JP2006136338A - Primer for prevotella and detection method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、腸内細菌の同定に有用なＤＮＡプライマー、プローブ及びこれを用いた腸内細菌の菌属、菌種特異的な検出・同定・解析方法に関するものである。 The present invention relates to DNA primers and probes useful for the identification of enteric bacteria and a method for detection / identification / analysis specific to the genus and species of enteric bacteria using the same.
ヒトや動物等の腸内には多様な細菌が生息し、腸内細菌叢を形成している。このような腸内細菌としてはビフィドバクテリウム属細菌やバクテロイデス属細菌等様々なものがあり、宿主である生体の生理状態等に影響を与えている。 A variety of bacteria inhabit the intestines of humans and animals, forming intestinal flora. There are various intestinal bacteria such as Bifidobacterium and Bacteroides, which affect the physiological state of the host organism.
例えば、ビフィドバクテリウム属細菌や乳酸菌等の腸内有用細菌数が増加すると、整腸効果、免疫賦活効果が高まることが知られており、また、腸内最優勢菌の１つであるバクテロイデスグループの細菌などは、菌体表面のＬＰＳ（lipopolysaccarido）にトキシン様の毒素活性があることも見出されているため、比較的悪玉菌として認識されている。 For example, it is known that when the number of intestinal useful bacteria such as Bifidobacterium and lactic acid bacteria increases, the intestinal regulating effect and the immunostimulatory effect increase, and Bacteroides, which is one of the most dominant bacteria in the intestine, is also known. Group bacteria and the like are recognized as relatively bad bacteria because LPS (lipopolysaccarido) on the surface of the cell body has been found to have toxin-like toxin activity.
従ってヒトや動物等の腸内細菌叢を解析することは、個体の健康状態の把握、腸管内の病理的研究等に非常に有用である。現状ではその手段として、種々の選択培地を組み合せて用いる選別方法や顕微鏡観察が主に行われている。 Therefore, analyzing the intestinal bacterial flora of humans and animals is very useful for grasping the health condition of individuals, pathological studies in the intestinal tract, and the like. At present, as the means, a selection method using a combination of various selective media and microscopic observation are mainly performed.
このため、菌種の同定、腸内細菌叢の解析を行うためには、対象となる個体の糞便を嫌気条件下において希釈液で希釈し、これを培地上にまき、嫌気性培養を行う必要がある。しかし、培養の際には数日から数週間の時間を要することとなり、コロニー数のカウント等操作も煩雑で、試験者の熟練を要するものであった。 Therefore, in order to identify the bacterial species and analyze the intestinal flora, it is necessary to dilute the feces of the target individual with a diluent under anaerobic conditions, and to spread this on the medium for anaerobic culture There is. However, it takes several days to several weeks for culturing, and operations such as counting the number of colonies are complicated and require skill of the tester.
また、近年では、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われるようになっている（非特許文献１）。しかしながら、この同定法も長時間を要し、迅速な菌種同定を行うには好ましいものではなかった。 In recent years, determination based on DNA-DNA homology has also been performed (Non-patent Document 1). However, this identification method also takes a long time, and is not preferable for rapid bacterial species identification.
上記検出法の問題点を解消するため、本出願人らはある種の腸内細菌に特異的なプローブやプライマーを用いて、菌の同定を行う方法を検討し、例えばバクテロイデスグループ細菌に特異的なプローブ（特許文献１）、ビフィドバクテリウム属細菌菌種に特異的なプライマー（特許文献２）を開示している。この方法によれば、菌の同定・検出を簡便、迅速に行えるが、ヒト腸内にはこの他にも様々な細菌が存在しているため、上記の他の菌をもカバーできるプライマーやプローブのセットも要望されている。 In order to solve the problems of the above detection method, the present applicants examined a method for identifying a bacterium using a probe or primer specific to a certain intestinal bacterium, for example, specific to a Bacteroides group bacterium. Probe (Patent Document 1) and a primer specific to Bifidobacterium species (Patent Document 2) are disclosed. According to this method, bacteria can be identified and detected easily and quickly. However, since there are various other bacteria in the human intestine, primers and probes that can cover other bacteria mentioned above. The set is also requested.
しかしながら、腸内細菌の同定等に使用しうるプライマーを設計するためには、遺伝子のシークエンシング、アライメント等かなりの手間がかかるばかりか、せっかく設計した配列でプライマーを合成しても、種々の菌と反応してしまい、必要な菌に対する特異性が得られないものであることが多い。このため、腸内の菌の動向を把握するのに十分なプライマーが更に求められていた。
従って、本発明の目的は、ヒト腸内において検出される各種の菌を属もしくは菌種レベルで特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to synthesize primers capable of specifically identifying various bacteria detected in the human intestine at the genus or species level, and to quickly and easily identify and analyze the bacteria using these primers. It is to provide a method.
斯かる実状に鑑み本発明者は、多大な労力を投入し、種々の遺伝子のシークエンシング、アライメント等々の煩雑な作業を行った結果、各種腸内細菌に特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマーを見出し、これを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に上記の菌の同定・解析が可能となることを見出し本発明を完成した。 In view of such a situation, the present inventor has invested a great deal of effort and performed complicated operations such as sequencing and alignment of various genes. As a result, DNA primers having base sequences specific to various intestinal bacteria have been obtained. The headline, and using this, the present invention was completed by finding that the above bacteria can be identified and analyzed quickly and easily by PCR reaction of DNA derived from bacteria extracted from a specimen without culturing the bacteria. did.
すなわち、本発明は、配列番号３若しくは２７に記載の塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるプレボテラ用プライマー又はプローブを提供するものである。 That is, the present invention provides a prebotella primer or probe comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 27 or a sequence complementary to the nucleotide sequence.
また、本発明は、配列番号３と２７に記載の塩基配列の組み合せ又はこれらの塩基配列の組み合せに相補的な配列からなるプレボテラ用プライマーを提供するものである。 In addition, the present invention provides a prebotera primer comprising a combination of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 3 and 27 or a sequence complementary to the combination of these nucleotide sequences.
更に、本発明は、上記プライマーを使用することを特徴とするプレボテラの検出方法を提供するものである。 Furthermore, the present invention provides a prevotella detection method characterized by using the above-mentioned primer.
更にまた、本発明は、（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程及び（２）上記プライマーを用いてＰＣＲ反応を行う工程を含むプレボテラの検出方法を提供するものである。 Furthermore, the present invention provides a method for detecting Prevotella comprising (1) a step of extracting DNA in a specimen and (2) a step of performing a PCR reaction using the above-mentioned primers.
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度に腸内細菌の検出・同定を行うことができる。また他の菌に特異的なプライマー等と組み合せて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行い消化管等の状態を把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。 By using the primer of the present invention, intestinal bacteria can be detected and identified quickly, easily, at low cost and with high accuracy without culturing bacteria. Further, by using in combination with primers specific to other bacteria, etc., it is possible to analyze the gut microbiota and grasp the state of the gastrointestinal tract, etc., so that prevention and treatment of various diseases and the like are facilitated.
本発明の抽出に特異的なプライマーを具体的に挙げれば、属特異的プライマーであるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属特異的プライマー、バクテロイデス（Bacteroides）グループ細菌のサブグループ特異的プライマーであるバクテロイデス（Bacteroides）クラスター特異的プライマー、プレボテラ（Prevotella）クラスター特異的プライマー、クロストリジウム（Clostridium）クラスターＸＩＶ特異的プライマー、及び菌種特異的プライマーであるバクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、バクテロイデス・セタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、バクテロイデス・エガーシィー（Bacteroides eggerthii）、バクテロイデス・ブルゲイタス（Bacteroides vulgatus）、クロストリジウム・スフェノイデス（Clostridium sphenoides）、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、クロストリジウム・イノカム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・パラプトリフィカム（Clostridium paraputrificum）、クロストリジウム・バイファーメンタンス（Clostridium bifermentans）、クロストリジウム・ディフィサイル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・ソルデリー（Clostridium sordellii) 、クロストリジウム・クロストリジフォーム（Clostridium clostridiiforme）、クロストリジウム・ネクサイル（Clostridium nexile）、クロストリジウム・コクレアータム（Clostridium cocleatum）を例示することができる。 By way of primers specific to the extraction of the present invention specifically, Bifidobacterium (Bifidobacterium) genus-specific primer is a genus-specific primers, a subgroup-specific primers Bacteroides (Bacteroides) Groups bacteria Bacteroides ( Bacteroides) cluster specific primers, Prevotella (Prevotella) cluster specific primers, Clostridium (Clostridium) cluster XIV-specific primers, and Bacteroides ovatus (Bacteroides ovatus a species-specific primers), Bacteroides Seta thetaiotaomicron (Bacteroides thetaiotaomicron ), Bacteroides fragilis (Bacteroides fragilis), Bacteroides Yuniforumisu (Bacteroides uniformis), Bacteroides Egashii (Bacteroides eggerthii), Bakuteroide Vinegar Burugeitasu (Bacteroides vulgatus), Clostridium Sufenoidesu (Clostridium sphenoides), Clostridium Indorisu (Clostridium indolis), Clostridium Inokamu (Clostridium innocuum), Clostridium Ramosamu (Clostridium ramosum), Clostridium perfringens (Clostridium perfringens), Clostridium butyricum (Clostridium butyricum), Clostridium para Putri Fi cam (Clostridium paraputrificum), Clostridium by fermentans (Clostridium bifermentans), Clostridium Difisairu (Clostridium difficile), Clostridium Soruderi (Clostridium sordellii), Clostridium cross birds di form (Clostridium clostridiiforme), Clostridium Nekusairu (Clostridium nexile), it can be exemplified Clostridium Kokureatamu (Clostridium cocleatum).
バクテロイデスグループ（Bacteroidesceae）細菌は、グラム陰性の嫌気性菌であり、ヒトの腸管内における最優勢菌である。バクテロイデスグループには、近年新しい属が提唱され、そのサブグループは、バクテロイデス（Bacteroides）クラスター、プレボテラ（Prevotella）クラスター、ポルフィロモナス（Porphyromonas）クラスター、ニュー１（New1）、ニュー２（New2）の５つに大別される。 Bacteroides Roy Death Group (Bacteroidesceae) bacteria are anaerobic bacteria Gram-negative, which is the most predominant bacteria in the intestinal tract of a human. The Bacteroides Roy Death group, in recent years new genus proposed, is the sub-group, Bacteroides 5 (Bacteroides) cluster, Prevotella (Prevotella) cluster, Porphyromonas (Porphyromonas) cluster, New 1 (New1), New 2 (New2) It is roughly divided into two.
上記バクテロイデス属細菌は、全てバクテロイデスサブグループ内のバクテロイデスクラスター内に属する。クロストリジウム属細菌は、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・パラプトリフィカムがクラスター１に、クロストリジウム・ディフィサイル、クロストリジウム・バイファーメンタンス、クロストリジウム・ソルデリーがクラスター１１に、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・インドリス、クロストリジウム・クロストリジフォーム、クロストリジウム・ネクサイルがクラスター１４ａに、クロストリジウム・イノカムがクラスター１６に、クロストリジウム・ラモーサム、クロストリジウム・コクレアータムがクラスター１８にそれぞれ属する。 All the Bacteroides bacteria belong to the Bacteroides cluster within the Bacteroides subgroup. Clostridium bacteria include Clostridium perfringens, Clostridium butyricum, Clostridium paraporificum in cluster 1, Clostridium difficile, Clostridium bifermentans, Clostridium soldery in cluster 11, Clostridium sphenoides, Clostridium indolith, Clostridium clostriform, Clostridium nexil belong to cluster 14a, Clostridium innocam belongs to cluster 16, Clostridium lamosam, and Clostridium cocleatum belong to cluster 18, respectively.
上記の腸内細菌に特異的なプライマーを作成するにあたり、そのターゲットには系統分類の指標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析には、ＰＣＲ法等の手段が必要となるため、ＲＮＡでなくＤＮＡを用いた。 In creating a primer specific to the above enterobacteria, a highly reliable 16S rRNA gene is used as a phylogenetic index for the target, and means such as PCR is required for identification and analysis. DNA was used instead of RNA.
プライマーは、本発明者がシークエンスを行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Genbank等）や本発明者が比較対象として新たにシークエンスを行って得た塩基配列とを比較・検討することにより得たものである。ここで本発明者が比較対象として新たに１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種は、具体的には、クロストリジウム・パーフリンジェンスＪＣＭ１２９０T、クロストリジウム・ブチリカムＪＣＭ１３９１T、クロストリジウム・バイファーメンタンスＪＣＭ１３８６T、クロストリジウム・ディフィサイルＪＣＭ１２９６０T、クロストリジウム・ソルデリーＪＣＭ３８１４T、クロストリジウム・スフェノイデスＪＣＭ１４１５T、クロストリジウム・コクレアータムＪＣＭ１３９７T、クロストリジウム・インドリスＪＣＭ１３８０Tである。これらの配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録する予定である。 The primer is obtained by comparing and examining the base sequence obtained by sequencing by the present inventor and a database (DDBJ, Genbank, etc.) or the base sequence obtained by newly sequencing by the present inventor for comparison. It is a thing. Here, the bacterial species for which the present inventors have newly sequenced the 16S rRNA gene for comparison are specifically Clostridium perfringens JCM1290 T , Clostridium butyricum JCM1391 T , Clostridium bifermentans JCM1386 T , Clostridium Difisairu JCM12960 T, Clostridium Soruderi JCM3814 T, is a Clostridium Sufenoidesu JCM1415 T, Clostridium Kokureatamu JCM1397 T, Clostridium Indorisu JCM1380 T. These sequences will be registered in the NIG database DDBJ.
プライマーの設計の際には、同定の対象となる菌とその近縁の菌を配列をアライメントした。その結果、ビフィドバクテリウム属に特異的なプライマーでは、大腸菌のナンバリングにおける１５３〜１６９領域と７２０〜６９９領域に属に特徴的な配列があり、以下バクテロイデスクラスターでは１４９〜１６９領域と６４６〜６２６領域に、プレボテラクラスターでは８０３〜８２７領域と１３３５〜１３１１領域に、クロストリジウムクラスターＸＩＶでは４７７〜４９６領域と９１６〜８９５領域に属に特徴的な配列があったので、この領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計した。また、オリゴヌクレオチドの長さはプライマーによって異なっており、１５〜２５ｂ．ｐとなっている。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂ．ｐの塩基配列を増減させたものを用いても良い。 When designing the primer, the sequences of the bacteria to be identified and the closely related bacteria were aligned. As a result, the primer specific to the genus Bifidobacterium has sequences characteristic to the genus in the 153 to 169 region and the 720 to 699 region in the numbering of E. coli, and the 149 to 169 region and 646 to 626 in the Bacteroides cluster hereinafter. In the Prevoterra cluster, there were characteristic sequences belonging to the genus in the 803-827 region and 1335-1311 region in the Prevotella cluster, and in the 477-496 region and 916-895 region in the Clostridium cluster XIV. Designed. In addition, the length of the oligonucleotide varies depending on the primer, and 15-25b. p. These are the most suitable lengths for operation, but in use, in each 16S rRNA gene, several to ten or more b. You may use what increased or decreased the base sequence of p.
このようにして得られたプライマーのうち、配列番号１及び２５記載の塩基配列を有するものは、ビフィドバクテリウム属に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、菌種の同定、解析を行うためのプライマーやプローブとして使用することができる。プライマーとしては、公知のユニバーサルプライマー等と組み合せて用いることも可能であるが、その組み合せによっては種特異的な検出を行えないものもあるので、両者を組み合せることが望ましい。 Among the primers obtained in this manner, those having the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 25 are DNA oligonucleotides specific to the genus Bifidobacterium, for identifying and analyzing the bacterial species. It can be used as a primer or a probe. The primer can be used in combination with a known universal primer or the like, but depending on the combination, there are some that cannot perform species-specific detection, so it is desirable to combine both.
また、配列番号２及び２６記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデスクラスターに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 2 and 26 is an oligonucleotide specific to a Bacteroides cluster. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号３及び２７記載の塩基配列を有するものは、プレボテラクラスターに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 3 and 27 is an oligonucleotide specific to a prebotella cluster. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号４及び２８記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウムクラスターＸＩＶに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 4 and 28 is an oligonucleotide specific to the clostridial cluster XIV. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号５及び２９記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・オバタス及びバクテロイデス・セタイオタオミクロンに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 5 and 29 is an oligonucleotide specific to Bacteroides obatas and Bacteroides cetaiomicron. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号６及び３０記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・セタイオタオミクロンに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 6 and 30 is an oligonucleotide specific to Bacteroides setiotaomicron. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号７及び３１記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・フラギリスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 7 and 31 is an oligonucleotide specific to Bacteroides fragilis. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号８及び３２記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・ユニフォルミスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 8 and 32 is an oligonucleotide specific to Bacteroides uniformis. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号９及び３３記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・エガーシィーに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 9 and 33 is an oligonucleotide specific to Bacteroides aegisii. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１０及び３４記載の塩基配列を有するものは、バクテロイデス・ブルゲイタスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 10 and 34 is an oligonucleotide specific to Bacteroides burgetatus. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１１及び３５記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・パーフリンジェンスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Those having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 and 35 are oligonucleotides specific for Clostridium perfringens. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１２及び３６記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ブチリカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 12 and 36 is an oligonucleotide specific to Clostridium butyricum. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１３及び３７記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・パラプトリフィカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 13 and 37 is an oligonucleotide specific to a Clostridium paraporificum. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１４及び３８記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・バイファーメンタンスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 14 and 38 is an oligonucleotide specific to Clostridium bifermentans. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１５及び３９記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ディフィサイルに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 15 and 39 is an oligonucleotide specific to Clostridium difficile. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１６及び４０記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ソルデリーに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has the base sequence of sequence number 16 and 40 is an oligonucleotide specific to a Clostridium soldery. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１７及び４１記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・クロストリジフォームに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 17 and 41 is an oligonucleotide specific to a clostridial clostridial form. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１８、１９及び４２記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ネクサイルに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 18, 19, and 42 is an oligonucleotide specific to a clostridial nexil. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２０及び４３記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・スフェノイデスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 20 and 43 is an oligonucleotide specific to Clostridium sphenoides. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２１及び４４記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・インドリスに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Moreover, what has the base sequence of sequence number 21 and 44 is an oligonucleotide specific to Clostridium indoris. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２２及び４５記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・イノーカムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Those having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 22 and 45 are oligonucleotides specific for Clostridium innocam. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２３及び４６記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・ラモーサムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Those having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 23 and 46 are oligonucleotides specific for Clostridium ramosaum. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２４及び４７記載の塩基配列を有するものは、クロストリジウム・コクレアータムに特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーとしては両者を組み合せて用いることが好ましい。 Those having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 24 and 47 are oligonucleotides specific for Clostridium cocreatum. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成される。その特異性は、以下の実施例に示す近縁種（標準株及び基準株）のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌種の特異性に問題はなかった。 The oligonucleotide primer designed as described above is artificially synthesized by a DNA synthesizer according to the base sequence. The specificity was confirmed by using the band-forming ability of the primer as an index for the DNA of related species (standard strain and reference strain) shown in the following examples. As a result, there was no problem in the specificity of all the above-mentioned bacterial species.
一方で、今回新たにシークエンスを行ったことにより、配列番号１〜４７に示す配列番号にも種特異的な配列が見出されている。例えばバクテロイデス・オバタスでは、プライマー設計時には特異性を有すると考えられた配列がフォワードで３箇所、リバースで２箇所見出されたが、これらの中には同定の際、別の種に属する株と反応してしまうものがあった。また、クロストリジウム属ではパーフリンジェンス、ブチリカムで１組、パラブトリフィカム、バイファーメンタンス、ディフィサイル、スフェノイデスで２組、クロストリジフォーム、インドリスで４組、ネクサイルで１５組、ソルデリーで３１組のプライマーセットを作製したが、インドリスで２組、その他は１組だけが特異性を有しているに過ぎず、これ以外の配列では、他菌種と反応してしまったり、目的とする菌種と反応しないといった問題があり使用上好ましいものではなかった。 On the other hand, by performing a new sequence this time, species-specific sequences have also been found in the SEQ ID NOs shown in SEQ ID NOs: 1 to 47. For example, in Bacteroides obatas, at the time of primer design, sequences considered to have specificity were found at three positions in the forward and two positions in the reverse. Among these, strains belonging to different species were identified during identification. There was something that would react. In the genus Clostridium, one set is perfringens and butyricum, two sets are parabutrificam, bifermentans, difficile and sphenoides, four sets are clostriform, indolith, 15 sets are nexils, and 31 sets are soldered. However, only 2 pairs of Indoris and only 1 set of others have specificity, and other sequences may react with other bacterial species or target bacteria. There was a problem that it did not react with the seeds, which was not preferable for use.
因みに、他菌種と反応してしまったものを例示すると、バクテロイデス・オバタス特異的な配列のプライマーでは、バクテロイデス属のセタイオタオミクロン、フラギリス、エガーシーとの反応が、クロストリジウム・ネクサイル特異的な配列のプライマーでは、バクテロイデス属のフラギリス、エガーシー、ユニフォルミスとの反応が、クロストリジウム・ソルデリー特異的な配列のプライマーでは、クロストリジウム属のバイファーメンタンス、バクテロイデス属のセタイオタオミクロン、フラギリス、エガーシー、ユニフォルミス、オバタス、ブルゲイタスとの反応が見られた。
一方、本発明のプライマーとして選択したものの中でも、バクテロイデス・オバタス特異的プライマーは、バクテロイデス・セタイオタオミクロンと、クロストリジウム・ソルデリー特異的プライマーは、バクテロイデス属のオバタス及びブルゲイタスと反応してしまう。しかし、これらの菌種ではより特異性の高いプライマーを作製することは不可能と考えられ、また、非特異的な反応を起こす菌種に特異的なプライマーを併用すれば、菌種の同定、検出を簡便に行えるものと判断されるため、使用に支障をきたすことはないと考えられる。
By the way, for example, those that have reacted with other bacterial species, Bacteroides obatas specific sequence primer, the reaction of Bacteroides genus Setaiotaomicron, Fragilis, Egashi is a Clostridial nexil specific sequence The primer reacts with Bacteroides fragilis, Egercy, Uniformis, while the Clostridium soldery specific primer, Clostridial bifermentans, Bacteroides genus Setaeotaomicron, Fragilis, Egercy, Uniformis, Obatas, A reaction with Brugetas was seen.
On the other hand, among the primers selected as the primers of the present invention, the Bacteroides ovatas-specific primer reacts with Bacteroides ceutaiomicron, and the Clostridium solderery-specific primer reacts with Bacteroides genus Obatas and Brugetatus. However, it is considered impossible to create a primer with higher specificity in these bacterial species, and if a primer specific to a bacterial species that causes a non-specific reaction is used in combination, Since it is judged that the detection can be easily performed, it is considered that the use is not hindered.
本発明のプライマーは、このように各種腸内細菌への特異性を有するため、これらを用いて腸内細菌を迅速に検出・同定できる。また、各菌の選択培地（例えばバクテロイデス属細菌であれば、選択培地であるＮＢＧＴ培地（腸内菌の世界ｐ３２４；光岡知足、叢文社（１９８０））に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌の簡易同定を行うことができる。 Since the primer of the present invention has specificity for various intestinal bacteria as described above, it is possible to rapidly detect and identify enteric bacteria using these primers. In addition, a selective culture medium of each bacterium (for example, in the case of Bacteroides spp., NBGT medium (intestinal fungal world p324; Tomitsu Mitsuoka, Sobunsha (1980)), which is a selective culture medium, is directly or from cultured colonies. Simple identification of bacteria can be performed by extracting DNA from the body and examining the reactivity with each primer.
培養を行うことなく糞便等から目的とする菌属、菌種を特異的に検出するためには、例えば、まず、糞便１mLを遠心分離して得られるペレットからベンジルクロライド法（Zhu,H.,Qu,L.H.(1993)Isolation of genomicＤＮＡ from plants,fungi and bacteria usingbenzyl chloride.nucleic Acids Res.21,5279-5280)等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合せ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。 In order to specifically detect the desired genus and species from feces without culturing, for example, first, benzyl chloride method (Zhu, H., Qu, LH (1993) Isolation of genomic DNA from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride. Nucleic Acids Res. 21, 5279-5280) etc., and this is used as template DNA. A DNA sequence (PCR product) specific to the bacterium can be obtained by combining the template DNA with the primer of the present invention and carrying out an amplification reaction. When the DNA thus obtained is electrophoresed, bacteria can be specifically detected from the presence or absence of bands and the primers used.
また、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験や生物、生化学的性状試験等の煩雑な操作を行うことなく、菌の同定を行うためには、例えば、まずボイリング法（Wang et al FEMS Microbiology letters 124(1994)229-238 ）等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合せ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を同定することができる。 In order to identify bacteria without performing complicated operations such as DNA-DNA homology tests and biological and biochemical property tests, first, for example, the boiling method (Wang et al FEMS Microbiology letters 124 (1994 ) 229-238) etc. to extract DNA and use it as template DNA. A DNA sequence (PCR product) specific to the bacterium can be obtained by combining the template DNA with the primer of the present invention and carrying out an amplification reaction. When the DNA thus obtained is electrophoresed, bacteria can be identified from the presence or absence of a band and the primers used.
ＤＮＡを抽出する方法としては、上記ボイリング法、定法であるMaraur法、その変法である酵素法、及び簡便法である上記ベンジルクロライド法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。 As a method for extracting DNA, the above-described boiling method, the usual Maraur method, an enzyme method which is a modified method thereof, and the above-described benzyl chloride method are preferable. Although these methods are somewhat complicated, DNA can be extracted with a high yield from a wide variety of bacterial species in the enzymatic method.
このように、コロニーや糞便等から抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下であった菌株や種の判別が困難であった菌株も簡便に検出することが可能であった。また、鋳型のＤＮＡ量を段階希釈しＰＣＲを行えば、目的とする菌の定量的検出も可能である。 As described above, when the bacteria were identified using the DNA extracted from colonies, feces, etc. as a template and using the primer of the present invention, it was difficult to discriminate strains and species that were below the detection limit in the conventional method. The strain could also be detected easily. In addition, if the DNA amount of the template is serially diluted and PCR is performed, the target bacteria can be quantitatively detected.
また、本発明のプライマーは、単独でもプローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組み合せても用いることができる。 The primer of the present invention can be used alone as a probe. These can also be used in combination with other known universal primers and oligonucleotides.
また、本発明のプライマーを上記腸内細菌菌種特異的プライマーやその他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合せて用いれば、ヒト、動物等の腸内細菌叢等の解析も行い、細菌叢の全体像を把握することも可能である。 In addition, if the primer of the present invention is used in combination with the above-mentioned enterobacterial species-specific primer and other various bacterial primers, the intestinal bacterial flora of humans, animals, etc. can also be analyzed, and the whole image of the bacterial flora It is also possible to grasp.
以下、実施例を挙げて本発明更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。実施例１ プライマーの設計及び合成
（１）ビフィドバクテリウム属、バクテロイデスクラスター、プレボテラクラスター及びクロストリジウムクラスターXIV特異的プライマー
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、プライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおける、ビフィドバクテリウム属はＶ２領域とＶ４周辺の領域に、バクテロイデスクラスターはＶ２領域とＶ４領域にプレボテラクラスターはＶ５周辺の領域とＶ８周辺の領域に、クロストリジウムクラスターXIVはＶ３領域とＶ５−Ｖ６間の領域に特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表１）。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these. Example 1 Primer Design and Synthesis (1) Bifidobacterium genus, Bacteroides cluster, Prevotella cluster and Clostridium cluster XIV specific primer Primer based on bacterial 16S rRNA gene sequences obtained from databases such as DDBJ and Genbank Was designed. In the numbering of E. coli, Bifidobacterium is in the V2 region and the region around V4, Bacteroides cluster is in the V2 region and V4 region, Prevoterra cluster is in the region around V5 and around V8, and Clostridial cluster XIV is in the V3 region. Since the specificity was recognized in the region between V5 and V5-V6, this portion was used as a target. Primers were synthesized using a DNA synthesizer according to the designed base sequence (Table 1).
（２）バクテロイデス属に菌種特異的なプライマー
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列及び本発明者が新たにシークエンシングした配列を基に、プライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおけるＶ３からＶ５領域の間に特異性が認められたので、この部分をターゲットして用いた。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表２）。
(2) Species-Specific Primers for Bacteroides Genus Primers were designed based on bacterial 16S rRNA gene sequences obtained from databases such as DDBJ and Genbank, and sequences newly sequenced by the present inventors. Since specificity was observed between the V3 and V5 regions in the numbering of E. coli, this portion was used as a target. Primers were synthesized using a DNA synthesizer according to the designed base sequence (Table 2).
実施例２ プライマーの特異性確認
実施例１（１）のプライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（標準株及び基準株）とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表３に示す、１４菌属８７菌種の細菌をＧＡＭ培地（Nissui社製）にて嫌気的に一晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、ベンジルクロライド法（Zhu,H.et al(1993)Nucleic Acids Research 21,5279-5280）により、ＤＮＡを抽出した。
すなわち、ＧＡＭ培地を用いた一夜培養菌液１．５mLの遠心菌体にExtraction buffer（１００mM Ｔｒｉｓ，４０mM ＥＤＴＡ pH９．０）２５０μＬ、ベンジルクロライド１５０μＬ、１０％ＳＤＳ５０μＬを加え、５０℃で３０分間激しく振盪した。３Ｍ酢酸ナトリウム１５０μＬを加えて氷中で１５分間静置した後、１５０００rpm、１０分間の遠心で得られた上清をイソプロパノールで沈殿させ７０％エタノールで洗浄した。沈殿を５０μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（pH８．０）／１mM ＥＤＴＡ）に溶かして濃度を測定し、１０μｇ／mLの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。
Example 2 Specificity confirmation of primer In order to confirm whether or not the primer of Example 1 (1) actually has specificity, the reactivity of closely related species (standard strain and reference strain) with the primer was determined. investigated.
(1) Pure culture of strain and extraction of DNA Bacteria of 14 species belonging to genus 87 shown in Table 3 were anaerobically pure cultured overnight in GAM medium (Nissui). From each of the cells thus obtained, DNA was extracted by the benzyl chloride method (Zhu, H. et al (1993) Nucleic Acids Research 21, 5279-5280).
That is, 250 μL of extraction buffer (100 mM Tris, 40 mM EDTA pH 9.0), 150 μL of benzyl chloride, and 50 μL of 10% SDS were added to a 1.5 mL centrifuge cell of an overnight culture using GAM medium, and vigorously shaken at 50 ° C. for 30 minutes. did. After adding 150 μL of 3M sodium acetate and allowing to stand in ice for 15 minutes, the supernatant obtained by centrifugation at 15000 rpm for 10 minutes was precipitated with isopropanol and washed with 70% ethanol. The precipitate was dissolved in 50 μL of TE buffer (10 mM Tris-HCL (pH 8.0) / 1 mM EDTA), the concentration was measured, and the concentration was adjusted to 10 μg / mL to obtain a template DNA solution.
（２）ＰＣＲ反応
総量を２５μＬとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mL ＭｇＣｌ2 、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、各々０．８μＭプライマー、１．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、１０ng鋳型ＤＮＡを含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）により、９４℃、２０秒、５５℃、２０秒、７２℃、３０秒を３０回のＰＣＲ反応を行った。
(2) PCR reaction The total amount was 25 μL, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mL MgCl 2 , 200 μM dNTP mix, 0.8 μM primer, 1.0 U Taq DNA polymerase (manufactured by Takara) ) PCR reaction was performed 30 times at 94 ° C., 20 seconds, 55 ° C., 20 seconds, 72 ° C. and 30 seconds with a DNA thermal cycler PJ480 (manufactured by Takara) using a reaction solution containing 10 ng template DNA.
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Mupid-２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表３に示す通りであり、プライマーは特異的にバンドを形成した。
(3) Examination of primer specificity The PCR product obtained by the PCR reaction was electrophoresed, and the primer specificity was determined by confirming the binding ability of the primer to the DNA of each strain by the presence or absence of a band. Electrophoresis with 1.5% agarose (Morecular Biology Certified Agarose; manufactured by Bio-Rad) with Mupid-2 (Cosmo Bio) for 25 minutes, staining with Ethidium Bromide (0.5 mg / mL), UV lamp The band was observed below. The results are shown in Table 3, and the primer specifically formed a band.
実施例３ プライマーを用いた菌の同定
３５名の成人糞便サンプルから抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。抽出法及びＰＣＲの条件は実施例１（１）と同じである。その結果、ビフィドバクテリウム属とクロストリジウムクラスターＸＩＶは３５名全てから、バクテロイデスは３４名からプレボテラは２２名から、それぞれ検出された。
Example 3 Identification of Bacteria Using Primers PCR was performed using DNA extracted from 35 adult stool samples as a template. The extraction method and PCR conditions are the same as in Example 1 (1). As a result, Bifidobacterium and Clostridium cluster XIV were detected from all 35 people, Bacteroides were detected from 34 people, and Prevotella were detected from 22 people.
実施例４ プライマーの特異性確認
実施例１（２）のバクテロイデス属細菌菌種特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の基準株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表４、５に示す、６菌種のバクテロイデスクラスター細菌基準株、バクテロイデスサブグループに属する２１菌株、及びその他の腸内から分離される代表的な菌種２３株をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
すなわち、培地上に出現したコロニーから菌体をかきとり、１００μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ中に懸濁する。この懸濁液を１００℃、５分間熱した後、氷中で急冷した。
Example 4 Confirmation of Primer Specificity In order to confirm whether the Bacteroides spp. Species-specific primer of Example 1 (2) actually has specificity, the reaction of a reference strain of a related species with the primer The sex was examined.
(1) Pure culture of bacterial strain and DNA extraction As shown in Tables 4 and 5, Bacteroides cluster bacterial reference strains of 6 bacterial species, 21 strains belonging to Bacteroides subgroup, and other representative bacterial species isolated from the intestine Twenty-three strains were anaerobically pure cultured overnight in EG medium (Nissui). DNA was extracted from each of the cells thus obtained by a boiling method.
That is, the bacterial cells are scraped off from the colonies appearing on the medium and suspended in 100 μL of TE buffer. The suspension was heated at 100 ° C. for 5 minutes and then rapidly cooled in ice.
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、２．４μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．６ＵのＴａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ１μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で、９４℃、３０秒、５７℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
(2) PCR reaction The total amount was 30 μL. The reaction solution was prepared by mixing 2.4 μL primer (20 pM), 0.6 U Taq DNA polymerase (manufactured by Takara), and template DNA 1 μL to the attached buffer, dNTP mixture, and DNA thermal cycler PJ480 (manufactured by Takara). The PCR reaction was performed 35 times at 94 ° C., 30 seconds, 57 ° C., 30 seconds, 72 ° C. and 2 minutes.
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表４、５に示す通りである。バクテロイデス・オバタス以外のプライマーは特異的にバンドを形成したがオバタス特異的プライマーはフラギリスやセタイオタオミクロンともバンドを形成してしまった（表４、５）。
(3) Examination of primer specificity The PCR product obtained by the PCR reaction was electrophoresed, and the primer specificity was determined by confirming the binding ability of the primer to the DNA of each strain by the presence or absence of a band. Electrophoresis with 1.5% agarose (Morecular Biology Certified Agarose; manufactured by Bio-Rad) for 25 minutes with Mupid-2 (Cosmo Bio), staining with Ethidium Bromide (0.5 mg / mL), and UV lamp The band was observed below. The results are as shown in Tables 4 and 5. Primers other than Bacteroides obatas specifically formed bands, but Obatas specific primers also formed bands with Fragilis and Setaiotaomicron (Tables 4 and 5).
実施例５ バクテロイデス・オバタス特異的プライマーの再設計及び合成
ＤＤＢＪ、Genbank 等のデータベースより得られた細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、実施例１と同様にプライマーの設計を行った。大腸菌のナンバリングにおけるＶ２領域及びＶ３とＶ８の間の領域に特異性が認められたので、この部分をターゲットとして用いた。こうして再度設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（表６）。
Example 5 Redesign and synthesis of Bacteroides obatas-specific primers Primers were designed in the same manner as in Example 1 based on bacterial 16S rRNA gene sequences obtained from databases such as DDBJ and Genbank. Specificity was observed in the V2 region and the region between V3 and V8 in the numbering of E. coli, and this portion was used as a target. Primers were synthesized using a DNA synthesizer according to the base sequence redesigned in this way (Table 6).
実施例６ プライマーの特異性確認
実施例５のバクテロイデス・オバタス特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（基準）株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
前記表４、５に示す細菌をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、実施例４と同様ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
Example 6 Specificity confirmation of primer In order to confirm whether or not the Bacteroides obatas-specific primer of Example 5 actually has specificity, the reactivity between the (reference) strains of closely related species and the primer was examined. did.
(1) Pure culture of strain and extraction of DNA The bacteria shown in Tables 4 and 5 were anaerobically pure cultured overnight in EG medium (Nissui). DNA was extracted from each of the cells thus obtained by the boiling method in the same manner as in Example 4.
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、２．４μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．６ＵのＴａｑ ＤＮＡ polymerase（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ１μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で、９４℃、３０秒、５７℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
(2) PCR reaction The total amount was 30 μL. The reaction solution was prepared by mixing 2.4 μL primer (20 pM), 0.6 U Taq DNA polymerase (manufactured by Takara), and template DNA 1 μL to the attached buffer, dNTP mixture, and DNA thermal cycler PJ480 (manufactured by Takara). The PCR reaction was performed 35 times at 94 ° C., 30 seconds, 57 ° C., 30 seconds, 72 ° C. and 2 minutes.
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロース（Morecular Biology Certified Agarose;バイオラッド社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（０．５mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表４、５に示す通りであり、バクテロイデス・セタイオタオミクロンと弱いバンドを形成したものの、バクテロイデス・オバタス特異的プライマーは特異的にバンドを形成した。
(3) Examination of primer specificity The PCR product obtained by the PCR reaction was electrophoresed, and the primer specificity was determined by confirming the binding ability of the primer to the DNA of each strain based on the presence or absence of a band. Electrophoresis with 1.5% agarose (Morecular Biology Certified Agarose; manufactured by Bio-Rad) for 25 minutes with Mupid-2 (Cosmo Bio), staining with Ethidium Bromide (0.5 mg / mL), and UV lamp The band was observed below. The results are as shown in Tables 4 and 5. Although a weak band was formed with Bacteroides ceteiotaomicron, the Bacteroides ovatas-specific primer formed a band specifically.
実施例７ プライマーの設計及び合成
表７、８に示すクロストリジウム属細菌菌種に特異的なプライマーを設計した。各種データベースより得られた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列及び本発明者がシークエンシングした配列を基に、特異性の認められた部分をターゲットとしてプライマーを設計した。こうして設計された塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した（なお、特異性を有する配列は、上記のように表７、８以外にも多種認められたが、後に示す特異性確認試験で、問題が生じたものは記載していない）。
Example 7 Primer Design and Synthesis Primers specific to the species of Clostridium bacteria shown in Tables 7 and 8 were designed. Based on the 16S rRNA gene sequences obtained from various databases and the sequences sequenced by the present inventor, primers were designed targeting specific portions. Primers were synthesized using a DNA synthesizer in accordance with the base sequence designed in this way. (Note that there were various types of sequences other than those shown in Tables 7 and 8 as described above. The test did not indicate what caused the problem).
実施例８ プライマーの特異性確認
実施例７のクロストリジウム属の菌種に特異的プライマーが、実際に特異性を有しているかを確認するため、近縁種の（基準）株とプライマーとの反応性を検討した。
（１）菌株の純粋培養及びＤＮＡの抽出
表９（グループ１）、グループ２及びグループ３に示す、１１菌属４７菌種の細菌をＥＧ培地（Nissui社製）にて嫌気的に２晩純粋培養した。こうして得た菌体各々から、実施例４と同様ボイリング法により、ＤＮＡを抽出した。
Example 8 Specificity confirmation of primer In order to confirm whether or not a primer specific to the species of the genus Clostridium of Example 7 actually has specificity, the reaction between a (reference) strain of a related species and the primer The sex was examined.
(1) Pure culture of strain and extraction of DNA Bacteria of 47 species of 11 species shown in Table 9 (Group 1), Group 2 and Group 3 were anaerobically purified overnight in EG medium (Nissui). Cultured. DNA was extracted from each of the cells thus obtained by the boiling method in the same manner as in Example 4.
（２）ＰＣＲ反応
総量を３０μＬとした。添付ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅに０．６μＬのプライマー（２０ｐＭ）、０．１２μＬのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ、タカラ社製）、鋳型ＤＮＡ０．６μＬを混合して反応液を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（タカラ社製）で９４℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、２分を３５回のＰＣＲ反応を行った。
(2) PCR reaction The total amount was 30 μL. The reaction solution was prepared by mixing 0.6 μL primer (20 pM), 0.12 μL Taq DNA polymerase (5 U / μL, manufactured by Takara) and template DNA 0.6 μL to the attached buffer, dNTPmixture, and DNA thermal cycler PJ480 ( The product was subjected to 35 times of PCR reaction at 94 ° C., 30 seconds, 60 ° C., 30 seconds, 72 ° C. and 2 minutes.
（３）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌株のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。０．８％アガロース（Ｈ１４「ＴＡＫＡＲＡ」；タカラ社製）で、Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ）により１００Ｖ、２５分電気泳動し、Ethidium Bromide（１．０mg／mL）で染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。その結果は表９に示す通りである。また、表９以外の菌に対しては、クロストリジウム・ソルデリー菌種特異的プライマー（ＣＩＳＯＲ−ＦＲ）が、クロストリジウム・ソルデリー以外に下記グループ３のバクテロイデス・オバタスＪＣＭ５８２４T 及びバクテロイデス・ブルガタスＪＣＭ５８２６T でバンドが認められた。その他のプライマーに関しては標的とした菌種以外にバンドは認められなかった。
(3) Examination of primer specificity The PCR product obtained by the PCR reaction was electrophoresed, and the primer specificity was determined by confirming the binding ability of the primer to the DNA of each strain by the presence or absence of a band. Electrophoresis with 0.8% agarose (H14 “TAKARA”; manufactured by Takara) at 100 V for 25 minutes with Mupid-2 (Cosmo Bio), staining with Ethidium Bromide (1.0 mg / mL), and under UV lamp The band was observed. The results are as shown in Table 9. For bacteria other than those in Table 9, the Clostridial species species-specific primer (CISOR-FR) has Bacteroides obatas JCM5824 T and Bacteroides bulgatus JCM5826 T of the following group 3 in addition to Clostridium sodelli. Admitted. Regarding the other primers, no band was observed other than the target species.
グループ２
１３菌体以外のClostridium９菌種（基準株）
C.barati ATCC 27639T
C.celatum ATCC 27791T
C.loptum ATCC 29065T
C.ghoni ATCC 25257T
C.aminovalericum ATCC13725T
C.coccoides ATCC 29236T
C.oroticum ATCC 13619T
C.symbiosum ATCC 14940T
C.spiroforme ATCC 29900T
グループ３
代表的ヒト腸内細菌２５菌種
Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum JCM 3718T
F.varium JCM 3722
F.necrophorum subsp. funduliforme JCM 3724T
Acinetobacter sp. ATCC 15308
Eschelihia coli MGG
Proteus vulgatus M52
Pseudomonas aeruginosa PA-15
Enterococcus faecalis ATCC 19433T
E.faecium ATCC 19434T
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356T
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius ATCC 11741T
Bifidobacterium adolescentis aE 1949
B.bifidum aE 319
B.breve aS-1
B.longum aE 1946
Eubacterium aerofaciens S 603
E.lentum VPI 0225 1
E.limosum ATCC 8486T
Bacterodies ovatus JCM 5824T
B.thetaiotaomicron JCM 5827T
B.fragilis DSM 2151T
B.eggerthii DSM 20697T
B.uniformis JCM 5828T
B.vulgatus JCM 5826T
B.distasonis JCM 5825T
Group 2
9 Clostridium species other than 13 cells (reference strain)
C.barati ATCC 27639 T
C.celatum ATCC 27791 T
C.loptum ATCC 29065 T
C.ghoni ATCC 25257 T
C.aminovalericum ATCC13725 T
C.coccoides ATCC 29236 T
C.oroticum ATCC 13619 T
C.symbiosum ATCC 14940 T
C.spiroforme ATCC 29900 T
Group 3
25 representative human intestinal bacteria
Fusobacterium necrophorum subsp.necrophorum JCM 3718 T
F.varium JCM 3722
F.necrophorum subsp.funuliforme JCM 3724 T
Acinetobacter sp. ATCC 15308
Eschelihia coli MGG
Proteus vulgatus M52
Pseudomonas aeruginosa PA-15
Enterococcus faecalis ATCC 19433 T
E.faecium ATCC 19434 T
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 T
Lactobacillus salivarius subsp.salivarius ATCC 11741 T
Bifidobacterium adolescentis aE 1949
B.bifidum aE 319
B.breve aS-1
B.longum aE 1946
Eubacterium aerofaciens S 603
E.lentum VPI 0225 1
E.limosum ATCC 8486 T
Bacterodies ovatus JCM 5824 T
B.thetaiotaomicron JCM 5827 T
B.fragilis DSM 2151 T
B.eggerthii DSM 20697 T
B.uniformis JCM 5828 T
B.vulgatus JCM 5826 T
B.distasonis JCM 5825 T
実施例９ プライマーの特異性確認
バクテロイデス属細菌菌種特異的プライマーを用い、ヒトふん便分離株をサンプルとして実施例４と同様の方法でサンプル中の菌種同定を行った。その結果、分離株２６株が同定された（表１０）。
なお、同一のサンプルの生物・生化学的性状を光岡らの方法（腸内菌の世界−嫌気性菌の分離と同定、光岡知足、叢文社）により確認したところ、本発明のプライマーによる同定（検出）結果と一致していた。
Example 9 Specificity confirmation of primer The bacterial species in the sample was identified in the same manner as in Example 4 using a Bacteroides spp. Bacterial species-specific primer and a human fecal isolate as a sample. As a result, 26 isolates were identified (Table 10).
The biological and biochemical properties of the same sample were confirmed by the method of Mitsuoka et al. (World of enterobacteria-Isolation and identification of anaerobic bacteria, Chichimitsu Mitsuoka, Sobunsha). ) Consistent with the results.
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