JP2005124495A - Primer for detecting human enterobacterium - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト腸内細菌の同定に有用なＤＮＡプライマー及びこれを用いる腸内細菌の検出・同定方法に関する。 The present invention relates to a DNA primer useful for identification of human enteric bacteria and a method for detecting and identifying enteric bacteria using the same.
ヒト腸内フローラにはおよそ３００種のバクテリアが存在し、健康者は常時ほぼ一定のバランスを保っている。これらの細菌は、消化の補助、ビタミンの合成、外来菌の感染に対する防御的役割等をしているといわれている。これら腸内フローラ構成菌のうち、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、クロストリジウム クラスター（Clostridium cluster）（非特許文献１）に含まれるクロストリジウム属(Clostridium)、ユウバクテリウム属(Eubacterium)、ルミノコッカス属(Ruminococcus)、フェイカリバクテリウム属(Faecalibacterium)、アシドアミノコッカス属(Acidaminococcus)、ベイヨネラ属(Veillonella)もビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)の細菌と同様にヒト腸内フローラにおける最優勢菌群である。 There are about 300 types of bacteria in the human intestinal flora, and healthy people always have a nearly constant balance. These bacteria are said to play a role in assisting digestion, synthesizing vitamins, and protecting against infection by foreign bacteria. Of these intestinal flora configuration bacterium, Lactobacillus (Lactobacillus), Clostridium contained Clostridium cluster (Clostridium cluster) (Non-Patent Document 1) (Clostridium), Yu genus (Eubacterium), ruminococcus (Ruminococcus ), Faye potash genus (Faecalibacterium) a SID amino genus (Acidaminococcus), a Veillonella sp (Veillonella) also bifidobacteria most prevalent bacterial group in bacteria as well as human intestinal flora (Bifidobacterium).
しかし、これらの腸内細菌は嫌気性菌であることから、分離培養には、特別な装置と試験者の熟練を必要とする。また、通常菌種の同定は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、一般生物学的性状等を検査することにより行われている。しかしながら、表現形質を基にした同定法は、操作が煩雑で多大な時間と労力を要し、試験者の熟練を要する。また、培地上のコロニー数が多くなると、コロニー同士が重なるなどしてしまい、菌数の少ないものを検出できない場合もあった。 However, since these intestinal bacteria are anaerobic bacteria, special culture and skill of the tester are required for the separation culture. In addition, identification of bacterial species is usually performed by examining phenotypic traits, that is, glycolytic properties, general biological properties, and the like. However, the identification method based on the phenotype is complicated and requires a lot of time and labor, and requires the skill of the tester. In addition, when the number of colonies on the medium increases, the colonies may overlap each other, and it may not be possible to detect a small number of bacteria.
近年では、菌種同定にはＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる判定も行われるようになっている（非特許文献２）。しかしながら、この同定法も長時間を必要とし、迅速な菌種同定を行うには好ましいものではなかった。 In recent years, determination by bacterial DNA identification is also performed by DNA-DNA homology (Non-patent Document 2). However, this identification method also requires a long time, and is not preferable for rapid bacterial species identification.
さらに、ヒト腸内細菌はほぼすべてが嫌気性細菌であることからその多くが分離・培養されていない。従って、これら分離・培養されていない菌種を無視しては、腸内フローラのバランスを正確に把握したとは言えない。特にクロストリジウム クラスターは、特に重要な役割をしており、これらに属する未同定菌群を検出する方法が望まれていた。 Furthermore, since almost all human intestinal bacteria are anaerobic bacteria, most of them are not isolated and cultured. Therefore, it cannot be said that the balance of the intestinal flora is accurately grasped by ignoring these non-separated and cultured bacterial species. In particular, the Clostridium cluster plays an especially important role, and a method for detecting unidentified bacterial groups belonging to these clusters has been desired.
上記検出法の問題点を解消するため、本出願人らはある種の腸内細菌に特異的なプローブやプライマーを用いて、菌の同定を行う方法を検討し、例えば特許文献１にはバクテロイデスグループ細菌に特異的なプローブを、特許文献２にはビフィドバクテリウム属細菌に特異的なプライマーを、特許文献３には、ヒト腸内フローラ中の未同定菌群に対する特異的なプライマーとプローブを開示している。この方法によれば、菌の同定・検出を簡便、迅速に行えるが、ヒト腸内や病変部位にはこの他にも様々な細菌が存在しており、特に最優勢で存在している他の菌種をカバーできるプライマーセットが要望されている。
しかしながら、腸内細菌の同定等に使用しうるプライマーを設計するためには、遺伝子のシークエンシング、アライメント等かなりの手間がかかるばかりか、せっかく設計した配列でプライマーを合成しても、特異性が得られない場合もある。このため、プライマーの種類がなかなか増えず、腸内、病変部での菌の動向を把握するには未だ不充分である。 However, designing primers that can be used to identify enterobacteria, etc., requires considerable effort, such as gene sequencing and alignment. Even if primers are synthesized with a specially designed sequence, specificity can be improved. It may not be obtained. For this reason, the kind of primer does not increase easily, and it is still insufficient to grasp the trend of bacteria in the intestines and lesions.
したがって、本発明の目的は、ヒト腸内や病変部位にて検出される各種の菌を特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to synthesize a primer that can specifically identify various bacteria detected in the human intestine or lesion site, and to use this primer to quickly and easily identify and analyze the bacteria. It is to provide.
斯かる現状に鑑み本発明者は鋭意研究を行ったところ、クロストリジウム クラスターに含まれるクロストリジウム属やユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属やベイヨネラ属細菌、ラクトバチルス属細菌、糞便から得られたＤＮＡを用いた１６Ｓ ｒＤＮＡクローンライブラリー法から見出されたクロストリジウム クラスターに属する未同定菌群のそれぞれに特異的なＤＮＡプライマーが得られ、これらを用いれば、細菌の培養を行うことなく、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に上記の菌の同定・解析が可能となることを見出し、本発明を完成した。 In view of the current situation, the present inventors have conducted intensive research and found that the genus Clostridium, Eubacterium, Luminococcus, Falicaribacterium, Acidaminococcus, Bayonella, Lactobacillus, DNA primers specific to each of the unidentified bacteria belonging to the Clostridium cluster found from the 16S rDNA clone library method using DNA obtained from genus bacteria and stool were obtained. The inventors have found that the above-mentioned bacteria can be identified and analyzed rapidly and easily by PCR reaction of bacteria-derived DNA extracted from a specimen without culturing, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、配列番号１〜３９から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有するヒト腸内細菌検出用プライマーを提供するものである。 That is, the present invention provides a primer for detecting human intestinal bacteria having a base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 39 or a sequence complementary to the base sequence.
さらに、本発明は、上記プライマーの１又は２以上を使用することを特徴とする、ヒト腸内細菌の検出方法又は同定方法を提供するものである。 Furthermore, the present invention provides a method for detecting or identifying human intestinal bacteria, wherein one or more of the above primers are used.
本発明のプライマーを使用すれば、菌を培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度にクロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属やラクトバチルス属細菌の同定を行うことができる。また、他の菌に特異的なプライマー等と組み合わせて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも行うことができる。さらに、同定、解析の結果から消化管等の状態を把握できるため、種々疾病等の予防・治療が容易になる。 By using the primer of the present invention, without culturing the fungus, the genus Clostridium, Eubacterium, Luminococcus, Faicaribacterium, Acidaminococcus, Bayonella, quickly, easily, at low cost and with high accuracy. The genus and Lactobacillus genus bacteria can be identified. Moreover, by using in combination with primers specific to other bacteria, analysis of intestinal bacterial flora can be performed. Furthermore, since the state of the digestive tract and the like can be grasped from the results of identification and analysis, prevention / treatment of various diseases and the like becomes easy.
本発明のプライマーは、クロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属やラクトバチルス属細菌、さらに、クロストリジウム クラスターに属する未同定菌群に特異的であり、ヒト腸管で頻繁に検出される菌に特異的な配列を有するものである。より具体的には、アシドアミノコッカス ファーメンタンス(Acidaminococcus fermentans)、クロストリジウム ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム レプタム(Clostridium leptum)、クロストリジウム オルビシンデンス(Clostridium orbiscindens)、クロストリジウム パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム シンデンス(Clostridium sindens)、ユウバクテリウム デスモランス(Eubacterium desmolans)、ユウバクテリウム レクターレ(Eubacterium rectale)、フェイカリバクテリウム プラウツニッチ(Faecalibacterium prausnitzii)、ルミノコッカス アルブス(Ruminococcus albus)、ルミノコッカス ブロミ(Ruminococcus bromii)、ルミノコッカス カリダス(Ruminococcus callidus)、ルミノコッカス オベウム(Ruminococcus obeum)、ルミノコッカス プロダクタス(Ruminococcus productus)とクロストリジウム コッコイデス(Clostridium coccoides)、ベイヨネラ クリセチ(Veillonella criceti)とベイヨネラ ラッティ(Veillonella ratti)、そしてラクトバチルス ルミニス(Lactobacillus ruminis)、クロストリジウム クラスター Iに含まれるＥＢ００２菌群、クロストリジウム クラスター ＩＶに含まれるＢＡ０３１菌群、クロストリジウム クラスター XIVbに含まれるＢＡ０７６菌群に特異的なプライマーがある。 The primer of the present invention is specific to Clostridium genus, Eubacterium genus, Luminococcus genus, Faikalibacterium genus, Acidaminococcus genus, Bayonella genus, Lactobacillus genus bacteria, and unidentified bacteria belonging to the Clostridial cluster It has a specific sequence for bacteria frequently detected in the human intestinal tract. More specifically, A Sid amino Lactococcus fermentans (Acidaminococcus fermentans), Clostridium butyricum (Clostridium butyricum), Clostridium Reputamu (Clostridium leptum), Clostridium orbiviruses thin dense (Clostridium orbiscindens), Clostridium perfringens (Clostridium perfringens), Clostridium Clostridium sindens , Eubacterium desmolans , Eubacterium rectale , Faecalibacterium prausnitz , Ruminococcus albus , Ruminococcus bromi Luminococcus calidus ( Ruminococcus callidus ), Luminococcus obeum ( Ruminococcus obeum ), Luminococcus productus ( Ruminococcus productus ) And Clostridium Kokkoidesu (Clostridium coccoides), Veillonella Kurisechi (Veillonella criceti) and Veillonella Ratti (Veillonella ratti), and Lactobacillus Ruminisu (Lactobacillus ruminis), EB002 bacteria groups included in Clostridium cluster I, BA031 bacteria groups included in a clostridial cluster IV There is a primer specific for the BA076 group contained in Clostridium cluster XIVb.
本発明のプライマーを作製するにあたり、そのターゲットには、系統分類の指標として信頼性の高い１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を用い、同定・解析にはＰＣＲ法等の手段が必要になるため、ＲＮＡではなくＤＮＡを用いた。 In preparing the primer of the present invention, a highly reliable 16S rRNA gene is used as a phylogenetic index for the target, and means such as a PCR method is required for identification and analysis. Using.
プライマーは、本発明者がシークエンスを行って得た塩基配列とデータベース（DDBJ、Genbank等）とを比較・検討することにより得たものである。 The primer was obtained by comparing and examining a base sequence obtained by sequencing by the present inventor and a database (DDBJ, Genbank, etc.).
プライマーの設計の際には、同定の対象となる菌とその近縁の菌の配列のアライメントを行った。すなわち、Collins, M. D., et al. (1994)INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 44,812-826）による分類に基づいて近縁菌種を選択し、アライメントを行った。その結果、標的とした菌種に特異的な配列が存在したため、この領域をターゲットとしたＰＣＲプライマーを設計した。その結果、配列番号１〜３９から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相乗的な配列を有するプライマーが得られた。 When designing the primers, the sequences of the bacteria to be identified and the closely related bacteria were aligned. That is, related bacterial species were selected and aligned based on the classification according to Collins, MD, et al. (1994) INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 44,812-826). As a result, there was a sequence specific to the target bacterial species, and thus a PCR primer targeting this region was designed. As a result, a primer having a base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 39 or a synergistic sequence to the base sequence was obtained.
また、オリゴヌクレオチドの長さはプライマーによって異なっており、１８〜２６塩基となっている。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数塩基の塩基配列を増減させたものを用いても良い。 Further, the length of the oligonucleotide varies depending on the primer, and is 18 to 26 bases. These are the most suitable lengths in terms of operation, but in use, in each 16S rRNA gene, those obtained by increasing or decreasing the base sequence of several to tens of bases adjacent to the oligonucleotide may be used.
このようにして得られた本発明プライマーのうち、配列番号１及び２記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム ブチリカムに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Among the primers of the present invention thus obtained, those having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 and 2 or those complementary thereto are DNA oligonucleotides specific for Clostridium butyricum. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号３及び４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム パーフリンジェンスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 3 and 4 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific for Clostridium perfringens. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号５及び６記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム レプタムに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。
Moreover, what has a base sequence of
また、配列番号７及び８記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム オルビシンデンスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 7 and 8 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to Clostridium orubicin dens. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号９及び１０記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ユウバクテリウム デスモランスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 9 and 10 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific for Eubacterium desmorans. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１１及び１２記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、フェイカリバクテリウム プラウツニッチに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 11 and 12 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to Faicaribacterium plautzich. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１３及び１４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス アルブスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 13 and 14 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to Luminococcus albus. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１５及び１６記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス ブロミに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 15 and 16 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to luminococcus bromi. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１７及び１８記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス カリダスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 17 and 18 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to Luminococcus calidas. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号１９及び２０記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、アシドアミノコッカス ファーメンタンスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 19 and 20 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to acid aminococcus fermentans. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２１及び２２記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ベイオネラ クリセチ及びベイオネラ ラッティに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 21 and 22 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to Beionella crisetti and Bayonella ratti. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２３及び２４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム シンデンスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 23 and 24, or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to a clostridial syndrome. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２５及び２６記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ユウバクテリウム レクターレに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 25 and 26, or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to S. cerevisiae. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２７及び２８記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス オベウムに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 27 and 28, or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to a luminococcus ubeum. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号２９及び３０記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ルミノコッカス プロダクタス及びクロストリジウム コッコイデスに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 29 and 30 or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to Luminococcus productus and Clostridium occoides. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号３３及び３４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム クラスターＩに属するＥＢ００２菌群に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 33 and 34, or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to EB002 bacteria group which belongs to the Clostridium cluster I. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号３３及び３４記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム クラスターIVに属するＢＡ０３１菌群に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 33 and 34, or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to BA031 bacteria group which belongs to Clostridium cluster IV. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号３５及び３６記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、クロストリジウム クラスターXIVbに属するＢＡ０７６菌群に特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては両者を組み合わせて用いることが好ましい。 Moreover, what has a base sequence of sequence number 35 and 36, or a base sequence complementary to this is a DNA oligonucleotide specific to BA076 bacteria group which belongs to the Clostridium cluster XIVb. For this reason, it is preferable to use both in combination as a primer.
また、配列番号３７、３８及び３９記載の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を有するものは、ラクトバチルス ルミニスに特異的にＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このためプライマーとしては配列番号３７と３８、又は配列番号３７と３９を組み合わせて用いることが好ましい。 Further, those having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 37, 38 and 39 or those complementary thereto are DNA oligonucleotides specific to Lactobacillus luminis. Therefore, it is preferable to use SEQ ID NOs: 37 and 38 or SEQ ID NOs: 37 and 39 in combination as primers.
上記のように設計したオリゴヌクレオチドプライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により、人工的に合成することができる。その特異性は、以下の実施例に示す近縁種のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌種の特異性に問題はなかった。 The oligonucleotide primer designed as described above can be artificially synthesized by a DNA synthesizer according to its base sequence. The specificity was confirmed using the band-forming ability of the primers for the closely related DNAs shown in the following examples as an index. As a result, there was no problem in the specificity of all the above-mentioned bacterial species.
一方で、配列番号１〜３９に示す配列以外にも種特異的な配列が見出されている。しかしながら、これらの配列や他の公知のプライマーで同定を行っても、別の種に属する株と反応したり、目的とする種の株と反応しない場合もあり、使用上好ましいものではなかった。このようなプライマーを用いてもＰＣＲ反応時の条件設定によって種特異的な反応性は達成されるものと考えられるが、現状ではそのような条件は見出されていない。 On the other hand, species-specific sequences other than those shown in SEQ ID NOs: 1 to 39 have been found. However, identification with these sequences and other known primers is not preferable in use because it may react with a strain belonging to another species or may not react with a strain of a target species. Even if such a primer is used, it is considered that species-specific reactivity can be achieved by setting conditions during the PCR reaction, but at present no such condition has been found.
本発明のプライマーとしては、上記の配列に相補的な配列も使用可能であり、また上記配列に1〜数個の塩基を付加させた配列でも使用可能である。 As the primer of the present invention, a sequence complementary to the above sequence can be used, and a sequence obtained by adding 1 to several bases to the above sequence can also be used.
本発明のプライマーは、 クロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属やラクトバチルス属細菌への特異性を有するため、これらを用いて糞便、腸内細菌を迅速に同定できる。また、各菌の選択培地もしくは、非選択培地上に形成されたコロニーから直接、あるいは培養した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性を調べることによって菌の簡易同定を行うことができる。 Since the primer of the present invention has specificity for Clostridium genus, Eubacterium genus, Luminococcus genus, Faikalibacterium genus, Acidaminococcus genus, Bayonella genus and Lactobacillus genus bacteria, Intestinal bacteria can be identified quickly. In addition, DNA can be extracted directly from colonies formed on selective or non-selective media of each bacterium or from cultured cells, and the bacterium can be easily identified by examining the reactivity with each primer. it can.
本発明のプライマーを用いて糞便等の検体から前記腸内細菌を検出するには、例えば（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）上記プライマーの１又は２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程、及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程により行うことができる。 In order to detect the intestinal bacteria from a sample such as stool using the primer of the present invention, for example, (1) a step of extracting DNA in the sample, (2) PCR reaction using one or more of the above primers And (3) a step of detecting the DNA fragment amplified in step (2).
より詳細には、まず、糞便等のサンプル１mL程度を遠心分離して得られるペレットから塩化ベンジル法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。 More specifically, first, DNA is extracted from a pellet obtained by centrifuging about 1 mL of a sample such as feces by the benzyl chloride method or the like, and this is used as template DNA. By combining the template DNA with the primer of the present invention and performing an amplification reaction, a DNA sequence (PCR product) specific to the bacterium can be obtained. When the DNA thus obtained is electrophoresed, bacteria can be specifically detected from the presence or absence of bands and the primers used.
また、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験や生物、生化学的性状試験等の煩雑な操作を行うことなく、菌の同定を行うためには、例えば、まずボイリング法等によってＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得ることができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を特異的に検出することができる。 In addition, in order to identify bacteria without complicated operations such as DNA-DNA homology tests and biological and biochemical property tests, for example, DNA is first extracted by a boiling method or the like, and this is used as a template. Let it be DNA. By combining the template DNA with the primer of the present invention and performing an amplification reaction, a DNA sequence (PCR product) specific to the bacterium can be obtained. When the DNA thus obtained is electrophoresed, bacteria can be specifically detected from the presence or absence of bands and the primers used.
ＤＮＡを抽出する方法としては、上記ボイリング法、常法であるMarmaur法、その変法である酵素法、及び簡便法である上記塩化ベンジル法が好ましい。これらの方法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌種から収率よくＤＮＡを抽出できる。 As a method for extracting DNA, the above-described boiling method, the conventional Marmaur method, the modified enzyme method, and the simple benzyl chloride method are preferable. Although these methods are somewhat complicated, DNA can be extracted with a high yield from a wide variety of bacterial species in the enzymatic method.
このように、コロニーや糞便サンプル等から抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下であった菌種の検出も可能であった。また、ＰＣＲを行う際に、鋳型のＤＮＡ量を段階希釈しＰＣＲを行えば、目的とする菌の定量化も可能である。 As described above, when the microorganisms are identified using the DNA extracted from the colony or stool sample as a template and using the primer of the present invention, it is possible to detect the bacterial species that were below the detection limit in the conventional method. . In addition, when PCR is performed, if the amount of template DNA is serially diluted and PCR is performed, the target bacteria can be quantified.
また、本発明のプライマーは、単独でもプローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバーサルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組み合わせても用いることができる。 The primer of the present invention can be used alone as a probe. These can also be used in combination with other known universal primers and oligonucleotides.
また、本発明のプライマーを用いれば、ヒト、動物等の腸内細菌叢等の解析も行える。すなわち、上記ビフィドバクテリウム属細菌用プライマーやその他の多岐にわたる細菌のプライマーと組み合わせて用いれば、細菌叢の全体像を把握することも可能である。 Moreover, if the primer of this invention is used, intestinal microflora, such as a human and an animal, can also be analyzed. That is, when used in combination with the above-mentioned primers for Bifidobacterium and other various bacteria, it is possible to grasp the whole image of the bacterial flora.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an example is given and the present invention is explained still in detail, the present invention is not limited to these.
実施例１（クローンライブラリー法）
健康成人５名（Ａ，Ｂ，Ｃ、Ｅ、Ｇ）の糞便を用い、以下の手順に従い、糞便中の菌の系統樹を作成した。
Example 1 (Clone library method)
Using the feces of five healthy adults (A, B, C, E, G), a phylogenetic tree of fungi in the feces was prepared according to the following procedure.
（１）糞便からのＤＮＡ抽出：
２５mgの糞便をＰＢＳバッファーに浮遊・遠心回収を３〜４回繰り返して洗浄後、ＤＮＡ抽出バッファー（100mM Tris-HCl, 40mM EDTA, pH9.0）に懸濁して総量を４５０μＬとし、５０μＬの１０％ＳＤＳ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール、３００mgのガラスビーズ（直径０．１mm）を加え、激しく振とうし、菌体を破砕した。上清を別のチューブに移し、フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿、７０％エタノールでの洗浄を順に行い、風乾して最後に１０００μＬのＴＥ（10mM Tris-HCl(pH８．０)、1mM EDTA）に溶解した。
(1) DNA extraction from feces:
25 mg of stool was suspended in PBS buffer and collected by centrifugation 3-4 times and washed, then suspended in DNA extraction buffer (100 mM Tris-HCl, 40 mM EDTA, pH 9.0) to a total volume of 450 μL, 50 μL of 10% SDS, 500 μL of TE-saturated phenol, 300 mg of glass beads (diameter 0.1 mm) were added and shaken vigorously to disrupt the cells. The supernatant was transferred to another tube, treated with phenol / chloroform, isopropanol precipitated, washed with 70% ethanol in that order, air-dried and finally 1000 μL of TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA). Dissolved.
（２）１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅ＰＣＲ反応：
増幅プライマーの異なる２系統で行った。総量を２５μＬとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH8.3)、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ mixture、０．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０ngの鋳型糞便ＤＮＡ、さらに系列Ａとして全生物に共通なプライマー（表１）８ＦとＢｉ８をそれぞれ０．２μＭずつと１５Ｒを０．４μＭ、又は、系列Ｂとして全生物に共通なプライマー（表１）６３ＭＦと１３９１ＭＲを０．４μＭを含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（MJ Research社）により、９４℃２０秒、５５℃１５秒、７２℃１８０秒を２５サイクル、ＰＣＲ反応を行った。
(2) 16S rDNA amplification PCR reaction:
This was carried out with two lines with different amplification primers. The total amount is 25 μL, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 200 μM dNTP mixture, 0.5 U Taq DNA polymerase (manufactured by Takara), 50 ng template fecal DNA, and further as series A Primers common to all organisms (Table 1) 8F and Bi8 each include 0.2 μM and 15R 0.4 μM, or primers common to all organisms as series B (Table 1) 63MF and 1391MR contain 0.4 μM PCR reaction was carried out using DNA thermal cycler PTC200 (MJ Research) for 25 cycles of 94 ° C. for 20 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 180 seconds.
（３）増幅産物のクローニング：
ＰＣＲ反応によって得られた増幅産物をＴＡクローニングキット（invitorogen社製）を用いて付属のマニュアル通りにクローニングを行った。すなわちＰＣＲ２．１ベクターにＰＣＲ増幅産物を挿入後、大腸菌に導入し形質転換させた。その後、５０μｇ／mLのアンピシリンと４０mg／mLのＸ−ｇａｌを含むＬＢ（Luria Bertani）寒天培地上に塗抹し、形成した白色コロニーをＬＢ液体培地で増菌後、ＤＮＡを抽出してクローンＤＮＡを得た。
(3) Cloning of amplification products:
The amplification product obtained by the PCR reaction was cloned using a TA cloning kit (Invitrogen) according to the attached manual. That is, the PCR amplification product was inserted into the PCR2.1 vector, then introduced into E. coli and transformed. Thereafter, the mixture was smeared on an LB (Luria Bertani) agar medium containing 50 μg / mL ampicillin and 40 mg / mL X-gal, and the formed white colonies were enriched with an LB liquid medium. Obtained.
（４）クローンＤＮＡ配列の系統解析：
得られたクローンＤＮＡの配列を解読後、上記で得られたこれまでに分離培養されていない未同定菌群に属する細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列(配列番号４０〜４２)とＤＤＢＪ等のデータベースより得られた近縁な細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と系統解析を行った（図１）。
(4) Phylogenetic analysis of cloned DNA sequence:
After decoding the sequence of the obtained clone DNA, the 16S rDNA sequence (SEQ ID NOs: 40 to 42) of bacteria belonging to the unidentified bacterial group that has not been separated and cultured so far and the database obtained from DDBJ or the like are obtained. A 16S rDNA base sequence and phylogenetic analysis of closely related bacteria were performed (FIG. 1).
実施例２（プライマーの設計及び合成）
クロストリジウム属、ユウバクテリウム属、ルミノコッカス属、フェイカリバクテリウム属、アシドアミノコッカス属、ベイヨネラ属、ラクトバチルス属細菌、さらに上記のクローンライブラリー法で得られたＥＢ００２クローン、ＢＡ０３１クローン、ＢＡ０７６クローンのそれぞれの菌種に近縁な菌種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を元に、菌種特異的なプライマーの設計を行った。その際、塩基数２０程度、ＧＣ含量が約５０％となる部分を探索した。その結果、フォワード及びリバースのプライマーとして表２に示す３９種類の種特異的プライマーが設計された。こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマーを合成した。
Example 2 (Primer design and synthesis)
Clostridium, Eubacterium, Luminococcus, Faikalibacterium, Acidaminococcus, Bayonella, Lactobacillus, EB002 clone, BA031 clone, BA076 clone obtained by the above clone library method Based on the 16S rDNA sequences of bacterial species closely related to each of these bacterial species, bacterial species-specific primers were designed. At that time, a portion having about 20 bases and a GC content of about 50% was searched. As a result, 39 species-specific primers shown in Table 2 were designed as forward and reverse primers. Primers were synthesized using a DNA synthesizer in accordance with the designed base sequence.
実施例３（特異性の確認）
以下の方法により、設計したプライマーの特異性を確認した。
Example 3 (Confirmation of specificity)
The specificity of the designed primer was confirmed by the following method.
（１）プライマーの特異性の確認
（１−１）菌株の純粋培養及びＤＮＡ抽出：表３〜６に示す、１９菌属８２菌種の腸内細菌を０．５％グルコース添加の変法ＧＡＭブロス（ニッスイ社製）を用いて３７℃、嫌気的に一晩培養した。これらの菌体から塩化ベンジル法にてそれぞれＤＮＡを抽出した。
（１−２）ＰＣＲ反応：総量を２５μＬとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ混合物、０．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０ngの鋳型ＤＮＡ、さらにそれぞれ０．４μＭのプライマーを含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（MJ Research社製）により、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒を３２サイクルのＰＣＲ反応を行った。
（１−３）プライマーの特異性の検討：ＰＣＲ反応によって得られた増幅産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌種のＤＮＡとの結合能を確認することで、プライマーの特異性を判定した。すなわち１．５％アガロース（Molecular Biology Certified Agarose；バイオラッド社）でＭｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ社）によりＴＡＥバッファー中で１００Ｖ、２０分電気泳動し、エチヂウムプロマイド（０．５mg/mL）で染色後、紫外線ランプ下でバンドを確認した。その結果、それぞれのプライマーは、標的とした菌種のみから増幅産物が得られ特異性が確認された。
(1) Confirmation of primer specificity (1-1) Pure culture and DNA extraction of strains: Modified GAM in which intestinal bacteria of 19 species of genus 82 shown in Tables 3 to 6 were added with 0.5% glucose The culture was carried out anaerobically overnight at 37 ° C. using Broth (Nissui). DNA was extracted from these cells by the benzyl chloride method.
(1-2) PCR reaction: The total volume was 25 μL, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 200 μM dNTP mixture, 0.5 U Taq DNA polymerase (manufactured by Takara), 50 ng PCR reaction was carried out for 32 cycles at 94 ° C. for 20 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds using a DNA thermal cycler PTC200 (manufactured by MJ Research) with a reaction solution containing template DNA and a primer of 0.4 μM each. .
(1-3) Examination of primer specificity: The amplification product obtained by the PCR reaction is electrophoresed, and the primer specificity is confirmed by checking the ability of the primer to bind to the DNA of each bacterial species based on the presence or absence of a band. Was judged. In other words, 1.5% agarose (Molecular Biology Certified Agarose; Bio-Rad) was electrophoresed in TAE buffer with Mupid-2 (Cosmo Bio) for 20 minutes, and ethidium promide (0.5 mg / mL) After dyeing, the band was confirmed under an ultraviolet lamp. As a result, each primer was amplified only from the target bacterial species, and its specificity was confirmed.
また、前記と同様のＰＣＲ反応により、公知のプライマーと本発明プライマーの特異性の比較を行った。その結果、表７及び表８に示すように、本発明プライマーは、特開２００１−１１２４８５号記載のＣＩＰＥＲ−Ｆ及びＣＩＰＥＲ−Ｒ、特開２００１−１１２４８５号記載のＣＩＢＵＴ−Ｆ及びＣＩＢＵＴ−Ｒ、特開２００１−１２０２７１号記載のＲｕＯＢＥ−１及びＲｕＯＢＥ−２、及び特開２００１−４６０６３号記載のＲＥＣ−Ｆ及びＲＥＣ−Ｒに比べて、各菌種に対して特異的であった。 Further, the specificity of the known primer and the primer of the present invention was compared by the same PCR reaction as described above. As a result, as shown in Table 7 and Table 8, the primer of the present invention includes CIPER-F and CIPER-R described in JP-A No. 2001-112485, CIBUT-F and CIBUT-R described in JP-A No. 2001-112485, Compared to RuOBE-1 and RuOBE-2 described in JP-A No. 2001-120271 and REC-F and REC-R described in JP-A No. 2001-46063, they were specific to each bacterial species.
実施例４（プライマーを用いた細菌叢の解析）
健康成人４６例の糞便２５mgをＰＢＳバッファーに浮遊・遠心回収を３〜４回繰り返して洗浄後、ＤＮＡ抽出バッファー（１００mM Tris-HCl, ４０mM EDTA, pH９．０）に懸濁して総量を４５０μＬとし、５０μＬの１０％ＳＤＳ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール、３００mgのガラスビーズ（直径０．１mm）を加え、激しく振とうし、菌体を破砕した。上清を別のチューブに移し、フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿、７０％エタノールでの洗浄を順に行い、風乾して最後に１０００μＬのＴＥ（１０mM Tris-HCl(pH８．０)、１mM EDTA）に溶解し糞便ＤＮＡを得た。糞便ＤＮＡの１μＬを鋳型としてそれぞれの菌種特異的プライマー（表２）を用いてＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（MJ Research社製）により、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒を３２サイクルのＰＣＲ反応を行った。その結果、表９に示すような結果を得た。
Example 4 (Analysis of bacterial flora using primers)
After washing 25 mg of stool from 46 healthy adults in PBS buffer by repeating suspension and centrifugation 3-4 times, suspending in DNA extraction buffer (100 mM Tris-HCl, 40 mM EDTA, pH 9.0) to make a total volume of 450 μL, 50 μL of 10% SDS, 500 μL of TE saturated phenol and 300 mg of glass beads (diameter 0.1 mm) were added, and the cells were shaken vigorously to disrupt the cells. The supernatant was transferred to another tube, followed by phenol / chloroform treatment, isopropanol precipitation, and washing with 70% ethanol, followed by air drying and finally 1000 μL of TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA). Dissolved to obtain fecal DNA. 32 cycles of 94 ° C. for 20 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds using 1 μL of fecal DNA as a template and each bacterial species-specific primer (Table 2) using DNA thermal cycler PTC200 (manufactured by MJ Research) The PCR reaction was performed. As a result, the results shown in Table 9 were obtained.
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