified region DNA of the gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
(7) Kefiagrain-constituting lactic acid bacteria, Lactobacillus kefiranofaciens (Lactobacillus) comprising at least one PCR primer set (set of F-primer and R-primer for PCR) according to (1) to (6) kefiranofaciens), the subspecies (Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens, Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum), Lactobacillus Kefiri (Lactobacillus kefiri), Lactobacillus Parakefiri (Lactobacillus parakefiri), Leuconostoc mesenteroides (Leucon stoc mesenteroides) at least one or more detection and identification and / or quantitative PCR test kit of lactic acid bacteria of the.
(8) Using at least one PCR primer set (F-primer and R-primer set for PCR) described in (1) to (6), and amplifying the sample DNA by PCR reaction , kefir grain structure lactic acid bacteria, lactobacillus Kefi Rano tumefaciens (lactobacillus kefiranofaciens), the subspecies (lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens, lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum), lactobacillus Kefiri (lactobacillus kefiri), lactobacillus Parakefiri (lactobacillus parakefiri) Leuconostoc mesenteroides (Leuconostoc mesenteroides) at least one or more methods of lactic acid bacteria for detection and identification and / or quantification of.
(9) The method for detecting / identifying and / or quantifying the lactic acid bacteria according to (8), wherein the PCR test kit according to (7) is used.
つまり、本発明においては、配列番号１〜１７及び図１、図２で示される、各乳酸菌株が固有に持つｇｙｒＢ部分塩基配列及びこれらを特異的に増幅するＰＣＲプライマーセット（Ｆ−プライマーとＲ−プライマーのセット）、このプライマーセットを１種以上含むＰＣＲ検査キット、及びこれらを使用した乳酸菌のＰＣＲ検査方法を提供している。 That is, in the present invention, the gyrB partial nucleotide sequences inherent to each lactic acid strain shown in SEQ ID NOs: 1 to 17 and FIGS. 1 and 2 and PCR primer sets (F-primer and R) that specifically amplify them. -Primer set), a PCR test kit comprising one or more of the primer sets, and a PCR test method for lactic acid bacteria using these.
本発明によれば、ケフィアグレイン構成乳酸菌であるラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムについて、ＰＣＲ検査によって直接、簡便に短時間に検出・識別することが可能となる。また、これらのプライマーセットをリアルタイムＰＣＲ検査に用いることで目的菌株の定量も行うことができ、検出・識別だけでなく、菌数確認、菌数管理などが可能であるため、上記乳酸菌の品質管理等に非常に有効である。 According to the present invention, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus parakefieri, Leuconostoc mesenteroides, and subspecies of Lactobacillus kefiranofaciens, kefiranofaciens, subspecies, which are kefir grains constituting lactic acid bacteria Kefir Granum can be detected and identified directly and simply in a short time by PCR inspection. In addition, by using these primer sets for real-time PCR testing, the target strain can be quantified, and not only detection and identification, but also bacterial count confirmation, bacterial count management, etc. are possible. Very effective for etc.
本発明では、まずケフィアグレイン構成乳酸菌の中で、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムを検出・識別標的菌株とした。 In the present invention, first, among the lactic acid bacteria constituting kefir grains, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefieli, Lactobacillus parakefieri, Leuconostoc mesenteroides and subspecies of Lactobacillus kefiranofaciens kefiranofaciens, The species kefirgranum was used as a detection / identification target strain.
そして、これらの菌株のＰＣＲ検査での検出・識別のため、配列多型が多いｇｙｒＢ遺伝子に着目し、公共の遺伝子配列データベースを解析した。しかし、データベースに蓄積されていたのはロイコノストック・メセンテロイデスのｇｙｒＢ遺伝子配列のみであったため、ＰＣＲ法を利用して他の菌株のｇｙｒＢ遺伝子を全て取得し、全長塩基配列を決定した。 Then, in order to detect and identify these strains in the PCR test, we focused on the gyrB gene having many sequence polymorphisms and analyzed the public gene sequence database. However, since only the gyrB gene sequence of Leuconostoc mesenteroides was accumulated in the database, all the gyrB genes of other strains were obtained using the PCR method, and the full-length nucleotide sequence was determined.
これらのｇｙｒＢ遺伝子配列情報と、近縁種でありｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列が公知である様々な乳酸菌の配列情報を比較して、上述のケフィアを構成する乳酸菌株を検出・識別するのに最適であると思われる増幅領域ＤＮＡ、及びこの領域のみを増幅するＰＣＲプライマーセットを設計した。これらの設計に際しては、通常のＰＣＲ検査に適用可能な領域及びプライマーであること、目的の菌株の目的領域のみを増幅、検出し、他の菌株では増幅反応を行わないプライマーであること、増幅後のＤＮＡ（ＰＣＲ産物）について制限酵素処理やシークエンス等の特別な操作を必要としない増幅領域であること、定量検査として有効なリアルタイムＰＣＲ検査にも適用可能な１００ｂｐ前後の長さの増幅領域であること、などを主な設計基準とした。 This gyrB gene sequence information is closely related to the sequence information of various lactic acid bacteria that are closely related and the base sequence of the gyrB gene is known, and is optimal for detecting and identifying the lactic acid strains that make up the above kefir. A possible amplification region DNA and a PCR primer set for amplifying only this region were designed. In designing these, it should be a region and primer that can be applied to a normal PCR test, a primer that only amplifies and detects the target region of the target strain, and does not perform the amplification reaction in other strains. It is an amplification region that does not require any special operation such as restriction enzyme treatment or sequencing, and is an amplification region having a length of about 100 bp that can also be applied to real-time PCR test effective as a quantitative test. This is the main design standard.
上記手法により設計されたのが、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスについては配列番号１で示されるＦ−プライマー、配列番号２で示されるＲ−プライマー、配列番号３で示される増幅領域ＤＮＡ（９８ｂｐ）、ラクトバシルス・ケフィーリについては配列番号４で示されるＦ−プライマー、配列番号５で示されるＲ−プライマー、配列番号６で示される増幅領域ＤＮＡ（１１７ｂｐ）、ラクトバシルス・パラケフィーリについては配列番号７で示されるＦ−プライマー、配列番号８で示されるＲ−プライマー、配列番号９で示される増幅領域ＤＮＡ（１１８ｂｐ）、ロイコノストック・メセンテロイデスについては配列番号１０で示されるＦ−プライマー、配列番号１１で示されるＲ−プライマー、配列番号１２で示される増幅領域ＤＮＡ（１４９ｂｐ）、亜種ケフィラノファシエンスについては配列番号１３で示されるＦ−プライマー、配列番号１４で示されるＲ−プライマー、配列番号１５で示される増幅領域ＤＮＡ（１２１ｂｐ）、亜種ケフィアグラナムについては配列番号１６で示されるＦ−プライマー、配列番号１４で示されるＲ−プライマー（亜種ケフィラノファシエンスのＲ−プライマーと同一）、配列番号１７で示される増幅領域ＤＮＡ（１２４ｂｐ）である。これらは図１、図２にも示されている。 The Lactobacillus kefiranofaciens designed by the above method is an F-primer represented by SEQ ID NO: 1, an R-primer represented by SEQ ID NO: 2, an amplification region DNA (98 bp) represented by SEQ ID NO: 3, For Lactobacillus kefieri, F-primer represented by SEQ ID NO: 4, R-primer represented by SEQ ID NO: 5, amplification region DNA (117 bp) represented by SEQ ID NO: 6, and F-primer represented by SEQ ID NO: 7 for Lactobacillus parakefieri -Primer, R-primer shown in SEQ ID NO: 8, amplification region DNA (118 bp) shown in SEQ ID NO: 9, F-primer shown in SEQ ID NO: 10 for Leuconostoc mesenteroides, R shown in SEQ ID NO: 11 -Primer, amplification region shown in SEQ ID NO: 12 For DNA (149 bp), subspecies kefiranofaciens, F-primer represented by SEQ ID NO: 13, R-primer represented by SEQ ID NO: 14, amplification region DNA (121 bp) represented by SEQ ID NO: 15, subspecies kefirgra For Nam, F-primer represented by SEQ ID NO: 16, R-primer represented by SEQ ID NO: 14 (identical to R-primer of subspecies Kefiranofaciens), amplification region DNA represented by SEQ ID NO: 17 (124 bp) is there. These are also shown in FIGS.
ＰＣＲ検査の検体としては、乳酸菌培養液、ケフィア、ケフィアグレインなどから定法により調製したＤＮＡを用いることができるほか、乳酸菌培養液、ケフィア、ケフィアグレインなどをそのまま検体として使用することも可能である。また、ケフィア以外の加工食品等から定法により調製したＤＮＡや、その加工食品等をそのまま検体として用いることも可能であり、その加工食品等の中の上記乳酸菌の有無の検出等にも利用可能である。 As a sample for the PCR test, DNA prepared from a lactic acid bacteria culture solution, kefir, kefir grains, etc. by a conventional method can be used, and a lactic acid bacteria culture solution, kefir, kefir grains, etc. can be used as they are as samples. In addition, DNA prepared from processed foods other than kefir, etc., or the processed foods can be used as a sample as they are, and can be used for detecting the presence or absence of the lactic acid bacteria in the processed foods. is there.
ＰＣＲ検査としては、定法のＰＣＲ試薬及びＰＣＲ検査機器を使用することができる。また、標的となる増幅領域ＤＮＡが短いためリアルタイムＰＣＲ法にも適用が可能であり、これらで通常用いられる試薬及び検査機器も使用することができる。反応条件についても定法を用いることができ、例えば、通常のＰＣＲ反応において、９５℃１０分の熱変性反応後、９５℃１５秒−６５℃１分の２ステップを３０サイクル反応し、最後に６５℃１０分伸長反応を行った後低温でホールドする条件などを用いることができる。この反応条件は、検体などの特性等により温度、時間を適宜増減させてもよく、反応サイクル数も適宜増減させてよい。例えば、ラクトバシルス・ケフィーリ及びラクトバシルス・パラケフィーリ増幅反応について、９５℃１５秒−６８℃１分の２ステップを３０サイクル反応し、最後に６８℃１０分伸長反応を行う条件としてもよく、亜種ケフィラノファシエンス増幅反応について、９６℃１５秒−７２℃３０秒の２ステップを２５サイクル反応し、最後に７２℃１０分伸長反応を行う条件としてもよく、亜種ケフィアグラナム増幅反応について、９６℃１５秒−７０℃３０秒の２ステップを２５サイクル反応し、最後に７０℃１０分伸長反応を行う条件としてもよい。このＰＣＲ反応条件の調整は、ＰＣＲに関する基本的な知識を有していれば、検体等に応じてすることは容易に行えるため、特に限定されるものではない。 As the PCR test, a conventional PCR reagent and a PCR test device can be used. In addition, since the target amplification region DNA is short, it can be applied to a real-time PCR method, and reagents and test equipment that are usually used in these methods can also be used. A standard method can also be used for the reaction conditions. For example, in a normal PCR reaction, a thermal denaturation reaction at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 30 cycles of 2 steps of 95 ° C. 15 seconds-65 ° C. 1 minute, and finally 65 Conditions such as holding at a low temperature after the elongation reaction at 10 ° C. for 10 minutes can be used. In this reaction condition, the temperature and time may be appropriately increased or decreased depending on the characteristics of the specimen or the like, and the number of reaction cycles may be appropriately increased or decreased. For example, for Lactobacillus kefieri and Lactobacillus parakefieri amplification reaction, the reaction may be carried out by subjecting 2 steps of 95 ° C. for 15 seconds to 68 ° C. for 30 minutes and finally carrying out an extension reaction for 68 ° C. for 10 minutes. For the facience amplification reaction, two cycles of 96 ° C. for 15 seconds to 72 ° C. for 30 seconds may be performed for 25 cycles, and finally, the extension reaction may be performed at 72 ° C. for 10 minutes, and for the subspecies kefir granum amplification reaction, It is good also as conditions which carry out 25 cycles of 2 steps of 15 seconds -70 degreeC 30 seconds, and finally performs extension reaction at 70 degreeC for 10 minutes. Adjustment of the PCR reaction conditions is not particularly limited because it can be easily performed according to the sample or the like if basic knowledge about PCR is possessed.
また、ＰＣＲ検査に際して、ＰＣＲ反応に使用するＰＣＲ試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、単体のデオキシリボヌクレオチドミックス、バッファー、ＭｇＣｌ２溶液等）の一部又は全部と上述のＰＣＲプライマーセットを１種含んだＰＣＲ検査キットとして使用することができる。増幅領域のサイズが異なるものや、蛍光ラベル標識等の条件があえば、２種以上のＰＣＲプライマーセットを含むＰＣＲ検査キットを使用して、同時に複数菌種の検査をすることも可能である。 In addition, as a PCR inspection kit that includes one or all of the above PCR primer sets and a part or all of the PCR reagents (DNA polymerase, single deoxyribonucleotide mix, buffer, MgCl 2 solution, etc.) used for the PCR reaction. Can be used. If there are different amplification region sizes or conditions such as fluorescent label labeling, it is possible to test multiple bacterial species simultaneously using a PCR test kit containing two or more PCR primer sets.
ＰＣＲ検査によって得られた増幅産物は、定法のＰＣＲ産物を確認する方法で行うことができる。例えば、通常のＰＣＲ法での増幅産物については、アガロースゲル等にＰＣＲ反応サンプル及び所定のサイズマーカーをアプライして一定時間ゲル電気泳動を行い、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド等の染色液で染色した後、ＵＶ照射などで増幅の有無及び断片サイズを確認することができる。なお、本発明のプライマーセットは菌種に特異的に反応するため、ＰＣＲ検査によって得られた増幅産物の制限酵素処理やシークエンス等の特別な確認操作は必要なく、これらを行うことはない。また、リアルタイムＰＣＲについては、通常は検査機器に常時検査結果（定量データ）が示されるため、ＰＣＲ反応後の増幅産物の確認操作自体を必要としない。 The amplification product obtained by the PCR test can be performed by a conventional method for confirming the PCR product. For example, for amplification products obtained by a normal PCR method, a PCR reaction sample and a predetermined size marker are applied to an agarose gel or the like, gel electrophoresis is performed for a certain period of time, and the gel after electrophoresis is stained with a staining solution such as ethidium bromide. After staining, the presence or absence of amplification and the fragment size can be confirmed by UV irradiation or the like. In addition, since the primer set of the present invention specifically reacts with bacterial species, special confirmation operations such as restriction enzyme treatment and sequencing of the amplification product obtained by the PCR test are not necessary, and these are not performed. In addition, for real-time PCR, the inspection device usually shows the inspection result (quantitative data) at all times, so the operation of confirming the amplification product after the PCR reaction is not required.
これらのＰＣＲプライマーセットによりＰＣＲ産物が確認された検体には、該プライマーセットが特異的に検出する菌株が存在していることがわかり、リアルタイムＰＣＲ検査によれば当該菌数の確認も可能である。また、分離培養等によって得られた特定の乳酸菌についても、これらのプライマーセットを用いて検査することにより菌株を識別することができる。これらの検査に要する時間は数時間であり、長くとも検査開始から６時間以内には検査結果が判明する。これにより、複数の乳酸菌で構成されるケフィア、ケフィアグレインから、培養検査と比較して、非常に短時間で直接的に簡便に上述の菌株を個別に検出、識別、定量することができる。また、ケフィア以外の加工食品等の検体についても、上述の菌株の含有の判別が即座に可能となり、発酵乳等の食品の品質管理など産業上非常に有効である。 It can be seen that the specimens in which PCR products were confirmed by these PCR primer sets contain strains that are specifically detected by the primer sets, and the number of bacteria can be confirmed by real-time PCR testing. . Moreover, about the specific lactic acid bacteria obtained by isolation | separation culture etc., a strain can be identified by test | inspecting using these primer sets. The time required for these inspections is several hours, and the inspection results become clear within 6 hours from the start of the inspection at the longest. Thereby, compared with a culture | cultivation test | inspection, the above-mentioned strain can be detected individually, identified, and quantified directly and easily in a very short time from kefir and kefir grains composed of a plurality of lactic acid bacteria. In addition, for samples such as processed foods other than kefir, it is possible to immediately determine the content of the above-mentioned strain, which is very effective in industry such as quality control of foods such as fermented milk.
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１：ＰＣＲ検査に用いる検体ゲノムＤＮＡの調製）
検査に用いた検出・識別標的菌株（８株）及び標的菌株以外の乳酸菌（７株）については表１に示した。菌株名に記載されるＪＣＭおよびＮＢＲＣは、菌株分譲機関を示している。菌株名にＪＣＭと記載されているものは、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室より入手し、菌株名にＮＢＲＣと記載されているものは、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門から入手した。また、菌株名の最後に「Ｔ」とつくものは、Ｔｙｐｅ Ｓｔｒａｉｎ（基準株）であることを示している。
(Example 1: Preparation of specimen genomic DNA used for PCR test)
The detection / identification target strains (8 strains) and lactic acid bacteria (7 strains) other than the target strains used for the inspection are shown in Table 1. JCM and NBRC described in the strain name indicate strain distribution agencies. Those with JCM in the name of the strain are obtained from the microbial material development room of RIKEN BioResource Center, and those with NBRC in the name of the strain are those of the National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Obtained from the Division of Biogenetic Resources. Moreover, what has "T" at the end of the strain name indicates that it is a Type Strain (reference strain).
これら１５株の菌よりゲノムＤＮＡを調製した。方法は、５ｍｌのＭＲＳ液体培地（ＯＸＯＩＤ社製品）に各供試菌を植菌し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製品）を用いて嫌気条件下３０℃で２〜１０日間培養を行った。充分培養がされたところで、これらの培養液２ｍｌからＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製品）を用いて抽出したものを各菌のＤＮＡ溶液として使用した。 Genomic DNA was prepared from these 15 strains. In the method, each test bacterium was inoculated into 5 ml of MRS liquid medium (product of OXOID), and cultured for 2 to 10 days at 30 ° C. under anaerobic conditions using Aneropack Kenki (product of Mitsubishi Gas Chemical Company). . When the cells were sufficiently cultured, those extracted from 2 ml of these culture solutions using DNeasy Blood & Tissue Kit (product of QIAGEN) were used as DNA solutions of each bacterium.
（実施例２：ＰＣＲプライマーの設計及び作製）
検出・識別標的菌株のｇｙｒＢ遺伝子配列情報とｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列が公知である様々な乳酸菌の配列情報を比較し、通常のＰＣＲ検査に適用可能な領域及びプライマーであること、目的の菌株の目的領域のみを増幅、検出し、目的の菌株の他の領域や他の菌株では増幅反応を行わないプライマーであること、増幅後のＤＮＡについて特別な操作を必要としないこと、リアルタイムＰＣＲ検査にも適用可能な１００ｂｐ前後の長さの増幅領域であることを設計基準として、各標的菌株の特異的プライマーセット（図１）及び増幅領域（図２）を設計した。
上述の設計した各菌株を特異的に検出するためのプライマーは、全て定法に従い、単体のデオキシリボヌクレオチドからＤＮＡ合成を行って作製した。
(Example 2: Design and production of PCR primers)
Compare the gyrB gene sequence information of the detection / identification target strain with the sequence information of various lactic acid bacteria whose base sequences of the gyrB gene are known, and be the regions and primers applicable to the normal PCR test, the purpose of the target strain Amplification and detection of only the region, primers that do not undergo amplification reaction in other regions of the target strain and other strains, that no special operation is required for the amplified DNA, and applicable to real-time PCR testing A specific primer set (FIG. 1) and an amplification region (FIG. 2) of each target strain were designed on the basis of the design criteria of a possible amplification region of about 100 bp in length.
Primers for specifically detecting each of the designed strains were prepared by DNA synthesis from a single deoxyribonucleotide according to a standard method.
（実施例３：ＰＣＲ反応液の調製及びＰＣＲ増幅反応）
各プライマーセットにつき、表２及び表３に示す組成でＰＣＲ反応液を調製した。
(Example 3: Preparation of PCR reaction solution and PCR amplification reaction)
For each primer set, a PCR reaction solution was prepared with the composition shown in Table 2 and Table 3.
ＰＣＲ増幅反応はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製品）を用いて、各プライマーセットにつき以下の条件で行った。 The PCR amplification reaction was performed using GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) under the following conditions for each primer set.
ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス及びロイコノストック・メセンテロイデス検出用プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅反応は、９５℃１０分間熱変性後、９５℃１５秒−６５℃１分の２ステップを３０サイクル反応し、最後に６５℃１０分間伸長反応を行った後低温でホールドした。 The PCR amplification reaction using the Lactobacillus kefiranofaciens and Leuconostoc mesenteroides detection primer sets was performed by heat denaturation at 95 ° C for 10 minutes, followed by 30 cycles of 95 ° C for 15 seconds-65 ° C for 1 minute, Finally, an extension reaction was carried out at 65 ° C. for 10 minutes and then held at a low temperature.
ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ検出用プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅反応は、９５℃１０分間熱変性後、９５℃１５秒−６８℃１分の２ステップを３０サイクル反応し、最後に６８℃１０分間伸長反応を行った後低温でホールドした。 The PCR amplification reaction using the Lactobacillus kefieri and Lactobacillus parakephiri detection primer sets was performed by heat denaturation at 95 ° C for 10 minutes, followed by 30 cycles of 2 steps of 95 ° C for 15 seconds to 68 ° C for 1 minute, and finally at 68 ° C for 10 ° C. After performing an extension reaction for a minute, it was held at a low temperature.
ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィラノファシエンス検出用プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅反応は、９５℃１０分間熱変性後、９６℃１５秒−７２℃３０秒の２ステップを２５サイクル反応し、最後に７２℃１０分間伸長反応を行った後低温でホールドした。 The PCR amplification reaction using the Lactobacillus kefiranofaciens subspecies kefiranofaciens detection primer set was heat denaturation at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 25 cycles of 96 ° C. for 15 seconds-72 ° C. for 30 seconds, Finally, an extension reaction was carried out at 72 ° C. for 10 minutes and then held at a low temperature.
ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス亜種ケフィアグラナム検出用プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅反応は、９５℃１０分間熱変性後、９６℃１５秒−７０℃３０秒の２ステップを２５サイクル反応し、最後に７０℃１０分間伸長反応を行った後低温でホールドした。 The PCR amplification reaction using the Lactobacillus kefiranofaciens subspecies kefirgranum detection primer set was heat-denatured at 95 ° C for 10 minutes, followed by 25 cycles of 2 steps of 96 ° C for 15 seconds-70 ° C for 30 seconds. The sample was subjected to an extension reaction at 70 ° C. for 10 minutes and then held at a low temperature.
ＰＣＲ増幅産物の検出はゲル電気泳動によって行った。各ＰＣＲ増幅反応後の反応液に６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｏｒａｎｇｅ Ｇ（ニッポンジーン社製品）２μｌを加え撹拌した後、６μｌを１×ＴＡＥ Ｂｕｆｆｅｒを用いて作製した３．５％のＮｕＳｉｅｖｅ ３：１ Ａｇａｒｏｓｅゲル（Ｌｏｎｚａ社製品）にアプライした。またＤＮＡサイズマーカーには５０ｂｐ ＤＮＡ ラダー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品）を使用した。ＤＮＡのバンドは、エチジウムブロマイド溶液で約２０分間染色後、紫外線照射して確認した。 PCR amplification products were detected by gel electrophoresis. After adding 2 μl of 6 × Loading Buffer Orange G (Nippon Gene Co., Ltd.) to the reaction solution after each PCR amplification reaction and stirring, 6 μl of 3.5% NuSieve 3: 1 Agarose gel prepared using 1 × TAE Buffer ( Lonza product). A 50 bp DNA ladder (product of Invitrogen) was used as a DNA size marker. The DNA band was confirmed by staining with ethidium bromide solution for about 20 minutes and then irradiating with ultraviolet rays.
各プライマーセットを使用したＰＣＲ増幅産物の確認結果（電気泳動写真）を図３〜８に示す。また、各ＰＣＲ増幅結果を一覧としてまとめたものを図９に示す。 The confirmation result (electrophoresis photograph) of the PCR amplification product using each primer set is shown in FIGS. Moreover, what put together as a list each PCR amplification result is shown in FIG.
各図から明らかなように、本発明において設計した全てのプライマーセットは、いずれも標的とする乳酸菌株から調製したゲノムＤＮＡを検体としたときのみにＰＣＲ増幅産物が確認され、標的としていない乳酸菌株から調製したゲノムＤＮＡを検体としたときには全くＰＣＲ増幅産物が確認されなかった。特に、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種特異的プライマーセットは、それぞれ標的外の亜種を検体としたときにＰＣＲ増幅産物が確認されず、各亜種を的確に検出、識別することができた。 As is clear from each figure, all the primer sets designed in the present invention were confirmed to have PCR amplification products only when genomic DNA prepared from the target lactic acid strain was used as a sample, and the non-target lactic acid strain When the genomic DNA prepared from the sample was used as a sample, no PCR amplification product was confirmed. In particular, the Lactobacillus kefiranofaciens subspecies-specific primer set does not confirm PCR amplification products when using non-target subspecies as specimens, and can accurately detect and identify each subspecies. It was.
（実施例４：ケフィアグレインを検体としたＰＣＲ増幅反応）
株式会社不二家で保有しているケフィアグレイン（Ｋｅｆｉｒ ｇｒａｉｎ Ｆ２０）２０ｍｇから、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製品）を用いて抽出したものをＤＮＡ溶液として使用し、各プライマーセットにつき表２及び表３に示す組成でＰＣＲ反応液を調製した。これを、各プライマーセットについて実施例３と同じ条件でＰＣＲ増幅反応を行い、同じ条件でゲル電気泳動によってＰＣＲ増幅産物を確認した。
(Example 4: PCR amplification reaction using kefir grains as a sample)
Extracted from 20 mg of Kefir grain F20 held by Fujiya Co., Ltd. using DNeasy Blood & Tissue Kit (product of QIAGEN) as a DNA solution. Tables 2 and 3 for each primer set A PCR reaction solution was prepared with the composition shown in FIG. A PCR amplification reaction was performed for each primer set under the same conditions as in Example 3, and a PCR amplification product was confirmed by gel electrophoresis under the same conditions.
ＰＣＲ増幅産物の確認結果（電気泳動写真）を図１０に示す。図から明らかなように、各レーンにはそれぞれのプライマーセットの増幅領域ＤＮＡのサイズ位置に唯一のバンドが見られる。このことから、本発明において設計した全てのプライマーセットは、複数の乳酸菌種が混在しているケフィアグレインから調製したゲノムＤＮＡを検体としても、プライマーセットの標的菌株のみを確実に増幅できることが確認された。 The confirmation result (electrophoresis photograph) of the PCR amplification product is shown in FIG. As is apparent from the figure, each lane has a unique band at the size position of the amplification region DNA of each primer set. From this, it was confirmed that all the primer sets designed in the present invention can reliably amplify only the target strain of the primer set, even when genomic DNA prepared from kefir grains mixed with a plurality of lactic acid bacteria species is used as a sample. It was.
したがって、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行うことで、検体中に含まれる標的のケフィアグレイン構成乳酸菌を簡便に短時間で個別に検出、識別できることが証明された。また、本発明のプライマーセットは蛍光標識等を行ってリアルタイムＰＣＲ検査に使用することも可能であるため、これらのプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ検査を行い、標的菌株の検体中の菌数を短時間で測定することも可能であることが明らかとなった。 Therefore, it was proved that the target kefirgrain-containing lactic acid bacteria contained in the specimen can be detected and identified individually in a short time by performing a PCR reaction using these primer sets. In addition, since the primer set of the present invention can be used for real-time PCR inspection by performing fluorescent labeling, etc., real-time PCR inspection is performed using these primer sets to shorten the number of bacteria in the target strain sample. It became clear that it was possible to measure in time.
本発明は要すれば、次の通りである。
本発明は、ケフィアグレイン構成乳酸菌、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバシルス・ケフィーリ、ラクトバシルス・パラケフィーリ、ロイコノストック・メセンテロイデス及び、ラクトバシルス・ケフィラノファシエンスの亜種ケフィラノファシエンス、亜種ケフィアグラナムのすくなくともひとつについて、ＰＣＲ検査によって簡便に短時間に検出・識別及び／又は定量するために使用することを特徴とする、各配列番号に示される塩基配列からなるＰＣＲプライマーセット、その増幅領域ＤＮＡ、及びこれらを用いた検査方法に関するものである。
本発明によれば、ケフィアグレイン構成乳酸菌のＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子塩基配列において、他の菌株にはない検出・識別に最適な領域及びこの領域の増幅用ＰＣＲプライマーセットを設計し、これを用いて検査することにより、簡便で短時間に目的の菌株を個別に検出、識別、定量することがはじめて可能となった。
In short, the present invention is as follows.
The present invention relates to kefirgrain-constituting lactic acid bacteria, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefieri, Lactobacillus parakefieri, Leuconostoc mesenteroides, and subspecies kefiranofaciens, subspecies kefirgranum of Lactobacillus kefiranofaciens PCR primer set consisting of the base sequence shown in each SEQ ID NO., Its amplification region DNA, characterized in that at least one of the above is used for simple detection, identification and / or quantification in a short time by PCR test, And an inspection method using them.
According to the present invention, in the DNA gyrase subunit B gene base sequence of kefir grain-constituting lactic acid bacteria, an optimal region for detection and identification not found in other strains and a PCR primer set for amplification of this region are designed, By using and testing, it became possible for the first time to easily detect, identify and quantify the target strain individually in a short time.
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