WO2019221219A1 - Method for examining bacterium, microarray for examining bacterium, kit for examining bacterium, probe set for examining bacterium, and primer set for examining bacterium - Google Patents

Method for examining bacterium, microarray for examining bacterium, kit for examining bacterium, probe set for examining bacterium, and primer set for examining bacterium Download PDF

Info

Publication number
WO2019221219A1
WO2019221219A1 PCT/JP2019/019446 JP2019019446W WO2019221219A1 WO 2019221219 A1 WO2019221219 A1 WO 2019221219A1 JP 2019019446 W JP2019019446 W JP 2019019446W WO 2019221219 A1 WO2019221219 A1 WO 2019221219A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
listeria
bacteria
seq
probes
nos
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/019446
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
隆明 山崎
伸哉 寿命
淳憲 一色
Original Assignee
東洋製罐グループホールディングス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2018190417A external-priority patent/JP2019201626A/en
Application filed by 東洋製罐グループホールディングス株式会社 filed Critical 東洋製罐グループホールディングス株式会社
Publication of WO2019221219A1 publication Critical patent/WO2019221219A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to an inspection technique for Listeria spp. Which is regarded as a problem in food manufacturing facilities.
  • Listeria monocytogenes is a pathogenic species of food poisoning.
  • Listeria Monocytogenes-induced food poisoning is likely to occur in pregnant women, newborns, the elderly, and people with weakened immune systems. In the United States, about 1,600 people have been affected each year in the past, and about 260 deaths have occurred. It has been reported that
  • Non-Patent Document 1 the gene region to be examined is iap, Listeria grayi, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes. (Listeria seeligeri), the method of detecting 6 microbial species of Listeria welshimeri is described.
  • Non-Patent Document 2 describes a technique for detecting the same six bacterial species as described above using the gene region to be examined as an IGS. However, none of these documents describes a technique for detecting all 17 species of Listeria.
  • Listeria floridensis Listeria weihenstephanensis, Listeria cornelensis, Listeria aria, Listeria aria, Listeria aria aria.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is capable of accurately identifying all 17 bacterial species in the genus Listeria, a microarray for testing bacteria, a kit for testing bacteria, An object is to provide a probe set for testing and a primer set for testing bacteria.
  • a method for examining bacteria is a method for examining the presence of bacteria in a sample
  • the target bacteria are Listeria belonging to the following (1) to (10): (1) Listeria floridensis, (2) Listeria weihenstephanensis, (3) Listeria cornellensis, (4) Listeria riparia, (5) Listeria grandensis, (6) Listeria boriae, (7) Listeria newyorkensis, (8) Listeria aquatica, (9) Listeria ⁇ ⁇ Georgiani ( Listeria yakmannii), (10) Listery Listeria marthii
  • the method includes (a) a preparation step of preparing a reaction solution containing a primer set for amplification of an IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene, and (b) a reaction obtained by the preparation step
  • the method includes an amplification step of amplifying the nucleic acid of the target bacteria contained in the sample using a liquid.
  • the microarray for testing bacteria of the present invention is a microarray for testing bacteria that detects the presence of bacteria in a sample, and is an IGS of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10). At least one of the probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32-43 and 47 selected from the (intergenic spacer) region is immobilized.
  • the bacterial test kit of the present invention is a bacterial test kit for detecting the presence of bacteria in a sample, and the IGS of the Listeria spp. RRNA gene described in (1) to (10) above.
  • a primer set consisting of primers having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17.
  • the bacterial test probe set of the present invention is a bacterial test probe set for testing the presence of bacteria in a sample, and the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10)
  • the IGS (intergenic spacer) region is selected from probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43 and 47.
  • the bacterial test primer set of the present invention is a bacterial test primer set for testing the presence of bacteria in a sample, the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10) From primers of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 for amplifying a nucleic acid that hybridizes with at least one of the probes of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43 and 47 selected from the IGS (intergenic spacer) region of The configuration is as follows.
  • FIG. 1 it is a figure which shows the base sequence of the primer used in order to analyze the base sequence of the IGS area
  • the IGS region of various Listeria species Listeria floridensis, Listeria wehenstephanensis, Listeria cornelensis, Listeria liparia, Listeria grandensis
  • Samples used in Test 1 for the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention (Listeria Locotier, Listeria Siligelli, Listeria Wersimeli, Listeria Floridensis, Listeria Wehenstephanensis, Listeria Cornelensis, Listeria Liparia, Listeria Grandensis, It is a figure which shows the sample number of the Listeria boriae, Listeria New Yorkensis, Listeria Aquatica, Listeria freshmanni, Listeria marti), and a test strain. It is a figure which shows the base sequence of the primer for amplifying the plasmid as an internal control used by each test, such as the inspection method of bacteria concerning embodiment of this invention, and its amplification object DNA.
  • FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 1 to 14) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 15 to 28) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 29 to 43) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 1 to 14) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 15 to 28) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 29 to 43) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • Sample numbers of samples (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella, Nagvibrio, Salmonella) used in Test 2 for the test method of bacteria according to the embodiment of the present invention to confirm the presence or absence of false positives, and test It is a figure which shows a strain.
  • FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 44 to 59) of test 2 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 44 to 59) of test 2 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the presence of a test strain, DNA concentration, and internal control (IC) added to a sample (sample numbers 60 to 65) used in Test 3 for a method for examining bacteria according to an embodiment of the present invention. is there.
  • FIG. 4 is a diagram showing the presence of a test strain, a DNA concentration, and an internal control (IC) added to a sample (sample numbers 66 to 71) used in Test 3 for a bacterial inspection method and the like according to an embodiment of the present invention. is there.
  • FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 60 to 71) of test 3 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 60 to 71) of test 3 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 1a to 14a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing detection results (sample numbers 15a to 28a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 29a to 43a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 1a to 14a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45, 47) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 15a to 28a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45, 47) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing detection results (sample numbers 29a to 43a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45, 47) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing detection results (sample numbers 44a to 59a) of test 5 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing detection results (sample numbers 44a to 59a) of test 5 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45 and 47) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 63a, 65a, 72a, 69a, 71a, 73a) of test 6 using probes (SEQ ID NOs: 32-45, 47) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. is there.
  • the method for examining bacteria is a method for examining the presence of bacteria in a sample, and the target bacteria is selected from the Listeria species described in (1) to (10) below, (1) Listeria floridensis, (2) Listeria weihenstephanensis, (3) Listeria cornellensis, (4) Listeria riparia, (5) Listeria grandensis, (6) Listeria booriae, (7) Listeria newyorkensis, (8) Listeria aquatica, (9) Listeria yakmannii, (10) Listeria marthii,
  • This method (A) a preparation step of preparing a reaction solution containing a primer set for amplification of an IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene; and (B) An amplification step of amplifying the nucleic acid of the target bacteria contained in the sample using the reaction solution obtained in the preparation step is characterized.
  • the target bacteria further include bacteria selected from Listeria spp. Described in (11) to (17) below.
  • (11) Listeria grayi (12) Listeria innocua (13) Listeria ivanovii (14) Listeria monocytogenes (15) Listeria rocourtiae (16) Listeria seeligeri (17) Listeria welshimeri
  • IGS intergenic spacer
  • F / R indicates that F is a forward primer and R is a reverse primer.
  • FIG. 2 shows the base sequences in the IGS region of Listeria floridensis, Listeria allegedlystephanensis, Listeria cornelensis, Listeria liparia, and Listeria grandensis (SEQ ID NOs: 3 to 7 in order).
  • FIG. 3 shows the base sequences in the IGS regions of Listeria Booliae, Listeria Nuyoenensis, Listeria Aquatica, Listeria Freshmanni, and Listeria Marti (sequence numbers 8 to 12 in order).
  • the IGS region was analyzed again in order to find a more effective probe, and the base sequence (SEQ ID NO: 46) shown in FIG. 23 was obtained.
  • the nucleotide sequences in the IGS regions of Listeria Gray, Listeria Inocure, Listeria Ivanobi, Listeria Monocytogenes, Listeria Locoutier, Listeria Shiligeri, and Listeria Wersimeli were obtained from DDBJ. Then, by comparing the base sequences in the IGS region of these 17 kinds of Listeria species, the design location of the bacterial test probe set and bacterial test primer set of this embodiment was determined.
  • the primer set for amplification in the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene contained in the reaction solution prepared in the above preparation step is a forward sequence consisting of an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 in FIG. It consists of a primer and a reverse primer consisting of an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • a probe set selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene that hybridizes with the nucleic acid amplified by the amplification step described above is based on the oligonucleotides of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 31 in FIG. And at least one selected from the group consisting of probes consisting of oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32-43 in FIG. Note that a probe for detecting a plasmid as an internal control used for determining whether or not DNA amplification by PCR reaction has been properly performed is shown in SEQ ID NO: 45 in FIG.
  • a probe having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 47 of FIG. 23 was designed as a more effective probe. That is, the probe set selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene that hybridizes with the nucleic acid amplified by the amplification step described above is a probe comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 18 to 31. It is also preferable to consist of at least one selected from the group consisting of probes consisting of oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43 and 47.
  • the above reaction solution contains genomic DNA extracted from Listeria cells.
  • Genomic DNA can be extracted by a general method such as a method using a kit or a method using a DNA extraction apparatus.
  • the target region in the extracted genomic DNA is amplified. That is, a DNA fragment containing the target region in genomic DNA is amplified.
  • the method for amplifying the target region is not particularly limited, but the PCR method can be suitably used. A general thermal cycler or the like can be used as the PCR apparatus.
  • the target region in the genomic DNA can be suitably amplified by performing PCR under the following reaction conditions.
  • a solution having the following composition is preferably used. That is, a PCR reaction containing a nucleic acid synthesis substrate (dNTPmixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)), primer set, nucleic acid synthase (such as HotStart DNA polymerase), sample genomic DNA, buffer solution, and sterilized water as the remaining components
  • dNTPmixture dCTP, dATP, dTTP, dGTP
  • primer set such as HotStart DNA polymerase
  • sample genomic DNA such as HotStart DNA polymerase
  • buffer solution such as HotStart DNA polymerase
  • hybridization can be performed as follows. That is, the amplification product obtained by the above amplification step is dropped onto the bacterial test microarray of this embodiment, and the label of the amplification product that has hybridized to the probe placed thereon is detected. Check for presence. Thereby, it is possible to identify Listeria belonging to the environment to be examined.
  • the detection of the label can be performed using a general label detection device such as a fluorescence scanning device.
  • a fluorescence scanning device For example, the fluorescence intensity of the amplification product is measured using the GENOGATE (R) reader of Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd. This can be done.
  • the measurement result is preferably obtained as an S / N ratio value (Signal to Noise ratio). This is because whether the measurement result is positive or negative can be determined with high accuracy based on the S / N ratio value. In the case of the microarray used in Examples described later, it can be determined as positive when the S / N ratio value is 3.0 or more.
  • the S / N ratio value described in the present specification is calculated by (median fluorescence intensity value ⁇ background value) ⁇ background value.
  • the label is not limited to fluorescence, and other labels can also be used.
  • the microarray for testing bacteria according to this embodiment is for testing the presence of bacteria in a sample, and an IGS (intergenic spacer) of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10) At least one of the probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43 and 47 selected from the region is immobilized.
  • the microarray for testing bacteria of this embodiment is further represented by SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (11) to (17). It is preferable that at least one of the probes of the base sequence is immobilized.
  • the microarray for testing bacteria of this embodiment can be obtained by immobilizing all or part of the probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47.
  • the microarray for testing bacteria can be produced by an existing general method using probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47.
  • an affixed DNA chip when produced as this microarray, it can be produced by immobilizing probes on a glass substrate with a DNA spotter and forming spots corresponding to each probe.
  • a synthetic DNA chip when produced, it can be produced by synthesizing a single-stranded oligo DNA having the above sequence on a glass substrate by a photolithography technique.
  • the substrate is not limited to glass, and a plastic substrate, a silicon wafer, or the like can also be used.
  • the shape of the substrate is not limited to a flat plate shape, and may be various three-dimensional shapes, and a substrate having a functional group introduced so that a chemical reaction can be performed on the surface can be used. .
  • test kit for bacteria of this embodiment is for testing the presence of bacteria in a sample, and an IGS (intergenic spacer) of the Listeria spp. RRNA gene described in (1) to (10) above.
  • IGS intergenic spacer
  • a primer set comprising primers of the base sequences shown in 16 and 17.
  • test kit for bacteria of the present embodiment is further represented by SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (11) to (17). It is preferable that at least one of the probes of the base sequence is immobilized.
  • the probe set for testing bacteria is for testing the presence of bacteria in a sample.
  • the IGS (intergenic spacer) of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10) ) It is characterized by comprising at least one of the probes of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43, 47 selected from the region.
  • the bacterial probe set of the present embodiment further includes SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the Listeria spp. RRNA gene described in (11) to (17) above. It is preferable to include at least one of the probes having the base sequences shown.
  • the bacterial test primer set of the present embodiment is for testing the presence of bacteria in a sample.
  • the probe set described above preferably includes at least one of the following probes (A) or (B), two or more of these, or all of them.
  • the probe set for testing bacteria of this embodiment has a length of 21 to 36 bases, and can be synthesized by a general DNA synthesizer.
  • the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 used in Examples described later were all synthesized by a DNA synthesizer.
  • the bacterial test primer set of the present embodiment is also 19 to 22 bases in length, and the primers comprising the base sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 used in PCR in the examples were synthesized by a DNA synthesizer. We used what we did.
  • the primers composed of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 used for PCR in the examples were also synthesized by a DNA synthesizer.
  • the probes consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43, 47 in this embodiment are not limited to the sequences themselves, and one or several bases are deleted from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43, 47. Substituted or added probes can be used. Probes that can hybridize under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 can also be used. In addition, these probes and probes having a base sequence complementary to the probes consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 can also be used.
  • the stringent condition refers to a condition where a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • DNAs having high homology (homology is 90% or more, preferably 95% or more) to DNAs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 are shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47.
  • Conditions for hybridizing with DNA consisting of a base sequence and DNA each consisting of a complementary base sequence are mentioned. Usually, it means a case where hybridization occurs at a temperature about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the complete hybrid.
  • Tm melting temperature
  • bacteria inspection microarray, bacteria inspection kit, bacteria inspection probe set, and bacteria inspection primer set of the present embodiment described above the above-described inspection has not been possible so far. It is possible to specifically and accurately identify all 17 types of Listeria species including the Listeria species of (1) to (10).
  • DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
  • the PCR reaction solution is uniformly a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 for amplifying the IGS region of the DNA of Listeria The one containing was used.
  • These primers were synthesized by Sigma-Aldrich Sakai Japan LLC.
  • PCR buffer QIAGEN
  • dNTP mix Cat No.BR0600503, biotechrabbit
  • 10 ⁇ M forward primer SEQ ID NO: 1
  • 10 ⁇ M reverse primer SEQ ID NO: 2
  • HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 ⁇ l 6).
  • Template DNA (10ng / ⁇ l) 2.0 ⁇ l 7.
  • Sterile water water added until the total volume is 20.0 ⁇ l)
  • DNA was amplified under the following conditions using a nucleic acid amplification apparatus (Master cycler ep, Eppendorf).
  • A 95 ° C 15 minutes
  • b 94 ° C 1 minute
  • c 60 ° C 1 minute
  • d 72 ° C 1 minute
  • E 72 ° C 10 minutes
  • electrophoresis of amplification products by PCR was performed using an electrophoresis apparatus (MupidexU, Mupid Co., Ltd.).
  • a gel imaging device (SCOPE WD, Optima Co., Ltd.) was used as a detector for amplification products.
  • the amplification product was excised and purified.
  • HiYield Gel / PCR DNA Fragments Extraction Kit (RBC Bioscience) for excision / DNA purification was used.
  • the purified DNA was sequenced using a DNA sequence reaction apparatus (Big Dye® X X terminator, Thermo Fisher Scientific). After the sequencing, purification was performed, and electrophoresis and analysis were performed with a DNA sequencer (3130xl Genetic Analyzer, 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). These sequences, migration and analysis were performed by Fasmac Co., Ltd. As a result, the obtained base sequences are shown in FIG. 2, FIG. 3, and FIG.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence in the IGS region of (1) Listeria fluoridensis, (2) Listeria wehenstephanensis, (3) Listeria cornelensis, (4) Listeria lipariae, and (5) Listeria grandensis (sequence number 3 in this order). To 7) are shown.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequences in the IGS region of (6) Listeria booriae, (7) Listeria nujönensis, (8) Listeria aquatica, (9) Listeria freshmanni, and (10) Listeria malti. 8-12) are shown.
  • FIG. 23 shows the base sequence (SEQ ID NO: 46) in the IGS region of (10) Listeria multi. Based on these base sequences and the like, the bacterial test probe set and bacterial test primer set of this embodiment were designed.
  • Tests for confirming the effects of the bacteria testing method, bacteria testing microarray, bacteria testing kit, bacteria testing probe set, and bacteria testing primer set of this embodiment were performed.
  • the probe set for testing bacteria according to the present embodiment was designed by comparing the IGS regions of all 17 Listeria species to identify highly specific regions. In this test, the specificity (inclusion) of these probe sets was verified.
  • Sample numbers 1 to 6 Listeria grayi ATCC 25401, ATCC 700545, ATCC 19120, ATCC 25400, ATCC 25403, ATCC 19120 ⁇ Sample Nos. 7-8: Listeria innocua in order ATCC 33090, NCTC 11288 Sample numbers 9 to 10: Listeria ivanovii subsp. Ivanovii ATCC 19119, Listeria ivanovii subsp.
  • Sample number 32 Listeria floridensis DSM 26687 Sample numbers 33 to 34: Listeria weihenstephanensis DSM 24698, DSM 24699 Sample number 35: Listeria cornellensis DSM 26689 Sample number 36: Listeria riparia DSM 26685 Sample number 37: Listeria grandensis DSM 26688 Sample number 38: Listeria booriae DSM 28860 Sample number 39: Listeria newyorkensis DSM 28861 Sample number 40: Listeria aquatica DSM 26686 Sample number 41: Listeria yakmannii subsp. Fleischmannii DSM 25003 Sample number 42: Listeria marthii DSM 23813 ⁇ Sample No. 43: Negative control (Add sterilized water instead of Template)
  • the PCR reaction solution is uniformly a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 for amplifying the IGS region of the DNA of Listeria
  • the one containing was used.
  • an internal control was used to determine whether or not DNA amplification by PCR reaction was properly performed.
  • plasmid DNA was used, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 15 was prepared by a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the target DNA consisting of was amplified.
  • These primers were synthesized by Sigma Aldrich Japan LLC.
  • the target DNA of the plasmid was synthesized by Fasmac Co., Ltd.
  • DNA was amplified under the following conditions using a nucleic acid amplification apparatus (Master cycler ep, Eppendorf).
  • A 95 ° C 15 minutes
  • b 94 ° C 1 minute
  • c 60 ° C 1 minute
  • d 72 ° C 1 minute
  • E 72 ° C 10 minutes
  • a DNA chip manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.
  • a probe with SEQ ID NOS: 18 to 45 shown in FIGS. 8 and 9 was used.
  • Each probe was synthesized by Sigma-Aldrich Sakai Japan LLC.
  • Each probe was immobilized on a substrate using a DNA spotter.
  • SEQ ID NO: 18 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria.
  • SEQ ID NO: 19 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria gray.
  • SEQ ID NOs: 20 to 21 show the base sequences of probes for detecting Listeria innocure.
  • SEQ ID NOs: 22 to 23 show the base sequences of probes for detecting Listeria ivanovi.
  • SEQ ID NOs: 24 to 25 show the base sequences of probes for detecting Listeria monocytogenes.
  • SEQ ID NOs: 26 to 28 show the base sequences of probes for detecting Listeria locotier.
  • SEQ ID NO: 29 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria shirigeri.
  • SEQ ID NOs: 30 to 31 show the base sequences of probes for detecting Listeria well simelii.
  • SEQ ID NOs: 32 to 33 show the base sequences of probes for detecting Listeria fluoridensis.
  • SEQ ID NO: 34 is the base sequence of the probe whose detection target is Listeria admir step hanensis.
  • SEQ ID NO: 35 is the base sequence of the probe whose detection target is Listeria cornellensis.
  • SEQ ID NO: 36 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria liparia.
  • SEQ ID NO: 37 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria grandensis.
  • SEQ ID NOs: 38 to 39 show the base sequences of probes for detection of Listeria boriae.
  • SEQ ID NOs: 40 to 41 show the base sequences of probes for detecting Listeria New Yorkensis.
  • SEQ ID NO: 42 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria aquatica.
  • SEQ ID NO: 43 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria Georgiani.
  • SEQ ID NO: 44 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria multi.
  • SEQ ID NO: 45 shows the base sequence of a probe whose target is a plasmid.
  • a reaction solution for hybridization was prepared as follows. 2 ⁇ L of hybridization buffer and 4 ⁇ L of amplification product were mixed on the cover of the DNA chip.
  • the buffer composition is 3 ⁇ SSC / 0.3% Tween20 and 20 nM Cy5 labeled oligonucleotide. Then, this cover was put on a DNA chip, and hybridization was performed in a hybridizer (Dako) at 45 ° C./1 hour for hybridization conditions.
  • the PCR product that had not been hybridized was washed away using a washing solution (0.5 ⁇ SSC / 0.2% SDS, 0.5 ⁇ SSC) for the DNA chip. Then, using a label detection device (GENOGATE (R) reader, Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd.), the fluorescence intensity of each probe placed on the DNA chip (the fluorescence intensity of the amplification product bound to the probe) is measured. Then, the S / N ratio value ((median fluorescence intensity value ⁇ background value) ⁇ background value) for each probe was obtained. The results are shown in FIGS. In these figures, when the S / N ratio value was positive for any of the probe sets corresponding to the Listeria species to be detected, it was determined that the Listeria species were detected. In these figures, positive S / N ratio values are indicated by thick frames.
  • the probe shown in SEQ ID NO: 18 is positive for all 17 Listeria species.
  • the probes shown in SEQ ID NOs: 19 to 43 are capable of detecting Listeria spp. That are the respective detection targets.
  • the probe set for testing bacteria of this embodiment exhibits excellent specificity (inclusion) except for SEQ ID NO: 44 for detecting Listeria multiplicity. Therefore, for Listeria multi, a probe shown in SEQ ID NO: 47 was newly developed. And in order to confirm the specificity (inclusion) of this embodiment including this probe, the test 4 mentioned later was done.
  • Sample number 44 Staphylococcus aureus GTC DY 0073
  • Sample number 45 Escherichia coli RIMD 0509516
  • Sample number 46 Shigella dysenteriae GTC 00100
  • Sample number 47 Nagvibrio Vibrio mimicus RIMD 2218001
  • Sample numbers 48-58 Salmonella enterica subsp salamae GTC 1731, Salmonella enterica subsp enterica serovar Arizonae GTC 1732, Salmonella enterica subsp enterica serovar Cerro GTC 2554, Salmonella enterica subsp enterica serovar Landau GTC 2614, TC 3820, Salmonalla enterica subsp enterica serovar Enteritidis GTC 3838, Salmonella enterica subsp enterica serovar Aberdeen GTC 12694, Salmonella enterica subsp enterica serovar Kentucky GTC 12786, Salmonella enterica subsp enterica serovar Essen GTC 12814, Salmonella entericaS enterica serovar Niarembe GTC 12820 ⁇ Sample No. 59: Negative control (Add sterilized water instead of Template)
  • the PCR reaction solution was composed of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 for amplifying the IGS region of Listeria spp.
  • the one containing the primer set was used.
  • an internal control was used to determine whether or not DNA amplification by PCR reaction was properly performed.
  • plasmid DNA was used, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 15 was prepared by a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the target DNA consisting of was amplified.
  • These primers were synthesized by Sigma Aldrich Japan LLC.
  • the target DNA of the plasmid was synthesized by Fasmac Co., Ltd.
  • DNA was amplified under the following conditions using a nucleic acid amplification apparatus (Master cycler ep, Eppendorf).
  • A 95 ° C 15 minutes
  • b 94 ° C 1 minute
  • c 60 ° C 1 minute
  • d 72 ° C 1 minute
  • E 72 ° C 10 minutes
  • test microarray a DNA chip (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.) was used as in the test 1, and probes having the sequence numbers 18 to 45 shown in FIGS. 8 and 9 were used. Each probe was synthesized by Sigma-Aldrich Sakai Japan LLC. Each probe was immobilized on a substrate using a DNA spotter.
  • a reaction solution for hybridization was prepared as follows in the same manner as in Test 1. 2 ⁇ L of hybridization buffer and 4 ⁇ L of amplification product were mixed on the cover of the DNA chip.
  • the buffer composition is 3 ⁇ SSC / 0.3% Tween20 and 20 nM Cy5 labeled oligonucleotide. Then, this cover was put on a DNA chip, and hybridization was performed in a hybridizer (Dako) at 45 ° C./1 hour for hybridization conditions.
  • the PCR product that had not been hybridized was washed away using a washing solution (0.5 ⁇ SSC / 0.2% SDS, 0.5 ⁇ SSC) for the DNA chip. Then, using a label detection device (GENOGATE (R) reader, Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd.), the fluorescence intensity of each probe placed on the DNA chip (the fluorescence intensity of the amplification product bound to the probe) is measured. Then, the S / N ratio value ((median fluorescence intensity value ⁇ background value) ⁇ background value) for each probe was obtained. The results are shown in FIGS. In these figures, positive S / N ratio values are indicated by thick frames.
  • the probe for internal control shown in SEQ ID NO: 45 shows positive for all the samples shown in sample numbers 44 to 59.
  • the other probes show negative for all bacteria of sample numbers 44 to 58, and no false positives are shown.
  • the probe set for testing bacteria according to this embodiment exhibits excellent specificity (exclusiveness).
  • Test 3 In this test, the specificity (simultaneous detection) of the test probe set for bacteria of this embodiment was verified using a sample in which a plurality of Listeria species were mixed.
  • Sample numbers 60 to 65 were those to which no plasmid was added as an internal control, and sample numbers 66 to 71 were samples to which an internal control was added.
  • Sample Nos. 60 and 61 Listeria Booliae, Listeria Nuyoensis, Listeria Freshmanni Sample No. 62: Listeria Floridensis, Listeria Wegenstep Hanensis, Listeria Georgiaensis, Listeria Liparia, Listeria Grandensis, Listeria Booliae, Listeria Nuyoensis , Listeria Aquatica, Listeria Freshmanni ⁇ Sample No. 63: Sample No. 62 plus Listeria Marti ⁇ Sample No. 64: Listeria genus excluding Listeria genus ⁇ Sample No. 65: All 17 types of Listeria spp. And sample numbers 66-71 contain the same strains as sample numbers 60-65, respectively. It is intended to include a roll.
  • the PCR reaction solution was composed of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 for amplifying the IGS region of Listeria spp.
  • the one containing the primer set was used.
  • an internal control was used to determine whether or not DNA amplification by the PCR reaction was properly performed.
  • plasmid DNA was used, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 15 was prepared by a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the target DNA consisting of was amplified.
  • These primers were synthesized by Sigma Aldrich Japan LLC.
  • the target DNA of the plasmid was synthesized by Fasmac Co., Ltd.
  • PCR buffer QIAGEN
  • dNTP mix Cat No.BR0600503, biotechrabbit
  • 10 ⁇ M forward primer SEQ ID NO: 16
  • 10 ⁇ M reverse primer SEQ ID NO: 17
  • 10 ⁇ M IC forward primer SEQ ID NO: 13
  • 10 ⁇ M reverse primer for IC SEQ ID NO: 14
  • 1.0 ⁇ l 7 100 pg / ⁇ l plasmid solution (SEQ ID NO: 15) 1.0 ⁇ l 8).
  • HotStarTaq DNA Polymerase Cat No.
  • Template DNA (10ng / PCR reaction solution) 2.0 ⁇ l 10. Sterile water (water added until the total volume is 20.0 ⁇ l) Template DNA was used as a reaction solution for 10 ng / PCR of each strain in sample numbers 60 and 66, and as a reaction solution for 1 ng / PCR of each strain in sample numbers 61 to 65 and 67 to 71.
  • DNA was amplified under the following conditions using a nucleic acid amplification apparatus (Master cycler ep, Eppendorf).
  • A 95 ° C 15 minutes
  • b 94 ° C 1 minute
  • c 60 ° C 1 minute
  • d 72 ° C 1 minute
  • E 72 ° C 10 minutes
  • a DNA chip manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.
  • a probe with SEQ ID NOS: 18 to 45 shown in FIGS. did.
  • Each probe was synthesized by Sigma-Aldrich Sakai Japan LLC.
  • Each probe was immobilized on a substrate using a DNA spotter.
  • a reaction solution for hybridization was prepared as follows in the same manner as in Test 1. 2 ⁇ L of hybridization buffer and 4 ⁇ L of amplification product were mixed on the cover of the DNA chip.
  • the buffer composition is 3 ⁇ SSC / 0.3% Tween20 and 20 nM Cy5 labeled oligonucleotide. Then, this cover was put on a DNA chip, and hybridization was performed in a hybridizer (Dako) at 45 ° C./1 hour for hybridization conditions.
  • the PCR product that had not been hybridized was washed away using a washing solution (0.5 ⁇ SSC / 0.2% SDS, 0.5 ⁇ SSC) for the DNA chip. Then, using a label detection device (GENOGATE (R) reader, Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd.), the fluorescence intensity of each probe placed on the DNA chip (the fluorescence intensity of the amplification product bound to the probe) is measured. Then, the S / N ratio value ((median fluorescence intensity value ⁇ background value) ⁇ background value) for each probe was obtained. The results are shown in FIGS. In these figures, when the S / N ratio value was positive for any of the probe sets corresponding to the Listeria species to be detected, it was determined that the Listeria species were detected. In these figures, positive S / N ratio values are indicated by thick frames.
  • Test 4 Including a new probe shown in SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi, a method for testing bacteria according to the present embodiment, a microarray for testing bacteria, a kit for testing bacteria, a probe set for testing bacteria, and A test for confirming the specificity (inclusion) of the test primer set was conducted in the same manner as in Test 1.
  • the same samples as the sample numbers 1 to 43 in the test 1 were prepared as the sample numbers 1a to 43a, respectively, and cultured in the same manner as the test 1. Then, PCR was performed in the same manner as in Test 1 using the genomic DNA extracted from the Listeria spp.
  • the probe shown in SEQ ID NO: 18 is positive for all 17 Listeria species.
  • the probes shown in SEQ ID NOs: 19 to 43 and 47 are capable of detecting Listeria spp. That are the detection targets.
  • the probe set for testing bacteria according to the present embodiment exhibits excellent specificity (inclusion).
  • Test 5 Including the probe shown in SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi, the method for testing bacteria of this embodiment, the microarray for testing bacteria, the kit for testing bacteria, the probe set for testing bacteria, and the A test for verifying the specificity (exclusiveness) of the test primer set was conducted in the same manner as in Test 2.
  • the same samples as the sample numbers 44 to 59 in the test 2 were prepared as the sample numbers 44a to 59a, respectively, and cultured in the same manner as the test 2. Then, PCR was performed in the same manner as in Test 2 using the genomic DNA extracted from Listeria spp.
  • the probe for internal control shown in SEQ ID NO: 45 is positive for all the samples shown in sample numbers 44a to 59a.
  • the other probes are negative for all the bacteria of sample numbers 44a to 58a and no false positives are shown.
  • the probe set for testing bacteria according to this embodiment exhibits excellent specificity (exclusiveness).
  • Test 6 Including a new probe shown in SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi, a method for testing bacteria according to the present embodiment, a microarray for testing bacteria, a kit for testing bacteria, a probe set for testing bacteria, and A test for verifying the specificity (simultaneous detection) by the test primer set was conducted in the same manner as in Test 3.
  • sample numbers 63, 65, 69, and 71 in the test 3 are prepared as the sample numbers 63a, 65a, 69a, and 71a, respectively. And cultured in the same manner.
  • Sample numbers 72a and 73a were prepared as negative controls (sterilized water was added instead of Template).
  • Sample number 72a is a sample to which no plasmid was added as an internal control
  • sample number 73a was a sample to which an internal control was added.
  • PCR was performed in the same manner as in Test 3 using genomic DNA extracted from the Listeria spp.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and it goes without saying that various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • the probes arranged in the microarray for testing bacteria of this embodiment are not limited to one spot per type, and a plurality of each probe may be arranged.
  • other probes for detecting bacteria other than Listeria belonging to the detection target of the present embodiment may be arranged in the microarray together with the probes in the present embodiment, and can be changed as appropriate. .
  • the present invention can be suitably used for specific and multiplex detection of Listeria spp. In environmental inspections, food inspections, and the like.

Abstract

In an examination for determining the presence of a bacterium, an existing bacterium belonging to the genus Listeria can be highly accurately and specifically detected. A method for examining the presence of a bacterium in a sample, wherein the bacterium to be detected is selected from among bacteria (1) to (10) belonging to the genus Listeria, i.e., (1) Listeria floridensis,(2) Listeria weihenstephanensis, (3) Listeria cornellensis, (4) Listeria riparia, (5) Listeria grandensis, (6) Listeria booriae, (7) Listeria newyorkensis, (8) Listeria aquatica, (9) Listeria fleischmannii and (10) Listeria marthii, said method comprising: (a) a preparation step for preparing a liquid reaction mixture containing a primer set for amplifying the intergenic spacer (IGS) region of rRNA gene; and (b) an amplification step for amplifying nucleic acid of the bacterium to be detected that is contained in the sample with the use of the liquid reaction mixture obtained in the preparation step.

Description

細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットBacteria inspection method, bacteria inspection microarray, bacteria inspection kit, bacteria inspection probe set, and bacteria inspection primer set
　本発明は、食品製造施設などにおいて問題視される、リステリア属菌を対象とする検査技術に関する。 The present invention relates to an inspection technique for Listeria spp. Which is regarded as a problem in food manufacturing facilities.
　リステリア属菌は、現在、全１７菌種の存在が確認されており、このうちリステリア　モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）が食中毒の病原菌種である。リステリア　モノサイトゲネスを原因とした食中毒は、妊婦や新生児、高齢者、及び免疫システムが弱った人などにおいて発症し易く、米国では近年、毎年１，６００人程度が罹患し、約２６０が死亡していることが報告されている。 As for the Listeria spp., The presence of all 17 species has been confirmed, and among these, Listeria monocytogenes is a pathogenic species of food poisoning. Listeria Monocytogenes-induced food poisoning is likely to occur in pregnant women, newborns, the elderly, and people with weakened immune systems. In the United States, about 1,600 people have been affected each year in the past, and about 260 deaths have occurred. It has been reported that
　リステリア属菌の検出手法としては、ＶＩＤＡＳ（登録商標、ビオメリュー）法が知られている。しかしながら、例えばリステリア　ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）をこの手法に供試すると、リステリア　モノサイトゲネスと識別されて、誤判定になるという問題があった。
　このようなことから、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することが望ましいが、そのような検査キットはこれまで存在していなかった。 As a method for detecting Listeria, the VIDAS (registered trademark, Biomelieu) method is known. However, when, for example, Listeria rocourtiae was used in this method, it was identified as Listeria monocytogenes, and there was a problem of erroneous determination.
For these reasons, it is desirable to accurately identify all 17 species of Listeria, but such a test kit has not existed so far.
特許第４６２１９１９号明細書Japanese Patent No. 4621919
　ここで、リステリア属菌の検出手法に関する先行文献としては、特許文献１に記載の微生物の多重検出方法を挙げることができる。この方法によれば、食品中のリステリア　モノサイトゲネスを含む２種以上の異なる特性の微生物を、一定の条件下で検出することが可能となっている。
　しかしながら、この方法では、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することはできなかった。 Here, as a prior document regarding the detection method of Listeria spp., There can be mentioned a multiplex detection method for microorganisms described in Patent Document 1. According to this method, it is possible to detect two or more types of microorganisms having different characteristics including Listeria monocytogenes in food under certain conditions.
However, this method could not accurately identify all 17 species in Listeria.
　また、非特許文献１には、検査対象の遺伝子領域をｉａｐとして、リステリア　グレイ（Listeria grayi）、リステリア　イノキュア（Listeria innocua）、リステリア　イバノビ（Listeria ivanovii）、リステリア　モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア　シリゲリ（Listeria seeligeri）、リステリア　ウェルシメリ（Listeria welshimeri）の６菌種を検出する手法が記載されている。
　また、非特許文献２には、検査対象の遺伝子領域をＩＧＳとして、上記と同じ６菌種を検出する手法が記載されている。
　しかしながら、これらのいずれの文献にも、リステリア属菌における全１７菌種を検出する手法については、記載されていない。 In Non-Patent Document 1, the gene region to be examined is iap, Listeria grayi, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes. (Listeria seeligeri), the method of detecting 6 microbial species of Listeria welshimeri is described.
Non-Patent Document 2 describes a technique for detecting the same six bacterial species as described above using the gene region to be examined as an IGS.
However, none of these documents describes a technique for detecting all 17 species of Listeria.
　さらに、リステリア属菌における全１７菌種のうち、リステリア　フロリデンシス（Listeria floridensis）、リステリア　ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、リステリア　コーネレンシス（Listeria cornellensis）、リステリア　リパリア（Listeria riparia）、リステリア　グランデンシス（Listeria grandensis）、リステリア　ボオリアエ（Listeria booriae）、リステリア　ニュヨークネンシス　（Listeria newyorkensis）、リステリア　アクアティカ（Listeria aquatica）、リステリア　フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、リステリア　マルティ（Listeria marthii）の１０菌種については、これまで検出することができなかった。 Furthermore, among all 17 species of Listeria species, Listeria floridensis, Listeria weihenstephanensis, Listeria cornelensis, Listeria aria, Listeria aria, Listeria aria aria. About 10 bacterial species, including Grandensis), Listeria ria, Listeria newyorkensis, Listeria aquatica, Listeria fleischmannii, Listeria marthii It could not be detected.
　本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することが可能な細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is capable of accurately identifying all 17 bacterial species in the genus Listeria, a microarray for testing bacteria, a kit for testing bacteria, An object is to provide a probe set for testing and a primer set for testing bacteria.
　上記目的を達成するため、本発明の細菌の検査方法は、試料中における細菌の存在を検査する方法であって、対象となる細菌は、以下の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌から選ばれ、（１）リステリア　フロリデンシス（Listeria floridensis）、（２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、（３）リステリア　コーネレンシス（Listeria cornellensis）、（４）リステリア　リパリア（Listeria riparia）、（５）リステリア　グランデンシス（Listeria grandensis）、（６）リステリア　ボオリアエ（Listeria booriae）、（７）リステリア　ニュヨークネンシス　（Listeria newyorkensis）、（８）リステリア　アクアティカ（Listeria aquatica）、（９）リステリア　フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、（１０）リステリア　マルティ（Listeria marthii）、前記方法は、（ａ）ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域の増幅用プライマーセットを含む反応液を調製する調製工程、及び、（ｂ）前記調製工程により得られた反応液を使用して、前記試料に含まれる前記対象となる細菌の核酸を増幅する増幅工程を含む方法としてある。 In order to achieve the above object, a method for examining bacteria according to the present invention is a method for examining the presence of bacteria in a sample, and the target bacteria are Listeria belonging to the following (1) to (10): (1) Listeria floridensis, (2) Listeria weihenstephanensis, (3) Listeria cornellensis, (4) Listeria riparia, (5) Listeria grandensis, (6) Listeria boriae, (7) Listeria newyorkensis, (8) Listeria aquatica, (9) Listeria マ ン freshmanni ( Listeria fleischmannii), (10) Listery Listeria marthii, the method includes (a) a preparation step of preparing a reaction solution containing a primer set for amplification of an IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene, and (b) a reaction obtained by the preparation step The method includes an amplification step of amplifying the nucleic acid of the target bacteria contained in the sample using a liquid.
　また、本発明の細菌の検査用マイクロアレイは、試料中における細菌の存在を検出する細菌の検査用マイクロアレイであって、上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化された構成としてある。 The microarray for testing bacteria of the present invention is a microarray for testing bacteria that detects the presence of bacteria in a sample, and is an IGS of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10). At least one of the probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32-43 and 47 selected from the (intergenic spacer) region is immobilized.
　また、本発明の細菌の検査用キットは、試料中における細菌の存在を検出する細菌の検査用キットであって、上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたマイクロアレイと、前記プローブとハイブリダイゼーション（相補的結合）をする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなるプライマーセットとを含む構成としてある。 The bacterial test kit of the present invention is a bacterial test kit for detecting the presence of bacteria in a sample, and the IGS of the Listeria spp. RRNA gene described in (1) to (10) above. Amplifying a microarray on which at least one of the probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32-43 and 47 selected from the (intergenic spacer) region is immobilized, and nucleic acid that hybridizes (complementary binding) to the probe And a primer set consisting of primers having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17.
　また、本発明の細菌の検査用プローブセットは、試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用プローブセットであって、上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかからなる構成としてある。 In addition, the bacterial test probe set of the present invention is a bacterial test probe set for testing the presence of bacteria in a sample, and the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10) The IGS (intergenic spacer) region is selected from probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43 and 47.
　また、本発明の細菌の検査用プライマーセットは、試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用プライマーセットであって、上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなる構成としてある。 In addition, the bacterial test primer set of the present invention is a bacterial test primer set for testing the presence of bacteria in a sample, the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10) From primers of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 for amplifying a nucleic acid that hybridizes with at least one of the probes of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43 and 47 selected from the IGS (intergenic spacer) region of The configuration is as follows.
　本発明によれば、リステリア属菌における全１７菌種を正確に識別することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to accurately identify all 17 species of Listeria.
実施例において、本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等の対象とする各種リステリア属菌のＩＧＳ領域の塩基配列を解析するために用いたプライマーの塩基配列を示す図である。In an Example, it is a figure which shows the base sequence of the primer used in order to analyze the base sequence of the IGS area | region of various Listeria genus bacteria used as the object of the test | inspection method etc. of the bacteria which concern on embodiment of this invention. 実施例において解析した、本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等の対象とする各種リステリア属菌（リステリア　フロリデンシス、リステリア　ウェヘンステップハネンシス、リステリア　コーネレンシス、リステリア　リパリア、リステリア　グランデンシス）のＩＧＳ領域の塩基配列を示す図である。The IGS region of various Listeria species (Listeria floridensis, Listeria wehenstephanensis, Listeria cornelensis, Listeria liparia, Listeria grandensis) that are analyzed in the examples and targeted for the method for testing bacteria according to the embodiments of the present invention It is a figure which shows the base sequence of. 実施例において解析した、本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等の対象とする各種リステリア属菌（リステリア　ボオリアエ、リステリア　ニュヨークネンシス、リステリア　アクアティカ、リステリア　フレッシュマンニ、リステリア　マルティ）のＩＧＳ領域の塩基配列を示す図である。In the IGS region of various Listeria spp. (Listeria booriae, Listeria New Yorkensis, Listeria aquatica, Listeria freshmanni, Listeria marti) that are analyzed in the examples and targeted for the method for testing bacteria according to the embodiments of the present invention. It is a figure which shows a base sequence. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等についての試験１で使用したサンプル（リステリア　グレイ、リステリア　イノキュア、リステリア　イバノビ、リステリア　モノサイトゲネス）のサンプル番号、及び供試菌株を示す図である。It is a figure which shows the sample number of the sample (Listeria gray, Listeria inocure, Listeria ivanovi, Listeria monocytogenes) used in the test 1 about the test | inspection method etc. of the bacteria which concern on embodiment of this invention, and a test strain. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等についての試験１で使用したサンプル（リステリア　ロコゥティエ、リステリア　シリゲリ、リステリア　ウェルシメリ、リステリア　フロリデンシス、リステリア　ウェヘンステップハネンシス、リステリア　コーネレンシス、リステリア　リパリア、リステリア　グランデンシス、リステリア　ボオリアエ、リステリア　ニュヨークネンシス、リステリア　アクアティカ、リステリア　フレッシュマンニ、リステリア　マルティ）のサンプル番号、及び供試菌株を示す図である。Samples used in Test 1 for the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention (Listeria Locotier, Listeria Siligelli, Listeria Wersimeli, Listeria Floridensis, Listeria Wehenstephanensis, Listeria Cornelensis, Listeria Liparia, Listeria Grandensis, It is a figure which shows the sample number of the Listeria boriae, Listeria New Yorkensis, Listeria Aquatica, Listeria freshmanni, Listeria marti), and a test strain. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等の各試験で使用したインターナルコントロールとしてのプラスミドを増幅するためのプライマー、及びその増幅対象ＤＮＡの塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence of the primer for amplifying the plasmid as an internal control used by each test, such as the inspection method of bacteria concerning embodiment of this invention, and its amplification object DNA. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等の対象とする各種リステリア属菌のＩＧＳ領域を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence of the primer for amplifying the IGS area | region of various Listeria genus bacteria made into object, such as the test | inspection method of the bacteria which concern on embodiment of this invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等の対象とする各種リステリア属菌（リステリア属、リステリア　グレイ、リステリア　イノキュア、リステリア　イバノビ、リステリア　モノサイトゲネス、リステリア　ロコゥティエ、リステリア　シリゲリ、リステリア　ウェルシメリ）を検出するためのプローブの塩基配列を示す図である。Detects various Listeria spp. (Listeria spp., Listeria gray, Listeria inocure, Listeria ivanovi, Listeria monocytogenes, Listeria locoutier, Listeria siligeri, Listeria wellsimeli) that are targets of the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention It is a figure which shows the base sequence of the probe for this. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等の対象とする各種リステリア属菌（リステリア　フロリデンシス、リステリア　ウェヘンステップハネンシス、リステリア　コーネレンシス、リステリア　リパリア、リステリア　グランデンシス、リステリア　ボオリアエ、リステリア　ニュヨークネンシス、リステリア　アクアティカ、リステリア　フレッシュマンニ、リステリア　マルティ）を検出するためのプローブ、及びインターナルコントロールとしてのプラスミドを検出するためのプローブの塩基配列を示す図である。Various Listeria spp. (Listeria floridensis, Listeria wegen stephanensis, Listeria cornelensis, Listeria liparia, Listeria grandensis, Listeria booriae, Listeria nujönensis, Listeria targeted for the method for testing bacteria according to embodiments of the present invention It is a figure which shows the base sequence of the probe for detecting the probe as a probe for detecting Aquatica, Listeria freshmani, Listeria marti), and an internal control. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験１の検出結果（サンプル番号１～１４）を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 1 to 14) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験１の検出結果（サンプル番号１５～２８）を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 15 to 28) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験１の検出結果（サンプル番号２９～４３）を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 29 to 43) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５）による試験１の検出結果（サンプル番号１～１４）を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 1 to 14) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５）による試験１の検出結果（サンプル番号１５～２８）を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 15 to 28) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５）による試験１の検出結果（サンプル番号２９～４３）を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 29 to 43) of test 1 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等についての試験２で使用した偽陽性の有無を確認するためのサンプル（黄色ブドウ球菌、大腸菌、赤痢菌、ナグビブリオ、サルモネラ）のサンプル番号、及び供試菌株を示す図である。Sample numbers of samples (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella, Nagvibrio, Salmonella) used in Test 2 for the test method of bacteria according to the embodiment of the present invention to confirm the presence or absence of false positives, and test It is a figure which shows a strain. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験２の検出結果（サンプル番号４４～５９）を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 44 to 59) of test 2 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５）による試験２の検出結果（サンプル番号４４～５９）を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 44 to 59) of test 2 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等についての試験３で使用したサンプル（サンプル番号６０～６５）の供試菌株、ＤＮＡ濃度、及びインターナルコントロール（IC）の添加の有無を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the presence of a test strain, DNA concentration, and internal control (IC) added to a sample (sample numbers 60 to 65) used in Test 3 for a method for examining bacteria according to an embodiment of the present invention. is there. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等についての試験３で使用したサンプル（サンプル番号６６～７１）の供試菌株、ＤＮＡ濃度、及びインターナルコントロール（IC）の添加の有無を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the presence of a test strain, a DNA concentration, and an internal control (IC) added to a sample (sample numbers 66 to 71) used in Test 3 for a bacterial inspection method and the like according to an embodiment of the present invention. is there. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験３の検出結果（サンプル番号６０～７１）を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 60 to 71) of test 3 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５）による試験３の検出結果（サンプル番号６０～７１）を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 60 to 71) of test 3 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 実施例において解析した、本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等の対象とするリステリア　マルティのＩＧＳ領域の塩基配列（配列番号４６）と、リステリア　マルティを検出するためのプローブの塩基配列（配列番号４７）を示す図である。The base sequence (SEQ ID NO: 46) of the I.S. region of Listeria marti that is the target of the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention, analyzed in the examples, and the base sequence (sequence) of the probe for detecting the Listeria marti FIG. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験４の検出結果（サンプル番号１ａ～１４ａ）を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the detection results (sample numbers 1a to 14a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験４の検出結果（サンプル番号１５ａ～２８ａ）を示す図である。FIG. 5 is a diagram showing detection results (sample numbers 15a to 28a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験４の検出結果（サンプル番号２９ａ～４３ａ）を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 29a to 43a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５、４７）による試験４の検出結果（サンプル番号１ａ～１４ａ）を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the detection results (sample numbers 1a to 14a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45, 47) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５、４７）による試験４の検出結果（サンプル番号１５ａ～２８ａ）を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing detection results (sample numbers 15a to 28a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45, 47) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５、４７）による試験４の検出結果（サンプル番号２９ａ～４３ａ）を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing detection results (sample numbers 29a to 43a) of test 4 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45, 47) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験５の検出結果（サンプル番号４４ａ～５９ａ）を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing detection results (sample numbers 44a to 59a) of test 5 using probes (SEQ ID NOs: 18 to 31) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５、４７）による試験５の検出結果（サンプル番号４４ａ～５９ａ）を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing detection results (sample numbers 44a to 59a) of test 5 using probes (SEQ ID NOs: 32 to 45 and 47) used in the method for examining bacteria according to the embodiment of the present invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号１８～３１）による試験６の検出結果（サンプル番号６３ａ、６５ａ、７２ａ、６９ａ、７１ａ、７３ａ）を示す図である。It is a figure which shows the detection result ( sample number 63a, 65a, 72a, 69a, 71a, 73a) of the test 6 by the probe (sequence number 18-31) used with the test | inspection method etc. of the bacteria which concern on embodiment of this invention. 本発明の実施形態に係る細菌の検査方法等で使用するプローブ（配列番号３２～４５、４７）による試験６の検出結果（サンプル番号６３ａ、６５ａ、７２ａ、６９ａ、７１ａ、７３ａ）を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the detection results ( sample numbers 63a, 65a, 72a, 69a, 71a, 73a) of test 6 using probes (SEQ ID NOs: 32-45, 47) used in the method for testing bacteria according to the embodiment of the present invention. is there.
　以下、本発明の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。 Hereinafter, an embodiment of the method for inspecting bacteria, microarray for inspecting bacteria, kit for inspecting bacteria, probe set for inspecting bacteria, and primer set for inspecting bacteria according to the present invention will be described in detail below. However, the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiment and examples described later.
　本実施形態の細菌の検査方法は、試料中における細菌の存在を検査する方法であって、対象となる細菌は、以下の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌から選ばれ、
（１）リステリア　フロリデンシス（Listeria floridensis）、
（２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、
（３）リステリア　コーネレンシス（Listeria cornellensis）、
（４）リステリア　リパリア（Listeria riparia）、
（５）リステリア　グランデンシス（Listeria grandensis）、
（６）リステリア　ボオリアエ（Listeria booriae）、
（７）リステリア　ニュヨークネンシス　（Listeria newyorkensis）、
（８）リステリア　アクアティカ（Listeria aquatica）、
（９）リステリア　フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、
（１０）リステリア　マルティ（Listeria marthii）、
　この方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域の増幅用プライマーセットを含む反応液を調製する調製工程、及び、
（ｂ）前記調製工程により得られた反応液を使用して、前記試料に含まれる前記対象となる細菌の核酸を増幅する増幅工程を含むことを特徴とする。 The method for examining bacteria according to the present embodiment is a method for examining the presence of bacteria in a sample, and the target bacteria is selected from the Listeria species described in (1) to (10) below,
(1) Listeria floridensis,
(2) Listeria weihenstephanensis,
(3) Listeria cornellensis,
(4) Listeria riparia,
(5) Listeria grandensis,
(6) Listeria booriae,
(7) Listeria newyorkensis,
(8) Listeria aquatica,
(9) Listeria fleischmannii,
(10) Listeria marthii,
This method
(A) a preparation step of preparing a reaction solution containing a primer set for amplification of an IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene; and
(B) An amplification step of amplifying the nucleic acid of the target bacteria contained in the sample using the reaction solution obtained in the preparation step is characterized.
　また、対象となる細菌には、さらに以下の（１１）～（１７）に記載のリステリア属菌から選ばれる細菌が含まれることが好ましい。
（１１）リステリア　グレイ（Listeria grayi）
（１２）リステリア　イノキュア（Listeria innocua）
（１３）リステリア　イバノビ（Listeria ivanovii）
（１４）リステリア　モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
（１５）リステリア　ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
（１６）リステリア　シリゲリ（Listeria seeligeri）
（１７）リステリア　ウェルシメリ（Listeria welshimeri） In addition, it is preferable that the target bacteria further include bacteria selected from Listeria spp. Described in (11) to (17) below.
(11) Listeria grayi
(12) Listeria innocua
(13) Listeria ivanovii
(14) Listeria monocytogenes
(15) Listeria rocourtiae
(16) Listeria seeligeri
(17) Listeria welshimeri
　上記（１）～（１０）の１０種類の対象菌のゲノム配列は、本願の出願時点のＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）において未報告となっていた。このため、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットについて開発を行うにあたり、まずこれら１０菌種のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域の解析を行った。
　ＩＧＳ領域は、ｒＲＮＡ遺伝子の１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡの間に存在する領域であり、この領域内の種特異的配列が存在すると推定した領域について、塩基配列を解析した。 The genome sequences of the 10 types of target bacteria of the above (1) to (10) have not been reported in DDBJ (DNA Data Bank of Japan) at the time of filing of the present application. Therefore, in developing the bacterial inspection method, the bacterial inspection microarray, the bacterial inspection kit, the bacterial inspection probe set, and the bacterial inspection primer set of the present embodiment, IGS (intergenic spacer) region was analyzed.
The IGS region is a region existing between 16S rRNA and 23S rRNA of the rRNA gene, and the nucleotide sequence of the region presumed to have a species-specific sequence in this region was analyzed.
　具体的には、図１に示す配列番号１、２に示すプライマーセットを用いて、上記１０菌種のＩＧＳ領域を解析した。なお、同図において、「Ｆ／Ｒ」は、Ｆがフォワードプライマーを、Ｒがリバースプライマーを示す。 Specifically, the IGS regions of the above 10 bacterial species were analyzed using the primer sets shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 shown in FIG. In the figure, “F / R” indicates that F is a forward primer and R is a reverse primer.
　その結果得られた塩基配列を図２、３に示す。図２には、リステリア　フロリデンシス、リステリア　ウェヘンステップハネンシス、リステリア　コーネレンシス、リステリア　リパリア、リステリア　グランデンシスのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号３～７）が示されている。また、図３には、リステリア　ボオリアエ、リステリア　ニュヨークネンシス、リステリア　アクアティカ、リステリア　フレッシュマンニ、リステリア　マルティのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号８～１２）が示されている。 The base sequences obtained as a result are shown in FIGS. FIG. 2 shows the base sequences in the IGS region of Listeria floridensis, Listeria wegenstephanensis, Listeria cornelensis, Listeria liparia, and Listeria grandensis (SEQ ID NOs: 3 to 7 in order). In addition, FIG. 3 shows the base sequences in the IGS regions of Listeria Booliae, Listeria Nuyoenensis, Listeria Aquatica, Listeria Freshmanni, and Listeria Marti (sequence numbers 8 to 12 in order).
　また、リステリア　マルティについては、より有効なプローブを見いだすために、ＩＧＳ領域を再度解析して、図２３に示す塩基配列（配列番号４６）を得た。 For Listeria multi, the IGS region was analyzed again in order to find a more effective probe, and the base sequence (SEQ ID NO: 46) shown in FIG. 23 was obtained.
　また、図示しないが、リステリア　グレイ、リステリア　イノキュア、リステリア　イバノビ、リステリア　モノサイトゲネス、リステリア　ロコゥティエ、リステリア　シリゲリ、リステリア　ウェルシメリのＩＧＳ領域における塩基配列をＤＤＢＪから取得した。
　そして、これら１７種類のリステリア属菌のＩＧＳ領域における塩基配列を比較して、本実施形態の細菌の検査用プローブセット及び細菌の検査用プライマーセットの設計箇所を決定した。 Although not shown, the nucleotide sequences in the IGS regions of Listeria Gray, Listeria Inocure, Listeria Ivanobi, Listeria Monocytogenes, Listeria Locoutier, Listeria Shiligeri, and Listeria Wersimeli were obtained from DDBJ.
Then, by comparing the base sequences in the IGS region of these 17 kinds of Listeria species, the design location of the bacterial test probe set and bacterial test primer set of this embodiment was determined.
　具体的には、上記の調製工程において調製される反応液に含まれるｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域の増幅用プライマーセットは、図７の配列番号１６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと、配列番号１７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとからなる。 Specifically, the primer set for amplification in the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene contained in the reaction solution prepared in the above preparation step is a forward sequence consisting of an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 in FIG. It consists of a primer and a reverse primer consisting of an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 17.
　また、上記の増幅工程により増幅された核酸とハイブリダイゼーションを行う、ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択されたプローブセットは、図８の配列番号１８～３１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブと図９の配列番号３２～４３に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブとからなる群から選択された少なくともいずれかからなる。
　なお、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために用いるインターナルコントロールとしてのプラスミドを検出するためのプローブが、図９の配列番号４５に示されている。 A probe set selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene that hybridizes with the nucleic acid amplified by the amplification step described above is based on the oligonucleotides of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 31 in FIG. And at least one selected from the group consisting of probes consisting of oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32-43 in FIG.
Note that a probe for detecting a plasmid as an internal control used for determining whether or not DNA amplification by PCR reaction has been properly performed is shown in SEQ ID NO: 45 in FIG.
　また、リステリア　マルティについては、より有効なプローブとして、図２３の配列番号４７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるものを設計した。
　すなわち、上記の増幅工程により増幅された核酸とハイブリダイゼーションを行う、ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択されたプローブセットは、配列番号１８～３１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブと配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブとからなる群から選択された少なくともいずれかからなるものとすることも好ましい。 For Listeria multi, a probe having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 47 of FIG. 23 was designed as a more effective probe.
That is, the probe set selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene that hybridizes with the nucleic acid amplified by the amplification step described above is a probe comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 18 to 31. It is also preferable to consist of at least one selected from the group consisting of probes consisting of oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43 and 47.
　また、上記の反応液には、リステリア属菌の細胞から抽出されたゲノムＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、キットによる方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。 Further, the above reaction solution contains genomic DNA extracted from Listeria cells. Genomic DNA can be extracted by a general method such as a method using a kit or a method using a DNA extraction apparatus.
　そして、上記の増幅工程において、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域の増幅が行われる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片が増幅される。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。 In the amplification step, the target region in the extracted genomic DNA is amplified. That is, a DNA fragment containing the target region in genomic DNA is amplified. The method for amplifying the target region is not particularly limited, but the PCR method can be suitably used. A general thermal cycler or the like can be used as the PCR apparatus.
　本実施形態では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃　１５分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程）　１分、（ｃ）６０℃（アニーリング工程）　１分、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）　１分（（ｂ）～（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃　１０分 In the present embodiment, for example, the target region in the genomic DNA can be suitably amplified by performing PCR under the following reaction conditions.
(A) 95 ° C. for 15 minutes, (b) 94 ° C. (DNA denaturation step) for 1 minute, (c) 60 ° C. (annealing step) for 1 minute, (d) 72 ° C. (DNA synthesis step) for 1 minute ((b) to (D) 35 cycles), (e) 72 ° C. 10 minutes
　ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。
　すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＨｏｔＳｔａｒｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、検体のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として滅菌水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。 As a reaction solution for PCR, for example, a solution having the following composition is preferably used.
That is, a PCR reaction containing a nucleic acid synthesis substrate (dNTPmixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)), primer set, nucleic acid synthase (such as HotStart DNA polymerase), sample genomic DNA, buffer solution, and sterilized water as the remaining components The liquid can be preferably used.
　本実施形態において、ハイブリダイゼーションは、以下のように行うことができる。
　すなわち、上記の増幅工程により得られた増幅産物を本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイに滴下し、これに配置されたプローブにハイブリダイゼーションをした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在しているリステリア属菌を特定することができる。 In this embodiment, hybridization can be performed as follows.
That is, the amplification product obtained by the above amplification step is dropped onto the bacterial test microarray of this embodiment, and the label of the amplification product that has hybridized to the probe placed thereon is detected. Check for presence. Thereby, it is possible to identify Listeria belonging to the environment to be examined.
　標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋製罐グループエンジリアリング株式会社のGENOGATE(R) readerを用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal　to　Noise　ratio）として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためである。
　後述する実施例で用いたマイクロアレイの場合、Ｓ／Ｎ比値が３．０以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。 The detection of the label can be performed using a general label detection device such as a fluorescence scanning device. For example, the fluorescence intensity of the amplification product is measured using the GENOGATE (R) reader of Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd. This can be done. The measurement result is preferably obtained as an S / N ratio value (Signal to Noise ratio). This is because whether the measurement result is positive or negative can be determined with high accuracy based on the S / N ratio value.
In the case of the microarray used in Examples described later, it can be determined as positive when the S / N ratio value is 3.0 or more. The S / N ratio value described in the present specification is calculated by (median fluorescence intensity value−background value) ÷ background value. The label is not limited to fluorescence, and other labels can also be used.
　また、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、試料中における細菌の存在を検査するものであり、上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたことを特徴とする。
　また、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、さらに上記の（１１）～（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号１８～３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたものとすることが好ましい。
　さらに、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列を有するプローブの全部又は一部を固定化したものとすることができる。 In addition, the microarray for testing bacteria according to this embodiment is for testing the presence of bacteria in a sample, and an IGS (intergenic spacer) of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10) At least one of the probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43 and 47 selected from the region is immobilized.
In addition, the microarray for testing bacteria of this embodiment is further represented by SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (11) to (17). It is preferable that at least one of the probes of the base sequence is immobilized.
Furthermore, the microarray for testing bacteria of this embodiment can be obtained by immobilizing all or part of the probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47.
　また、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイは、配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
　例えば、このマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。 In addition, the microarray for testing bacteria according to this embodiment can be produced by an existing general method using probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47.
For example, when an affixed DNA chip is produced as this microarray, it can be produced by immobilizing probes on a glass substrate with a DNA spotter and forming spots corresponding to each probe. When a synthetic DNA chip is produced, it can be produced by synthesizing a single-stranded oligo DNA having the above sequence on a glass substrate by a photolithography technique. Furthermore, the substrate is not limited to glass, and a plastic substrate, a silicon wafer, or the like can also be used. Further, the shape of the substrate is not limited to a flat plate shape, and may be various three-dimensional shapes, and a substrate having a functional group introduced so that a chemical reaction can be performed on the surface can be used. .
　また、本実施形態の細菌の検査用キットは、試料中における細菌の存在を検査するものであり、上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたマイクロアレイと、マイクロアレイに固定化されたプローブとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなるプライマーセットとを含むことを特徴とする。
　また、本実施形態の細菌の検査用キットは、さらに上記の（１１）～（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号１８～３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたものとすることが好ましい。 In addition, the test kit for bacteria of this embodiment is for testing the presence of bacteria in a sample, and an IGS (intergenic spacer) of the Listeria spp. RRNA gene described in (1) to (10) above. A microarray on which at least one of the probes of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32-43 and 47 selected from the region is immobilized, and a sequence number for amplifying a nucleic acid that hybridizes with the probe immobilized on the microarray And a primer set comprising primers of the base sequences shown in 16 and 17.
In addition, the test kit for bacteria of the present embodiment is further represented by SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (11) to (17). It is preferable that at least one of the probes of the base sequence is immobilized.
　また、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、試料中における細菌の存在を検査するものであり、上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかからなることを特徴とする。
　また、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、さらに上記の（１１）～（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号１８～３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかを含むことが好ましい。 In addition, the probe set for testing bacteria according to the present embodiment is for testing the presence of bacteria in a sample. The IGS (intergenic spacer) of the rRNA gene of Listeria belonging to the above (1) to (10) ) It is characterized by comprising at least one of the probes of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32 to 43, 47 selected from the region.
In addition, the bacterial probe set of the present embodiment further includes SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the Listeria spp. RRNA gene described in (11) to (17) above. It is preferable to include at least one of the probes having the base sequences shown.
　また、本実施形態の細菌の検査用プライマーセットは、試料中における細菌の存在を検査するものであり、上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなることを特徴とする。 Moreover, the bacterial test primer set of the present embodiment is for testing the presence of bacteria in a sample. The IGS (intergenic spacer) of the Listeria spp. RRNA gene described in (1) to (10) above. And a primer having a base sequence shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 for amplifying a nucleic acid that hybridizes with at least one of the probes of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 32-43 and 47 selected from the region. To do.
　さらに、上記のプローブセットを、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含むものとすることも好ましい。
　（Ａ）配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列からなる各プローブ
　（Ｂ）上記（Ａ）の各プローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各プローブ Furthermore, the probe set described above preferably includes at least one of the following probes (A) or (B), two or more of these, or all of them.
(A) Each probe comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 to 43, 47 (B) Each probe having 90% or more identity to the base sequence of each probe of (A) above
　本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、いずれも２１～３６塩基の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例で用いた配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
　また、本実施形態の細菌の検査用プライマーセットも、１９～２２塩基の長さであり、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１６、１７に示す塩基配列からなるプライマーは、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。また、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１、２に示す塩基配列からなるプライマーについても、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。 The probe set for testing bacteria of this embodiment has a length of 21 to 36 bases, and can be synthesized by a general DNA synthesizer. The probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 used in Examples described later were all synthesized by a DNA synthesizer.
In addition, the bacterial test primer set of the present embodiment is also 19 to 22 bases in length, and the primers comprising the base sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 used in PCR in the examples were synthesized by a DNA synthesizer. We used what we did. In addition, the primers composed of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 used for PCR in the examples were also synthesized by a DNA synthesizer.
　本実施形態における配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。 The probes consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43, 47 in this embodiment are not limited to the sequences themselves, and one or several bases are deleted from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43, 47. Substituted or added probes can be used. Probes that can hybridize under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 can also be used. In addition, these probes and probes having a base sequence complementary to the probes consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 can also be used.
　なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列からなるＤＮＡとそれぞれ相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃～約３０℃、好ましくは約１０℃～約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。 The stringent condition refers to a condition where a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, DNAs having high homology (homology is 90% or more, preferably 95% or more) to DNAs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 are shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47. Conditions for hybridizing with DNA consisting of a base sequence and DNA each consisting of a complementary base sequence are mentioned. Usually, it means a case where hybridization occurs at a temperature about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the complete hybrid. For stringent conditions, see J.M. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) can be used, and in particular, Section 11.45 “Conditions for HybridOlybridement”
　以上説明した本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットによれば、これまでは検査できなかった上記の（１）～（１０）のリステリア属菌を含む全１７種類のリステリア属菌をそれぞれ特異的に正確に識別することが可能である。 According to the bacteria inspection method, bacteria inspection microarray, bacteria inspection kit, bacteria inspection probe set, and bacteria inspection primer set of the present embodiment described above, the above-described inspection has not been possible so far. It is possible to specifically and accurately identify all 17 types of Listeria species including the Listeria species of (1) to (10).
　以下、本発明の実施形態に係る細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットを開発ために行った実験、及びこれらの効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。 Hereinafter, an experiment conducted to develop a method for inspecting bacteria, a microarray for inspecting bacteria, a kit for inspecting bacteria, a probe set for inspecting bacteria, and a primer set for inspecting bacteria according to embodiments of the present invention, and these The test conducted to confirm the effect of will be specifically described.
［実験１］
　本実施形態の細菌の検査方法等において対象となる上記の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のゲノム配列は、本願の出願時点のＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）において未報告となっていた。
　このため、まずこれら１０菌種のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域の解析を行った。 [Experiment 1]
The genomic sequence of Listeria belonging to the above (1) to (10), which is a target in the method for testing bacteria of this embodiment, has not been reported in DDBJ (DNA Data Bank of Japan) at the time of filing of the present application. It was.
For this reason, first, IGS (intergenic spacer) regions of these 10 species were analyzed.
　対象菌の菌株としては、ＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen）から入手した以下のものを使用した。
（１）リステリア　フロリデンシス（DSM 26687）
（２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス（DSM 24698）
（３）リステリア　コーネレンシス（DSM 26689）
（４）リステリア　リパリア（DSM 26685）
（５）リステリア　グランデンシス（DSM 26688）
（６）リステリア　ボオリアエ（DSM 28860）
（７）リステリア　ニュヨークネンシス（DSM 28861）
（８）リステリア　アクアティカ（DSM 26686）
（９）リステリア　フレッシュマンニ（DSM 25003）
（１０）リステリア　マルティ（DSM 23813） The following strains obtained from DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) were used as strains of the target bacteria.
(1) Listeria Fluoridensis (DSM 26687)
(2) Listeria Wegen Stephanensis (DSM 24698)
(3) Listeria Cornellensis (DSM 26689)
(4) Listeria Liparia (DSM 26685)
(5) Listeria Grandensis (DSM 26688)
(6) Listeria Booliae (DSM 28860)
(7) Listeria New Yorkensis (DSM 28861)
(8) Listeria Aquatica (DSM 26686)
(9) Listeria Fresh Manni (DSM 25003)
(10) Listeria Maruti (DSM 23813)
　これらのリステリア属菌を菌株毎に個別に培養した。培養は、Ｂｒａｉｎ　ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて、３７℃で、１～２日間静置させて行った。
　次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製）　の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。 These Listeria species were individually cultured for each strain. The culture was performed by using Brain HeartInfusion (manufactured by Difco) at 37 ° C. for 1 to 2 days.
Next, genomic DNA of Listeria was extracted according to the instructions of RBC Genomic DNA Extraction Mini (RBC Bioscience), which is a DNA extraction kit.
　ＰＣＲ用反応液は、一律に、リステリア属菌のＤＮＡのＩＧＳ領域を増幅させるための配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。 The PCR reaction solution is uniformly a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 for amplifying the IGS region of the DNA of Listeria The one containing was used. These primers were synthesized by Sigma-Aldrich Sakai Japan LLC.
　ＰＣＲ用反応液としては、菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．PCR buffer　(QIAGEN社製)　2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製)　0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１）　0.2μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号２)　0.2μl
５．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製)　0.1μl
６．Template　DNA（10ng/μl）　2.0μl
７．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水） As a PCR reaction solution, 20 μl of the following composition was prepared for each strain.
1. PCR buffer (QIAGEN) 2.0 μl
2. dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit) 0.4μl
3. 10 μM forward primer (SEQ ID NO: 1) 0.2 μl
4. 10 μM reverse primer (SEQ ID NO: 2) 0.2 μl
5. HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 μl
6). Template DNA (10ng / μl) 2.0μl
7. Sterile water (water added until the total volume is 20.0μl)
　上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorf社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃　１５分
（b）９４℃　１分
（c）６０℃　１分
（d）７２℃　１分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃　１０分 Using each PCR reaction solution, DNA was amplified under the following conditions using a nucleic acid amplification apparatus (Master cycler ep, Eppendorf).
(A) 95 ° C 15 minutes (b) 94 ° C 1 minute (c) 60 ° C 1 minute (d) 72 ° C 1 minute (35 cycles from (b) to (d))
(E) 72 ° C 10 minutes
　次に、ＰＣＲ法による増幅産物の電気泳動を、電気泳動装置（MupidexU、株式会社ミューピッド）を用いて行った。増幅産物の検出器としては、ゲル撮影装置（SCOPE WD、株式会社オプティマ）を使用した。
　次に、増幅産物の切り出しと精製を行った。このとき、切り出し／ＤＮＡ精製用キットのHiYield Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit（RBC Bioscience社）を使用した。 Next, electrophoresis of amplification products by PCR was performed using an electrophoresis apparatus (MupidexU, Mupid Co., Ltd.). A gel imaging device (SCOPE WD, Optima Co., Ltd.) was used as a detector for amplification products.
Next, the amplification product was excised and purified. At this time, HiYield Gel / PCR DNA Fragments Extraction Kit (RBC Bioscience) for excision / DNA purification was used.
　さらに、精製したＤＮＡをＤＮＡシークエンス反応装置（Big Dye(R) X terminator、Thermo Fisher Scientific社)を用いて、シークエンスした。そして、シークエンス後に精製し、ＤＮＡシークエンサー（3130xl Genetic Analyzer, 3730xl DNA Analyzer、Thermo Fisher Scientific社）により泳動、解析を行った。これらのシークエンス及び泳動、解析は、株式会社ファスマックにより行った。その結果、得られた塩基配列を図２、図３、及び図２３に示す。 Furthermore, the purified DNA was sequenced using a DNA sequence reaction apparatus (Big Dye® X X terminator, Thermo Fisher Scientific). After the sequencing, purification was performed, and electrophoresis and analysis were performed with a DNA sequencer (3130xl Genetic Analyzer, 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). These sequences, migration and analysis were performed by Fasmac Co., Ltd. As a result, the obtained base sequences are shown in FIG. 2, FIG. 3, and FIG.
　図２には、（１）リステリア　フロリデンシス、（２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス、（３）リステリア　コーネレンシス、（４）リステリア　リパリア、（５）リステリア　グランデンシスのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号３～７）が示されている。
　また、図３には、（６）リステリア　ボオリアエ、（７）リステリア　ニュヨークネンシス、（８）リステリア　アクアティカ、（９）リステリア　フレッシュマンニ、（１０）リステリア　マルティのＩＧＳ領域における塩基配列（順に配列番号８～１２）が示されている。
　さらに、図２３には、（１０）リステリア　マルティのＩＧＳ領域における塩基配列（配列番号４６）が示されている。
　これらの塩基配列などにもとづいて、本実施形態の細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの設計を行った。 FIG. 2 shows the nucleotide sequence in the IGS region of (1) Listeria fluoridensis, (2) Listeria wehenstephanensis, (3) Listeria cornelensis, (4) Listeria lipariae, and (5) Listeria grandensis (sequence number 3 in this order). To 7) are shown.
In addition, FIG. 3 shows the nucleotide sequences in the IGS region of (6) Listeria booriae, (7) Listeria nujönensis, (8) Listeria aquatica, (9) Listeria freshmanni, and (10) Listeria malti. 8-12) are shown.
Further, FIG. 23 shows the base sequence (SEQ ID NO: 46) in the IGS region of (10) Listeria multi.
Based on these base sequences and the like, the bacterial test probe set and bacterial test primer set of this embodiment were designed.
［試験１］
　本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの効果を確認するための試験を行った。
　本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、全１７種類のリステリア属菌のＩＧＳ領域を比較して、特異性の高い領域を特定することにより、設計した。本試験では、これらのプローブセットの特異性（包含性）の検証を行った。 [Test 1]
Tests for confirming the effects of the bacteria testing method, bacteria testing microarray, bacteria testing kit, bacteria testing probe set, and bacteria testing primer set of this embodiment were performed.
The probe set for testing bacteria according to the present embodiment was designed by comparing the IGS regions of all 17 Listeria species to identify highly specific regions. In this test, the specificity (inclusion) of these probe sets was verified.
　対象菌の菌株としては、図４、５に示すように、以下のものを使用した。これらは、それぞれ次の機関から入手した。
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures 
DSM:  Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 
GTC:  岐阜大学
RIMD: 大阪大学微生物病研究所 As the strains of the target bacteria, the following were used as shown in FIGS. These were obtained from the following institutions.
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
GTC: Gifu University
RIMD: Institute for Microbial Diseases, Osaka University
・サンプル番号１～６：リステリア　グレイ Listeria grayi　順にATCC 25401、ATCC 700545、ATCC 19120、ATCC 25400、ATCC 25403、ATCC 19120
・サンプル番号７～８：リステリア　イノキュア Listeria innocua 　順にATCC 33090、NCTC 11288
・サンプル番号９～１０：リステリア　イバノビ　順にListeria ivanovii subsp. ivanovii ATCC 19119、Listeria ivanovii subsp. londoniensis ATCC BAA-139
・サンプル番号１１～２２：リステリア　モノサイトゲネス Listeria monocytogenes 　順にATCC 7644、SLR 2249、ATCC 19112、ATCC 19111、ATCC 15313、ATCC 19115、ATCC 13932、NCTC 10890、ATCC BAA-751、ATCC 19114、ATCC 19118、NCTC 11994
・サンプル番号２３：リステリア　ロコゥティエ Listeria rocourtiae 　DSM 22097
・サンプル番号２４～２７：リステリア　シリゲリ Listeria seeligeri 　順にATCC 51334、ATCC 35967、ATCC 51335、ATCC 35967（サンプル番号２５と２７は同一菌株）
・サンプル番号２８～３１：リステリア　ウェルシメリ Listeria welshimeri 　順にATCC 43549、ATCC 49591、DSM 15452、ATCC 35897 Sample numbers 1 to 6: Listeria grayi ATCC 25401, ATCC 700545, ATCC 19120, ATCC 25400, ATCC 25403, ATCC 19120
・ Sample Nos. 7-8: Listeria innocua in order ATCC 33090, NCTC 11288
Sample numbers 9 to 10: Listeria ivanovii subsp. Ivanovii ATCC 19119, Listeria ivanovii subsp. Londoniensis ATCC BAA-139
Sample numbers 11 to 22: Listeria monocytogenes Listed in order of ATCC 7644, SLR 2249, ATCC 19112, ATCC 19111, ATCC 15313, ATCC 19115, ATCC 13932, NCTC 10890, ATCC BAA-751, ATCC 19114, ATCC 19118, NCTC 11994
Sample number 23: Listeria rocourtiae DSM 22097
Sample numbers 24 to 27: Listeria seeligeri in the order of ATCC 51334, ATCC 35967, ATCC 51335, ATCC 35967 ( sample numbers 25 and 27 are the same strain)
・ Sample numbers 28-31: Listeria welshimeri in order of ATCC 43549, ATCC 49591, DSM 15452, ATCC 35897
・サンプル番号３２：リステリア　フロリデンシス Listeria floridensis 　DSM 26687
・サンプル番号３３～３４：リステリア　ウェヘンステップハネンシス Listeria weihenstephanensis 　順にDSM 24698、DSM 24699
・サンプル番号３５：リステリア　コーネレンシス Listeria cornellensis 　DSM 26689
・サンプル番号３６：リステリア　リパリア Listeria riparia 　DSM 26685
・サンプル番号３７：リステリア　グランデンシス Listeria grandensis 　DSM 26688
・サンプル番号３８：リステリア　ボオリアエ Listeria booriae 　DSM 28860
・サンプル番号３９：リステリア　ニュヨークネンシス Listeria newyorkensis 　DSM 28861
・サンプル番号４０：リステリア　アクアティカ Listeria aquatica 　DSM 26686
・サンプル番号４１：リステリア　フレッシュマンニ Listeria fleischmannii subsp. fleischmannii 　DSM 25003
・サンプル番号４２：リステリア　マルティ Listeria marthii 　DSM 23813
・サンプル番号４３：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加） Sample number 32: Listeria floridensis DSM 26687
Sample numbers 33 to 34: Listeria weihenstephanensis DSM 24698, DSM 24699
Sample number 35: Listeria cornellensis DSM 26689
Sample number 36: Listeria riparia DSM 26685
Sample number 37: Listeria grandensis DSM 26688
Sample number 38: Listeria booriae DSM 28860
Sample number 39: Listeria newyorkensis DSM 28861
Sample number 40: Listeria aquatica DSM 26686
Sample number 41: Listeria fleischmannii subsp. Fleischmannii DSM 25003
Sample number 42: Listeria marthii DSM 23813
・ Sample No. 43: Negative control (Add sterilized water instead of Template)
　これらのリステリア属菌を菌株毎に個別に培養した。培養は、Ｂｒａｉｎ　ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて、３７℃で、１～２日間静置させて行った。
　次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製）　の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。 These Listeria species were individually cultured for each strain. The culture was performed by using Brain HeartInfusion (manufactured by Difco) at 37 ° C. for 1 to 2 days.
Next, genomic DNA of Listeria was extracted according to the instructions of RBC Genomic DNA Extraction Mini (RBC Bioscience), which is a DNA extraction kit.
　ＰＣＲ用反応液は、一律に、リステリア属菌のＤＮＡのＩＧＳ領域を増幅させるための配列番号１６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１７に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。
　また、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
　これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。 The PCR reaction solution is uniformly a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 for amplifying the IGS region of the DNA of Listeria The one containing was used.
In addition, an internal control was used to determine whether or not DNA amplification by PCR reaction was properly performed. As an internal control, plasmid DNA was used, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 15 was prepared by a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14. The target DNA consisting of was amplified.
These primers were synthesized by Sigma Aldrich Japan LLC. The target DNA of the plasmid was synthesized by Fasmac Co., Ltd.
　ＰＣＲ用反応液としては、菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．PCR buffer　(QIAGEN社製)　2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製)　0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６）　1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７)　0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３）　0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４)　1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 　1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製)　0.1μl
９．Template　DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液）　2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水） As a PCR reaction solution, 20 μl of the following composition was prepared for each strain.
1. PCR buffer (QIAGEN) 2.0 μl
2. dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit) 0.4μl
3. 10 μM forward primer (SEQ ID NO: 16) 1.0 μl
4. 10 μM reverse primer (SEQ ID NO: 17) 0.1 μl
5. 10 μM IC forward primer (SEQ ID NO: 13) 0.5 μl
6. 1 μM reverse primer for IC (SEQ ID NO: 14) 1.0 μl
7. 100 pg / μl plasmid solution (SEQ ID NO: 15) 1.0 μl
8). HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 μl
9. Template DNA (10ng / PCR reaction solution) 2.0μl
10. Sterile water (water added until the total volume is 20.0μl)
　上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorf社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃　１５分
（b）９４℃　１分
（c）６０℃　１分
（d）７２℃　１分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃　１０分 Using each PCR reaction solution, DNA was amplified under the following conditions using a nucleic acid amplification apparatus (Master cycler ep, Eppendorf).
(A) 95 ° C 15 minutes (b) 94 ° C 1 minute (c) 60 ° C 1 minute (d) 72 ° C 1 minute (35 cycles from (b) to (d))
(E) 72 ° C 10 minutes
　リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、ＤＮＡチップ（東洋製罐グループホールディングス会社製）を用い、図８、９に示す、配列番号１８～４５のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、ＤＮＡスポッターにより行った。 As a microarray for testing Listeria spp., A DNA chip (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.) using a probe with SEQ ID NOS: 18 to 45 shown in FIGS. 8 and 9 was used. Each probe was synthesized by Sigma-Aldrich Sakai Japan LLC. Each probe was immobilized on a substrate using a DNA spotter.
　配列番号１８は、リステリア属を検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号１９は、リステリア　グレイを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２０～２１は、リステリア　イノキュアを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２２～２３は、リステリア　イバノビを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２４～２５は、リステリア　モノサイトゲネスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２６～２８は、リステリア　ロコゥティエを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号２９は、リステリア　シリゲリを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３０～３１は、リステリア　ウェルシメリを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。 SEQ ID NO: 18 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria. SEQ ID NO: 19 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria gray. SEQ ID NOs: 20 to 21 show the base sequences of probes for detecting Listeria innocure. SEQ ID NOs: 22 to 23 show the base sequences of probes for detecting Listeria ivanovi. SEQ ID NOs: 24 to 25 show the base sequences of probes for detecting Listeria monocytogenes. SEQ ID NOs: 26 to 28 show the base sequences of probes for detecting Listeria locotier. SEQ ID NO: 29 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria shirigeri. SEQ ID NOs: 30 to 31 show the base sequences of probes for detecting Listeria well simelii.
　配列番号３２～３３は、リステリア　フロリデンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３４は、リステリア　ウェヘンステップハネンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３５は、リステリア　コーネレンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３６は、リステリア　リパリアを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３７は、リステリア　グランデンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号３８～３９は、リステリア　ボオリアエを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４０～４１は、リステリア　ニュヨークネンシスを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４２は、リステリア　アクアティカを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４３は、リステリア　フレッシュマンニを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４４は、リステリア　マルティを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。配列番号４５は、プラスミドを検出対象とするプローブの塩基配列を示す。 SEQ ID NOs: 32 to 33 show the base sequences of probes for detecting Listeria fluoridensis. SEQ ID NO: 34 is the base sequence of the probe whose detection target is Listeria wegen step hanensis. SEQ ID NO: 35 is the base sequence of the probe whose detection target is Listeria cornellensis. SEQ ID NO: 36 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria liparia. SEQ ID NO: 37 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria grandensis. SEQ ID NOs: 38 to 39 show the base sequences of probes for detection of Listeria boriae. SEQ ID NOs: 40 to 41 show the base sequences of probes for detecting Listeria New Yorkensis. SEQ ID NO: 42 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria aquatica. SEQ ID NO: 43 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria freshmanni. SEQ ID NO: 44 shows the base sequence of a probe whose detection target is Listeria multi. SEQ ID NO: 45 shows the base sequence of a probe whose target is a plasmid.
　ハイブリダイゼーション用の反応液は、以下のように調製した。
　ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
　そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。 A reaction solution for hybridization was prepared as follows.
2 μL of hybridization buffer and 4 μL of amplification product were mixed on the cover of the DNA chip. The buffer composition is 3 × SSC / 0.3% Tween20 and 20 nM Cy5 labeled oligonucleotide.
Then, this cover was put on a DNA chip, and hybridization was performed in a hybridizer (Dako) at 45 ° C./1 hour for hybridization conditions.
　次に、ＤＮＡチップを洗浄液（0.5×SSC/0.2%SDS、0.5×SSC）を用いて、ハイブリダイゼーションをしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
　そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図１０～図１５に示す。これらの図において、検出対象とするリステリア属菌に対応するプローブセットのうちのいずれかについて、Ｓ／Ｎ比値が陽性の場合に、当該リステリア属菌が検出されたと判定した。また、これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。 Next, the PCR product that had not been hybridized was washed away using a washing solution (0.5 × SSC / 0.2% SDS, 0.5 × SSC) for the DNA chip.
Then, using a label detection device (GENOGATE (R) reader, Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd.), the fluorescence intensity of each probe placed on the DNA chip (the fluorescence intensity of the amplification product bound to the probe) is measured. Then, the S / N ratio value ((median fluorescence intensity value−background value) ÷ background value) for each probe was obtained. The results are shown in FIGS. In these figures, when the S / N ratio value was positive for any of the probe sets corresponding to the Listeria species to be detected, it was determined that the Listeria species were detected. In these figures, positive S / N ratio values are indicated by thick frames.
　これらの図に示されるように、配列番号１８に示すプローブは、１７種類の全てのリステリア属菌について、陽性を示している。また、配列番号１９～４３に示すプローブは、それぞれの検出対象であるリステリア属菌を検出できていることがわかる。
　このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、リステリア　マルティを検出するための配列番号４４を除き、優れた特異性（包含性）を示すことが明らかとなった。
　そこで、リステリア　マルティについては、新たに配列番号４７に示すプローブを開発した。そして、このプローブを含めて本実施形態の特異性（包含性）を確認するために、後述する試験４を行った。 As shown in these figures, the probe shown in SEQ ID NO: 18 is positive for all 17 Listeria species. In addition, it can be seen that the probes shown in SEQ ID NOs: 19 to 43 are capable of detecting Listeria spp. That are the respective detection targets.
Thus, it was clarified that the probe set for testing bacteria of this embodiment exhibits excellent specificity (inclusion) except for SEQ ID NO: 44 for detecting Listeria multiplicity.
Therefore, for Listeria multi, a probe shown in SEQ ID NO: 47 was newly developed. And in order to confirm the specificity (inclusion) of this embodiment including this probe, the test 4 mentioned later was done.
［試験２］
　本試験では、これらの本実施形態の細菌の検査用プローブセットの特異性（排他性）の検証を行った。
　対象菌の菌株としては、図１６に示すように、以下のものを使用した。 [Test 2]
In this test, the specificity (exclusiveness) of the probe set for testing bacteria according to this embodiment was verified.
As the strains of the target bacteria, the following were used as shown in FIG.
・サンプル番号４４：黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus GTC DY 0073
・サンプル番号４５：大腸菌 Escherichia coli RIMD 0509516
・サンプル番号４６：赤痢菌 Shigella dysenteriae GTC 00100
・サンプル番号４７：ナグビブリオ Vibrio mimicus RIMD 2218001 Sample number 44: Staphylococcus aureus GTC DY 0073
Sample number 45: Escherichia coli RIMD 0509516
Sample number 46: Shigella dysenteriae GTC 00100
・ Sample number 47: Nagvibrio Vibrio mimicus RIMD 2218001
・サンプル番号４８～５８：サルモネラ　順にSalmonella enterica subsp salamae GTC 1731、Salmonella enterica subsp enterica serovar Arizonae GTC 1732、Salmonella enterica subsp enterica serovar Cerro GTC 2554、Salmonella enterica subsp enterica serovar Landau GTC 2614、Salmonalla enterica subsp enterica serovar Arizonae GTC 3820、Salmonalla enterica subsp enterica serovar Enteritidis GTC 3838、Salmonella enterica subsp enterica serovar Aberdeen GTC 12694、Salmonella enterica subsp enterica serovar Kentucky GTC 12786、Salmonella enterica subsp enterica serovar Essen GTC 12814、Salmonella enterica subsp enterica va Newport GTC 12819、Salmonella enterica subsp enterica serovar Niarembe GTC 12820
・サンプル番号５９：ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加） Sample numbers 48-58: Salmonella enterica subsp salamae GTC 1731, Salmonella enterica subsp enterica serovar Arizonae GTC 1732, Salmonella enterica subsp enterica serovar Cerro GTC 2554, Salmonella enterica subsp enterica serovar Landau GTC 2614, TC 3820, Salmonalla enterica subsp enterica serovar Enteritidis GTC 3838, Salmonella enterica subsp enterica serovar Aberdeen GTC 12694, Salmonella enterica subsp enterica serovar Kentucky GTC 12786, Salmonella enterica subsp enterica serovar Essen GTC 12814, Salmonella entericaS enterica serovar Niarembe GTC 12820
・ Sample No. 59: Negative control (Add sterilized water instead of Template)
　これらの菌を菌株毎に個別に培養した。培養は、Ｂｒａｉｎ　ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製）もしくは１．０％塩化ナトリウム加普通ブイヨン培地（日水製薬製）を用いて、３７℃で、１～２日間静置させて行った。
　次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製）　の説明書に沿って、これらの菌のゲノムＤＮＡを抽出した。 These bacteria were cultured individually for each strain. Cultivation was performed by allowing to stand for 1 to 2 days at 37 ° C. using Brain Heart Infusion (Difco) or 1.0% sodium chloride-added normal broth medium (Nissui Pharmaceutical).
Subsequently, the genomic DNA of these bacteria was extracted according to the instructions of RBC Genomic DNA Extraction Mini (RBC Bioscience), which is a DNA extraction kit.
　ＰＣＲ用反応液は、試験１と同様に、リステリア属菌のＤＮＡのＩＧＳ領域を増幅させるための配列番号１６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１７に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。
　また、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
　これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。 As in Test 1, the PCR reaction solution was composed of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 for amplifying the IGS region of Listeria spp. The one containing the primer set was used.
In addition, an internal control was used to determine whether or not DNA amplification by PCR reaction was properly performed. As an internal control, plasmid DNA was used, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 15 was prepared by a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14. The target DNA consisting of was amplified.
These primers were synthesized by Sigma Aldrich Japan LLC. The target DNA of the plasmid was synthesized by Fasmac Co., Ltd.
　ＰＣＲ用反応液としては、菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．PCR buffer　(QIAGEN社製)　2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製)　0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６）　1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７)　0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３）　0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４)　1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 　1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製)　0.1μl
９．Template　DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液）　2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水） As a PCR reaction solution, 20 μl of the following composition was prepared for each strain.
1. PCR buffer (QIAGEN) 2.0 μl
2. dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit) 0.4μl
3. 10 μM forward primer (SEQ ID NO: 16) 1.0 μl
4. 10 μM reverse primer (SEQ ID NO: 17) 0.1 μl
5. 10 μM IC forward primer (SEQ ID NO: 13) 0.5 μl
6. 1 μM reverse primer for IC (SEQ ID NO: 14) 1.0 μl
7. 100 pg / μl plasmid solution (SEQ ID NO: 15) 1.0 μl
8). HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 μl
9. Template DNA (10ng / PCR reaction solution) 2.0μl
10. Sterile water (water added until the total volume is 20.0μl)
　上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorf社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃　１５分
（b）９４℃　１分
（c）６０℃　１分
（d）７２℃　１分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃　１０分 Using each PCR reaction solution, DNA was amplified under the following conditions using a nucleic acid amplification apparatus (Master cycler ep, Eppendorf).
(A) 95 ° C 15 minutes (b) 94 ° C 1 minute (c) 60 ° C 1 minute (d) 72 ° C 1 minute (35 cycles from (b) to (d))
(E) 72 ° C 10 minutes
　検査用マイクロアレイとしては、試験１と同様に、ＤＮＡチップ（東洋製罐グループホールディングス会社製）を用い、図８、９に示す、配列番号１８～４５のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、ＤＮＡスポッターにより行った。 As the test microarray, a DNA chip (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.) was used as in the test 1, and probes having the sequence numbers 18 to 45 shown in FIGS. 8 and 9 were used. Each probe was synthesized by Sigma-Aldrich Sakai Japan LLC. Each probe was immobilized on a substrate using a DNA spotter.
　ハイブリダイゼーション用の反応液は、試験１と同様に、以下のように調製した。
　ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
　そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。 A reaction solution for hybridization was prepared as follows in the same manner as in Test 1.
2 μL of hybridization buffer and 4 μL of amplification product were mixed on the cover of the DNA chip. The buffer composition is 3 × SSC / 0.3% Tween20 and 20 nM Cy5 labeled oligonucleotide.
Then, this cover was put on a DNA chip, and hybridization was performed in a hybridizer (Dako) at 45 ° C./1 hour for hybridization conditions.
　次に、ＤＮＡチップを洗浄液（0.5×SSC/0.2%SDS、0.5×SSC）を用いて、ハイブリダイゼーションをしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
　そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図１７～図１８に示す。これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。 Next, the PCR product that had not been hybridized was washed away using a washing solution (0.5 × SSC / 0.2% SDS, 0.5 × SSC) for the DNA chip.
Then, using a label detection device (GENOGATE (R) reader, Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd.), the fluorescence intensity of each probe placed on the DNA chip (the fluorescence intensity of the amplification product bound to the probe) is measured. Then, the S / N ratio value ((median fluorescence intensity value−background value) ÷ background value) for each probe was obtained. The results are shown in FIGS. In these figures, positive S / N ratio values are indicated by thick frames.
　これらの図に示されるように、配列番号４５に示すインターナルコントロール用のプローブは、サンプル番号４４～５９に示す全てのサンプルについて、陽性を示している。
　一方、その他のプローブは、サンプル番号４４～５８の全ての細菌について、陰性を示しており、偽陽性は示されていない。
　このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（排他性）を示すことが明らかとなった。 As shown in these figures, the probe for internal control shown in SEQ ID NO: 45 shows positive for all the samples shown in sample numbers 44 to 59.
On the other hand, the other probes show negative for all bacteria of sample numbers 44 to 58, and no false positives are shown.
Thus, it was clarified that the probe set for testing bacteria according to this embodiment exhibits excellent specificity (exclusiveness).
［試験３］
　本試験では、複数のリステリア属菌を混合したサンプルを用いて、本実施形態の細菌の検査用プローブセットによる特異性（同時検出）についての検証を行った。 [Test 3]
In this test, the specificity (simultaneous detection) of the test probe set for bacteria of this embodiment was verified using a sample in which a plurality of Listeria species were mixed.
　対象菌の菌株としては、図１９、２０に示すように、以下のものをサンプル番号ごとに組み合わせて使用した。サンプル番号６０～６５は、インターナルコントロールとしてプラスミドを添加しなかったものであり、サンプル番号６６～７１は、インターナルコントロールを添加したものである。 As strains of the target bacteria, as shown in FIGS. 19 and 20, the following were used in combination for each sample number. Sample numbers 60 to 65 were those to which no plasmid was added as an internal control, and sample numbers 66 to 71 were samples to which an internal control was added.
・リステリア　グレイ　Listeria grayi ATCC 19120
・リステリア　イノキュア　Listeria innocua NCTC 11288
・リステリア　イバノビ　Listeria ivanovii subsp. ivanovii ATCC 19119
・リステリア　モノサイトゲネス　Listeria monocytogenes NCTC 11994
・リステリア　ロコゥティエ　Listeria rocourtiae DSM 22097
・リステリア　シリゲリ　Listeria seeligeri ATCC 35967
・リステリア　ウェルシメリ　Listeria welshimeri ATCC 35897 Listeria grayi ATCC 19120
Listeria innocua NCTC 11288
Listeria ivanovii subsp. Ivanovii ATCC 19119
Listeria monocytogenes NCTC 11994
Listeria rocourtiae DSM 22097
Listeria seeligeri ATCC 35967
Listeria welshimeri ATCC 35897
・リステリア　フロリデンシス　Listeria floridensis DSM 26687
・リステリア　ウェヘンステップハネンシス　Listeria weihenstephanensis DSM 24698
・リステリア　コーネレンシス　Listeria cornellensis DSM 26689
・リステリア　リパリア　Listeria riparia DSM 26685
・リステリア　グランデンシス　Listeria grandensis DSM 26688
・リステリア　ボオリアエ　Listeria booriae DSM 28860
・リステリア　ニュヨークネンシス　Listeria newyorkensis DSM 28861
・リステリア　アクアティカ　Listeria aquatica DSM 26686
・リステリア　フレッシュマンニ　Listeria fleischmannii subsp. fleischmannii DSM 25003
・リステリア　マルティ　Listeria marthii DSM 23813 Listeria floridensis DSM 26687
Listeria weihenstephanensis DSM 24698
Listeria cornellensis DSM 26689
Listeria riparia DSM 26685
Listeria grandensis DSM 26688
Listeria booriae DSM 28860
Listeria newyorkensis DSM 28861
Listeria aquatica DSM 26686
Listeria fleischmannii subsp. Fleischmannii DSM 25003
Listeria marthii DSM 23813
・サンプル番号６０、６１：リステリア　ボオリアエ、リステリア　ニュヨークネンシス、リステリア　フレッシュマンニ
・サンプル番号６２：リステリア　フロリデンシス、リステリア　ウェヘンステップハネンシス、リステリア　コーネレンシス、リステリア　リパリア、リステリア　グランデンシス、リステリア　ボオリアエ、リステリア　ニュヨークネンシス、リステリア　アクアティカ、リステリア　フレッシュマンニ
・サンプル番号６３：サンプル番号６２のものに、リステリア　マルティを加えたもの
・サンプル番号６４：全１７種類のリステリア属菌からリステリア　マルティを除いたもの
・サンプル番号６５：全１７種類のリステリア属菌
・サンプル番号６６～７１は、それぞれサンプル番号６０～６５と同じ菌株を含み、インターナルコントロールを含むものである。 Sample Nos. 60 and 61: Listeria Booliae, Listeria Nuyoensis, Listeria Freshmanni Sample No. 62: Listeria Floridensis, Listeria Wegenstep Hanensis, Listeria Cornellensis, Listeria Liparia, Listeria Grandensis, Listeria Booliae, Listeria Nuyoensis , Listeria Aquatica, Listeria Freshmanni ・ Sample No. 63: Sample No. 62 plus Listeria Marti ・ Sample No. 64: Listeria genus excluding Listeria genus ・ Sample No. 65: All 17 types of Listeria spp. And sample numbers 66-71 contain the same strains as sample numbers 60-65, respectively. It is intended to include a roll.
　これらのリステリア属菌を菌株毎に個別に培養した。培養は、Ｂｒａｉｎ　ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて、３７℃で、１～２日間静置させて行った。
　次いで、ＤＮＡ抽出キットであるＲＢＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｍｉｎｉ（RBC Bioscience社製）　の説明書に沿って、リステリア属菌のゲノムＤＮＡを抽出した。 These Listeria species were individually cultured for each strain. The culture was performed by using Brain HeartInfusion (manufactured by Difco) at 37 ° C. for 1 to 2 days.
Next, genomic DNA of Listeria was extracted according to the instructions of RBC Genomic DNA Extraction Mini (RBC Bioscience), which is a DNA extraction kit.
　ＰＣＲ用反応液は、試験１と同様に、リステリア属菌のＤＮＡのＩＧＳ領域を増幅させるための配列番号１６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１７に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。
　また、サンプル番号６６～７１では、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅が適切に行えたか否かを判定するために、インターナルコントロールを使用した。インターナルコントロールとしては、プラスミドのＤＮＡを使用し、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットにより、配列番号１５に示す塩基配列からなる対象ＤＮＡの増幅を行った。
　これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。また、プラスミドの対象ＤＮＡは、株式会社ファスマックにより合成した。 As in Test 1, the PCR reaction solution was composed of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 for amplifying the IGS region of Listeria spp. The one containing the primer set was used.
In Sample Nos. 66 to 71, an internal control was used to determine whether or not DNA amplification by the PCR reaction was properly performed. As an internal control, plasmid DNA was used, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 15 was prepared by a primer set consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14. The target DNA consisting of was amplified.
These primers were synthesized by Sigma Aldrich Japan LLC. The target DNA of the plasmid was synthesized by Fasmac Co., Ltd.
　ＰＣＲ用反応液としては、サンプル番号毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．PCR buffer　(QIAGEN社製)　2.0μl
２．dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit社製)　0.4μl
３．10μMフォワードプライマー(配列番号１６）　1.0μl
４．10μMリバースプライマー(配列番号１７)　0.1μl
５．10μM ＩＣ用フォワードプライマー(配列番号１３）　0.5μl
６．1μM ＩＣ用リバースプライマー(配列番号１４)　1.0μl
７．100pg/μl プラスミド溶液(配列番号１５) 　1.0μl
８．HotStarTaq DNA Polymerase(Cat No.203203, QIAGEN社製)　0.1μl
９．Template　DNA（10ng/ＰＣＲ用反応液）　2.0μl
１０．滅菌水（全体が20.0μlになるまで加水）
　Template　DNAは、サンプル番号６０、６６では、各菌株10ng/ＰＣＲ用反応液とし、サンプル番号６１～６５、６７～７１では、各菌株1ng/ＰＣＲ用反応液とした。 As a PCR reaction solution, 20 μl of the following composition was prepared for each sample number.
1. PCR buffer (QIAGEN) 2.0 μl
2. dNTP mix (Cat No.BR0600503, biotechrabbit) 0.4μl
3. 10 μM forward primer (SEQ ID NO: 16) 1.0 μl
4. 10 μM reverse primer (SEQ ID NO: 17) 0.1 μl
5. 10 μM IC forward primer (SEQ ID NO: 13) 0.5 μl
6. 1 μM reverse primer for IC (SEQ ID NO: 14) 1.0 μl
7. 100 pg / μl plasmid solution (SEQ ID NO: 15) 1.0 μl
8). HotStarTaq DNA Polymerase (Cat No. 203203, QIAGEN) 0.1 μl
9. Template DNA (10ng / PCR reaction solution) 2.0μl
10. Sterile water (water added until the total volume is 20.0μl)
Template DNA was used as a reaction solution for 10 ng / PCR of each strain in sample numbers 60 and 66, and as a reaction solution for 1 ng / PCR of each strain in sample numbers 61 to 65 and 67 to 71.
　上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（Master cycler ep、Eppendorf社）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃　１５分
（b）９４℃　１分
（c）６０℃　１分
（d）７２℃　１分（（b）～（d）を３５サイクル）
（e）７２℃　１０分 Using each PCR reaction solution, DNA was amplified under the following conditions using a nucleic acid amplification apparatus (Master cycler ep, Eppendorf).
(A) 95 ° C 15 minutes (b) 94 ° C 1 minute (c) 60 ° C 1 minute (d) 72 ° C 1 minute (35 cycles from (b) to (d))
(E) 72 ° C 10 minutes
　リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、試験１と同様に、ＤＮＡチップ（東洋製罐グループホールディングス会社製）を用い、図８、９に示す、配列番号１８～４５のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、ＤＮＡスポッターにより行った。 As a microarray for testing Listeria spp., A DNA chip (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.) and a probe with SEQ ID NOS: 18 to 45 shown in FIGS. did. Each probe was synthesized by Sigma-Aldrich Sakai Japan LLC. Each probe was immobilized on a substrate using a DNA spotter.
　ハイブリダイゼーション用の反応液は、試験１と同様に、以下のように調製した。
　ハイブリダイゼーション用バッファー2μLと増幅産物4μLをＤＮＡチップのカバー上で混合した。バッファー組成は、3×SSC/0.3%Tween20、及び20nM Cy5標識オリゴヌクレオチドである。
　そして、このカバーをＤＮＡチップに被せ、ハイブリダイゼーションの条件を４５℃／１時間として、ハイブリダイザー（Dako社）内でハイブリダイゼーションを行った。 A reaction solution for hybridization was prepared as follows in the same manner as in Test 1.
2 μL of hybridization buffer and 4 μL of amplification product were mixed on the cover of the DNA chip. The buffer composition is 3 × SSC / 0.3% Tween20 and 20 nM Cy5 labeled oligonucleotide.
Then, this cover was put on a DNA chip, and hybridization was performed in a hybridizer (Dako) at 45 ° C./1 hour for hybridization conditions.
　次に、ＤＮＡチップを洗浄液（0.5×SSC/0.2%SDS、0.5×SSC）を用いて、ハイブリダイゼーションをしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
　そして、標識検出装置（GENOGATE(R) reader 、東洋製罐グループエンジリアリング株式会社)を用いて、ＤＮＡチップに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図２１～図２２に示す。これらの図において、検出対象とするリステリア属菌に対応するプローブセットのうちのいずれかについて、Ｓ／Ｎ比値が陽性の場合に、当該リステリア属菌が検出されたと判定した。また、これらの図において、陽性のＳ／Ｎ比値を太枠で示している。 Next, the PCR product that had not been hybridized was washed away using a washing solution (0.5 × SSC / 0.2% SDS, 0.5 × SSC) for the DNA chip.
Then, using a label detection device (GENOGATE (R) reader, Toyo Seikan Group Engineering Co., Ltd.), the fluorescence intensity of each probe placed on the DNA chip (the fluorescence intensity of the amplification product bound to the probe) is measured. Then, the S / N ratio value ((median fluorescence intensity value−background value) ÷ background value) for each probe was obtained. The results are shown in FIGS. In these figures, when the S / N ratio value was positive for any of the probe sets corresponding to the Listeria species to be detected, it was determined that the Listeria species were detected. In these figures, positive S / N ratio values are indicated by thick frames.
　これらの図に示されるように、サンプル番号６０～６２、６４、６６～６８、７０では、全てのリステリア属菌が同時に検出できていることがわかる。
　サンプル番号６３、６５、６９、７１については、リステリア　マルティが同時に検出できなかったが、その他のリステリア属菌は全て同時に検出できており、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、同時検出においても概ね優れた特異性を示すことが明らかとなった。 As shown in these figures, it can be seen that in sample numbers 60 to 62, 64, 66 to 68 and 70, all Listeria species can be detected simultaneously.
For sample numbers 63, 65, 69, and 71, Listeria multi was not detected at the same time, but all other Listeria spp. Were detected at the same time, and the bacterial probe set of this embodiment was Were also found to show excellent specificity.
［試験４］
　リステリア　マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの特異性（包含性）を確認するための試験を試験１と同様にして行った。 [Test 4]
Including a new probe shown in SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi, a method for testing bacteria according to the present embodiment, a microarray for testing bacteria, a kit for testing bacteria, a probe set for testing bacteria, and A test for confirming the specificity (inclusion) of the test primer set was conducted in the same manner as in Test 1.
　すなわち、対象菌の菌株として試験１と同じものを使用して、試験１におけるサンプル番号１～４３と同じサンプルをそれぞれサンプル番号１ａ～４３ａとして準備して、試験１と同様に培養した。
　そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験１と同様にして、ＰＣＲを行った。 That is, using the same strain as the test 1 as the target strain, the same samples as the sample numbers 1 to 43 in the test 1 were prepared as the sample numbers 1a to 43a, respectively, and cultured in the same manner as the test 1.
Then, PCR was performed in the same manner as in Test 1 using the genomic DNA extracted from the Listeria spp.
　リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、試験１のプローブに加えて、リステリア　マルティを検出対象とする配列番号４７のプローブを配置したＤＮＡチップを使用した。
　そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図２４～図２９に示す。 As a microarray for testing Listeria spp., A DNA chip in which the probe of SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi was detected in addition to the probe of Test 1 was used.
Then, hybridization was performed and the fluorescence intensity in each probe was measured. The results are shown in FIGS.
　これらの図に示されるように、配列番号１８に示すプローブは、１７種類の全てのリステリア属菌について、陽性を示している。また、配列番号１９～４３、４７に示すプローブは、それぞれの検出対象であるリステリア属菌を検出できていることがわかる。
　このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（包含性）を示すことが明らかとなった。 As shown in these figures, the probe shown in SEQ ID NO: 18 is positive for all 17 Listeria species. In addition, it can be seen that the probes shown in SEQ ID NOs: 19 to 43 and 47 are capable of detecting Listeria spp. That are the detection targets.
Thus, it was clarified that the probe set for testing bacteria according to the present embodiment exhibits excellent specificity (inclusion).
［試験５］
　リステリア　マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットの特異性（排他性）を検証するための試験を試験２と同様にして行った。 [Test 5]
Including the probe shown in SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi, the method for testing bacteria of this embodiment, the microarray for testing bacteria, the kit for testing bacteria, the probe set for testing bacteria, and the A test for verifying the specificity (exclusiveness) of the test primer set was conducted in the same manner as in Test 2.
　すなわち、対象菌の菌株として試験２と同じものを使用して、試験２におけるサンプル番号４４～５９と同じサンプルをそれぞれサンプル番号４４ａ～５９ａとして準備して、試験２と同様に培養した。
　そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験２と同様にして、ＰＣＲを行った。 That is, using the same strain as the test strain 2 as the test strain 2, the same samples as the sample numbers 44 to 59 in the test 2 were prepared as the sample numbers 44a to 59a, respectively, and cultured in the same manner as the test 2.
Then, PCR was performed in the same manner as in Test 2 using the genomic DNA extracted from Listeria spp.
　リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、試験２のプローブに加えて、リステリア　マルティを検出対象とする配列番号４７のプローブを配置したＤＮＡチップを使用した。
　そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図３０～図３１に示す。 As a microarray for testing Listeria spp., A DNA chip in which the probe of SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi was detected in addition to the probe of Test 2 was used.
Then, hybridization was performed and the fluorescence intensity in each probe was measured. The results are shown in FIGS.
　これらの図に示されるように、配列番号４５に示すインターナルコントロール用のプローブは、サンプル番号４４ａ～５９ａに示す全てのサンプルについて、陽性を示している。
　一方、その他のプローブは、サンプル番号４４ａ～５８ａの全ての細菌について、陰性を示しており、偽陽性は示されていない。
　このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットは、優れた特異性（排他性）を示すことが明らかとなった。 As shown in these figures, the probe for internal control shown in SEQ ID NO: 45 is positive for all the samples shown in sample numbers 44a to 59a.
On the other hand, the other probes are negative for all the bacteria of sample numbers 44a to 58a and no false positives are shown.
Thus, it was clarified that the probe set for testing bacteria according to this embodiment exhibits excellent specificity (exclusiveness).
［試験６］
　リステリア　マルティを検出するための新たな配列番号４７に示すプローブを含めて、本実施形態の細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセットによる特異性（同時検出）を検証するための試験を試験３と同様にして行った。 [Test 6]
Including a new probe shown in SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi, a method for testing bacteria according to the present embodiment, a microarray for testing bacteria, a kit for testing bacteria, a probe set for testing bacteria, and A test for verifying the specificity (simultaneous detection) by the test primer set was conducted in the same manner as in Test 3.
　すなわち、対象菌の菌株として試験３と同じものを使用して、試験３におけるサンプル番号６３、６５、６９、７１と同じサンプルをそれぞれサンプル番号６３ａ、６５ａ、６９ａ、７１ａとして準備して、試験３と同様に培養した。また、ネガティブコントロール（Templateの代わりに、滅菌水を添加）として、サンプル番号７２ａ、７３ａを準備した。サンプル番号７２ａは、インターナルコントロールとしてプラスミドを添加しなかったものであり、サンプル番号７３ａは、インターナルコントロールを添加したものである。
　そして、得られたリステリア属菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、試験３と同様にして、ＰＣＲを行った。 That is, using the same strain as the test strain 3 as the test strain 3, the same samples as the sample numbers 63, 65, 69, and 71 in the test 3 are prepared as the sample numbers 63a, 65a, 69a, and 71a, respectively. And cultured in the same manner. Sample numbers 72a and 73a were prepared as negative controls (sterilized water was added instead of Template). Sample number 72a is a sample to which no plasmid was added as an internal control, and sample number 73a was a sample to which an internal control was added.
Then, PCR was performed in the same manner as in Test 3 using genomic DNA extracted from the Listeria spp.
　リステリア属菌の検査用マイクロアレイとしては、試験３のプローブに加えて、リステリア　マルティを検出対象とする配列番号４７のプローブを配置したＤＮＡチップを使用した。
　そして、ハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図３２～図３３に示す。 As a microarray for testing Listeria spp., A DNA chip in which the probe of SEQ ID NO: 47 for detecting Listeria multi was detected in addition to the probe of Test 3 was used.
Then, hybridization was performed and the fluorescence intensity in each probe was measured. The results are shown in FIGS.
　これらの図に示されるように、サンプル番号６３ａ、６５ａ、６９ａ、７１ａでは、リステリア　マルティを検出するための配列番号４４を除いて、全てのリステリア属菌が同時に検出できていることがわかる。そして、リステリア　マルティについては、配列番号４７のプローブにより、同時に検出できていることがわかる。
　このように、本実施形態の細菌の検査用プローブセットによれば、同時検出においても優れた特異性を示すことが明らかとなった。 As shown in these figures, it can be seen that in sample numbers 63a, 65a, 69a, 71a, all Listeria species can be detected simultaneously except for SEQ ID NO: 44 for detecting Listeria multi. It can be seen that the Listeria multi can be detected simultaneously by the probe of SEQ ID NO: 47.
As described above, according to the probe set for testing bacteria of this embodiment, it has been clarified that excellent specificity is exhibited even in simultaneous detection.
　本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、本実施形態の細菌の検査用マイクロアレイに配置するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ配置しても良い。また、本実施形態の検出対象であるリステリア属菌以外の細菌等を検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共にマイクロアレイに配置されていても良く、適宜変更することが可能である。 The present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and it goes without saying that various modifications can be made within the scope of the present invention.
For example, the probes arranged in the microarray for testing bacteria of this embodiment are not limited to one spot per type, and a plurality of each probe may be arranged. Further, other probes for detecting bacteria other than Listeria belonging to the detection target of the present embodiment may be arranged in the microarray together with the probes in the present embodiment, and can be changed as appropriate. .
　本発明は、環境検査、食品検査等において、リステリア属菌を特異的かつ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。 The present invention can be suitably used for specific and multiplex detection of Listeria spp. In environmental inspections, food inspections, and the like.
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。 All the contents of the documents described in this specification and the specification of the Japanese application that is the basis of Paris priority of this application are incorporated herein.

Claims (11)

  1. 　試料中における細菌の存在を検査する方法であって、対象となる細菌は、以下の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌から選ばれ、
    （１）リステリア　フロリデンシス（Listeria floridensis）、
    （２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、
    （３）リステリア　コーネレンシス（Listeria cornellensis）、
    （４）リステリア　リパリア（Listeria riparia）、
    （５）リステリア　グランデンシス（Listeria grandensis）、
    （６）リステリア　ボオリアエ（Listeria booriae）、
    （７）リステリア　ニュヨークネンシス　（Listeria newyorkensis）、
    （８）リステリア　アクアティカ（Listeria aquatica）、
    （９）リステリア　フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、
    （１０）リステリア　マルティ（Listeria marthii）、
    　前記方法は、
    （ａ）ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域の増幅用プライマーセットを含む反応液を調製する調製工程、及び、
    （ｂ）前記調製工程により得られた反応液を使用して、前記試料に含まれる前記対象となる細菌の核酸を増幅する増幅工程、を含む
    　ことを特徴とする細菌の検査方法。     A method for examining the presence of bacteria in a sample, wherein the target bacteria is selected from the Listeria species described in (1) to (10) below:
    (1) Listeria floridensis,
    (2) Listeria weihenstephanensis,
    (3) Listeria cornellensis,
    (4) Listeria riparia,
    (5) Listeria grandensis,
    (6) Listeria booriae,
    (7) Listeria newyorkensis,
    (8) Listeria aquatica,
    (9) Listeria fleischmannii,
    (10) Listeria marthii,
    The method
    (A) a preparation step of preparing a reaction solution containing a primer set for amplification of an IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene; and
    (B) An amplification step of amplifying the nucleic acid of the target bacteria contained in the sample using the reaction solution obtained in the preparation step.
  2. 　前記対象となる細菌には、さらに以下の（１１）～（１７）に記載のリステリア属菌から選ばれる細菌が含まれることを特徴とする請求項１記載の細菌の検査方法。
    （１１）リステリア　グレイ（Listeria grayi）
    （１２）リステリア　イノキュア（Listeria innocua）
    （１３）リステリア　イバノビ（Listeria ivanovii）
    （１４）リステリア　モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
    （１５）リステリア　ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
    （１６）リステリア　シリゲリ（Listeria seeligeri）
    （１７）リステリア　ウェルシメリ（Listeria welshimeri）     2. The method for inspecting bacteria according to claim 1, wherein the target bacteria further include bacteria selected from Listeria belonging to the following (11) to (17).
    (11) Listeria grayi
    (12) Listeria innocua
    (13) Listeria ivanovii
    (14) Listeria monocytogenes
    (15) Listeria rocourtiae
    (16) Listeria seeligeri
    (17) Listeria welshimeri
  3. 　前記反応液に含まれる前記プライマーセットは、配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなることを特徴とする請求項１又は２記載の細菌の検査方法。 The method for examining bacteria according to claim 1 or 2, wherein the primer set contained in the reaction solution comprises primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17.
  4. 　ｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号１８～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかと、前記増幅工程により増幅された核酸とのハイブリダイゼーションにより、前記対象となる細菌の存在を検査することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の細菌の検査方法。 The target bacteria by hybridization of at least one of the probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 43 and 47 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene and the nucleic acid amplified in the amplification step The method for inspecting bacteria according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the presence of bacterium is inspected.
  5. 　試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用マイクロアレイであって、以下の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化された
    　ことを特徴とする細菌の検査用マイクロアレイ。
    （１）リステリア　フロリデンシス（Listeria floridensis）
    （２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）
    （３）リステリア　コーネレンシス（Listeria cornellensis）
    （４）リステリア　リパリア（Listeria riparia）
    （５）リステリア　グランデンシス（Listeria grandensis）
    （６）リステリア　ボオリアエ（Listeria booriae）
    （７）リステリア　ニュヨークネンシス　（Listeria newyorkensis）
    （８）リステリア　アクアティカ（Listeria aquatica）
    （９）リステリア　フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）
    （１０）リステリア　マルティ（Listeria marthii）     A microarray for testing bacteria for examining the presence of bacteria in a sample, which is selected from the IGS (intergenic spacer) region of the Listeria spp. RRNA gene described in (1) to (10) below: SEQ ID NO: 32 A microarray for testing bacteria, wherein at least one of the probes having the base sequences shown in (43) to (47) is immobilized.
    (1) Listeria floridensis
    (2) Listeria weihenstephanensis
    (3) Listeria cornellensis
    (4) Listeria riparia
    (5) Listeria grandensis
    (6) Listeria booriae
    (7) Listeria newyorkensis
    (8) Listeria aquatica
    (9) Listeria fleischmannii
    (10) Listeria marthii
  6. 　さらに以下の（１１）～（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号１８～３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたことを特徴とする請求項５記載の細菌の検査用マイクロアレイ。
    （１１）リステリア　グレイ（Listeria grayi）
    （１２）リステリア　イノキュア（Listeria innocua）
    （１３）リステリア　イバノビ（Listeria ivanovii）
    （１４）リステリア　モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
    （１５）リステリア　ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
    （１６）リステリア　シリゲリ（Listeria seeligeri）
    （１７）リステリア　ウェルシメリ（Listeria welshimeri）     Furthermore, at least one of the probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the Listeria spp. RRNA gene described in (11) to (17) below was immobilized. The microarray for testing bacteria according to claim 5.
    (11) Listeria grayi
    (12) Listeria innocua
    (13) Listeria ivanovii
    (14) Listeria monocytogenes
    (15) Listeria rocourtiae
    (16) Listeria seeligeri
    (17) Listeria welshimeri
  7. 　試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用キットであって、以下の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化されたマイクロアレイと、
    前記プローブとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなるプライマーセットと、を含む
    　ことを特徴とする細菌の検査用キット。
    （１）リステリア　フロリデンシス（Listeria floridensis）
    （２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）
    （３）リステリア　コーネレンシス（Listeria cornellensis）
    （４）リステリア　リパリア（Listeria riparia）
    （５）リステリア　グランデンシス（Listeria grandensis）
    （６）リステリア　ボオリアエ（Listeria booriae）
    （７）リステリア　ニュヨークネンシス　（Listeria newyorkensis）
    （８）リステリア　アクアティカ（Listeria aquatica）
    （９）リステリア　フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）
    （１０）リステリア　マルティ（Listeria marthii）     A bacterial test kit for testing the presence of bacteria in a sample, which is selected from the IGS (intergenic spacer) region of the Listeria sp. RRNA gene described in (1) to (10) below: SEQ ID NO: 32 A microarray on which at least one of the probes having the nucleotide sequences shown in (43) to (47) is immobilized;
    A bacterial test kit, comprising: a primer set comprising primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 for amplifying nucleic acids that hybridize with the probe.
    (1) Listeria floridensis
    (2) Listeria weihenstephanensis
    (3) Listeria cornellensis
    (4) Listeria riparia
    (5) Listeria grandensis
    (6) Listeria booriae
    (7) Listeria newyorkensis
    (8) Listeria aquatica
    (9) Listeria fleischmannii
    (10) Listeria marthii
  8. 　さらに以下の（１１）～（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号１８～３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかが固定化された前記マイクロアレイを含むことを特徴とする請求項７記載の細菌の検査用キット。
    （１１）リステリア　グレイ（Listeria grayi）
    （１２）リステリア　イノキュア（Listeria innocua）
    （１３）リステリア　イバノビ（Listeria ivanovii）
    （１４）リステリア　モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
    （１５）リステリア　ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
    （１６）リステリア　シリゲリ（Listeria seeligeri）
    （１７）リステリア　ウェルシメリ（Listeria welshimeri）     Furthermore, at least one of the probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the Listeria spp. RRNA gene described in (11) to (17) below was immobilized. The kit for testing bacteria according to claim 7, comprising the microarray.
    (11) Listeria grayi
    (12) Listeria innocua
    (13) Listeria ivanovii
    (14) Listeria monocytogenes
    (15) Listeria rocourtiae
    (16) Listeria seeligeri
    (17) Listeria welshimeri
  9. 　試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用プローブセットであって、以下の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかからなる
    　ことを特徴とする細菌の検査用プローブセット。
    （１）リステリア　フロリデンシス（Listeria floridensis）
    （２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）
    （３）リステリア　コーネレンシス（Listeria cornellensis）
    （４）リステリア　リパリア（Listeria riparia）
    （５）リステリア　グランデンシス（Listeria grandensis）
    （６）リステリア　ボオリアエ（Listeria booriae）
    （７）リステリア　ニュヨークネンシス　（Listeria newyorkensis）
    （８）リステリア　アクアティカ（Listeria aquatica）
    （９）リステリア　フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）
    （１０）リステリア　マルティ（Listeria marthii）     A probe set for testing bacteria for examining the presence of bacteria in a sample, which is selected from the IGS (intergenic spacer) region of the Listeria spp. RRNA gene described in (1) to (10) below: A probe set for testing bacteria, which comprises at least one of probes having the base sequences shown in 32-43 and 47.
    (1) Listeria floridensis
    (2) Listeria weihenstephanensis
    (3) Listeria cornellensis
    (4) Listeria riparia
    (5) Listeria grandensis
    (6) Listeria booriae
    (7) Listeria newyorkensis
    (8) Listeria aquatica
    (9) Listeria fleischmannii
    (10) Listeria marthii
  10. 　さらに以下の（１１）～（１７）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号１８～３１に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかを含むことを特徴とする請求項９記載の細菌の検査用プローブセット。
    （１１）リステリア　グレイ（Listeria grayi）
    （１２）リステリア　イノキュア（Listeria innocua）
    （１３）リステリア　イバノビ（Listeria ivanovii）
    （１４）リステリア　モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
    （１５）リステリア　ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）
    （１６）リステリア　シリゲリ（Listeria seeligeri）
    （１７）リステリア　ウェルシメリ（Listeria welshimeri）     It further comprises at least one of probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 31 selected from the IGS (intergenic spacer) region of the Listeria spp. RRNA gene described in (11) to (17) below. A probe set for testing bacteria according to claim 9.
    (11) Listeria grayi
    (12) Listeria innocua
    (13) Listeria ivanovii
    (14) Listeria monocytogenes
    (15) Listeria rocourtiae
    (16) Listeria seeligeri
    (17) Listeria welshimeri
  11. 　試料中における細菌の存在を検査する細菌の検査用プライマーセットであって、以下の（１）～（１０）に記載のリステリア属菌のｒＲＮＡ遺伝子のＩＧＳ（intergenic　spacer）領域から選択された配列番号３２～４３、４７に示す塩基配列のプローブの少なくともいずれかとハイブリダイゼーションをする核酸を増幅するための配列番号１６、１７に示す塩基配列のプライマーからなる
    　ことを特徴とする細菌の検査用プライマーセット。
    （１）リステリア　フロリデンシス（Listeria floridensis）
    （２）リステリア　ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）
    （３）リステリア　コーネレンシス（Listeria cornellensis）
    （４）リステリア　リパリア（Listeria riparia）
    （５）リステリア　グランデンシス（Listeria grandensis）
    （６）リステリア　ボオリアエ（Listeria booriae）
    （７）リステリア　ニュヨークネンシス　（Listeria newyorkensis）
    （８）リステリア　アクアティカ（Listeria aquatica）
    （９）リステリア　フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）
    （１０）リステリア　マルティ（Listeria marthii）
          A primer set for testing bacteria for examining the presence of bacteria in a sample, which is selected from the IGS (intergenic spacer) region of the rRNA gene of Listeria belonging to the following (1) to (10) A primer set for testing bacteria comprising the primers of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 for amplifying a nucleic acid that hybridizes with at least one of the probes of the base sequences shown in 32-43 and 47.
    (1) Listeria floridensis
    (2) Listeria weihenstephanensis
    (3) Listeria cornellensis
    (4) Listeria riparia
    (5) Listeria grandensis
    (6) Listeria booriae
    (7) Listeria newyorkensis
    (8) Listeria aquatica
    (9) Listeria fleischmannii
    (10) Listeria marthii
PCT/JP2019/019446 2018-05-18 2019-05-16 Method for examining bacterium, microarray for examining bacterium, kit for examining bacterium, probe set for examining bacterium, and primer set for examining bacterium WO2019221219A1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-096638 2018-05-18
JP2018096638 2018-05-18
JP2018190417A JP2019201626A (en) 2018-05-18 2018-10-05 Method for examining bacterium, micro array for examining bacterium, kit for examining bacterium, probe set for examining bacterium, and primer set for examining bacterium
JP2018-190417 2018-10-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019221219A1 true WO2019221219A1 (en) 2019-11-21

Family

ID=68539747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/019446 WO2019221219A1 (en) 2018-05-18 2019-05-16 Method for examining bacterium, microarray for examining bacterium, kit for examining bacterium, probe set for examining bacterium, and primer set for examining bacterium

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2019221219A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961926A (en) * 2021-03-18 2021-06-15 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) Primer, kit and method for simultaneously detecting Listeria monocytogenes CC87 and 88 strains

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAHAM, TA. ET AL.: "Inter-and Intraspecies Comparison of the 16S-23S rRNA Operon Intergenic Spacer Regions of Six Listeria spp.", INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 47, no. 3, 1997, pages 863 - 869, XP055654389 *
LIN, MC . ET AL.: "Use of oligonucleotide array for identification of six foodborne pathogens and Pseudomonas aeruginosa grown on selective media", J FOOD PROT, vol. 68, no. 11, 2005, pages 2278 - 86, XP009103178 *
O'CONNOR L. ET AL.: "Rapid polymerase chain reaction/DNA probe membrane-based assay for the detection of Listeria and Listeria monocytogenes in food", J FOOD PROT, vol. 63, no. 3, 2000, pages 337 - 42, XP009009531 *
ORSI, RH. ET AL.: "Characteristics and distribution of Listeria spp., including Listeria species newly described since 2009", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 100, no. 12, 2016, pages 5273 - 87, XP035870496 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961926A (en) * 2021-03-18 2021-06-15 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) Primer, kit and method for simultaneously detecting Listeria monocytogenes CC87 and 88 strains
CN112961926B (en) * 2021-03-18 2024-01-09 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) Primer, kit and method for simultaneously detecting listeria monocytogenes CC87 and listeria monocytogenes type 88 strains

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3097059B2 (en) Generation of specific probes for target nucleotide sequences
Kim et al. Microarray detection of food-borne pathogens using specific probes prepared by comparative genomics
JP2013520186A (en) Assays and kits for serotyping of Pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits
Kim et al. Detection of representative enteropathogenic bacteria, Vibrio spp., pathogenic Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., and Yersinia enterocolitica, using a virulence factor gene-based oligonucleotide microarray
Hu et al. Simultaneous analysis of foodborne pathogenic bacteria by an oligonucleotide microarray assay
Debruyne et al. Comparative performance of different PCR assays for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli
WO2019221219A1 (en) Method for examining bacterium, microarray for examining bacterium, kit for examining bacterium, probe set for examining bacterium, and primer set for examining bacterium
US20100167956A1 (en) Dna chip for detection of escherichia coli
Chiang et al. Development of PCR primers and a DNA macroarray for the simultaneous detection of major Staphylococcus species using groESL gene
JP2017136019A (en) Carrier for pathogenic escherichia coli detection, kit for pathogenic escherichia coli detection, and detection method of enteropathogenic escherichia coli
JP5048622B2 (en) PCR primers for detection of lactic acid bacteria
EP4130272A1 (en) Primer set and probe for detecting klebsiella bacteria
US20170081709A1 (en) Method for detecting escherichia coli and carrier for detecting escherichia coli
Saint et al. A PCR test for the identification and discrimination of Legionella longbeachae serogroups 1 and 2
KR102407237B1 (en) Real-time PCR kit for specific detection of Campylobacter
KR101299627B1 (en) Primers for simultaneous detection of foodborne bacteria and use thereof
JP6648559B2 (en) Bacteria test method, primer set, bacteria test carrier, and bacteria test kit
JP2019201626A (en) Method for examining bacterium, micro array for examining bacterium, kit for examining bacterium, probe set for examining bacterium, and primer set for examining bacterium
AU776138B2 (en) Detection of mycobacterium avium subspecies
JP2021036802A (en) Primer sets, pcr products, microarrays, kits and methods for determining serotypes of salmonella bacteria
WO2016129249A1 (en) Method for detecting lactic acid bacteria, lactic acid bacteria detection kit, and lactic acid bacteria detection instrument
US20100167951A1 (en) Dna chip for detection of staphylococcus aureus
EP2723891B1 (en) Diagnostic methods for detecting clostridium difficile
JP6672760B2 (en) Carrier for detecting pathogenic E. coli, kit for detecting pathogenic E. coli, and method for detecting pathogenic E. coli
KR20230095302A (en) Multiplex real-time polymerase chain reaction assay for differential identification of avian Chlamydia

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19803296

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19803296

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1