JP7252606B2 - Lactic acid bacteria detection primer set and detection method using the primer set - Google Patents
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Description
本発明は、特定の乳酸菌の検出方法に関する。詳しくは、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１株（ＮＩＴＥ Ｐ－９２）の検出用プライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting specific lactic acid bacteria. Specifically, it relates to a detection primer set for Lactococcus lactis subsp. cremoris strain H61 (NITE P-92) and a detection method using the primer set.
乳酸菌は、様々な作用を有することが昔から知られており、近年はプロバイオティクスとして消化管内の細菌叢の改善による整腸効果、免疫力向上効果、抗腫瘍効果などの種々の健康保持効果を有することから、人類にとって健康に深く関わる有用な微生物資源として利用されている。
乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１株（ＮＩＴＥ Ｐ－９２）（以下、「乳酸菌Ｈ６１株」という。）は、老化実験用のマウスを用いた試験から、骨密度の減少や潰瘍発生などの老化抑制効果を有することが報告（特許文献１）されている。また、乳酸菌Ｈ６１株の加熱処理菌体を摂取することにより、５０～６０歳代の肌への保湿効果を向上することも報告（非特許文献１）されている。さらに、乳酸菌Ｈ６１株またはその抽出物は、メラニン産生抑制効果、育毛・発毛効果と脱毛抑制効果を有することも報告（特許文献２）されている。このように、乳酸菌Ｈ６１株は、様々な健康効果を有する機能性乳酸菌である。
Lactic acid bacteria have been known to have various effects for a long time, and in recent years, various health maintenance effects such as intestinal regulation effect by improving the bacterial flora in the gastrointestinal tract, immunity improvement effect, anti-tumor effect as a probiotic , it is used as a useful microbial resource deeply related to human health.
The lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris H61 strain (NITE P-92) (hereinafter referred to as "lactic acid bacterium H61 strain") has been shown to improve bone density from tests using mice for aging experiments. It has been reported that it has anti-aging effects such as reduction and ulcer development (Patent Document 1). It has also been reported that ingestion of heat-treated cells of lactic acid bacterium H61 strain improves the moisturizing effect on the skin of people in their 50s and 60s (Non-Patent Document 1). Furthermore, it is also reported that the lactic acid bacterium H61 strain or its extract has a melanin production inhibitory effect, a hair growth/hair growth effect, and a hair loss inhibitory effect (Patent Document 2). Thus, the lactic acid bacterium strain H61 is a functional lactic acid bacterium with various health effects.
乳酸菌Ｈ６１株を含む発酵乳やチーズ等の食品、サプリメント、ペットフードなどにおいて、機能性乳酸菌として乳酸菌Ｈ６１株の菌数を確保することが重要である。また、ヒトやマウスなどの実験動物の腸内において、摂取した乳酸菌Ｈ６１株を正確に識別し、菌数を把握することも、乳酸菌Ｈ６１株の有効性を評価するうえで重要である。上述の乳酸菌Ｈ６１株が発揮する効果は、菌株特異的なものであるから、腸内細菌と乳酸菌Ｈ６１株とを区別して検出することが求められている。さらに、乳酸菌Ｈ６１株は加熱処理菌体（死菌）でも効果があることが知られており、加熱処理した乳酸菌Ｈ６１株含有の有無を検出することも求められている。 In foods such as fermented milk and cheese containing lactic acid bacterium H61 strain, supplements, pet foods, etc., it is important to ensure the number of lactic acid bacterium H61 strains as functional lactic acid bacteria. In addition, it is important to accurately identify the ingested lactic acid bacterium H61 strain in the intestines of laboratory animals such as humans and mice, and to grasp the number of bacteria in order to evaluate the effectiveness of the lactic acid bacterium H61 strain. Since the effect exhibited by the above-mentioned lactic acid bacterium H61 strain is strain-specific, it is required to distinguish between intestinal bacteria and lactic acid bacterium H61 strain for detection. Furthermore, it is known that the lactic acid bacterium H61 strain is effective even in heat-treated cells (killed bacteria), and it is also required to detect the presence or absence of heat-treated lactic acid bacterium H61 strain.
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって特定の微生物を検出する方法が報告されており、例えば、ハウスキーピング遺伝子の塩基配列の違いを利用したプライマーを用いて、種特異的なＰＣＲ産物を検出することで菌種の同定を行うことができるが、同属同種の異株間の識別は困難である。菌株の識別方法として、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）法（非特許文献２）や、１０塩基程度のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法を行い、ランダムに増幅されたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを比較するＲａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法（非特許文献３）などが報告されている。
しかしながら、ＲＦＬＰ法やＲＡＰＤ法は何れも定量性がなく、ＲＦＬＰ法は高精度であるものの工程が複雑で時間がかかること、ＲＡＰＤ法は迅速な検出が可能であるものの、使用する機器により結果が異なり再現性に問題があった。また、生菌であれば純粋培養により菌体を増やし、遺伝子レベルの解析を行うことは容易であるが、死菌の場合、質の高いＤＮＡを調製することは困難という問題もあった。
In recent years, a method for detecting specific microorganisms by the polymerase chain reaction (PCR) method has been reported. For example, using primers that utilize differences in the nucleotide sequences of housekeeping genes, species-specific PCR products are detected. However, it is difficult to distinguish different strains of the same genus and species. As a strain identification method, a Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) method (Non-Patent Document 2) or a PCR method is performed using an oligonucleotide of about 10 bases, and electrophoresis patterns of randomly amplified PCR products are compared. A Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) method (Non-Patent Document 3) and the like have been reported.
However, neither the RFLP method nor the RAPD method has quantitative properties. Although the RFLP method is highly accurate, the process is complicated and takes time. There was a problem with reproducibility. In addition, although it is easy to increase the number of viable cells by pure culture and analyze them at the gene level, it is difficult to prepare high-quality DNA from dead cells.
本発明は、乳酸菌Ｈ６１株を特異的に迅速かつ簡便に識別できるプライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法を提供することを課題としている。 An object of the present invention is to provide a primer set and a detection method using the primer set that can specifically, rapidly and easily identify the H61 strain of lactic acid bacteria.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌Ｈ６１株に特異的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む検出用プライマーセットを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor found a detection primer set containing an oligonucleotide having a base sequence specific to lactic acid bacterium H61 strain, and completed the present invention.
本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
１．配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ Ｐ－９２）株検出用プライマーセット。
２．１．記載のプライマーセットを含むことを特徴とする、Ｈ６１株検出用キット。
３．以下の工程を含む、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ Ｐ－９２）株の検出方法。
（１）１．記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程
（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程
４．配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ Ｐ－９２）株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号４の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
５．配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなる、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（ＮＩＴＥ Ｐ－９２）株検出用プライマーセットで増幅されることを特徴とする、配列番号５で表されるポリヌクレオチド。
Specifically, the gist of the present invention is as follows.
1. Lactococcus lactis subsp. cremoris H61 (NITE P-92 ) strain detection primer set.
2.1. A kit for detecting strain H61, comprising the primer set described.
3. A method for detecting the lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris H61 (NITE P-92) strain, comprising the following steps.
(1) 1. step (2) of amplifying the nucleic acid fragment using the described primer set; step (2) of detecting the nucleic acid fragment obtained in step (1); Lactococcus lactis subsp. cremoris H61 (NITE P-92) strain consisting of a pair of an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 4, which is amplified with a detection primer set.
5. Lactococcus lactis subsp. cremoris H61 (NITE P-92) strain consisting of a pair of an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 A polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5, which is amplified with a detection primer set.
本発明により、乳酸菌Ｈ６１株を簡便かつ迅速に、かつ、同亜種の乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス菌と交差反応を示すことなく、検出することが可能となり、非常に有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, lactic acid bacterium strain H61 can be easily and rapidly detected without cross-reactivity with the same subspecies lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris, which is very useful.
本発明のプライマーセットは、乳酸菌Ｈ６１株に特異的な塩基配列を有する染色体ＤＮＡ領域をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅することができ、乳酸菌Ｈ６１株に近縁の菌株を認識することなく、乳酸菌Ｈ６１株を特異的に認識し、乳酸菌Ｈ６１株を特異的に検出することが可能である。
なお、本発明における乳酸菌Ｈ６１株とは、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｈ６１（寄託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－９２）株を意味する。
The primer set of the present invention can amplify a chromosomal DNA region having a nucleotide sequence specific to the lactic acid bacterium H61 strain by PCR (polymerase chain reaction), without recognizing strains related to the lactic acid bacterium H61 strain. It is possible to specifically recognize the H61 strain and specifically detect the H61 strain of lactic acid bacteria.
The lactic acid bacterium H61 strain in the present invention means the lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris H61 (deposit number: NITE P-92) strain.
本発明のプライマーセットは、以下の方法で設計した。
まず、乳酸菌Ｈ６１株の完全長ゲノム配列を、第３世代シーケンサーであるＰａｃＢｉｏ ＲＳＩＩ（デジタルバイオロジー社製）を用いて決定した。このゲノム配列と、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス菌４株（全ゲノム配列解読済み：ＭＧ１３６３株、ＳＫ１１株、ＮＺ９０００株、Ｓｃａｆｆｏｌｄｓレベルでのゲノム配列解読済み：ＪＭ１株）を比較して、タンパク質をコードするコーディングシーケンス（ＣＤＳ）を検索し、相同性の認められない領域を検出した。これらの領域の核酸配列を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）でＢＬＡＳＴ検索し、全細菌種に対しても相同性の認められない領域を絞り込んだ。これらの配列から、ＧＣ含量が４０％以上になるような領域の２５０ｂｐから３５０ｂｐの長さのＰＣＲ産物が得られるＰＣＲプライマーを作成した。標準株であるラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＡＴＣＣ １９２５７株、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 畜産研究部門保有のラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス菌１０株、および亜種ラクティス菌８株とＨ６１株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、当該プライマーによるＰＣＲを行ない、Ｈ６１株のみ相当する鎖長のＰＣＲ産物が得られ、他の菌株のＤＮＡを鋳型に用いてもＰＣＲ産物は得られないプライマーセットを選抜した。
The primer set of the present invention was designed by the following method.
First, the full-length genome sequence of lactic acid bacterium strain H61 was determined using a third-generation sequencer, PacBio RSII (manufactured by Digital Biology). This genome sequence was compared with 4 strains of lactobacillus Lactococcus lactis subsp. A coding sequence (CDS) encoding was searched to detect regions with no homology. Nucleic acid sequences of these regions were BLAST-searched by NCBI (National Center for Biotechnology Information) to narrow down the regions with no homology to all bacterial species. From these sequences, PCR primers were constructed that yield PCR products of lengths from 250 bp to 350 bp in regions where the GC content is greater than 40%. Lactococcus lactis subspecies cremoris ATCC 19257 strain, which is a type strain, National Agriculture and Food Research Organization Livestock Research Institute 10 strains of Lactococcus lactis subsp. cremoris, and 8 strains of subspecies lactis and H61 strain as a template, PCR is performed with the primers, and a PCR product with a chain length corresponding to only the H61 strain is obtained. We selected a primer set that does not
＜本発明のプライマーセットについて＞
本発明のプライマーセットは、下記表１に示す、配列番号１の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２または３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるものである。
例えば、本発明のプライマーセットは、使用目的や条件によっては、必ずしも配列番号１～３の塩基配列と１００％の相同性を有している必要はなく、目的とする領域のプライマーの５’末端付近で数塩基が異なっていてもよい。そのようなプライマーを使用しても、アニーリング温度等を検討することによって目的ＤＮＡ断片を適宜増幅させることは可能である。
詳しくは、乳酸菌Ｈ６１株の検出に際し、高い特異性が要求される場合には、完全に相同な配列部位（配列番号１～３の塩基配列）を使用し、かつ、そのような配列でしかアニーリングしないＰＣＲ条件を選択すればよい。その反面、比較的特異性の低い条件が許容される場合には、配列番号１～３の塩基配列とは数塩基異なる配列を使用し、かつ、それでもアニーリングするようなＰＣＲ条件を選択することができる。
<Regarding the primer set of the present invention>
The primer set of the present invention comprises a pair of an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 3, as shown in Table 1 below.
For example, the primer set of the present invention does not necessarily have 100% homology with the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, depending on the purpose and conditions of use. A few bases may differ in the vicinity. Even if such primers are used, it is possible to appropriately amplify the target DNA fragment by considering the annealing temperature and the like.
Specifically, when high specificity is required for the detection of lactic acid bacteria strain H61, completely homologous sequence sites (nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3) are used, and annealing is performed only with such sequences. It is sufficient to select PCR conditions that do not On the other hand, if conditions with relatively low specificity are acceptable, it is possible to use sequences that differ by a few nucleotides from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, and to select PCR conditions that still allow annealing. can.
本発明のプライマーセットは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法により、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。また、ＤＮＡ合成業者に合成を委託することによっても、本発明のプライマーを得ることができる。
本発明のプライマーセットを用いて、試料に含まれる被検菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することにより、試料中の乳酸菌Ｈ６１株を検出することができる。すなわち、プライマーの配列に特異的なＰＣＲの反応が起こると、乳酸菌Ｈ６１株の染色体ＤＮＡ内の、対となる各プライマーの配列に相当する配列に挟まれた領域（標的領域）が増幅される。
したがって、本発明のプライマーセットを用いて増幅産物が得られれば、被検菌は乳酸菌Ｈ６１株であると同定されるか、または、被検菌に乳酸菌Ｈ６１株が含まれていると判定される。
また、増幅産物が得られる場合は、増幅産物の有無の決定には、増幅産物の長さの決定が含まれてもよい。例えば、配列番号１および配列番号２、または配列番号１および３の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌Ｈ６１株検出用プライマーセットを用いた場合、被検菌に乳酸菌Ｈ６１株が含まれていれば、通常は各々３４３ｂｐ、２５１ｂｐの増幅産物が得られる。
本発明のオリゴヌクレオチドを含む乳酸菌Ｈ６１株検出用プライマーセットを用いた場合に得られる、請求項４に特定する３４３ｂｐの増幅産物である配列番号４の塩基配列を含むポリヌクレオチドを下記図１に、請求項５に特定する２５１ｂｐである配列番号５の塩基配列を含む増幅産物のポリヌクレオチドを下記図２に示す。図１、２中の下線は、乳酸菌Ｈ６１株の特異的検出のための本発明のプライマーセットが、ハイブリダイズする部位を示す。
配列番号１～５の塩基配列は、乳酸菌Ｈ６１株に特異的な配列であることから、これらの一部の配列をＤＮＡプローブとしたＦＩＳＨ法やサザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションなどを実施することも可能である。
なお、本発明において、乳酸菌Ｈ６１株の検出とは、試料中に乳酸菌Ｈ６１株が存在するか否かを検出すること、および、被検菌が単一種である場合には、同被検菌が乳酸菌Ｈ６１株であるか否かを同定することを含む。
The primer set of the present invention can be synthesized by a conventional DNA synthesis method well known to those skilled in the art, for example, using a DNA synthesizer. The primers of the present invention can also be obtained by entrusting synthesis to a DNA synthesizer.
Using the primer set of the present invention, PCR is performed using the chromosomal DNA of the test bacterium contained in the sample as a template, and the presence or absence of an amplified product is determined to detect the lactic acid bacterium H61 strain in the sample. That is, when a PCR reaction specific to the sequences of the primers occurs, a region (target region) sandwiched between sequences corresponding to the sequences of the paired primers in the chromosomal DNA of the H61 strain of lactic acid bacterium is amplified.
Therefore, if an amplification product is obtained using the primer set of the present invention, the test bacterium is identified as lactic acid bacterium H61 strain, or it is determined that the test bacterium contains lactic acid bacterium H61 strain. .
Determining the presence or absence of an amplification product may also include determining the length of the amplification product, if an amplification product is obtained. For example, when using a primer set for detecting lactic acid bacterium H61 strain containing an oligonucleotide consisting of a combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 1 and 3, if the test bacterium contains lactic acid bacterium H61 strain , usually resulting in amplification products of 343 bp and 251 bp, respectively.
A polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 4, which is the 343 bp amplification product specified in
Since the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 are sequences specific to the H61 strain of lactic acid bacteria, FISH, Southern hybridization, dot hybridization, etc. may be performed using some of these sequences as DNA probes. It is possible.
In the present invention, the detection of the lactic acid bacterium H61 strain means detecting whether or not the lactic acid bacterium H61 strain is present in the sample, and when the test bacterium is a single species, the test bacterium is Including identifying whether it is the lactic acid bacterium H61 strain.
ここで、乳酸菌Ｈ６１株の検出に用いる試料としては、乳酸菌Ｈ６１株が存在し得る試料であればいずれのものであってもよく、例えば、乳酸菌の混合培養物、ヨーグルトやチーズなどの微生物を含む食品、マウスやラットなどの実験動物やヒトの糞便、土壌等の環境中に存在する細菌等を挙げることができる。被検菌は、分離された単一種であってもよく、複数の菌種を含む混合物であってもよい。
死菌であれば、試料からそのままＤＮＡを調製してＰＣＲに用いてもよく、また生菌であれば、試料からコロニー分離等により被検菌体を分離して、被検菌体からＤＮＡを調製してからＰＣＲに供してもよい。これらの試料から核酸を抽出する方法は、例えば、一般的に乳酸菌のゲノムＤＮＡ調製に用いるような、細胞壁をＬｙｓｏｚｙｍｅなどの酵素で分解またはビーズなどで物理的に破壊したのちに、市販の抽出キット（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、Ｉｓｏｇｅｎなど）を使用することが可能であり、特に限定されるものではない。
Here, the sample used for detecting lactic acid bacterium H61 strain may be any sample in which lactic acid bacterium H61 strain can be present, for example, mixed cultures of lactic acid bacteria, yogurt, cheese, etc. Food, experimental animals such as mice and rats, human feces, and bacteria present in the environment such as soil can be mentioned. The test bacterium may be an isolated single species or a mixture containing multiple bacterial species.
If it is a dead bacterium, DNA may be prepared from the sample as it is and used for PCR, and if it is a live bacterium, the test bacterium is isolated from the sample by colony separation or the like, and the DNA is extracted from the test bacterium. PCR may be performed after preparation. Methods for extracting nucleic acids from these samples include, for example, decomposing the cell walls with an enzyme such as Lysozyme or physically destroying them with beads or the like, which is generally used for the preparation of genomic DNA of lactic acid bacteria, followed by a commercially available extraction kit. (DNeasy Blood & Tissue kit (manufactured by QIAGEN), Isogen, etc.) can be used, and is not particularly limited.
＜本発明の検出方法について＞
本発明の乳酸菌Ｈ６１株の検出方法は、（１）本発明のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程と、（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程を含むものである。
本発明の検出方法として、具体的には、例えば、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、サザンハイブリダイゼーションやドットハイブリダイゼーション等を挙げることができる。中でも、ＰＣＲ法が好ましい。
このうち、ＰＣＲ法による乳酸菌Ｈ６１株の検出方法では、本発明のプライマーセットを用いる以外は、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ試薬および機器を使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定はされないが、例えば、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製) 、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－ポリメラーゼ（東洋紡社製）等が好ましい。
ＰＣＲ反応条件については、用いるＤＮＡポリメラーゼの最適温度、合成するＤＮＡの長さや種類等により適宜設定すればよいが、サイクル条件であれば「９０～９８℃で５～３０秒（熱変性・解離）→５６℃で５～３０秒（アニーリング）→６５～８０℃で３０～６０秒（合成・伸長）」を１サイクルとして合計２０～４０サイクル行う条件が好ましい。この場合、鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、１０～３０ｎｇのゲノムＤＮＡ量に対し、各プライマーを０．２４μＭ程度が好ましい。
ＰＣＲにより得られる増幅産物の有無またはその大きさは、通常の核酸の検出法によって、決定することができる。例えば、アガロース電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、蛍光強度によって増幅産物の量を、分子量マーカーとの比較によって分子量を決定することができる。ＰＣＲ産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによっても、増幅産物の有無を確認することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、経時的に増幅反応を検出することができる。
<Regarding the detection method of the present invention>
The method for detecting the lactic acid bacterium strain H61 of the present invention comprises the steps of (1) amplifying a nucleic acid fragment using the primer set of the present invention, and (2) detecting the nucleic acid fragment obtained in step (1). .
Specific examples of the detection method of the present invention include PCR, FISH, Southern hybridization, dot hybridization, and the like. Among them, the PCR method is preferred.
Of these, in the method for detecting lactic acid bacterium H61 strain by PCR method, except for using the primer set of the present invention, it is possible to use commonly used PCR reagents and equipment such as DNA polymerase, and there is no particular limitation. do not have.
The DNA polymerase used in PCR is not particularly limited, but ExTaq (manufactured by Takara Bio), KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo), KOD-plus-polymerase (manufactured by Toyobo) and the like are preferred.
The PCR reaction conditions may be appropriately set according to the optimum temperature of the DNA polymerase to be used, the length and type of DNA to be synthesized, etc., but the cycle conditions are "90-98°C for 5-30 seconds (thermal denaturation/dissociation). → 56° C. for 5 to 30 seconds (annealing) → 65 to 80° C. for 30 to 60 seconds (synthesis/extension). In this case, the quantitative ratio of template DNA and primers is preferably about 0.24 μM of each primer for 10-30 ng of genomic DNA.
The presence or absence or size of an amplification product obtained by PCR can be determined by a conventional nucleic acid detection method. For example, after electrophoresis by agarose electrophoresis, the amplified product can be detected by staining with ethidium bromide or SYBR Green I. Also, the amount of amplification product can be determined by fluorescence intensity, and the molecular weight can be determined by comparison with molecular weight markers. The presence or absence of an amplification product can also be confirmed by measuring the base sequence and length using a DNA sequencer after cycle sequencing the PCR product. Moreover, according to the real-time PCR method, the amplification reaction can be detected over time.
本発明のプライマーセットは、他の要素と併せて、乳酸菌Ｈ６１株検出用キットとすることができる。前記の他の要素としては、例えば、核酸の抽出、ＰＣＲ、および増幅産物の検出に必要な試薬類の任意の１種または２種以上が挙げられる。また、この乳酸菌Ｈ６１株検出用キットは、陽性コントロールとして、乳酸菌Ｈ６１株の染色体ＤＮＡの配列の一部を有し、本発明のプライマーセットにより増幅され得るＤＮＡ断片、および／または、陰性コントロールとして、本発明のプライマーセットに対応するが、１塩基または数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでいてもよい。 The primer set of the present invention can be combined with other elements to form a detection kit for lactic acid bacterium H61 strain. Said other elements include, for example, any one or more of the reagents necessary for nucleic acid extraction, PCR, and amplification product detection. In addition, this kit for detecting lactic acid bacterium H61 strain has a DNA fragment that has a part of the chromosomal DNA sequence of lactic acid bacterium H61 strain as a positive control and can be amplified by the primer set of the present invention, and / or as a negative control, It may contain a DNA fragment that corresponds to the primer set of the present invention but has a base sequence with one or several base mismatches.
本発明のプライマーセットは、前記したように、乳酸菌Ｈ６１株の検出に用いることができる。また、本発明のプライマーセットを用いることにより、乳酸菌Ｈ６１株菌体または同菌体を含む飲食品等を工業的に製造するに際し、菌数の測定や発酵状態の管理を容易に行うことができる。 The primer set of the present invention can be used for detection of lactic acid bacterium H61 strain, as described above. In addition, by using the primer set of the present invention, it is possible to easily measure the number of bacteria and manage the fermentation state when industrially producing lactic acid bacteria strain H61 cells or foods and drinks containing the same bacteria. .
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の技術範囲はこれらにより限定されるものではない。
＜実施例１：乳酸菌Ｈ６１株の検出１＞
（１）供試菌株
供試菌株として、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス株を８株（Ｌｃｌ１～Ｌｃｌ８）と、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス株を１３株（Ｌｃｃ１～Ｌｃｃ１１、乳酸菌Ｈ６１株、標準株ＡＴＣＣ １９２５７株）、ラクトバシラス・デキストリニカス株を１株（Ｌｂ１１）使用した。
EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
<Example 1:
(1) Test bacterial strains Test strains include 8 strains of Lactococcus lactis subsp. lactis strains (Lcl1 to Lcl8) and 13 strains of Lactococcus lactis subsp. strain ATCC 19257) and one strain of Lactobacillus dextrinicus (Lb11) were used.
（２）乳酸菌ＤＮＡの調製種特異的ＰＣＲ用のＤＮＡ調製
この実施例においては、簡便なのでキットを使用しているが、他のＤＮＡ調製方法により調製してもよい。精製したＤＮＡを使った方がＰＣＲの再現性が良く好ましい。
（ａ）ＭＲＳ液体培地で供試菌株を一晩培養した。
（ｂ）ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のグラム陽性細菌のＤＮＡ調製プロトコールに従い、ＤＮＡを調製した。詳細は以下のとおりである。
（ｂ－１）培養液１ｍＬ（ＯＤ ６００ｎｍ １．０程度の濁度）を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、集菌した。この上清は廃棄した。
（ｂ－２）１８０μＬのリシス溶液（２×ＴＥ (２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、 ２ｍＭ ＥＤＴＡ)１ｍＬに２０ｍｇリゾチーム、１２μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を加えて調製）を、上記の集菌した菌体に加え、懸濁後、３７℃、３０分間インキュベートした。
（ｂ－３） インキュベート後の上記懸濁液に２５μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋと２００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＬを加え、混合後、５６℃で３０分間インキュベートした。
（ｂ－４）これに、２００μＬの１００％エタノールを加えた。
（ｂ－５）上記（ｂ－４）の溶液をスピンカラムに添加し、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、ＤＮＡをカラムに吸着させた。このカラム通過液とチューブは廃棄した。
（ｂ－６）カラムを新しいチューブにセットし、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ１ ５００μＬを添加し、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。このカラム通過液とチューブは廃棄した。
（ｂ－７）カラムを新しいチューブにセットし、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ２ ５００μＬを添加し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
（ｂ－８）カラムを１．５ｍＬのマイクロチューブにセットし、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ ２００μＬを添加し、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
（ｂ－９）得られたＤＮＡを含む溶出液のＯＤ２６０ｎｍの吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度（ＯＤ２６０×５０μｇ/ｍＬ）を決定し、これを鋳型ＤＮＡ溶液とした。
(2) Preparation of lactic acid bacteria DNA Preparation of DNA for species-specific PCR In this example, a kit is used because it is simple, but other DNA preparation methods may be used. It is preferable to use purified DNA because of good reproducibility of PCR.
(a) The test strain was cultured overnight in MRS liquid medium.
(b) DNA was prepared according to the DNA preparation protocol for Gram-positive bacteria of DNeasy Blood & Tissue Kit (manufactured by QIAGEN). Details are as follows.
(b-1) 1 mL of the culture solution (turbidity of OD 600 nm, about 1.0) was centrifuged at 8000 rpm for 5 minutes to collect the bacteria. This supernatant was discarded.
(b-2) 180 μL of lysis solution (prepared by adding 20 mg of lysozyme and 12 μL of Triton X-100 to 1 mL of 2×TE (20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA)) was added to the above collected cells and suspended. After turbidity, it was incubated at 37°C for 30 minutes.
(b-3) 25 μL of Proteinase K and 200 μL of Buffer AL were added to the suspension after incubation, mixed, and incubated at 56° C. for 30 minutes.
(b-4) To this, 200 μL of 100% ethanol was added.
(b-5) The solution of (b-4) above was added to a spin column and centrifuged at 8000 rpm for 1 minute to adsorb DNA onto the column. The column flow-through and tubing were discarded.
(b-6) The column was set in a new tube, 500 μL of Buffer AW1 was added, and centrifuged at 8000 rpm for 1 minute. The column flow-through and tubing were discarded.
(b-7) The column was set in a new tube, 500 μL of Buffer AW2 was added, and centrifuged at 14000 rpm for 2 minutes.
(b-8) The column was set in a 1.5 mL microtube, 200 μL of Buffer AE was added, and centrifuged at 8000 rpm for 1 minute.
(b-9) The absorbance at OD260 nm of the resulting eluate containing DNA was measured to determine the DNA concentration ( OD260 ×50 μg/mL), which was used as a template DNA solution.
（３）ＰＣＲ反応
上記（２）において得た供試菌株のＤＮＡ溶液を鋳型とし、配列番号１および配列番号３の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットを用い、ＰＣＲ反応試薬キットであるＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）の方法にしたがってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の総量を２５μＬとすると、キット付属の１０ｘＥｘＴａｑ緩衝液２.５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ２.０μＬ、２０μＭ プライマー各０．３μＬ、鋳型ＤＮＡ１０～２０ｎｇ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０.７５Ｕを含む反応液０．１５μＬを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステム社製）を用いて、９８℃で１０秒の予備加熱後、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５６℃で３０秒、伸長を７２℃で６０秒のサイクルを３５サイクル行った。
(3) PCR reaction Using the DNA solution of the test strain obtained in (2) above as a template, using a primer set consisting of a pair of oligonucleotides containing the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, with a PCR reaction reagent kit A PCR reaction was carried out according to the method of ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.). Assuming that the total volume of the PCR reaction solution is 25 μL, the reaction solution containing 2.5 μL of 10×ExTaq buffer attached to the kit, 2.0 μL of dNTP mixture, 0.3 μL each of 20 μM primers, 10 to 20 ng of template DNA, and 0.75 U of ExTaq DNA polymerase was used. 15 μL was preheated at 98° C. for 10 seconds using GeneAmp PCR System 9700 (manufactured by Applied Biosystems), followed by denaturation at 98° C. for 10 seconds, annealing at 56° C. for 30 seconds, and extension at 72° C. for 60 seconds. Cycles of seconds were performed for 35 cycles.
（４）アガロース電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物を、１．８％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動した。次に、アガロースゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍＬ）で染色後、青色ＬＥＤライト下でＰＣＲ産物の増幅を示すバンドを観察した。結果を表２と図２に、実施例２の結果とまとめて示す。表中、プライマーと反応して２５１ｂｐ（配列番号１および配列番号３のプライマーを用いた場合）のＰＣＲ産物が増幅されたものを「＋」、プライマーと反応しなかったものを「－」と表す。
(4) Agarose electrophoresis The PCR product obtained by the PCR reaction was electrophoresed on a 1.8% agarose gel at 100 V for 30 minutes. Next, after staining the agarose gel with ethidium bromide (0.5 μg/mL), a band indicating amplification of the PCR product was observed under blue LED light. The results are shown in Table 2 and FIG. 2 together with the results of Example 2. In the table, "+" indicates that a 251 bp PCR product (when using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3) was amplified by reaction with the primers, and "-" indicates that it did not react with the primers. .
＜実施例２：乳酸菌Ｈ６１株の検出２＞
供試菌株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１および配列番号２の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの対からなるプライマーセットを用いたこと以外は、すべて実施例１と同様に行った。
結果を表２に、実施例１の結果とまとめて示す。表中、プライマーと反応して３４３ｂｐ（配列番号１および配列番号２のプライマーを用いた場合）のＰＣＲ産物が増幅されたものを「＋」、プライマーと反応しなかったものを「－」と表す。
<Example 2:
Everything was performed in the same manner as in Example 1 except that genomic DNA prepared from the test strain was used as a template and a primer set consisting of a pair of oligonucleotides containing the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 was used.
The results are shown in Table 2 together with the results of Example 1. In the table, "+" indicates that a PCR product of 343 bp (when using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) was amplified by reaction with the primers, and "-" indicates those that did not react with the primers. .
表２と図２に示すとおり、乳酸菌Ｈ６１株のＤＮＡを使用した試験番号６と２０のみにバンドが観察され、本発明のプライマーセットにより乳酸菌Ｈ６１株だけを特異的に検出できることが確認された。同一亜種のクレモリス株であってもＨ６１株以外では増幅が見られず、乳酸菌Ｈ６１株を特異的に検出できることが明らかとなった。
As shown in Table 2 and FIG. 2, bands were observed only in
＜実施例３：乳酸菌Ｈ６１株の検出３（生菌と加熱菌）＞
（１）供試菌株と培養条件
乳酸菌Ｈ６１株（異なる２つの保存ロット１、２を使用)を、ＭＲＳ液体培地１０ｍＬで菌を一晩培養した。
（２）加熱処理条件とＤＮＡの抽出
（２－１）一晩培養した培養液を８０００ｒｐｍで１分間遠心分離して集菌し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回菌体を洗浄した。
（２－２）菌体にＰＢＳを加えてＯＤ６００ｎｍの吸光度が１および５になるように調製した。
（２－３）ＯＤ６００５の菌体懸濁液０．５ｍＬをマイクロチューブ２本にとり、１本は１００℃で３０分間煮沸、もう１本は１２１℃で１５分間オートクレーブ処理を行った。
（２－４）ＯＤ６００１の菌体懸濁液１．０ｍＬをマイクロチューブ２本にとり、１本は１００℃で３０分間煮沸を行った。もう１本は生菌からのＤＮＡ調製に用いた。
（２－５）上記（２－３）、（２－４）により処理済みの菌体を、遠心分離により集菌し、上記実施例１の「乳酸菌ＤＮＡの調製種特異的ＰＣＲ用のＤＮＡ調製」と同様の方法でＤＮＡ調製を行った。
（２－６）得られたＤＮＡを鋳型に用いて、上記実施例１の「ＰＣＲ反応」と同様の方法でＰＣＲを行った。
結果を表３と図４に示す。
表３と図４中の試験番号１～４は上記保存ロット１、試験番号５～８は上記保存ロット２の乳酸菌Ｈ６１株である。また、試験番号１、５は生菌から調製した乳酸菌Ｈ６１株のＤＮＡ、試験番号２、６はＯＤ６００５に調製し１００℃で３０分間加熱した乳酸菌Ｈ６１株から調製したＤＮＡ、試験番号３、７はＯＤ６００１に調製し１００℃で３０分間加熱した乳酸菌Ｈ６１株から調製したＤＮＡ、試験番号４、８はＯＤ６００５に調製し１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した乳酸菌Ｈ６１株から調製したＤＮＡである。
<Example 3: Detection of lactic acid bacteria H61 strain 3 (live bacteria and heated bacteria)>
(1) Test Strains and Culture Conditions Lactobacillus strain H61 (using two
(2) Heat Treatment Conditions and DNA Extraction (2-1) The overnight culture was centrifuged at 8000 rpm for 1 minute to collect the cells, and the cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS). bottom.
(2-2) PBS was added to the cells to adjust the absorbance at OD600 nm to 1 and 5.
(2-3) 0.5 mL of the
(2-4) 1.0 mL of the cell suspension having an OD 600 of 1 was placed in two microtubes, and one was boiled at 100°C for 30 minutes. The other was used for DNA preparation from live bacteria.
(2-5) The cells treated by (2-3) and (2-4) above are collected by centrifugation, and the "Preparation of lactic acid bacteria DNA" in Example 1 above Preparation of DNA for species-specific PCR ” was prepared in the same manner as in
(2-6) Using the obtained DNA as a template, PCR was performed in the same manner as in "PCR reaction" in Example 1 above.
The results are shown in Table 3 and FIG.
表３と図３に示すとおり、乳酸菌Ｈ６１株の生菌のＤＮＡおよび加熱処理菌のＤＮＡを使用した試験番号１～８全てにバンドが観察され、本発明のプライマーセットは、乳酸菌Ｈ６１株の生菌のみならず加熱処理菌（死菌）に対しても、特異的な検出能を発揮することが明らかとなった。これは、乳酸菌Ｈ６１株の生菌を利用した製品等はもとより、加熱処理した乳酸菌Ｈ６１株を利用した製品等においても、乳酸菌Ｈ６１株を検出できることを意味する結果であり、非常に有用である。
As shown in Table 3 and FIG. 3, bands were observed in all
Claims (5)
（１）請求項１記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程
（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程 A method for detecting the lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris H61 (NITE P-92) strain, comprising the following steps.
(1) step of amplifying a nucleic acid fragment using the primer set according to claim 1; (2) step of detecting the nucleic acid fragment obtained in step (1);
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