JP3667104B2

JP3667104B2 - Primer for Bifidobacterium

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Publication number: JP3667104B2
Application number: JP22958398A
Authority: JP
Inventors: 隆広松木; 幸一渡辺; 隆一郎田中; 広志小柳津
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2005-07-06
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: JPH11123093A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定に有用なＤＮＡプライマー及びこれを用いるビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定・解析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物等の腸内細菌叢を同定・解析することは、個体の健康状態の把握、腸管内の病理的研究等に非常に有用である。特にビフィドバクテリウム属細菌は、グラム陽性の多型性桿菌でヒト腸内フローラにおける最優勢菌群のひとつであり、この菌種は、宿主に対して腸管感染防御作用、免疫機能の増強作用、栄養、腸内腐敗の抑制作用などの生理作用を持っており、この菌種分布を把握することは重要である。現状ではその手段として、種々の選択培地を組み合わせて用いる選別方法や顕微鏡観察が主に行われている。
【０００３】
菌種の同定、腸内細菌叢の解析を行うためには、対象となる個体の糞便を嫌気条件下において希釈液で希釈し、これを培地上にまき、嫌気性培養を行う必要がある。しかし、培養の際には数日から数週間の時間を要することとなり、コロニー数のカウント等操作も煩雑であった。
【０００４】
また、ヒトや動物の腸内に生息しているビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、発酵生産物（乳酸又は酢酸等）、一般生物学的性状等を検査することにより行われている。また、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われている（INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 21, No.4, p.276〜294(1971)）。
【０００５】
しかしながら、表現形質を基にした同定法は、操作が煩雑であり、試験者の熟練を要する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定・解析を行うには、長期間を要し、また操作が煩雑である等の問題があった。
従って、本発明の目的は、ビフィドバクテリウム属細菌菌種を迅速、簡便に同定・解析し得る方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
斯かる現状に鑑み本発明者は鋭意研究を行ったところ、ビフィドバクテリウム属細菌の菌種又は系統的に近縁な種からなるグループに特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを見出し、これを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便にビフィドバクテリウム属細菌の菌種又は系統的に近縁な種からなるグループの同定・解析が可能となることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号１〜２１から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるビフィドバクテリウム属細菌用プライマーを提供するものである。
【０００９】
また本発明は、配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号７及び１９、配列番号１４及び２０若しくは配列番号７及び２１記載の塩基配列又はこれらと相補的な塩基配列からなるプライマーの組合せ、或いは請求項１記載のプライマーから選ばれる１のプライマーを使用することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の系統的に近縁な種からなるグループ又はビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定方法を提供するものである。
【００１０】
更に本発明は、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号７及び１９、配列番号１４及び２０若しくは配列番号７及び２１記載の塩基配列又はこれらと相補的な塩基配列からなるプライマーの組合せ、或いは請求項１記載のプライマーから選ばれる１のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う工程及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含むビフィドバクテリウム属細菌の系統的に近縁な種からなるグループ又はビフィドバクテリウム属細菌菌種の特異的検出方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のプライマーのターゲットには、系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いた。
【００１２】
プライマーは、本発明者がシークエンシングを行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Genbank等）や本発明者が比較対象として新たにシークエンスを行って得た塩基配列とを比較・検討することにより得たものである。ここで本発明者が比較対象として新たに１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種（基準株）は、具体的には、ビフィドバクテリウム・アングラータム(Bifidobacterium angulatum) ＡＴＣＣ２７５３５株、ビフィドバクテリウム・アニマーリス(Bifidobacterium animalis) ＡＴＣＣ２５５２７株、ビフィドバクテリウム・ボウム(Bifidobacterium boum) ＪＣＭ１２１１株、ビフィドバクテリウム・チョエリナム(Bifidobacterium choerinum) ＡＴＣＣ２７６８６株、ビフィドバクテリウム・デンティウム(Bifidobacterium dentium) ＡＴＣＣ２７５３４株、ビフィドバクテリウム・ガリカム(Bifidobacterium gallicum) ＪＣＭ８２２４株、ビフィドバクテリウム・ガリナラム(Bifidobacterium gallinarum) ＪＣＭ６２９１株、ビフィドバクテリウム・インディカム(Bifidobacterium indicum) ＪＣＭ１３０２株、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis) ＡＴＣＣ１５６９７株、ビフィドバクテリウム・マグナム(Bifidobacterium magnum) ＪＣＭ１２１８株、ビフィドバクテリウム・メリシカム(Bifidobacterium merycicum) ＪＳＭ８２１９株、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム(Bifidobacterium pseudocatenulatum) ＪＣＭ１２００株、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムサブスピーシーズ・グロボッサム(Bifidobacterium pseudolongum ss.globosum) ＪＣＭ５８２０株、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムサブスピーシーズ・シュードロンガム(Bifidobacterium pseudolongum ss. pseudolongum) ＪＣＭ１２０５株、ビフィドバクテリウム・プロラム(Bifidobacterium pullorum) ＪＣＭ１２１４株、ビフィドバクテリウム・ルミナンティウム(Bifidobacterium ruminantium) ＪＣＭ８２２２株、ビフィドバクテリウム・サエクラレ(Bifidobacterium saeculare) ＤＳＭ６５３１株、ビフィドバクテリウム・ズブティル(Bifidobacterium subtile) ＤＳＭ２００９６株、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス(Bifidobacterium denticolens) ＤＳＭ１０１０５株、ビフィドバクテリウム・イノピオナータム(Bifidobacterium inopionatum) ＤＳＭ１０１０７株、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Bifidobacterium catenulatum)ＡＴＣＣ２７５３９株であり、これらの配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録した。
【００１３】
ビフィドバクテリウム属の菌種間でアライメントを行った。その結果、全部で９ケ所ある可変領域のうちＶ２エリアとＶ３エリアに、多くの菌種に特異的な配列があることがわかった（図１）。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム及びビフィドバクテリウム・インファンティスはＶ６エリアに、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム及びビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータムはＶ１エリアとＶ６エリアに両者を区別できる配列があることがわかった（図２）。そこで上記領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計した。また、オリゴヌクレオチドの長さは、１７〜２１ｂ．ｐであり、これらは操作上最も好適な長さである。しかし、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜数十ｂ．ｐの塩基配列を増減させたものを用いても良い。
【００１４】
このようにして得られたプライマーのうち、配列番号１及び２記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１５】
また、配列番号３及び４記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１６】
また、配列番号５及び６記載の塩基配列を有するものはビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１７】
また、配列番号７及び８記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１８】
また、配列番号９及び１０記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム(Bifidobacterium pseudolongum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００１９】
また、配列番号１１及び１２記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・アングラータム（ Bifidobacterium angulatum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２０】
配列番号１３及び１４記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム(Bifidobacterium catenulatum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２１】
また、配列番号１５及び１６記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２２】
また、配列番号１７及び１８記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・ガリカム(Bifidobacterium gallicum)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２３】
更に、配列番号７及び１９記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)に特異的なＤＮＡプライマーである。
【００２４】
また、配列番号７及び２１に記載のプライマーは、Ｂ．ロンガムのみならずＢ．インファンティス、Ｂ．ズイスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ともバンドを形成した。しかし、これら３菌種は系統的に非常に近縁の種であり、細胞壁のペプチド鎖、ムレイン（酸）が同一であること、また、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーも７０％前後であり、また前述のようにＢ．ロンガムグループが認識できるので、ビフィドバクテリウム属細菌菌種の同定において特に支障なく使用することができる。
【００２５】
更に、配列番号１４及び２０に記載のプライマーは、Ｂ．カテヌラータム及びＢ．シュードカテヌラータムの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ともバンドを形成した。しかし、これら２菌種についても同様の理由からＢ．カテヌラータムグループと認識できるので、同様に支障なく使用できる。
【００２６】
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成される。その種特異性は、ビフィドバクテリム属細菌と代表的な腸内細菌の１６ＳｒＲＮＡに対するプライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記のうち、Ｂ．アドレスセンティス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．シュードロンガム、Ｂ．カテヌラータム、Ｂ．アングラータム、Ｂ．シュードカテヌラータム、Ｂ．ガリカム、Ｂ．インファンティスに対するプライマーの特異性に問題はなかった。一方、Ｂ．ロンガムに対するプライマーは、Ｂ．ズイスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ともバンドを形成した。しかし、これら２菌種は系統的に非常に近縁の種であり、またＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーも７５〜７８％であり、また１６ＳｒＲＮＡ配列の類似性も９９．７％を超えることから同一菌種に再分類されるべきで、両者を区別できなくても特に支障がないと考えられる。
【００２７】
本発明のプライマーは、このように特異性を有するため、これらを用いたビフィドバクテリウム属細菌用選択培地ＴＯＳ、ＭＰＮ上に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌種又は系統的に近縁な種からなるグループの簡易同定を行うことができる。
また、本発明のプライマーを用いれば、培養を行うことなく、各個体の菌種又は系統的に近縁な種からなるグループレベルでの分布の調査が可能である。このような方法としては例えば次の方法が挙げられる。
【００２８】
まず、糞便等からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲのサンプルとする。
糞便等の希釈液からＤＮＡを抽出する方法としては、定法であるＭａｒｍｕｒ法、その変法である酵素法、及びベンジルクロライド法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。また、純粋培養した細菌等から抽出したＤＮＡに対しては、前述の方法の他、フェノール法等も好適に使用しうる。また、菌体の一部をバッファー又は滅菌水に懸だくし、９５℃、１５分程度加熱したものを、テンプレートとして、ＰＣＲに供することも可能である。
【００２９】
抽出されたＤＮＡに種又はグループ特異的プライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、種又はグループ特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。通常、ＰＣＲ法等にプライマーを使用する際には、２種類のプライマーを１組として用いることが好ましい。例えば、配列番号１及び２に係るプライマーを用いれば、多種類存在する細菌群のうち、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスのＤＮＡにおいてのみ、両者のプライマー間で増幅反応が起こり、これを同定することができる。このように２種類のプライマーを組にして用いる場合は、両者がリーディング鎖とラギング鎖との組み合わせになるようにする必要がある。また、ＰＣＲ反応を行う際、アニーリングの温度はほぼ一定に設定してあるので、５種類のプライマーを同時に検定することも可能である。また、ＰＣＲを行う際に、予め鋳型のＤＮＡ量を段階希釈し、検出限界を求め同様の解析を行えば、目的とする菌種の定量化も可能である。
【００３０】
このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌種又は系統的に近縁な種からなるグループを同定することができる。
【００３１】
また、本発明のプライマーは、菌種又は系統的に近縁な種からなるグループ特異的な配列を有しているため、単独でもプローブとして使用できる。更に、本発明のプライマー単独もしくは複数と他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチドとを組み合わせても用いることができる。
【００３２】
また、本発明のプライマーを用いれば、ヒト、動物等の腸内等の解析も行える。現状では、ビフィドバクテリウム属細菌の菌種又は系統的に近縁な種からなるグループ以外を検出することは不可能であるものの、ビフィドバクテリウム属細菌の分布、菌数が分かれば、健康状態等様々な情報が得られる。更に、その他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度にビフィドバクテリウム属細菌菌種又は系統的に近縁な種からなるグループの同定を行うことができる。また、他の菌種特異的なプライマー等と組み合わせて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行うことができる。更に、解析の結果から消化管等の状態が把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１プライマーの設計及び合成：
ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースより得られたビフィドバクテリウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と、本発明者らが解読した上記の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、種特異的なプライマーの設計を行った。可変領域のうちＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ６エリアに菌種特異的配列が認められたので、これをターゲットとしてプライマーを作成した。プライマーの二本鎖形成能は、塩基配列中のＧＣ含量と塩基数に依存するため、ＧＣ含量に伴って塩基数に差異が生じた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した。
【００３６】
【表１】

【００３７】
実施例２プライマーを用いた菌種の同定及び菌種特異性の確認：
本発明のプライマーが、実際に種特異性を有しているかを確認するため、以下の実験を行った。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表２及び３に示す、３１菌種４７株のビフィドバクテリウム属細菌と、９属１５菌種の代表的腸内細菌とをＧＡＭ broth 培地（ニッスイ社製）に一晩純粋培養した。このとき、嫌気性細菌は嫌気的に好気性細菌は好気的に培養した。こうして得た菌体６２種類各々から、ガラスビーズを用いたフェノール法により、ＤＮＡを抽出した。
【００３８】
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μｌとし、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１５ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，２５ｍＭＭｇＣｌ₂，０．４５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２００μＭｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ２００ｍｇ／ｍｌＢＳＡに、各々０．２５μＭプライマー，０．９ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＢｉｏｔｅｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），１０ｎｇテンプレートＤＮＡを含む反応液で、ＨｙｂａｉｄＴｏｕｃｈｄｏｗｎＴｅｒｍｉｎａｌＣｙｃｌｅｒ（ＬａｂｓｙｓｔｅｍｓＪａｐａｎ）により、９４℃５分の熱変性の後９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒を３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。この条件で、（１）のサンプル６２種類と本発明のプライマーとを反応させた。
【００３９】
（３）プライマーの種特異性の検討
（２）で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無により、プライマーの特異性を判定した。１％LO.3Agarose(タカラ社製)で、ミューピットにより１００Ｖ、２５分電気泳動し、ｅｔｈｉｄｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅで染色後、ＵＶランプ下でバンドの有無を観察した。その結果は表２、３に示す通り、プライマーはビフィドバクテリウム属細菌特異的にバンドを形成した。具体的には、ターゲットとするB. adolescentis ４株からは目的とするＰＣＲ産物が得られたが、他のBifidobacterium 及び腸内菌からは目的とするサイズのＰＣＲ産物が得られず、この特異的プライマーBiADO によりB. adolescentis の特異的な検出が可能であることがわかった。同様に、他のBifidobacterium 菌種特異的プライマーの特異性を調べたところ、BiBIF、BiBRE、BiANG、BiPDLは、それぞれB. bifidum、B. breve、B. angulatum、B.pseudolongumを特異的に検出できることがわかった。
【００４０】
一方、BiLONgはＢ．ロンガム以外にもＢ．インファティス、Ｂ．ズイスのＤＮＡを鋳型としてもＰＣＲ産物が生じた。しかし、この三者は系統的に非常に近縁な種であり、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性も７０％前後であることから今後同一菌種に再分類される可能性が高い。したがってこれら３菌種はＢ．ロンガムグループとしても認識でき、表現性状も似ていることから、これらを明確に区別できなくても特に支障はないと考えられる。BiCATgもＢ．カテヌラータム以外にＢ．シュード−カテヌラータムのＤＮＡを鋳型としてもＰＣＲ産物が生じることがわかった。しかし、この場合も両者は系統的に非常に近縁な種であり、今後同一菌種に再分類される可能性が高い。したがって、これらを明確に区別できなくても特に支障はないと考えられる。
【００４１】
また、同様にBiPSC、BiGAL、BiLON、BiINFについても試験した。結果を表４〜６に示す。
【００４２】
【表２】

【００４３】
【表３】

【００４４】
【表４】

【００４５】
【表５】

【００４６】
【表６】

【００４７】
実施例３プライマーを用いたヒト腸内細菌叢の菌種同定及び解析：
（１）糞便のサンプリング
ヒト大便サンプルから直接抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行うことで、培養を行うことなくビフィドバクテリウム属細菌を菌種レベルで検出することを試みた。サンプルとしては、健常な成人男性８名の糞便を採取したものを用いた。成人男性は４名ずつミルミル（当社実施品：１本あたり平均でLactobacilus acidophilusを２×１０⁹、Bifidobacterium bifidumを１０⁹、Bifidobacterium breveを１０¹⁰含有）投与群と非投与群とに分け、サンプリング前後の発酵乳投与の有無による腸内細菌叢への影響も併せて検討した。すなわち、両群への発酵乳等生菌含有食品投与を４週間止めた後、４名にはミルミルを１日３本食後飲用させ、他の４名には、細菌が含まれておらず他の成分の組成は同一の偽ミルミルを同量飲用させた。飲用開始４週間後、糞便を採取して、TE buffer にて洗浄し、５０mgずつ分割して−８０℃で保存した。
【００４８】
（２）ＤＮＡの抽出
酵素法を用いて、ＤＮＡの抽出を行った。サンプルを５００μｌの５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１０ｍＭＥＤＴＡ−１０ｍＭＮａＣｌに浮遊し、凍結と融解を２回繰り返した。その後１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌアクロモペプチダーゼ溶液と７．５μｌの５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、２５μｌの０．５ｍｇ／ｍｌＮ−アセチルムラミダーゼ溶液を加え、３７℃で６０分反応した。更に、２０％ＳＤＳ溶液（ｆｉｎａｌ１．５％）と４μｌの１０ｍｇ／μｌプロテイナーゼＫ溶液を加え、３７℃で６０分反応させた。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール処理を行った。次に１／２０倍容のＲＮａｓｅＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で６０分反応し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール処理後、エタノール沈殿した。沈殿を４００μｌＴＥｂｕｆｆｅｒに溶かして、限外濾過チューブＣ３ＬＴＫ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により精製した。また、紫外線領域の吸光度を測定してＤＮＡの収量を求めた。
【００４９】
（３）ＰＣＲ反応
実施例２（２）と同様の条件で、（１）のサンプルと各プライマーとを反応させた。
【００５０】
（４）ＰＣＲ産物の確認
電気泳動により、ＰＣＲ産物の確認を行ったところ、ミルミル投与群では、全ての検体で投与菌と同じ菌種のビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベが検出された。非投与群においては、ビフィドバクテリウム・ビフィダムが４名中２名、ビフィドバクテリウム・ブレーベが４名中１名から検出された。これらの菌が、元々腸内に常在していた菌であるのか投与された菌であるのかは確認できなかった。一方、ビフィドバクテリウム・カテネラータム、ビフィドバクテリウム・ロンガムは８名全てから検出され、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスも８名中７名から検出されたことから、これらはヒト成人に広く分布しているものと推測される。結果は表７に示す。
【００５１】
【表７】

【００５２】
実施例４プライマーを用いた野性株の菌種同定：
まず、ビフィドバクテリウム属野性株の菌種同定を、作成したプライマーにより試みた。表８の各株からＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲ反応を行って、どのプライマーを使用したときに増幅産物が得られるかを調べた。
【００５３】
一方、従来の方法として、最も高精度な同定方法であるＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験も行ったところ本発明のプライマーによる結果とこの結果は一致していた（表８）。また、（21. Scardovi, V.1984. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen, 1924, 472, p1418-1434. In N.R.Krieg and J.G.Holt(ed), Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol. 1. The Williamd & Wilkins Co., Baltimore.)でも菌種同定を行ったところ、本発明のプライマーによる結果とほぼ同様の結果が得られた（表８）。
【００５４】
【表８】

【００５５】
ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験においてＢ．カテヌラータムとＢ．シュードカテヌラータム、Ｂ．ロンガムとＢ．インファンティスは、近縁種どうしであるため、お互い高いホモロジーを示したが、一方が２０％程度もう一方よりも高いことから判別可能であった。
【００５６】
実施例５
成人のビフィドバクテリウム菌種分布の解析
合計で成人３３検体の糞便から抽出したＤＮＡを鋳型として各菌種特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、それぞれの個体のビフィドバクテリウムの菌種構成を調べた（表９）。このデータをもとに、それぞれの菌種の分布状況（検出率）を求めたところ、これら６菌種のうち最も広くヒト成人の腸管内に分布していたのはＢ．ロンガムの７０％で、ついでＢ．アドレスセンティス５８％、以下、Ｂ．シュードカテヌラータムの５５％、Ｂ．ビフィダム４２％、Ｂ．ブレーベ１５％、Ｂ．アングラータムが６％となっていて、Ｂ．インファンティスとＢ．ガリカムは検出されなかった。
【００５７】
乳児のビフィドバクテリウム菌種分布の解析
同様に生後１ケ月の乳児２７検体のビフィドバクテリウムの菌種構成を調べ（表１０）、それぞれの菌種の分布状況（検出率）をもとめたところ、最も検出率の高かったのは、Ｂ．ブレーベ７０％で、以下Ｂ．インファンティスの４１％、Ｂ．ロンガム３７％、Ｂ．ビフィダム２２％、Ｂ．カテヌラータムグループの１９％、Ｂ．アドレスセンティス７．４％、Ｂ．アングラータム３．７％となっていた。
【００５８】
方法
成人サンプル
健康成人３３名の糞便サンプルを用いた。被験者は我々の知る限りにおいて、腸疾患を持たず、サンプリング前の１週間は抗生物質の投与やヨーグルトなどの生菌の含まれる食品を摂取していない。
【００５９】
乳児サンプル
生後１ケ月の健常な母乳栄養児２７名について調べた。乳児は１９９７年に長崎大学附属病院で、通常分娩により生まれた。どの乳児も消化器系の異常はなく、また抗生物質の投与も受けていない。
【００６０】
糞便からのＤＮＡの抽出
健常な成人から採取した糞便１０mgをもちい、Ｚｈｕらのベンジルクロライド法に従ってＤＮＡを抽出した。糞便中に多く含まれるＰＣＲの阻害物質を除去する目的で、検体を１mlのＴＥに懸濁し、１５０００rpmで遠心分離後上清を捨てるという操作を３回繰り返した。このサンプルを２５０μｌのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４０mM ＥＤＴＡ，pH９．０）に浮遊し、５０μｌの１０％ＳＤＳを加えて凍結・融解を３回繰り返した。１５０μｌのベンジルクロリドを加え、ＭｉｃｒｏＩｎｃｕｂａｔｅｒＭ−３６（ＴＡＩＴＥＣＨ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により５０℃で３０分激しく振とうした。反応後、３ＭＳｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅを１５０μｌ添加し、氷中に１５分間静置した。１５０００rpmで１０分間遠心分離を行い、上清を別のチューブにとって等量のイソプロパノールを加え、析出したＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡを１００μｌのＴＥに溶解し、１μｌを鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００６１】
ＰＣＲの条件
ＰＣＲ反応は、総量を２５μｌとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ₂、２００μＭｄＮＴＰ混合物、各２５μＭプライマー、０．９ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、１μｌテンプレートＤＮＡを含む反応液で、ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（Ｈｙｂａｉｄ）により行った。反応液は、テンプレートＤＮＡの二本鎖の解離のため９４℃で３分加熱した後、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒を３５サイクルで行った。
増幅産物は１％アガロースで電気泳動後、臭化エチジウムで染色してＵＶ下でバンドの有無を観察した。
【００６２】
【表９】

【００６３】
【表１０】

【００６４】
実施例６プライマーを用いた各菌種の菌体数の比較定量：
（１）検出可能な鋳型ＤＮＡ濃度の検討
各プライマーが目的とする配列をＰＣＲ増幅するための鋳型ＤＮＡ量の下限を検討したところ、１００fg程度まで可能であった。そこで、糞便から抽出したＤＮＡの量を変えて各プライマーによるＰＣＲ反応を行えば、各菌種の比較定量が可能であると考えられた。そこで、成人男性２名（Adult D及びAdult F）に実施例３と同様にミルミルを投与し、その糞便中、すなわち腸内細菌叢を解析するため、糞便より抽出した鋳型ＤＮＡを１０ngから１０fgまで１０倍段階希釈し、菌株の比較定量化を図ることとした。
【００６５】
（２）細菌群の比較定量化
まず、各濃度の鋳型ＤＮＡと本発明のプライマーとを実施例２と同様の条件にてＰＣＲ反応に供した後、バンド形成の有無により細菌叢中に存在する菌種を同定した。その結果、ビフィドバクテリウム属細菌菌種により、検出可能な鋳型ＤＮＡ濃度が異なっていた（表１１、表１２）。このとき、検出可能な鋳型ＤＮＡ濃度が低いプライマー程、そのプライマーに特異的な菌種の濃度が高いものと予想される。
【００６６】
【表１１】

【００６７】
【表１２】

【００６８】
また、一方ビフィドバクテリウム属細菌に特異的な選択培地であるＭＰＮ培地、バクテロイデス属細菌に特異的な選択培地であるＶＬＭ−Ｂ培地、及び各種細菌の増殖培地であるＶＬＭ培地にて、上記の糞便サンプルを１０⁸倍希釈したものを培養し、培養後のコロニー数から総ビフィドバクテリウム属細菌数、総バクテロイデス属細菌数、総細菌数を算出した。また、これに合わせてビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌数も算出した。その結果、総ビフィドバクテリウム属細菌数はAdult Dで１．９×１０⁸Adult Fで２．７×１０¹⁰であり、ビフィドバクテリウム・ブレーベ菌数が４．６×１０⁷、ビフィドバクテリウム・ビフィダム菌数が６．４×１０⁷であった。その他の各菌数は表１３、表１４に示す。
【００６９】
【表１３】

【００７０】
【表１４】

【００７１】
本発明のプライマーにより、最も低濃度で検出できたビフィドバクテリウム属細菌は、ビフィドバクテリウム・カテヌラータムグループであり、次に低濃度で検出できたビフィドバクテリウム・アドレセンティスよりも１０倍低濃度であった。このため、ビフィドバクテリウム・カテヌラータムグループは最優勢の菌種であると考えられ、Adult Dでコロニー数から求めた総ビフィドバクテリウム属細菌数が１．９×１０¹⁰であったことと合わせて、その菌数は１０¹⁰オーダーと考えられた。また、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ビフィダムは共に１００pgで弱く検出されていた。これは弱く検出された濃度の約１００分の１〜１０００分の１であったので、両者の菌数は１０⁷〜１０⁸オーダーと推察され、コロニー数から求めた値と合致していた。ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ビフィダムは成人にはあまり一般的な菌種でないため、上記において検出されたものはミルミル由来の株であると考えられる。
【００７２】
また、Adult Fにおいてもビフィドバクテリウム・カテヌラータムグループは最も低濃度で検出されており、最優勢の菌種であることが示唆された。また、Ｂ．ブレーベ及びＢ．ビフィダムは１pgで弱く検出されており、Adult D と比べて１０〜１００倍の菌数が存在することが示唆され、コロニー数から算出した菌数と合致していた。このように、本発明のプライマーを用いた定量結果とコロニー数から算出した菌数は合致しており、本発明のプライマーを用いた定量方法の定量性が確認された。
【００７３】
【配列表】
＜１１０＞株式会社ヤクルト本社；財団法人ヤクルト・バイオサイエンス研究財団（KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA;ZAIDAN HOJIN YAKULT・ BIO SCIENCE KENKYU ZAIDAN ）
＜１２０＞ビフィドバクテリウム属細菌用プライマー
＜１３０＞Ｐ０３５６１００８
＜１５０＞ＪＰ１９９７−２１９５６７
＜１５１＞１９９７─８─１４
＜１６０＞１９
＜２１０＞１
＜２１１＞１９
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１
ctccagttgg atgcatgtc 19
＜２１０＞２
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞２
cgaaggcttg ctcccagt 18
＜２１０＞３
＜２１１＞２１
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞３
ccacatgatc gcatgtgatt g 21
＜２１０＞４
＜２１１＞１９
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞４
ccgaaggctt gctcccaaa 19
＜２１０＞５
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞５
ccggatgctc catcacac 18
＜２１０＞６
＜２１１＞１９
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞６
acaaagtgcc ttgctccct 19
＜２１０＞７
＜２１１＞２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞７
ttccagttga tcgcatggtc 20
＜２１０＞８
＜２１１＞２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞８
gggaagccgt atctctacga 20
＜２１０＞９
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞９
cacatgagcg catgcgag 18
＜２１０＞１０
＜２１１＞１９
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１０
tccactcaac acggccgaa 19
＜２１０＞１１
＜２１１＞１９
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１１
cagtccatcg catggtggt 19
＜２１０＞１２
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１２
gaaggcttgc tccccaac 18
＜２１０＞１３
＜２１１＞１９
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１３
gatccgggag tttgctgcc 19
＜２１０＞１４
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１４
cgaaggcttg ctcccgat 18
＜２１０＞１５
＜２１１＞２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１５
atccatcagg ctttgcttgg 20
＜２１０＞１６
＜２１１＞２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１６
gaggccatat ctctacggct 20
＜２１０＞１７
＜２１１＞２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１７
taataccgga tgttccgctc 20
＜２１０＞１８
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１８
acatccccga aaggacgc 18
＜２１０＞１９
＜２１１＞２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞１９
ggaaacccca tctctgggat 20
＜２１０＞２０
＜２１１＞１７
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞２０
cggatgctcc gactcct 17
＜２１０＞２１
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ Artificial Sequence
＜４００＞２１
tcscgcttgc tccccgat 18
【図面の簡単な説明】
【図１】ビフィドバクテリウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列のうちＶ２及びＶ３エリアを比較した図
【図２】ビフィドバクテリウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列のうちＶ６及びＶ１エリアを比較した図[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA primer useful for identifying a Bifidobacterium species and a method for identifying and analyzing a Bifidobacterium species using the same.
[0002]
[Prior art]
Identifying and analyzing the gut microbiota of humans and animals is very useful for grasping the health condition of individuals, pathological studies in the intestinal tract, and the like. Bifidobacterium, in particular, is a Gram-positive polymorphic gonococcus and is one of the most prevalent bacteria in human intestinal flora. It has important physiological effects such as nutrition and intestinal spoilage suppression, and it is important to understand the distribution of this species. At present, as the means, a selection method using a combination of various selective media and microscopic observation are mainly performed.
[0003]
In order to identify the bacterial species and analyze the intestinal microflora, it is necessary to dilute the feces of the subject individual with a diluent under anaerobic conditions, and to spread the stool on the medium for anaerobic culture. However, the culture takes several days to several weeks, and operations such as counting the number of colonies are complicated.
[0004]
In addition, the identification of Bifidobacterium species living in the intestines of humans and animals is mainly phenotypic, that is, glycolytic properties, fermentation products (such as lactic acid or acetic acid), general biological This is done by inspecting properties and the like. Moreover, the determination by DNA-DNA homology is also performed (INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 21, No. 4, p.276-294 (1971)).
[0005]
However, the identification method based on the phenotype is complicated and requires the skill of the examiner.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, identification and analysis of Bifidobacterium species require a long time and have problems such as complicated operations.
Therefore, an object of the present invention is to provide a method capable of quickly and easily identifying and analyzing Bifidobacterium species.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
  In view of the current situation, the present inventor conducted intensive research and found a DNA primer having a base sequence specific to a group consisting of species of Bifidobacterium or systematically related species. By using a PCR reaction of DNA derived from bacteria extracted from a specimen without culturing the bacteria, the species of Bifidobacterium spp. Or a group of closely related species can be obtained quickly and easily. The present invention has been completed by finding out that identification and analysis are possible.
[0008]
  That is, the present invention provides a primer for Bifidobacterium which comprises a base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 21 or a sequence complementary to the base sequence.
[0009]
  The present invention also includes SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, SEQ ID NOs: 11 and 12, SEQ ID NOs: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 And SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 7 and 19, SEQ ID NOs: 14 and 20, or SEQ ID NOs: 7 and 21, or a combination of primers consisting of these and complementary primer sequences, or The present invention provides a method for identifying a group consisting of systematically related species of Bifidobacterium or Bifidobacterium species characterized by using one primer selected from the primers .
[0010]
  The present invention further includes (1) a step of extracting DNA in a specimen, (2) SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, SEQ ID NOs: 11 and 12, SEQ ID NOs: 13 and 14, SEQ ID NOs: 15 and 16, SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 7 and 19, SEQ ID NOs: 14 and 20, or SEQ ID NOs: 7 and 21, or nucleotide sequences complementary thereto A step of performing a PCR reaction using a primer combination consisting of simple nucleotide sequences, or one primer selected from the primers according to claim 1, and (3) a step of detecting the DNA fragment amplified in step (2) The present invention provides a method for specific detection of a group consisting of systematically related species of Bifidobacterium or Bifidobacterium species.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As the target of the primer of the present invention, a highly reliable 16S rRNA gene was used as an index of phylogeny.
[0012]
The primer is obtained by comparing and examining the base sequence obtained by sequencing by the present inventor and a database (DDBJ, Genbank, etc.) and the base sequence obtained by newly sequencing by the present inventor for comparison. It is obtained. Here, as a comparison target, the present inventor newly sequenced 16S rRNA gene (Reference stock) Specifically, Bifidobacterium anguratam(Bifidobacterium angulatum) ATCC 27535 strain, Bifidobacterium animalis (Bifidobacterium animalis) ATCC25527 strain, Bifidobacterium boum (Bifidobacterium boum) JCM1211 stock, Bifidobacterium choelinum (Bifidobacterium choerinum) ATCC27686 shares, Bifidobacterium dentium (Bifidobacterium dentium) ATCC 27534 shares, Bifidobacterium gallicum (Bifidobacterium gallicum) JCM8224 shares, Bifidobacterium gallinarum (Bifidobacterium gallinarum) JCM6291 shares, Bifidobacterium indicam (Bifidobacterium indicum) JCM 1302 shares, Bifidobacterium infantis (Bifidobacterium infantis) ATCC15697 strain, Bifidobacterium magnum (Bifidobacterium magnum) JCM1218 shares, Bifidobacterium Melissicam (Bifidobacterium merycicum) JSM8219 shares, Bifidobacterium pseudocatenuratam (Bifidobacterium pseudocatenulatum) JCM1200 shares, Bifidobacterium pseudolongum subspecies globosum (Bifidobacterium pseudolongum ss.globosum) JCM5820Strain, Bifidobacterium pseudolongum Subspecies pseudolongum (Bifidobacterium pseudolongum ss. Pseudolongum) JCM1205 shares, Bifidobacterium prolam (Bifidobacterium pullorum) JCM1214 shares, Bifidobacterium luminantium (Bifidobacterium ruminantium) JCM8222 shares, Bifidobacterium saeclare (Bifidobacterium saeculare) DSM6531 shares, Bifidobacterium subutil (Bifidobacterium subtile) DSM20096 stock, Bifidobacterium denticorens (Bifidobacterium denticolens) DSM10105 shares, Bifidobacterium inopionatum (Bifidobacterium inopionatum) DSM10107 shares, Bifidobacterium catenuratum (Bifidobacterium catenulatum) ATCC 27539 strain, and these sequences were registered in the NIG database DDBJ.
[0013]
Alignment was performed between species of the genus Bifidobacterium. As a result, it was found that there are sequences specific to many bacterial species in the V2 area and the V3 area among the 9 variable regions in total (FIG. 1). Bifidobacterium longum and Bifidobacterium infantis are in the V6 area, and Bifidobacterium catenuratum and Bifidobacterium pseudocatenatum are in the V1 and V6 areas. (Fig. 2). Therefore, PCR primers were designed targeting the above region. The length of the oligonucleotide is 17-21b. p, which are the most preferred lengths for operation. However, in use, in each 16S rRNA gene, several to several tens of b. You may use what increased or decreased the base sequence of p.
[0014]
Among the primers thus obtained, those having the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2 are Bifidobacterium addresscentis.(Bifidobacterium adolescentis)Specific DNA primer.
[0015]
Further, those having the base sequences described in SEQ ID NOs: 3 and 4 are Bifidobacterium bifidum(Bifidobacterium bifidum)Specific DNA primer.
[0016]
Those having the base sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6 are Bifidobacterium breve.(Bifidobacterium breve)Specific DNA primer.
[0017]
Those having the base sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 are Bifidobacterium longum(Bifidobacterium longum)Specific DNA primer.
[0018]
Moreover, what has a base sequence of sequence number 9 and 10 is Bifidobacterium pseudoron gum.(Bifidobacterium pseudolongum) Specific DNA primer.
[0019]
Those having the base sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12 are Bifidobacterium angulatam( Bifidobacterium angulatum)Specific DNA primer.
[0020]
Those having the base sequences of SEQ ID NOs: 13 and 14 are Bifidobacterium catenuratum(Bifidobacterium catenulatum)Specific DNA primer.
[0021]
Further, those having the base sequences described in SEQ ID NOs: 15 and 16 are Bifidobacterium pseudocatenulatum(Bifidobacterium pseudocatenulatum)Specific DNA primer.
[0022]
Further, those having the base sequences described in SEQ ID NOs: 17 and 18 are Bifidobacterium gallicum(Bifidobacterium gallicum)Specific DNA primer.
[0023]
Further, those having the base sequences described in SEQ ID NOs: 7 and 19 are Bifidobacterium infantis(Bifidobacterium infantis)Specific DNA primer.
[0024]
The primers described in SEQ ID NOs: 7 and 21 are B.I. Not only Longum but B. Infantis, B.M. A band was also formed with the 16S rRNA gene of Zuis. However, these three species are systematically very closely related, the cell chain peptide chain and murein (acid) are the same, and the DNA-DNA homology is around 70%. B. Since it can be recognized by the Longham group, it can be used without any particular difficulty in identifying Bifidobacterium species.
[0025]
Furthermore, the primers described in SEQ ID NOs: 14 and 20 are B.I. Catenuratum and B.I. A band was also formed with the 16S rRNA gene of pseudocatenulatum. However, for these two species, B.B. Since it can be recognized as a catenuratum group, it can be used without any problems.
[0026]
The oligonucleotide primer designed as described above is artificially synthesized by a DNA synthesizer according to the base sequence. The species specificity was confirmed by using the band-forming ability of the primer for 16S rRNA of Bifidobacterium and representative intestinal bacteria as an index. As a result, B. Address Scentis, B.I. Bifidham, B. Breve, B. Pseudoron gum, B.M. Catenuratum, B.I. Anglertam, B.B. Pseudocatenuratam, B.B. Gallicum, B.B. There was no problem with the specificity of the primer for Infantis. B. Primers for longum are A band was also formed with the 16S rRNA gene of Zuis. However, these two bacterial species are systematically very closely related, the DNA-DNA homology is 75-78%, and the similarity of 16S rRNA sequences exceeds 99.7%. Should be reclassified, and even if they cannot be distinguished, there is no particular problem.
[0027]
  Since the primer of the present invention has such specificity, DNA can be extracted directly from a colony formed on the selective medium TOS or MPN for Bifidobacterium using these or from cultured cells. By examining the reactivity with each primer, simple identification of a group consisting of bacterial species or systematically related species can be performed.
  Moreover, if the primer of this invention is used, the distribution | distribution in the group level which consists of a microbial species of each individual | organism | solid or a systemically related species is possible, without culturing. Examples of such a method include the following method.
[0028]
First, DNA is extracted from stool or the like and used as a PCR sample.
As a method for extracting DNA from a diluted solution such as feces, the Marmur method which is a conventional method, the enzyme method which is a modified method thereof, and the benzyl chloride method are preferable. Although these methods are somewhat complicated, DNA can be extracted with a high yield from a wide variety of bacterial species in the enzymatic method. In addition to the above-described method, a phenol method or the like can be suitably used for DNA extracted from purely cultured bacteria or the like. Alternatively, a part of the cells can be suspended in a buffer or sterilized water and heated at 95 ° C. for about 15 minutes to be used as a template for PCR.
[0029]
  A species- or group-specific DNA sequence (PCR product) can be obtained by combining the extracted DNA with a species- or group-specific primer and performing an amplification reaction. Usually, when using primers for PCR or the like, it is preferable to use two types of primers as one set. For example, if the primers according to SEQ ID NOs: 1 and 2 are used, an amplification reaction occurs between both primers only in the Bifidobacterium adrecentis DNA among the many types of bacteria, and this is identified. Can do. Thus, when using two types of primers as a set, it is necessary to make both become a combination of a leading strand and a lagging strand. In addition, when performing the PCR reaction, the annealing temperature is set to be almost constant, so it is possible to simultaneously test five types of primers. In addition, when PCR is performed, the amount of DNA in the template is serially diluted, the detection limit is obtained, and the same analysis is performed, so that the target bacterial species can be quantified.
[0030]
  When the DNA thus obtained is electrophoresed, a group consisting of bacterial species or systematically related species can be identified from the presence or absence of a band and the primers used.
[0031]
  Moreover, since the primer of the present invention has a group-specific sequence consisting of bacterial species or systematically related species, it can be used alone as a probe. Furthermore, the primer of the present invention can be used alone or in combination with other known universal primers or oligonucleotides.
[0032]
  Further, by using the primer of the present invention, it is possible to analyze the intestines of humans and animals. At present, it is impossible to detect any species other than Bifidobacterium spp. Or a group of closely related species, but if the distribution and number of Bifidobacterium spp. Various information such as health status can be obtained. Furthermore, if it is used in combination with other various bacterial primers, it is possible to grasp the whole image of the bacterial flora.
[0033]
【The invention's effect】
  By using the primer of the present invention, it is possible to identify a group consisting of Bifidobacterium species or systematically related species quickly, simply, at low cost and with high accuracy without culturing the bacteria. Can do. In addition, the intestinal bacterial flora can be analyzed by using in combination with other species-specific primers. Furthermore, since the state of the digestive tract and the like can be grasped from the result of the analysis, it becomes easy to prevent and treat various diseases.
[0034]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these.
[0035]
Example 1 Primer design and synthesis:
A species-specific primer was designed based on the 16S rRNA gene sequence of Bifidobacterium bacteria obtained from databases such as DDBJ and Genbank, and the above 16S rRNA gene sequence decoded by the present inventors. Bacteria-specific sequences were found in the V1, V2, V3, and V6 areas of the variable region, and primers were prepared using this as a target. Since the duplex forming ability of the primer depends on the GC content and the number of bases in the base sequence, the number of bases varies with the GC content. Primers were synthesized using a DNA synthesizer in accordance with the designed base sequence.
[0036]
[Table 1]

[0037]
Example 2 Identification of bacterial species using a primer and confirmation of bacterial species specificity:
In order to confirm whether the primer of the present invention actually has species specificity, the following experiment was conducted.
(1) Pure strain culture and DNA extraction
The 47 Bifidobacterium genus bacteria of 31 strains shown in Tables 2 and 3 and the representative intestinal bacteria of 15 genus and 15 species were purely cultured overnight in a GAM broth medium (Nissui). At this time, the anaerobic bacteria were anaerobically cultured and the aerobic bacteria were aerobically cultured. DNA was extracted from each of the 62 types of bacterial cells thus obtained by the phenol method using glass beads.
[0038]
(2) PCR reaction
The total volume is 25 μl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 15 mM (NH_Four)₂SO_Four, 25 mM MgCl₂, 0.45% TritonX-100, 200 μM dNTPmixture 200 mg / ml BSA, each containing 0.25 μM primer, 0.9 UTaq DNA polymerase (Biotech International), 10 ng template DNA, Hybaid Touchdown Terminal Cycler (Label) After heat denaturation at 94 ° C. for 5 minutes, PCR reaction was performed for 30 cycles of 94 ° C. for 20 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. Under these conditions, 62 types of sample (1) were reacted with the primer of the present invention.
[0039]
(3) Examination of species specificity of primers
The PCR product obtained in (2) was electrophoresed, and the specificity of the primer was determined based on the presence or absence of a band. Electrophoresis was performed with 1% LO.3Agarose (manufactured by Takara) at 100 V for 25 minutes using a mupit, and after staining with ethidium bromide, the presence or absence of a band was observed under a UV lamp. As a result, as shown in Tables 2 and 3, the primer formed a band specifically for the genus Bifidobacterium. Specifically, the target PCR product was obtained from the target B. adolescentis 4 strains, but other Bifidobacterium and enterobacteria could not obtain the desired PCR product, and this specific product was obtained. It was found that B. adolescentis can be specifically detected by the primer BiADO. Similarly, when the specificity of other Bifidobacterium species-specific primers was examined, BiBIF, BiBRE, BiANG, and BiPDL could specifically detect B. bifidum, B. breve, B. angulatum, and B. pseudolongum, respectively. I understood.
[0040]
On the other hand, BiLONg In addition to Longum, Inphatis, B.M. A PCR product was also produced using the DNA of Zuis as a template. However, these three are systematically very closely related species, and their DNA-DNA homology is around 70%, so there is a high possibility that they will be reclassified to the same bacterial species in the future. Therefore, these three species are Since it can be recognized as a longum group and the expression is similar, it is considered that there is no particular problem even if these cannot be clearly distinguished. BiCATg In addition to catenuratum It was found that a PCR product was also produced using pseudo-catenulatum DNA as a template. However, in this case as well, both are systematically very closely related species, and there is a high possibility that they will be reclassified to the same bacterial species in the future. Therefore, even if they cannot be clearly distinguished, it is considered that there will be no problem.
[0041]
Similarly, BiPSC, BiGAL, BiLON, and BiINF were also tested. The results are shown in Tables 4-6.
[0042]
[Table 2]

[0043]
[Table 3]

[0044]
[Table 4]

[0045]
[Table 5]

[0046]
[Table 6]

[0047]
Example 3 Identification and analysis of strains of human intestinal flora using primers:
(1) Fecal sampling
An attempt was made to detect Bifidobacterium at the bacterial species level without performing culture by performing a PCR reaction using DNA directly extracted from a human stool sample as a template. As a sample, a sample obtained by collecting feces of 8 healthy adult men was used. Four adult males are mil-mills (our products: average per bottleLactobacilus acidophilus2 × 10⁹,Bifidobacterium bifidum10⁹,Bifidobacterium breve10^TenIncluding the administration group and the non-administration group, the effect on the gut microbiota by the presence or absence of fermented milk administration before and after sampling was also examined. That is, after the administration of food containing fermented milk and other fermented bacteria to both groups was stopped for 4 weeks, 4 people were allowed to drink milmil 3 times a day after meals, and the other 4 were free of bacteria. The same amount of the same pseudo-mill was drunk. Four weeks after the start of drinking, feces were collected, washed with TE buffer, divided into 50 mg portions, and stored at -80 ° C.
[0048]
(2) DNA extraction
DNA was extracted using an enzymatic method. Sample 500 μl of 50 mM
The suspension was suspended in Tris-HCl (pH 8.0) -10 mM EDTA-10 mM NaCl, and freezing and thawing were repeated twice. Thereafter, 100 μl of a 10 mg / ml achromopeptidase solution, 7.5 μl of a 50 mg / ml lysozyme solution and 25 μl of a 0.5 mg / ml N-acetylmuramidase solution were added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. Furthermore, 20% SDS solution (final 1.5%) and 4 μl of 10 mg / μl proteinase K solution were added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. Phenol-chloroform-isoamyl alcohol treatment was performed. Next, 1/20 volume RNase A solution (1 mg / ml) was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After treatment with phenol-chloroform-isoamyl alcohol, ethanol precipitation was performed. The precipitate was dissolved in 400 μl TEbuffer and purified by ultrafiltration tube C3 LTK (Millipore). Further, the yield of DNA was determined by measuring the absorbance in the ultraviolet region.
[0049]
(3) PCR reaction
Under the same conditions as in Example 2 (2), the sample of (1) was reacted with each primer.
[0050]
(4) Confirmation of PCR products
When PCR products were confirmed by electrophoresis, Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium breve of the same bacterial species as the administered bacteria were detected in all samples in the Milmil administration group. In the non-administration group, Bifidobacterium bifidum was detected in 2 out of 4 people and Bifidobacterium breve was detected in 1 out of 4 people. It was not possible to confirm whether these bacteria originally existed in the intestines or were administered. On the other hand, Bifidobacterium catenellatum and Bifidobacterium longum were detected in all 8 people, and Bifidobacterium adrecentis was also detected in 7 out of 8 people. Presumed to be. The results are shown in Table 7.
[0051]
[Table 7]

[0052]
Example 4 Species identification of wild strains using primers:
First, we attempted to identify the species of Bifidobacterium wild strains using the prepared primers. DNA was extracted from each strain in Table 8, and PCR was performed using this as a template to examine which primer was used to obtain an amplification product.
[0053]
On the other hand, when a DNA-DNA homology test, which is the most accurate identification method, was performed as a conventional method, the results obtained with the primer of the present invention were in agreement (Table 8). (21. Scardovi, V.1984. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen, 1924, 472, p1418-1434. In NRKrieg and JGHolt (ed), Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol. 1. The Williamd & Wilkins Co , Baltimore.), The identification of the bacterial species was performed, and almost the same results as those obtained with the primer of the present invention were obtained (Table 8).
[0054]
[Table 8]

[0055]
In the DNA-DNA homology test, Catenulatum and B.C. Pseudocatenuratam, B.B. Longham and B.C. Since Infantis is a related species, it showed high homology with each other, but one was higher than the other by about 20%, and was distinguishable.
[0056]
Example 5
Analysis of Bifidobacterium species distribution in adults
PCR amplification was performed using DNA extracted from the stool of 33 adults in total as a template using each bacterial species-specific primer, and the bacterial species composition of each individual Bifidobacterium was examined (Table 9). Based on this data, the distribution status (detection rate) of each bacterial species was determined. Among these 6 bacterial species, B. was the most widely distributed in the intestinal tract of human adults. 70% of longum followed by B. Address Scentis 58%, B.B. 55% of Pseudocatenuratam; Bifidum 42% Brave 15%, B.I. Anglertam is 6%. Infantis and B.B. Gallicum was not detected.
[0057]
Analysis of Bifidobacterium species distribution in infants
Similarly, the Bifidobacterium species composition of 27 infants 1 month old was examined (Table 10), and the distribution status (detection rate) of each species was determined. B. Brave 70%, B. 41% of Infantis; Longum 37%, B.I. Bifidum 22% 19% of the catenuratum group, Address Scentis 7.4%, B.I. Anglertam was 3.7%.
[0058]
Method
Adult sample
Fecal samples from 33 healthy adults were used. To the best of our knowledge, the subject has no bowel disease and has not taken antibiotics or foods containing live bacteria such as yogurt for a week prior to sampling.
[0059]
Infant sample
Twenty seven healthy breastfeeding infants a month after birth were examined. Infants were born in 1997 at Nagasaki University Hospital, usually by delivery. None of the infants have digestive abnormalities and are not taking antibiotics.
[0060]
DNA extraction from feces
Using 10 mg of stool collected from a healthy adult, DNA was extracted according to the benzyl chloride method of Zhu et al. In order to remove PCR inhibitors contained in a large amount of feces, the procedure of suspending the specimen in 1 ml of TE, centrifuging at 15000 rpm, and discarding the supernatant was repeated three times. This sample was suspended in 250 μl of Extraction Buffer (100 mM Tris-HCl, 40 mM EDTA, pH 9.0), 50 μl of 10% SDS was added, and freezing / thawing was repeated three times. 150 μl of benzyl chloride was added and shaken vigorously with Micro Incubator M-36 (TAITECH, Tokyo, Japan) at 50 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 150 μl of 3M sodium acetate was added and allowed to stand in ice for 15 minutes. Centrifugation was performed at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was added to another tube to which an equal amount of isopropanol was added, and the precipitated DNA was collected. The obtained DNA was dissolved in 100 μl of TE, and 1 μl was used as template DNA.
[0061]
PCR conditions
In the PCR reaction, the total amount was 25 μl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl.₂, 200 μM dNTP mixture, each 25 μM primer, 0.9 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer), 1 μl template DNA, and a reaction solution containing Touchdown Thermal Cycler (Hybaid). The reaction solution was heated at 94 ° C. for 3 minutes to dissociate the double strands of the template DNA, and then subjected to 94 ° C. for 20 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds in 35 cycles.
The amplified product was electrophoresed with 1% agarose, stained with ethidium bromide, and the presence or absence of a band was observed under UV.
[0062]
[Table 9]

[0063]
[Table 10]

[0064]
Example 6 Comparative quantification of the number of cells of each species using a primer:
(1) Examination of detectable template DNA concentration
When the lower limit of the amount of template DNA for PCR amplification of the target sequence of each primer was examined, it was possible to reach about 100 fg. Therefore, it was considered that comparative quantification of each bacterial species was possible by performing a PCR reaction with each primer while changing the amount of DNA extracted from stool. Therefore, two adult males (Adult D and Adult F) were administered millil as in Example 3, and the template DNA extracted from the stool was analyzed from 10 ng to 10 fg in order to analyze the stool, that is, the intestinal bacterial flora. We decided to dilute 10 times and to compare and quantify the strains.
[0065]
(2) Comparative quantification of bacterial groups
First, the template DNA of each concentration and the primer of the present invention were subjected to a PCR reaction under the same conditions as in Example 2, and then the bacterial species present in the bacterial flora were identified by the presence or absence of band formation. As a result, the detectable template DNA concentration was different depending on the Bifidobacterium species (Tables 11 and 12). At this time, a primer having a lower detectable template DNA concentration is expected to have a higher concentration of bacterial species specific to the primer.
[0066]
[Table 11]

[0067]
[Table 12]

[0068]
On the other hand, in the MPN medium, which is a selective medium specific to Bifidobacterium, VLM-B medium, which is a selective medium specific to Bacteroides, and the VLM medium, which is a growth medium for various bacteria, 10 fecal samples⁸The double dilution was cultured, and the total number of Bifidobacterium, total Bacteroides, and total bacteria were calculated from the number of colonies after culture. In accordance with this, the number of Bifidobacterium breve and Bifidobacterium bifidum was also calculated. As a result, the total number of Bifidobacterium was 1.9 × 10 in Adult D.⁸2.7 × 10 for Adult F^TenAnd the number of Bifidobacterium breve bacteria is 4.6 × 10⁷, Bifidobacterium bifidum count is 6.4 × 10⁷Met. The numbers of other bacteria are shown in Tables 13 and 14.
[0069]
[Table 13]

[0070]
[Table 14]

[0071]
The Bifidobacterium genus bacteria detected at the lowest concentration by the primer of the present invention is the Bifidobacterium catenuratum group, and then Bifidobacterium adrecentis detected at the lower concentration. The concentration was 10 times lower. Therefore, the Bifidobacterium catenuratum group is considered to be the most dominant species, and the total number of Bifidobacterium genus determined from the number of colonies by Adult D is 1.9 × 10.^TenAnd the number of bacteria is 10^TenIt was considered an order. Both Bifidobacterium breve and Bifidobacterium bifidum were weakly detected at 100 pg. Since this was about 1/1000 to 1 / 1,000 of the weakly detected concentration, the number of both bacteria was 10⁷-10⁸It was inferred as an order and was consistent with the value obtained from the number of colonies. Since Bifidobacterium breve and Bifidobacterium bifidum are not very common species in adults, those detected above are considered to be strains derived from Milmil.
[0072]
Also in Adult F, the Bifidobacterium catenuratum group was detected at the lowest concentration, suggesting that it is the most dominant species. B. Breve and B. Bifidum was weakly detected at 1 pg, suggesting that the number of bacteria was 10 to 100 times that of Adult D, and was consistent with the number of bacteria calculated from the number of colonies. Thus, the quantification result using the primer of this invention and the number of bacteria computed from the number of colonies corresponded, and the quantitative property of the quantification method using the primer of this invention was confirmed.
[0073]
[Sequence Listing]
<110> Yakult Honsha Co., Ltd .; Yakult Bioscience Research Foundation (KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA; ZAIDAN HOJIN YAKULT, BIO SCIENCE KENKYU ZAIDAN)
<120> Primer for Bifidobacterium
<130> P03561008
<150> JP 1997-219567
<151> 1997-8-14
<160> 19
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctccagttgg atgcatgtc 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgaaggcttg ctcccagt 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccacatgatc gcatgtgatt g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccgaaggctt gctcccaaa 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccggatgctc catcacac 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
acaaagtgcc ttgctccct 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ttccagttga tcgcatggtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gggaagccgt atctctacga 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cacatgagcg catgcgag 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tccactcaac acggccgaa 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cagtccatcg catggtggt 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gaaggcttgc tccccaac 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gatccgggag tttgctgcc 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cgaaggcttg ctcccgat 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
atccatcagg ctttgcttgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gaggccatat ctctacggct 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
taataccgga tgttccgctc 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
acatccccga aaggacgc 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ggaaacccca tctctgggat 20
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
cggatgctcc gactcct 17
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
tcscgcttgc tccccgat 18
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram comparing the V2 and V3 areas of the 16S rRNA sequences of Bifidobacterium spp.
FIG. 2 is a diagram comparing the V6 and V1 areas in the 16S rRNA sequence of Bifidobacterium spp.

Claims

A primer for a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium comprising a base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 21 or a sequence complementary to the base sequence.

SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NO: 1 selected from 17 and 18, SEQ ID NOs: 7 and 19, SEQ ID NOs: 14 and 20, or SEQ ID NOs: 7 and 21, or a primer combination consisting of a complementary base sequence, or a primer according to claim 1 A method for identifying a group of Bifidobacterium species or a species of Bifidobacterium species characterized by using a primer of

(1) Step of extracting DNA in a specimen, (2) SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, SEQ ID NOs: 11 and 12 SEQ ID NOs: 13 and 14, SEQ ID NOs: 15 and 16, SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 7 and 19, SEQ ID NOs: 14 and 20, or SEQ ID NOs: 7 and 21, or a complementary nucleotide sequence thereof. A step of performing a PCR reaction using a primer combination or one primer selected from the primers according to claim 1 and a step of (3) detecting a DNA fragment amplified by step (2). A method for specific detection of a group consisting of species of closely related bacteria or a species of Bifidobacterium.

(1) Step of extracting DNA in a specimen, (2) SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, SEQ ID NOs: 11 and 12 SEQ ID NOs: 13 and 14, SEQ ID NOs: 15 and 16, SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 7 and 19, SEQ ID NOs: 14 and 20, or SEQ ID NOs: 7 and 21, or a complementary nucleotide sequence thereof. A step of performing a PCR reaction using a primer combination or one primer selected from the primers according to claim 1 and a step of (3) detecting a DNA fragment amplified by step (2). A specific quantification method for a group consisting of systematically related species of bacteria or Bifidobacterium species.