KR20040077544A - Method for identification of microorganism of Lactobacillus species - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A method for identification of a microorganism of Lactobacillus species is provided, thereby easily, rapidly and accurately identifying the probiotic Lactobacillus species using Lactobacillus species specific primers and Lactobacillus species common primers. CONSTITUTION: The method for identification of a microorganism of Lactobacillus species comprises the steps of: (1) PCR amplifying DNA of a testing microorganism as a template using one or more of Lactobacillus species specific primers and one or more of Lactobacillus species common primers; and (2) analyzing the amplification and the size of PCR products, wherein the Lactobacillus species specific primer has the nucleotide sequence selected from SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:8; the Lactobacillus species common primer has the nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO:10; and the Lactobacillus species is selected from Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus reuteri.

Description

락토바실러스 속 균종의 동정방법{Method for identification of microorganism of Lactobacillus species}Method for identification of microorganism of Lactobacillus species

본 발명은 락토바실러스 속 균종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 락토바실러스 속 균종에 특이적인 프라이머 및 락토바실러스 속 균종에 공통적인 프라이머를 이용하여 검사체 내의 락토바실러스 속 균주를 검출하고 동정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for identifying Lactobacillus spp., And more particularly, to detect and identify Lactobacillus spp. In a test subject using a primer specific for the Lactobacillus spp. And a primer common to the Lactobacillus spp. It is about a method.

요구르트에서 분리된 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus)의 정장효과가 인정되면서 유산균에 대한 관심이 증대하고 이에 따른 연구가 계속적으로 진행되어 왔지만, 국내에서의 유산균 관련 연구는 아직까지 미미한 상태이다. 오래전부터 유럽의 여러 국가에서 유제품 및 치즈 등으로부터 다양한 유산균주가 분리되었으며, 일본에서 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 개발된 이래 다양한 의약품 및 기능성 식품으로써 유산균이 많이 사용되고 있다. 최근에는 미국에서도 장 정착성 및 내산성이 우수한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG의 제품화가 성공한 이후 유산균에 대한 연구는 전 세계에서 활발하게 진행되고 있으며 성인병 예방 및 면역 증강에 의한 항암효과 등이 우수한 기능성 프로바이오틱(probiotic) 유산균의 분리와 개발에 대한 관심이 계속적으로 증폭되고 있다. 프로바이오틱 유산균은 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품, 캡슐제제 등에 사용되고 있으며 향후 프로바이오틱 유산균 개발 기술은 기술 집약형 방식으로 전개되어 이들 제품의 규모는 지속적으로 증가할 것으로 예상된다. 국내 상황도 마찬가지여서 대부분의 균주를 수입에 의존하고 있는 발효유 시장만 놓고 볼 때 2001년 현재 매출은 9,300억원이며 매년 10% 씩 꾸준한 성장세를 보여 2002년에는 12,000억 원대가 될 것으로 추산되어 고기능성 프로바이오틱 유산균주를 이용한 제품의 시장성은 무한하다고 할 수 있다(McCannet al.,J. Food. Pretect.,1996, 59, 41-45).Although the formal effects of Lactobacillus bulgaricus and L. acidophilus isolated from yogurt have been recognized, interest in lactic acid bacteria has increased and research has been continuously conducted. Research on lactic acid bacteria is still insignificant. Since long ago, various lactic acid bacteria have been separated from dairy products and cheese in various countries in Europe, and since the development of Bifidobacterium bifidum in Japan, lactic acid bacteria have been widely used as various medicines and functional foods. Recently, since the successful commercialization of Lactobacillus rhamnosus GG, which has excellent intestinal fixation and acid resistance, research on lactic acid bacteria has been actively conducted all over the world, and it has excellent anti-cancer effects by preventing adult diseases and enhancing immunity. There is a growing interest in the isolation and development of functional probiotic lactic acid bacteria. Probiotic lactobacillus is used in fermented milk, baby food, dairy products, livestock farm feed, cosmetics, dietary supplements, formal medicines, capsules, etc. Probiotic lactobacillus development technology is developed in a technology-intensive manner, and the scale of these products is continuously It is expected to increase. The domestic situation is also the same. Based on the fermented milk market, which relies on imports, most of the strains are estimated to be KRW 930 billion in 2001, with a steady growth rate of 10% annually. The marketability of products using biotic lactic acid strains is infinite (McCann et al. , J. Food.Pretect., 1996, 59, 41-45).

락토바실러스는 간균으로써 호모(homo) 유산발효성과 헤테로(hetero) 유산발효성을 모두 가지고 있으며, 동·식물체 및 발효유제품 등 다양한 분리원에서 발견되는 통성혐기성 균종이다. 락토바실러스는 젖산, 초산과 같은 유기산 생성과 그에 따른 pH 저하에 의한 항균작용과 H2O2와 디아세틸(diacetyl) 등의 항균성 대사산물 및 다양한 단백질성 고분자 물질인 박테리오신(bacteriocin)의 생성에 의해 식품 부패 미생물과 다른 병원성 미생물의 생육을 억제하는 것으로 알려져 있어서 요구르트나 발효유 제조 혹은 건강식품 및 의약품으로도 널리 사용된다. 또한, 락토바실러스의 발효에 의해 생성되는 유기산은 부패 방지를 위한 식품첨가물뿐만 아니라 수술용 제봉사의 원료가 되는 폴리락틱산(polylactic acid)과 그 밖에 아세트알데히드(acetealdehyde), 아크릴릭산(acrylic acid), 2,3-펜타디온(2,3-pentadione) 등 다양한 합성물질의 재료로써 사용된다(Porroet al., Appl. Environ. Microbiol.,1999, 65, 4211-4215).Lactobacillus is a bacterium that has both homo lactic fermentation and hetero lactic fermentation, and is an anaerobic fungal species found in various isolates such as animals, plants and fermented milk products. Lactobacillus has an antibacterial effect caused by the formation of organic acids such as lactic acid and acetic acid and the resulting pH drop.2O2It is known to inhibit the growth of food spoilage microorganisms and other pathogenic microorganisms by the production of antimicrobial metabolites such as and diacetyl and bacteriocin, a variety of proteinaceous polymers. Also widely used as. In addition, the organic acid produced by the fermentation of Lactobacillus is not only a food additive to prevent corruption, but also polylactic acid (acetealdehyde) and acrylic acid (acrylic acid), which is a raw material for surgical sewing It is used as a material of various synthetic materials such as 2,3-pentadione.et al., Appl. Environ. Microbiol.,1999, 65, 4211-4215).

지금까지 알려진 락토바실러스 속 균종에는 90 여종이 있으며, 현재 프로바이오틱 균주로써 상용화되고 있는 균주는 일부에 불과하다. 이들 중 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus;L. delbrueckii subsp. bulgaricus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus;L. casei subsp. rhamnosus), 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 등이 대부분을 차지한다. 이 밖에도 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus), 락토바실러스 존소니이(L.johnsonii;L. acidophilus subsp. johnsonii), 락토바실러스 훼르멘텀(L. fermentum) 등이 최근 기능성 프로바이오틱 균주로 개발되고 있지만 이들은 기존의 프로바이오틱 균종인 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 등과 유사한 균종에 속한다.There are about 90 species of genus Lactobacillus so far known, and only a few are currently commercialized as probiotic strains. Among them, L. acidophilus , L. bulgaricus ; L. delbrueckii subsp.bulgaricus , L. casei , L. gasseri , L. gasseri , L. paracasei , L. plantarum , L. plantarum , L. rhamnosus ( L. casei subsp. Rhamnosus ), L. reuteri , etc. Occupies most of it. In addition, L. helveticus , L. johnsonii ( L. acidophilus subsp.johnsonii ), and L. fermentum ( L. fermentum ) have recently been developed as functional probiotic strains. However, they belong to species similar to the existing probiotic species L. acidophilus ( L. acidophilus ), L. plantarum ( L. plantarum ).

락토바실러스에 대한 계통분류학적 분류를 위해 현재까지는 현미경적 소견과 그람염색법, 카탈라제 시험법, 생육 시험법, 당 이용성 등을 포함한 생리특성시험 및 이를 포괄하는 생화학적 방법인 API 시험키트를 이용하였다. 그러나 상기와 같은 분류 방법은 데이터베이스의 한계성을 가지며 재현성이 떨어지고 모호한 동정 결과를 많이 도출하기 때문에 원하는 균주를 특이적으로 동정하기 위한 방법이 절실히 요구된다.For the phylogenetic classification of Lactobacillus, physiological characteristics tests including microscopic findings, gram staining, catalase testing, growth testing, sugar availability, and API test kits, which encompass them, have been used. However, such a classification method has a limitation of the database, has a poor reproducibility, and leads to many ambiguous identification results. Therefore, a method for specifically identifying a desired strain is urgently required.

상기와 같은 문제점을 보완하기 위해 분자생물학적 동정 및 특성 분석법을 이용하기 시작하였으며(Tenoveret al., J. Clin. Microbiol.,1995, 33(9), 2233-2239, 1995), 최근에는 PCR 및 다양한 전기영동방법 등이 보고 되고 있다(Walteret al.,Appl. Environ. Microbiol.,2001, 67(6), 2578-2585). 이 중 현재 많이 연구되고 있는 것은 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA) 분석법으로, 상기 방법은 10개 내외의 염기서열로 구성된 임의의 프라이머(random primer)를 사용한 일종의 유전자지문분석(fingerprinting) 기법이다(Cusicket al.,Appl. Environ. Microbiol., 2001, 66(5), 2227-2231). RAPD를 이용해서 얻은 유전자지문형(fingerprint pattern)은 게놈 유전자(genomic DNA)에 따라 고유하게나타남으로써 미생물의 분리, 동정 및 특성 분석이 가능하다(Kaufmanet al.,Appl. Environ. Microbiol.,1997, 65(4), 1268-1273). 그러나 아직까지는 PCR 조건에 따른 재현성 문제와 속, 종 및 그 이하의 균주간 비교를 위해 적합한 프라이머의 확립이 부족하여 이에 대한 연구가 진행 중이다(Wanget al.,Appl. Environ. Microbiol.,1996, 62(4), 1241-1247). 최근에는 종 특이 프라이머를 이용한 PCR 기법(species specific PCR, 이하 "SS-PCR"이라 약칭함)을 사용하고 있는데, 상기 방법은 게놈 유전자의 특정 부위가 종간 염기서열에 있어서 차이가 있다는 점을 이용하여 종 특이적인 프라이머를 사용한 유전자 증폭을 통하여 특정 종에서만 특이적인 PCR 산물을 생산하게 하는 원리이다(Matsukiet al.,Appl. Environ. Microbiol.,1999, 65(10), 4506-4512). SS-PCR의 주요 대상 유전자로 많이 연구된 것은 16S, 23S rRNA 및 16S-23S rRNA 사이 지역(interspacial region)으로 이들에 관한 염기서열 정보는 다양한 웹기반의 데이타베이스들에 공개되어 있다(Naimiet al.,Microbiol.,1997, 143(6), 823-834). 이들 염기서열 내의 변이 지역을 프라이머 대상 부위로 이용하여 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus)를 포함한 유산균 속내의 종 분류가 가능함이 다수 보고 되었다(Angelettiet al.,J. Clin. Microbiol.,2001, 39(2), 794-797; Walteret al.,Appl. Environ. Microbiol.,2000, 66(1), 297-303). 또한, 장내환경 등 여러 균주가 혼재된 상태에서 원하는 종들의 SS-PCR 프라이머를 혼합하여 사용함으로써 원하는 균주들의 존재 유무를 신속, 정확하게 확인하거나 균주들을 분류, 동정하는 다중 PCR(multiplex PCR) 기법들도 최근 많이 보고되고 있다(Lee,et al.,FEMS Microbiol. Letters.,2000, 193, 243-47).Molecular biological identification and characterization methods have begun to overcome these problems (Tenover et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33 (9), 2233-2239, 1995), and recently PCR and Various electrophoretic methods have been reported (Walter et al. , Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67 (6), 2578-2585). Among these, a lot of research is being conducted on randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis, which is a kind of fingerprinting technique using random primers consisting of about 10 sequences (Cusick et. al ., Appl. Environ.Microbiol . , 2001, 66 (5), 2227-2231). The fingerprint pattern obtained using RAPD is uniquely expressed according to genomic DNA, which allows the isolation, identification and characterization of microorganisms (Kaufman et al. , Appl. Environ. Microbiol., 1997) . , 65 (4), 1268-1273). However, studies on the reproducibility problem according to PCR conditions and the lack of suitable primers for comparison between genus, species and substrains are still underway (Wang et al. , Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62 (4), 1241-1247). Recently, PCR using species-specific primers (Species specific PCR, abbreviated as "SS-PCR") has been used. This method uses the fact that certain regions of the genomic genes differ in species sequence. Gene amplification using species-specific primers allows the production of PCR products specific to specific species (Matsuki et al. , Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65 (10), 4506-4512). Many of the major target genes of SS-PCR have been studied in the interspacial region between 16S, 23S rRNA and 16S-23S rRNA, and their sequencing information has been published in various web-based databases (Naimi et al. , Microbiol., 1997, 143 (6), 823-834). It has been reported that species variation in lactic acid bacteria including Enterococcus and Lactobacillus can be classified by using mutation regions within these sequences (Angeletti et al. , J. Clin. Microbiol., 2001, 39 (2), 794-797; Walter et al. , Appl. Environ.Microbiol ., 2000, 66 (1), 297-303). In addition, multiple PCR (multiplex PCR) techniques for quickly and accurately checking the presence or absence of desired strains or classifying and identifying strains by mixing SS-PCR primers of desired species in a mixed state such as intestinal environment are also used. Much has been reported recently (Lee, et al. , FEMS Microbiol. Letters., 2000, 193, 243-47).

그러나 현재까지 알려진 16S rRNA와 23S rRNA 등을 기반으로 하는 다양한 다중 PCR 방법을 사용하여도 16S rRNA에서의 종특이 변이 지역의 제한성 및 23S rRNA 지역에 관한 정보의 부족과 염기서열 길이의 한계 등으로 단일 PCR 반응을 통한 다수의 락토바실러스 종의 분류 및 동정은 불가능한 실정이다(Song,et al., FEMS Microbiol. Letters., 2000, 187, 167-173).However, even with multiple PCR methods based on 16S rRNA and 23S rRNA, which are known to date, the use of a single region is limited due to the limitation of the species-specific mutation region in the 16S rRNA, the lack of information on the 23S rRNA region, and the limitation of the sequence length. The classification and identification of many Lactobacillus species via PCR reactions is impossible (Song, et al., FEMS Microbiol. Letters. , 2000, 187, 167-173).

이에, 본 발명자들은 종 특이적 프라이머를 이용한 PCR 기법을 사용하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 정확하고 간편하게 동정하기 위해 연구하던 중, 다양한 균종의 염기서열 데이터를 바탕으로 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역을 포함하는 염기서열들을 사용하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종 공통적 서열 및 균종 특이적 서열을 확보하였으며 이를 이용하여 180 bp에서 1090 bp에 이르는 다양한 크기의 PCR 산물이 생성될 수 있도록 다중 PCR 프라이머 세트를 제작하였다. 이 프라이머 세트를 사용할 경우 단일 PCR 반응을 통하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종을 간편하고 정확하게 동정할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Thus, the inventors of the present invention, while using the PCR technique using a species-specific primer to study the probiotic Lactobacillus strains to accurately and easily, based on the sequence data of various species based on 16S rRNA, 23S rRNA or 16S Base sequences comprising the region between the rRNA and 23S rRNA were used to obtain species common and species specific sequences of the genus Probiotic Lactobacillus, and PCR products of various sizes ranging from 180 bp to 1090 bp could be generated. Multiple PCR primer sets were prepared. In the case of using this primer set, the present invention was completed by confirming that the species of the genus Probiotic Lactobacillus can be identified easily and accurately through a single PCR reaction.

본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a primer set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 PCR 방법을 통해 검사체 내의 락토바실러스 속 균종을 검출하고 동정하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is one or more primers selected from primers having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 and one or more primers selected from primers having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 It is to provide a method for detecting and identifying Lactobacillus spp.

도 1a는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머 및 공통적 프라이머의 설계 계획 및 예상 PCR 증폭 산물의 크기를 나타낸 그림이다. Figure 1a is a diagram showing the design of the genus Lactobacillus species specific primers and common primers and the size of the expected PCR amplification products.

Reu: 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균종 특이 프라이머 부착 위치,Reu: L. reuteri species specific primer attachment site,

Cas: 락토바실러스 카제이(L. casei) 균종 특이 프라이머 부착 위치,Cas: Lactobacillus casi strain species specific primer attachment position,

Bul: 락토바실러스 불가리쿠스(L. delbrueckii subsp. bulgaricus) 균종 특이 프라이머 부착 위치,Bul: L. delbrueckii subsp.bulgaricus species-specific primer attachment site,

Gas: 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) 균종 특이 프라이머 부착 위치,Gas: L. gasseri species specific primer attachment position,

Aci: 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus) 균종 특이 프라이머 부착 위치,Aci: L. acidophilus species specific primer attachment site,

Par: 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 균종 특이 프라이머 부착 위치,Par: L. paracasei species species specific primer attachment site,

Pla: 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 균종 특이 프라이머 부착 위치,Pla: Lactobacillus plantarum species specific primer attachment site,

Rha: 락토바실러스 람노서스(L. casei subsp. rhamnosus) 균종 특이 프라이머 부착 위치,Rha: L. casei subsp.rhamnosus species specific primer attachment site,

REV: 서열번호 9로 기재되는 락토바실러스 속 균종 공통 프라이머 부착 위치, 및REV: Lactobacillus spp. Common primer attachment site as set forth in SEQ ID NO: 9, and

FOR: 서열번호 10으로 기재되는 락토바실러스 속 균종 공통 프라이머 부착 위치FOR: Lactobacillus spp. Common primer attachment site as set forth in SEQ ID NO: 10

도 1b는 락토바실러스 속 표준균주의 염색체 DNA를 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 조합을 사용하여 PCR을 수행한 전기영동 사진이다. Figure 1b is an electrophoresis picture of the chromosomal DNA of the genus Lactobacillus standard PCR using a primer combination described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10.

Aci: 락토바실러스 애시도필러스, Bul: 락토바실러스 불가리쿠스,Aci: Lactobacillus ashdophyllus, Bul: Lactobacillus bulgaricus,

Cas: 락토바실러스 카제이, Gas: 락토바실러스 가쎄리,Cas: Lactobacillus casei, Gas: Lactobacillus gasteria,

Hel: 락토바실러스 헬베티쿠스, Pla: 락토바실러스 플란타룸,Hel: Lactobacillus helveticus, Pla: Lactobacillus plantarum,

Reu: 락토바실러스 루테리, Par: 락토바실러스 파라카제이,Reu: Lactobacillus lusteri, Par: Lactobacillus paracazei,

Rha: 락토바실러스 람노서스,Rha: Lactobacillus rhamnosus,

9-1(0.6 kb): 서열번호 9 및 서열번호 1로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.60 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,9-1 (0.6 kb): Production of a PCR amplification product having a size corresponding to 0.60 kb obtained by PCR using the primers set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 1,

2-10(0.18kb): 서열번호 2 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.18 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,2-10 (0.18 kb): Production of a PCR amplification product having a size corresponding to 0.18 kb obtained by PCR using the primers set forth in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 10,

3-10(0.71 kb): 서열번호 3 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.71 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,3-10 (0.71 kb): Production of a PCR amplification product having a size corresponding to 0.71 kb obtained by PCR using the primers set forth in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 10,

9-4(0.28 kb): 서열번호 9 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.28 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,9-4 (0.28 kb): Production of a PCR amplification product of a size corresponding to 0.28 kb obtained by PCR using the primers set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 4,

9-6(0.43 kb): 서열번호 9 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 사용하여PCR을 수행하여 얻은 0.43 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,9-6 (0.43 kb): Production of a PCR amplification product having a size corresponding to 0.43 kb obtained by PCR using the primers set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 6,

8-10(1.09 kb): 서열번호 8 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 1.09 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,8-10 (1.09 kb): Production of a PCR amplification product having a size corresponding to 1.09 kb obtained by PCR using the primers set forth in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10,

9-5(0.65 kb): 서열번호 9 및 서열번호 5로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.65 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과, 및9-5 (0.65 kb): Production result of a PCR amplification product of a size corresponding to 0.65 kb obtained by PCR using the primers set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 5, and

9-7(0.45 kb): 서열번호 9 및 서열번호 7로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.45 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과9-7 (0.45 kb): Production of PCR amplification products having a size corresponding to 0.45 kb obtained by PCR using the primers set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 7

도 2는 8종의 락토바실러스 속 표준균주의 염색체 DNA 및 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 사용하여 다중 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. FIG. 2 is an electrophoretic photograph showing the results of multiple PCR reactions using chromosomal DNA of eight strains of Lactobacillus genus and primer mixtures set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10. FIG.

레인 1: 락토바실러스 애시도필러스, 레인 2: 락토바실러스 불가리쿠스,Lane 1: Lactobacillus ashdophilus, lane 2: Lactobacillus bulgaricus,

레인 3: 락토바실러스 카제이, 레인 4: 락토바실러스 가쎄리,Lane 3: Lactobacillus kazei, lane 4: Lactobacillus gaseri,

레인 5: 락토바실러스 플란타룸, 레인 6: 락토바실러스 루테리,Lane 5: Lactobacillus plantarum, lane 6: Lactobacillus lusteri,

레인 7: 락토바실러스 람노서스, 레인 8: 락토바실러스 파라카제이,Lane 7: Lactobacillus rhamnosus, lane 8: Lactobacillus paracazei,

레인 M: 100 bp DNA 사이즈 마커.Lane M: 100 bp DNA size marker.

도 3은 락토바실러스 속 8종의 표준균주 콜로니의 불균등 조합된 혼합물 및 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 사용하여 다중 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. Figure 3 is an electrophoresis picture showing the results of multiple PCR reactions using an unevenly combined mixture of eight standard strain colonies of the genus Lactobacillus and primer mixtures described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10.

레인 1: 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 루테리,Lane 1: Lactobacillus ashidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus cassia, Lactobacillus gaseri, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus luterie,

레인 M: 100 bp DNA 사이즈 마커,Lane M: 100 bp DNA size marker,

레인 2: 락토바실러스 카제이,Lane 2: Lactobacillus casei,

레인 3: 락토바실러스 플란타룸,Lane 3: Lactobacillus plantarum,

레인 4: 락토바실러스 애시도필러스 및 락토바실러스 파라카제이,Lane 4: Lactobacillus ashidophilus and Lactobacillus paracazei,

레인 5: 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 불가리쿠스,Lane 5: Lactobacillus ashidophilus, Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus vulgaris,

레인 6: 락토바실러스 불가리쿠스,Lane 6: Lactobacillus bulgaricus,

레인 7: 락토바실러스 가쎄리,Lane 7: Lactobacillus gaseri,

레인 8: 락토바실러스 루테리 및 락토바실러스 플란타룸Lane 8: Lactobacillus luster and Lactobacillus plantarum

도 4는 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주 포함 제품으로부터 분리한 균주의 유전계통수(Phylogenetic tree)에서의 종의 위치를 나타낸 계통도이다. Figure 4 is a schematic diagram showing the location of the species in the Phylogenetic tree of the strain isolated from the probiotic Lactobacillus strain containing products.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a primer described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 PCR 방법을 통해 검사체 내의 락토바실러스 속 균종을 검출하고 동정하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention uses one or more primers selected from primers having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 and one or more primers selected from primers having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 Provided is a method for detecting and identifying Lactobacillus spp. In a test subject through a PCR method.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공한다.The present invention provides primers set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10.

본 발명의 프라이머는 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역 유전자를 이용하여 제작한 것으로, 상기 유전자의 특정 부분의 염기 서열 또는 이것과 상동하는 염기 서열이다. 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 속 균종 특이적인 프라이머이며, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 속 균종에 공통적인 프라이머이다.The primer of the present invention was prepared using a 16S rRNA, 23S rRNA or a region between 16S rRNA and 23S rRNA of the genus Lactobacillus, and is a nucleotide sequence of a specific portion of the gene or a nucleotide sequence homologous thereto. The primers described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 are genus specific primers of the genus Lactobacillus, and the primers described in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 are primers common to the genus Lactobacillus.

서열번호 1로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus) 균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 애시도필러스 속 균주의 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:22128340, 6537241, 1771113 및 1771109 등)을 이용하여 제조하였다.The primer described in SEQ ID NO: 1 corresponds to the 23S rRNA gene sequence of the L. acidophilus strain, and in a preferred embodiment of the present invention, the 23S rRNA gene of the strain of the genus Lactobacillus ashidophilus. It was prepared using the nucleotide sequence (GI: 22128340, 6537241, 1771113, 1771109, etc.).

서열번호 2로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 불가리쿠스 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:15982695, 15982694, 15982693, 2588893, 43981 및 175022 등)을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 2 corresponds to the 16S rRNA gene sequence of the L. bulgaricus strain, and in a preferred embodiment of the present invention, the Lactobacillus vulgaris 16S rRNA gene sequence (GI: 15982695, 15982694, 15982693, 2588893, 43981 and 175022, etc.).

서열번호 3으로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이 및 락토바실러스 람노서스 16S rRNA 유전자 염기서열(각각 GI:14583099, 1848057, 1848056, 1848055, 1848054, 1848053, 1848052, 1843428, 1843427, 20257220, 12382750, 6996495, 43970, 175023, 7621525, 7621504, 1808583, 7159888, 7159887, 6996530, 7621503 등; GI:6552383, 6537239 등; GI:20086370, 6537244, 6815814 등)을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 3 corresponds to the 16S rRNA gene sequences of the Lactobacillus casei , Lactobacillus paracasei and L. rhamnosus strains. In a preferred embodiment of the present invention, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus 16S rRNA gene sequences (GI: 14583099, 1848057, 1848056, 1848055, 1848054, 1848053, 1848052, 1843428, 1843427, 20257220, respectively). , 12382750, 6996495, 43970, 175023, 7621525, 7621504, 1808583, 7159888, 7159887, 6996530, 7621503 and the like; GI: 6552383, 6537239 and the like; GI: 20086370, 6537244, 6815814 and the like).

서열번호 4로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) 균종의 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이지역 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 가쎄리 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이지역 염기서열(GI:6537236 등)을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 4 corresponds to the nucleotide sequence between the 16S rRNA gene and the 23S rRNA gene of the L. gasseri strain, and in a preferred embodiment of the present invention, the Lactobacillus sarycin 16S rRNA gene and It was prepared using the 23S rRNA interregion nucleotide sequence (GI: 6537236, etc.).

서열번호 5로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 파라카제이 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:6552383, 6537239 등)을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 5 corresponds to the 23S rRNA gene sequence of the L. paracasei strain , and in a preferred embodiment of the present invention, the Lactobacillus paracasei 23S rRNA gene sequence (GI: 6552383, 6537239, etc.).

서열번호 6으로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 플란타룸 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:6537237, 20086379, 20086378, 20086376, 20086375, 20086372, 3046893, 2738840, 3420786 등)을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 6 corresponds to the 23S rRNA gene sequence of the L. plantarum strain , and in a preferred embodiment of the present invention, the Lactobacillus plantarum 23S rRNA gene sequence (GI: 6537237, 20086379, 20086378, 20086376, 20086375, 20086372, 3046893, 2738840, 3420786, etc.).

서열번호 7로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 람노서스 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:20086370, 6537244, 6815814 등)을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 7 corresponds to the 23S rRNA gene sequence of the L. rhamnosus strain, and in a preferred embodiment of the present invention, the Lactobacillus rhamnosus 23S rRNA gene sequence (GI: 20086370, 6537244, 6815814, etc.).

서열번호 8로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 루테리 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:3420786, 388037 등)을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 8 corresponds to the 16S rRNA gene sequence of the L. reuteri strain, and in a preferred embodiment of the present invention, the Lactobacillus luterie 16S rRNA gene sequence (GI: 3420786, 388037, etc.). Was prepared using).

서열번호 9로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에서 기재한 8종의 프로바이오틱(probiotic) 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 9 corresponds to the 16S rRNA gene sequence of the genus Lactobacillus, and in a preferred embodiment of the present invention, the 16S rRNA of the eight types of probiotic Lactobacillus genus described above It was prepared using the gene sequence.

서열번호 10으로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에서 기재한 8종의 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 제조하였다.The primer set forth in SEQ ID NO: 10 corresponds to the 16S rRNA gene sequence of the genus Lactobacillus, and in a preferred embodiment of the present invention, the 16S rRNA gene sequence of the eight probiotic Lactobacillus genus described above It was prepared using.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 다중 PCR(multiplex PCR) 방법을 통해 락토바실러스 속 균종을 동정하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is Lactobacillus having a base sequence described in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 and at least one primer selected from the group of Lactobacillus genus specific primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 Provided is a method for identifying a genus Lactobacillus through multiplex PCR (multiplex PCR) method using one or more primers selected from the group of common genus.

본 발명의 락토바실러스 속 균종을 동정하는 방법은The method of identifying the genus Lactobacillus of the present invention is

1) 검사체 및 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용하여 다중 PCR 반응을 수행하는 단계; 및1) Lactobacillus having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 and at least one primer selected from the group of Lactobacillus genus specific primers having the test sequence and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 Performing multiple PCR reactions using one or more primers selected from the group of genus species common primers; And

2) 단계 1을 통한 PCR 산물의 증폭 여부 및 증폭 산물의 크기를 측정하는 단계를 포함한다.2) measuring the amplification of the PCR product and the size of the amplification product through step 1.

상기 단계 1에 있어서, 검사체는 락토바실러스 속 균주를 포함하고 있는 시료의 일부를 직접 검사체로 사용할 수도 있으며, 적당한 배지에 배양하여 수득된 콜로니 자체를 사용하거나 콜로니로부터 분리된 염색체 DNA를 사용할 수 있다. 시료는 락토바실러스 속 균주를 함유하는 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품 및 캡슐제제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 염색체 DNA는 공지의 DNA 추출법에 의해 콜로니로부터 분리될 수 있으며, PCR 반응의 주형으로 사용할 때에는 약 0.01 ㎍ 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, PCR 반응 주형으로 사용하기 위해서 균주의 콜로니는 1 ×105cfu 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하며, 시료를 직접 검사체로 사용할 경우 상기와 동일한 콜로니 이상을 포함하도록 적절하게 희석한 현탁액으로부터 간단한 처리를 통해 얻은 균체를 사용할 수도 있다. 또한, 검사체로 사용하는 균주의 염색체 DNA 또는 균주의 콜로니는 단독으로 사용하거나 이들의 혼합으로 사용할 수 있다. PCR 반응은 통상적인 방법에 따라 실시한다.In step 1, the test sample may directly use a part of a sample containing a strain of the genus Lactobacillus as a test sample, using colonies obtained by culturing in a suitable medium or chromosomal DNA isolated from the colonies. . The sample may be selected from the group consisting of fermented milk, baby food, dairy products, livestock farm feed, cosmetics, dietary supplements, formal medicines, and capsules containing Lactobacillus strains, but are not necessarily limited thereto. Chromosomal DNA can be separated from colonies by known DNA extraction methods, and when used as a template for PCR reaction, it is preferable to use at a concentration of about 0.01 μg or more. In addition, in order to use as a PCR reaction template, the colony of the strain is preferably used at a concentration of 1 × 10 5 cfu or more, and when the sample is directly used as a test sample, a simple treatment from a suspension diluted appropriately to contain the same colony or more as described above. Cells obtained through the use can also be used. In addition, the chromosomal DNA of the strain used as a test body or the colony of the strain can be used alone or in combination thereof. PCR reactions are carried out according to conventional methods.

상기 단계 2에 있어서, PCR 산물의 증폭 여부 및 증폭 산물의 크기를 측정하는 것은 통상적인 방법, 예를 들어 젤 전기영동법을 통해 수행할 수 있다. 본 발명에서 제조한 프라이머는 락토바실러스 속 균종마다 각각 다른 크기의 PCR 증폭산물을 형성하도록 제조된 것이기 때문에 PCR 반응을 통해 증폭된 산물의 크기를 비교하면 검사체 내에 포함되어 있는 다양한 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 동시에 동정할 수 있다.In step 2, the amplification of the PCR product and the size of the amplification product can be measured by a conventional method, for example, gel electrophoresis. Since the primers prepared in the present invention are prepared to form PCR amplification products of different sizes for each Lactobacillus spp., Comparing the sizes of the products amplified by the PCR reaction, various probiotic lactobacillus contained in the test body. Genus strains can be identified simultaneously.

즉, 서열번호 1 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 애시도필러스, 서열번호 2 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 불가리쿠스, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 가쎄리, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머쌍을 이용하여 락토바실러스 루테리, 서열번호 6 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 플란타룸, 서열번호 7 및 서열번호 9 또는 서열번호 3 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 람노서스, 서열번호 5 및 서열번호 9 또는 서열번호 3 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 파라카제이 및 서열번호 3 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 카제이를 동정할 수 있다. 또한, 상기 각 균주에 해당하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하는 다중 PCR(multiplex PCR) 반응을 수행함으로써 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 파라카제이 및 락토바실러스 카제이로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균종을 동시에 동정할 수 있다.That is, Lactobacillus vulgaris, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO using the primer pairs described in Lactobacillus ashidophilus, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 10 using the primer pairs described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 9 Lactobacillus using the primer pairs described by Lactobacillus luterie, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9 using the primer pairs described by Lactobacillus gasser, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 using the primer pair described by 10 As described in Lactobacillus rhamnosus, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 10 using primer pairs described in Plantarum, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 10 Using primer pairs, primer pairs described by Lactobacillus paracasei and SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 10 were prepared. Lactobacillus casei can be used to identify. In addition, by performing a multiplex PCR (multiplex PCR) reaction using one or more primer pairs corresponding to each strain, Lactobacillus ashidophilus, Lactobacillus vulgaris, Lactobacillus gaseri, Lactobacillus luteri, Lactobacillus plantarum One or more species selected from the group consisting of, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus casei can be identified simultaneously.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 단일한 종의 락토바실러스 속 균주 염색체 DNA와 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 각 균주 특이적으로 증폭된 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었다(도 2참조). 또한, 여러 종의 균주가 혼합된 락토바실러스 균주 콜로니와 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 균주가 혼합되어 있어도 각 균종 특이적으로 증폭된 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었다(도 3참조).In a preferred embodiment of the present invention, PCR was carried out using a mixture of chromosomal DNA of a single species of Lactobacillus sp. And primers described in SEQ ID NOs: 1 to 10. Was obtained (see FIG. 2 ). In addition, as a result of PCR using the Lactobacillus strain colony mixed with several strains and the primer mixture described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10, even if the strains are mixed, each PCR species specifically amplified product Was obtained (see FIG. 3 ).

본 발명의 락토바실러스 속 균종의 동정방법은 여러 종류의 락토바실러스가 혼재되어 있더라도 단일 PCR 반응을 통해 종의 분포 및 동정을 신속하고 정확하게 수행할 수 있어 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종을 이용한 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강 보조식품, 정장약품 및 캡슐제제의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.Lactobacillus spp. Identification method of the present invention is a fermented milk, baby food using a probiotic Lactobacillus spp. It can be used to develop raw materials for dairy products, livestock farm feed, cosmetics, dietary supplements, formal medicines and capsules.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 락토바실러스 속 균종 탐지용 프라이머의 제조Example 1 Preparation of a Primer for Detection of Strains of the Genus Lactobacillus

락토바실러스 속 균종을 탐지하기 위한 PCR 방법을 수행하는데 사용되는 프라이머를 작성하기 위해 8종의 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 및 16S rRNA와 23S rRNA사이 지역 유전자에 대한 대량의 서열정보를 이용하여 녹는점(Tm) 값이 50℃를 넘도록 길이를 조절하고 헤어핀(haipin)구조나 다이머(self-dimer)가 생성되지 않는 범위로 각 종에 따른 특이적인 염기서열 및 공통 염기서열을 탐색하여 프라이머를 제작하였다. 구체적으로, 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus) 23S rRNA 유전자의 염기 서열(GI:22128340, 6537241, 1771113 및 1771109 등)을 이용하여 서열번호 1로 기재되는 프라이머를 제작하고, 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus) 16S rRNA 유전자의 염기서열(GI:15982695, 15982694, 15982693, 2588893, 43981 및 175022 등)을 이용하여 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 제작하였다. 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 16S rRNA 유전자의 염기서열(각각 GI:14583099, 1848057, 1848056, 1848055, 1848054, 1848053, 1848052, 1843428, 1843427, 20257220, 12382750, 6996495, 43970, 175023, 7621525, 7621504, 1808583, 7159888, 7159887, 6996530, 7621503 등; GI:6552383, 6537239 등; GI:20086370, 6537244, 6815814 등)을 이용하여 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 제조하였다. 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이지역 염기서열(GI:6537236 등)을 이용하여 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 제작하고, 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 23S rRNA 유전자의 염기서열(GI:6552383, 6537239 등)을이용하여 서열번호 5로 기재되는 프라이머를 제작하였다. 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 23S rRNA 유전자의 염기서열(GI:6537237, 20086379, 20086378, 20086376, 20086375, 20086372, 3046893, 2738840, 3420786 등)을 이용하여 서열번호 6으로 기재되는 프라이머, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 23S rRNA 유전자의 염기서열(GI:20086370, 6537244, 6815814 등)을 이용하여 서열번호 7로 기재되는 프라이머를 제작하고, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 16S rRNA 유전자의 염기서열(GI:3420786, 388037 등)을 이용하여 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 제작하였다.Large numbers of sequences for 16S rRNA, 23S rRNA, and local genes between 16S rRNA and 23S rRNA of eight probiotic Lactobacillus spp. To prepare primers used to perform PCR methods for detecting Lactobacillus spp. Use the information to adjust the length so that the melting point (Tm) value exceeds 50 ℃ and do not generate hairpin (haipin) structure or dimer (self-dimer). The primers were prepared by searching. Specifically, using the base sequence (GI: 22128340, 6537241, 1771113 and 1771109, etc.) of the L. acidophilus 23S rRNA gene to prepare a primer described in SEQ ID NO: 1, Lactobacillus Bulgaricus ( L. bulgaricus ) A primer described in SEQ ID NO: 2 was prepared using the nucleotide sequence (GI: 15982695, 15982694, 15982693, 2588893, 43981, 175022, etc.) of the 16S rRNA gene. Base sequences of Lactobacillus casi ( L. casei ), Lactobacillus paracasei ( L. paracasei ) and Lactobacillus rhamnosus 16S rRNA genes (GI: 14583099, 1848057, 1848056, 1848055, 1848054, respectively) 1848053, 1848052, 1843428, 1843427, 20257220, 12382750, 6996495, 43970, 175023, 7621525, 7621504, 1808583, 7159888, 7159887, 6996530, 7621503, etc .; GI: 6552383, 6537239, etc .; GI: 20086370, 6537244, 6815814, etc.) To prepare a primer set forth in SEQ ID NO: 3. Using the L. gasseri 16S rRNA gene and 23S rRNA gene sequence sequences (GI: 6537236, etc.), a primer set forth in SEQ ID NO: 4 was prepared, and L. paracasei ( L. paracasei ) The primer set forth in SEQ ID NO: 5 was prepared using the nucleotide sequence of 23S rRNA gene (GI: 6552383, 6537239, etc.). Lactobacillus plantarum ( L. plantarum ) primers described in SEQ ID NO: 6 using the nucleotide sequence of the 23S rRNA gene (GI: 6537237, 20086379, 20086378, 20086376, 20086375, 20086372, 3046893, 2738840, 3420786, etc.) Using the nucleotide sequence of the L. rhamnosus 23S rRNA gene (GI: 20086370, 6537244, 6815814, etc.), a primer set forth in SEQ ID NO: 7 was prepared, and the L. reuteri 16S rRNA gene was prepared. The primer set forth in SEQ ID NO: 8 was prepared using the nucleotide sequence (GI: 3420786, 388037, etc.).

또한, 상기에서 제작한 종 특이적인 프라이머와 함께 PCR을 수행하기 위한 나머지 프라이머로 상기 8가지 종의 염기서열에 존재하는 공통적인 서열을 탐지하는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머를 제작하였다. 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 프라이머와 쌍으로 PCR 반응을 하기 위한 정방향의 프라이머로 상기에 기재한 8종의 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 제작하였고, 역방향의 프라이머로 상기 8종의 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제작하였다.In addition, as the remaining primers for conducting PCR with the species-specific primers prepared above, a common primer of the genus Lactobacillus which detects the common sequences present in the 8 nucleotide sequences was prepared. It is described as SEQ ID NO: 9 using the 16S rRNA gene sequence of the 8 species of the genus Lactobacillus described above as a forward primer for PCR reaction in pairs with the primers described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 The primers were prepared, and primers described in SEQ ID NO: 10 were prepared using the 16S rRNA gene sequences of the 8 species of Lactobacillus genus as reverse primers.

상기에서 제조한 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머가 부착되는 위치 및 PCR 증폭시 예상되는 증폭 산물의 크기를도 1a에 나타내었다.도 1b에 나타난 바와 같이 락토바실러스 람노서스 (0.45 kb)는 락토바실러스 플란타룸(0.43 kb)과 증폭되는 산물의 크기가 비슷하고, 락토바실러스 파라카제이(0.65 kb)는 락토바실러스 애시도필러스(0.6 kb)와 증폭되는 산물의 크기가 비슷하기 때문에 이를 구분하기 위해 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 람노서스를 증폭할 수 있는 또 다른 프라이머로 락토바실러스 카제이를 증폭하는 프라이머와 동일한 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 제작하였다.The positions to which the primers described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10 prepared above are attached, and the size of the amplification products expected in PCR amplification are shown in FIG. 1A . As shown in FIG. 1B , Lactobacillus rhamnosus (0.45 kb) is similar in size to the product amplified with Lactobacillus plantarum (0.43 kb), and Lactobacillus paracazei (0.65 kb) is Lactobacillus ashdophyllus. (0.6 kb) and the size of the product to be amplified are similar to the primers for amplifying the Lactobacillus casei as another primer for amplifying Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus to distinguish it The primer described as was produced.

<실시예 2> 락토바실러스 속 균종 탐지용 프라이머를 이용한 락토바실러스 속 표준균주의 탐지Example 2 Detection of Standard Strains of Lactobacillus Species Using Primers for Detection of Lactobacillus Species

종특이 및 종공통 프라이머를 이용한 PCR 증폭산물이 종별 특이성을 가지는지 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 제작한 각각의 종특이 프라이머 및 종공통 프라이머 쌍을 이용하여 8종의 락토바실러스 표준균주의 염색체로부터 얻어진 DNA를 주형으로한 종특이 중합효소 연쇄반응(species specific PCR, SS-PCR) 분석을 실시하였다. 구체적으로, 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종의 표준균주인 락토바실러스 애시도필러스(ATCC 4356), 락토바실러스 불가리쿠스(ATCC 11842), 락토바실러스 카제이(ATCC 334), 락토바실러스 가쎄리 (ATCC 33323), 락토바실러스 파라카제이(ATCC 25302), 락토바실러스 플란타룸(ATCC 14917), 락토바실러스 루테리(ATCC 3594) 및 락토바실러스 람노서스(ATCC 7469)로부터 바마넨 등의 방법에 의해 염색체를 분리하였다(Varmanenet al.,Appl. Environ. Microbiol.,1998, 64, 1831-1836). 상기에서 분리한 염색체 DNA 0.25 ㎍과 종특이 및 종공통 프라이머를 각각 125 p㏖ 혼합하여 96℃에서 5분간 가열하고, 61℃에서 1분간 단일 가닥의 염색체 DNA와 프라이머를 결합시킨 후 68℃에서 2분간 중합반응을 시키고, 94℃에서 30초, 61℃에서 20초, 68℃에서 40초 중합반응을 총 35회 수행한 뒤 마지막으로 68℃에서 7분간 반응시켰다. 상기 반응은 각 균주를 증폭하기 위한 프라이머 쌍 이외에도 나머지 균주를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로도 동일하게 PCR 반응을 수행하여 각 균주 특이적으로 PCR 증폭 산물이 나오는지를 확인하고자 하였다. 최종 생성된 PCR 반응물 20 ㎕를 취하여 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하고 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색하여 증폭된 PCR 산물의 밴드 양상을 관찰하였다. 상기에서 락토바실러스 종을 구별하기 위해 사용한 PCR 프라이머 쌍 및 반응후 수득된 PCR 산물의 크기는표 1에 나타내었으며 실제 9종의 표준균주에 대하여 8종 각 균종 특이 단일 프라이머 쌍을 이용한 PCR 결과는도 1b와 같다.From the chromosomes of eight Lactobacillus standard strains using each species-specific primer and a species-specific primer pair prepared in Example 1 to determine whether the PCR amplification products using species-specific and species-specific primers have species specificity Species specific PCR (SS-PCR) analysis was performed using the obtained DNA as a template. Specifically, Lactobacillus ashidophyllus (ATCC 4356), Lactobacillus vulgaris (ATCC 11842), Lactobacillus casei (ATCC 334), Lactobacillus gasteria (ATCC 33323), which are standard strains of the probiotic Lactobacillus genus ), Lactobacillus paracasei (ATCC 25302), Lactobacillus plantarum (ATCC 14917), Lactobacillus luteri (ATCC 3594) and Lactobacillus rhamnosus (ATCC 7469) to separate chromosomes by methods such as bamanen. (Varmanen et al. , Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, 1831-1836). 0.25 μg of the chromosomal DNA isolated above and 125 pmol of each species and a common primer were mixed, heated at 96 ° C. for 5 minutes, and a single strand of chromosomal DNA and primers were combined at 61 ° C. for 1 minute. The polymerization was performed for 30 minutes, 35 seconds at 94 ° C, 20 seconds at 61 ° C, and 40 seconds at 68 ° C for a total of 35 times, followed by 7 minutes at 68 ° C. The reaction was performed to perform PCR reactions in the same manner as the primer pairs for amplifying the remaining strains in addition to the primer pairs for amplifying each strain. 20 μl of the final PCR reaction product was taken and electrophoresed on a 1.5% agarose gel and stained with ethidium bromide to observe the band profile of the amplified PCR product. The PCR primer pairs used to distinguish Lactobacillus species and the size of the PCR products obtained after the reaction are shown in Table 1 , and PCR results using 8 species of each species specific single primer pairs for 9 standard strains are shown in FIG. Same as 1b .

그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 상기도 1a에 기재된 반응 후 수득될 PCR 산물의 크기와 동일하게 각 균주의 DNA로부터 증폭된 PCR 산물을 얻을 수 있었으며(표 1도 1b), 다른 균종 특이적 프라이머를 사용한 PCR에서는 증폭된 PCR 산물을 얻을 수 없어 본 발명에서 제조한 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머가 프로바이오틱 락토바실러스 균종을 탐색하는데 유용한 프라이머 임을 알 수 있었다.As a result, PCR products amplified from the DNA of each strain were obtained in the same size as the PCR product to be obtained after the reaction described in FIG. 1A when compared to each band of the size marker ( Table 1 and FIG. In the PCR using a strain specific primer, the amplified PCR product cannot be obtained, and thus, the strain specific lactobacillus of the genus Lactobacillus described in SEQ ID NOS: 1 to 8 prepared in the present invention, and the lactose described in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. Bacillus spp. Common primer was found to be a useful primer for screening probiotic Lactobacillus spp.

검출 미생물Microbe detection 프라이머primer 증폭산물의 크기(kb)Size of amplification product (kb) 정방향Forward direction 역방향Reverse 락토바실러스 애시도필러스Lactobacillus ashdophyllus 서열번호 9SEQ ID NO: 9 서열번호 1SEQ ID NO: 1 0.600.60 락토바실러스 불가리쿠스Lactobacillus Bulgaricus 서열번호 2SEQ ID NO: 2 서열번호 10SEQ ID NO: 10 0.180.18 락토바실러스 가쎄리Lactobacillus gasserie 서열번호 9SEQ ID NO: 9 서열번호 4SEQ ID NO: 4 0.280.28 락토바실러스 루테리Lactobacillus rutheri 서열번호 8SEQ ID NO: 8 서열번호 10SEQ ID NO: 10 1.091.09 락토바실러스 플란타룸Lactobacillus plantarum 서열번호 9SEQ ID NO: 9 서열번호 6SEQ ID NO: 6 0.430.43 락토바실러스 람노서스Lactobacillus rhamnosus 서열번호 9SEQ ID NO: 9 서열번호 7SEQ ID NO: 7 0.450.45 서열번호 3SEQ ID NO: 3 서열번호 10SEQ ID NO: 10 0.710.71 락토바실러스 파라카제이Lactobacillus paracazei 서열번호 9SEQ ID NO: 9 서열번호 5SEQ ID NO: 5 0.650.65 서열번호 3SEQ ID NO: 3 서열번호 10SEQ ID NO: 10 0.710.71 락토바실러스 카제이Lactobacillus casei 서열번호 3SEQ ID NO: 3 서열번호 10SEQ ID NO: 10 0.710.71

<실시예 3><Example 3> 프라이머 혼합액을 이용한 프로바이오틱 락토바실러스 속 표준균주의 탐지Detection of Standard Strains of Probiotic Lactobacillus Using Primer Mixtures

균주의 동정을 단회의 PCR로 수행하기 위해 한 종의 균주에 대해 나머지 8종의 여러 종류의 프라이머를 하나의 반응에서 동시에 반응시킴으로써 효율적으로 종을 동정할 수 있는 다중 PCR(Multiplex PCR) 방법을 수행하였다. 본 발명에서 다중 PCR이라 함은 단일 종의 균주를 다종의 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하거나, 다종의 균주를 다종의 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 것을 뜻한다. PCR 방법은 상기 실시예 2에서 수행한 것과 동일하며, PCR을 수행하기 위한 프라이머는 한 균주의 염색체 DNA에 대해 모든 균주를 탐색하기 위한 프라이머(표 1)를 동일한 비율로 혼합하여 다중 PCR 반응을 수행하였다.In order to perform the identification of strains by a single PCR, multiple PCR (Multiplex PCR) methods are performed to efficiently identify species by simultaneously reacting the other eight different primers in one reaction to one strain. It was. In the present invention, the multiple PCR means performing a PCR reaction using a single species of strain using a plurality of PCR primers, or performing a PCR reaction using a variety of strains of a PCR primer. The PCR method is the same as that performed in Example 2, and the primers for performing PCR are mixed with primers ( Table 1 ) for searching all strains against the chromosomal DNA of one strain to perform multiple PCR reactions. It was.

그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 다중 PCR을 수행한 후의 PCR 산물은도 1a에 기재된 예상 PCR 산물 크기와 동일하였다(도 2). 상기 결과로부터 본 발명에서 제작한 종특이 다중 프라이머 혼합액을 사용한 PCR 반응은 프로바이오틱 락토바실러스 표준균주 모두에 대해 종특이 PCR 증폭산물을 특이적으로생산하므로, 본 발명의 종특이 프라이머는 종특이 다중 PCR 수행에 있어 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.As a result, the PCR product after performing multiple PCR when compared with each band of the size marker was the same as the expected PCR product size described in Figure 1a ( Fig. 2 ). From the above results, the PCR reaction using the species-specific multiple primer mixture prepared in the present invention specifically produces species-specific PCR amplification products for all probiotic Lactobacillus standard strains, and the species-specific primer of the present invention is species-specific multiple. It can be seen that it can be useful in performing the PCR.

<실시예 4> 혼합 균주로부터 락토바실러스 속 균주의 탐지Example 4 Detection of Strains of the Genus Lactobacillus from Mixed Strains

<4-1> 균주의 콜로니를 이용한 다중 PCR<4-1> Multiplex PCR using Colony of Strain

다중 PCR 방법을 이용하여 락토바실러스 속 균종을 간편하게 검색하기 위해서는 균주의 염색체 DNA를 추출하는 것이 번거롭기 때문에 배양한 균주의 콜로니(bacterial colony)로부터 직접 PCR 반응이 가능하여야 한다. 이를 확인하기 위해 8종의 프로바이오틱 락토바실러스 속 표준균주의 콜로니를 각각 멸균수에 혼탁시킨 현탁액을 PCR 반응을 위한 검사체로 사용하고, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머의 혼합액을 이용하여 다중 PCR을 수행하였다.In order to easily search for Lactobacillus spp. By multiplex PCR method, extracting the chromosomal DNA of the strain is cumbersome. Therefore, the PCR reaction should be possible directly from the colony of the cultured strain. In order to confirm this, a suspension of colonies of eight standard strains of the probiotic Lactobacillus genus, each of which was suspended in sterile water, was used as a test for PCR reaction, and the primers described in SEQ ID NOs: 1 to 10 of the present invention Multiple PCR was performed using the mixed solution.

그 결과, 각 균주의 콜로니를 멸균수에 혼합한 현탁액(탁도가 600nm 파장에서 1.0) 1 ㎕를 주형으로 한 PCR 산물은 각 균주에서 분리한 0.15 ㎍의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물의 결과와 거의 동일하게 나왔으며, 단일 균주의 콜로니를 사용한 PCR에서는 8종의 표준균주 모두 1 ×105cfu의 농도까지 각 종별 특이밴드를 생산해 내었다. 결과적으로 600 nm 파장에서 0.8-1.0의 탁도인 균주의 현탁액을 PCR 반응의 총 부피에 대해 1/10로 사용하였을 경우에 8종 표준균주 모두에서도 2와 동일한 증폭산물을 생산함을 알 수 있었다.As a result, the PCR product containing 1 μl of the suspension (1.0 at 600 nm wavelength turbidity) in which colonies of each strain was mixed with sterile water was used as the result of PCR products containing 0.15 μg of chromosomal DNA isolated from each strain. In the PCR using a single strain colony, almost all of the 8 standard strains produced specific bands up to the concentration of 1 × 10 5 cfu. As a result, it was found that the production of the same amplification product suspension having a turbidity of the strain of 0.8-1.0 and Figure 2 both in the case of using 8 kinds of strains by a factor of 10, relative to the total volume of the PCR reaction at 600 nm wavelength .

<4-2> 혼합 균주 콜로니를 이용한 다중 PCR 수행<4-2> Multiple PCR Using Mixed Strain Colonies

상기 실시예 <4-1>에서 균주의 콜로니를 PCR 반응의 주형으로 사용하여도 염색체 DNA를 주형으로 한 다중 PCR과 동일한 결과를 보임을 확인하였기 때문에, 균주의 콜로니를 PCR 반응의 검사체로 사용할 때에 균주의 콜로니를 혼합하여 다중 PCR을 수행하여도 균주 특이적으로 PCR 증폭되는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 8종의 프로바이오틱 락토바실러스 표준균주들의 콜로니들을 2, 3종 또는 6종까지 불균등한 비율로 혼탁시킨 세포 현탁액(OD600nm=1.0)을 PCR 반응의 주형으로 하여 전체 PCR 반응액의 1/10로 첨가한 후 다중 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 상기 실시예 2에서 기재된 바와 동일하게 수행하였다.When using the colony of the strain as a template for PCR reaction in Example <4-1>, it showed the same result as multiple PCR with chromosomal DNA as a template. The colony of the strains were mixed and multiple PCR was performed to determine whether the strain was specifically PCR amplified. Specifically, a cell suspension (OD 600 nm = 1.0) in which colonies of eight probiotic Lactobacillus standard strains were clouded at an uneven ratio up to two, three, or six was used as a template for PCR reaction. Multiple PCR was performed after addition to / 10. PCR reactions were performed as described in Example 2 above.

그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 여러 종류의 락토바실러스 균주가 혼합되어 있어도도 1a에 기재된 예상 PCR 증폭 산물과 동일하게 각 종별 특이 밴드를 재현성 있게 증폭함을 알 수 있었다(도 3). 따라서, 본 발명의 프라이머는 균주를 혼합하여 수행하는 다중 PCR 방법에도 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.As a result, it was found that even when various types of Lactobacillus strains were mixed when compared to each band of the size marker, the specific bands of each species were reproducibly amplified in the same manner as the expected PCR amplification products described in FIG. 1A ( FIG. 3 ). . Therefore, it can be seen that the primer of the present invention can also be usefully used in multiple PCR methods performed by mixing strains.

<실시예 5> 다중 PCR을 이용한 락토바실러스 균종 동정의 정확도 검사Example 5 Accuracy Test of Lactobacillus Species Identification Using Multiplex PCR

상기 실시예 1 내지 실시예 4를 통해 다중 프라이머를 이용한 PCR 반응을 이용하여 8종의 락토바실러스 표준균주들을 모두 정확하게 특이적으로 탐지하는 것이가능함을 확인하였다. 다음으로 이러한 다중 PCR을 통해 증폭된 PCR 산물이 실제 탐색하고자 하는 균종의 염색체 DNA를 증폭한 것인지 확인함으로써 균주 동정의 정확도를 검사하고자하였다. 구체적으로, 표준균주이거나 혹은 KCTC(Korean collection for type cultures)로부터 분양받은 락토바실러스 속의 여러 종에 속하는 총 29개의 분양주(표 2)에 대하여 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재된 프라이머의 혼합액을 이용한 다중 PCR을 실시하였으며, 각각의 균주들에 대해서는 생화학적 동정방법인 API 검사법(Chang,et al.,Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.,2000, 27(1), 23-27)을 병행하여 락토바실러스 속 균종 동정의 정확도를 측정하였다.In Examples 1 to 4 it was confirmed that it is possible to accurately detect all 8 different Lactobacillus standard strains by using a PCR reaction using multiple primers. Next, the accuracy of the strain identification was examined by confirming whether the PCR product amplified by the multiple PCR amplified the chromosomal DNA of the species to be actually searched. Specifically, using a mixture of the primers described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10 for a total of 29 distribution strains ( Table 2 ) belonging to several species of the genus Lactobacillus, which are standard strains or sold from Korean collection for type cultures (KCTC) Multiple PCR was performed, and each strain was combined with the API test (Chang, et al. , Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 27 (1), 23-27), which is a biochemical identification method . The accuracy of the species identification of Lactobacillus was measured.

다중 PCR에 의한 균주 동정 결과, 락토바실러스 애시도필러스(ATCC 1039), 락토바실러스 아밀로보루스(L. amylovorus)(ATCC 33620) 및 락토바실러스 존소니이(L. johnsonii)(JCM 1022) 의 3 균주에서 다른 결과를 보여 평균 89.7%의 정확도를 보였다. 또한, API 검사법에 의한 균주 동정 결과, 락토바실러스 아밀로필러스(L. amylophilus)(DSM 20533), 아밀로보루스(ATCC 33620), 락토바실러스 카제이(ATCC 334), 락토바실러스 카제이(ATCC 393), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 19992), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 33323), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 9857), 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus)(ATCC 15009), 락토바실러스 젠세니이(L. jensenii)(ATCC 25258), 락토바실러스 존소니이(JCM 1022), 락토바실러스 루테리(ATCC 23272) 및 락토바실러스 루테리(LMG 13090)의 12균주에서 다른 결과를 보여 58.6 %의 정확도를 보였다. API 검사법이 데이터베이스에 포함되지 않는균주들에 대해서도 근처의 유연 균주로 표시됨을 감안하여도, 다중 PCR 동정법과 API 검사법은 락토바실러스 애시도필러스(ATCC 1039), 락토바실러스 아밀로보루스(ATCC 33620), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 19992), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 33323), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 9857), 락토바실러스 헬베티쿠스(ATCC 15009), 락토바실러스 존소니이(JCM 1022) 등 7균주에서 차이를 보여 75.9%(22/29)의 일치도를 나타내었다(표 2). 상기 결과들을 종합할 때, API 검사법이 다중 PCR 방법에 의한 결과에 비하여 동정의 신뢰도가 떨어짐을 알 수 있었다. 이는 API 검사법이 균주의 배양과정에서 함유하고 있는 다양한 효소의 활성 정도를 검사액의 색도의 변화로 측정하는 것이므로 반응 시간의 차이에 따른 검사액 색도의 차이 변화에 따라 판정 결과가 모호할 수 있으며 또한 판정을 위해 사용되는 데이터베이스의 제한성이 존재하는 등 실험 결과의 정확도가 떨어지기 때문으로 생각된다. 이에 반하여 다중 PCR 방법은 균주의 유전자 차이 여부에 근거하는 것으로 8균주의 프로바이오틱 락토바실러스 종에 대해서는 정확한 동정이 가능함을 볼 수 있었다.As a result of strain identification by multiple PCR, three strains of Lactobacillus ashidophilus (ATCC 1039), Lactobacillus amylovorus (ATCC 33620) and Lactobacillus john SONii ( L. johnsonii ) (JCM 1022) In other results, the average accuracy was 89.7%. In addition, as a result of strain identification by API test, L. amylophilus (DSM 20533), amyloborus (ATCC 33620), Lactobacillus casei (ATCC 334), Lactobacillus casei (ATCC 393) ), Lactobacillus gasseri (ATCC 19992), Lactobacillus gasseri (ATCC 33323), Lactobacillus gasseri (ATCC 9857), Lactobacillus helveticus ( L. helveticus ) (ATCC 15009), Lactobacillus zensenyi ( L jensenii ) (ATCC 25258 ), Lactobacillus Johnsoni (JCM 1022), Lactobacillus luteri (ATCC 23272) and Lactobacillus luteri (LMG 13090) showed different results with 58.6% accuracy. Multiple PCR identification and API assays were performed using Lactobacillus ashdophyllus (ATCC 1039) and Lactobacillus amyloborus (ATCC 33620). , Lactobacillus gasserie (ATCC 19992), Lactobacillus gasserie (ATCC 33323), Lactobacillus gasserie (ATCC 9857), Lactobacillus helveticus (ATCC 15009), Lactobacillus john sony (JCM 1022) The difference showed 75.9% (22/29) agreement ( Table 2 ). In sum, the reliability of identification was lower than that obtained by the multiplex PCR method. This is because the API test measures the activity of various enzymes contained in the culture of the strain by the change in the chromaticity of the test solution, so the determination result may be ambiguous according to the change in test chromaticity according to the reaction time. It is considered that the accuracy of the experimental results is inferior, such as the limitation of the database used for the determination. On the contrary, the multiple PCR method is based on the difference of the genes of the strains, and it can be seen that 8 strains of the probiotic Lactobacillus species can be accurately identified.

락토바실러스 분양주에 대한 다중 PCR 검사법 및 API 결과 비교Comparison of Multiplex PCR and API Results for Lactobacillus Distribution Liquors 분양 균주 명Distribution strain name 다중 PCRMultiplex PCR API 검사법API inspection method 종(species)Species 아종(subspecies)Subspecies 균주*(strain)Strain * (strain) 동정 결과* Identification result * 동정 결과* Identification result * 정확도*(ID; %)Accuracy * (ID;%) L. acidophilusL. acidophilus ATCC 4356T ATCC 4356 T L. acidophilusL. acidophilus L. acidophilusL. acidophilus 99.899.8 L. acidophilusL. acidophilus ATCC 832ATCC 832 L. acidophilusL. acidophilus L. acidophilusL. acidophilus 99.899.8 L. acidophilusL. acidophilus ATCC 1039ATCC 1039 L. gasseriL. gasseri L. acidophilusL. acidophilus 89.289.2 L. amylophilusL. amylophilus DSM 20533T DSM 20533 T -- L. crispatusL. crispatus 63.763.7 L. amylovorusL. amylovorus ATCC 33620T ATCC 33620 T L. gasseriL. gasseri L. crispatusL. crispatus 98.998.9 L. caseiL. casei caseicasei ATCC 334T ATCC 334 T L. caseiL. casei L. paracaseiL. paracasei 78.078.0 L. caseiL. casei caseicasei ATCC 393ATCC 393 L. caseiL. casei L. paracaseiL. paracasei 68.668.6 L. crispatusL. crispatus JCM 5808JCM 5808 -- L. crispatusL. crispatus 99.699.6 L. crispatusL. crispatus JCM 5810JCM 5810 -- L. crispatusL. crispatus 98.998.9 L. curvatusL. curvatus ATCC 25601T ATCC 25601 T -- L. curvatusL. curvatus 95.495.4 L. delbrueckiiL. delbrueckii bulgaricusbulgaricus ATCC 11842T ATCC 11842 T L. delbrueckiiL. delbrueckii L. delbrueckiiL. delbrueckii 94.394.3 L. delbrueckiiL. delbrueckii delbrueckiidelbrueckii ATCC 9649T ATCC 9649 T L. delbrueckiiL. delbrueckii L. delbrueckiiL. delbrueckii 99.899.8 L. delbrueckiiL. delbrueckii lactislactis ATCC 21051T ATCC 21051 T L. delbrueckiiL. delbrueckii L. delbrueckiiL. delbrueckii 78.778.7 L. fermentumL. fermentum ATCC 14931T ATCC 14931 T -- L. fermentumL. fermentum 99.499.4 L. gasseriL. gasseri ATCC 19992ATCC 19992 L. gasseriL. gasseri L. acidophilusL. acidophilus 99.599.5 L. gasseriL. gasseri ATCC 33323T ATCC 33323 T L. gasseriL. gasseri L. acidophilusL. acidophilus 97.897.8 L. gasseriL. gasseri ATCC 9857ATCC 9857 L. gasseriL. gasseri L.acidophilusL.acidophilus 89.689.6 L. helveticusL. helveticus ATCC 15009T ATCC 15009 T -- L. acidophilusL. acidophilus 88.788.7 L. jenseniiL. jensenii ATCC 25258T ATCC 25258 T -- L. crispatusL. crispatus 63.263.2 L. johnsoniiL. johnsonii JCM 1022JCM 1022 L. gasseriL. gasseri L. acidophilusL. acidophilus 99.399.3 L. paracaseiL. paracasei paracaseiparacasei ATCC 25302T ATCC 25302 T L. paracaseiL. paracasei L. paracaseiL. paracasei 77.977.9 L. paracaseiL. paracasei paracaseiparacasei ATCC 27216ATCC 27216 L. paracaseiL. paracasei L. paracaseiL. paracasei 82.582.5 L. paracaseiL. paracasei toleranstolerans ATCC 25599T ATCC 25599 T L. paracaseiL. paracasei L. paracaseiL. paracasei 89.889.8 L. plantarumL. plantarum ATCC 10012ATCC 10012 L. plantarumL. plantarum L. plantarumL. plantarum 75.375.3 L. plantarumL. plantarum ATCC 14917T ATCC 14917 T L. plantarumL. plantarum L. plantarumL. plantarum 97.397.3 L. rhamnosusL. rhamnosus ATCC 7469T ATCC 7469 T L. rhamnosusL. rhamnosus L. rhamnosusL. rhamnosus 99.899.8 L. reuteriL. reuteri ATCC 23272T ATCC 23272 T L. reuteriL. reuteri L. fermentumL. fermentum 92.692.6 L. reuteriL. reuteri LMG 13090LMG 13090 L. reuteriL. reuteri L. fermentumL. fermentum 99.299.2 L. salivariusL. salivarius saliciniussalicinius ATCC 11742T ATCC 11742 T -- L. salivariusL. salivarius 92.592.5

상기에서 T는 표준균주를 의미하고, - 는 다중 PCR 결과 PCR 증폭 산물이 없음을 의미한다. ID는 API 결과에 대한 정확도로 데이터베이스에 있는 미생물 종과의 관계에서 얼마나 가까운 성질을 가지고 있는지에 대한 결과로써 ID %가 높을수록 확률적으로 거의 근접한 미생물로 판단한다.In the above, T means the standard strain, and-means that there is no PCR amplification product as a result of multiplex PCR. The ID is a result of how close the property is to the relationship with the microbial species in the database with the accuracy of the API result. The higher the ID%, the more likely it is to be determined to be close to the microbe.

또한, 상기 API 결과에서는 락토바실러스 카제이와 락토바실러스 파라카제이를 유사균주으로 규정하기 때문에 모두 동일하게 락토바실러스 파라카제이라고 표기되었다.In addition, in the above API results, because Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei are defined as similar strains, both are labeled as Lactobacillus paracase.

<실시예 6> 동정된 락토바실러스 속 균주의 확인 실험<Example 6> Identification experiment of the identified strain Lactobacillus

상기 실시예 5에서 다중 PCR을 수행한 결과 어떠한 증폭 산물도 생산해 내지 않은 9개의 균주들에 대한 결과(표 2)가 PCR 진행 여부와 상관없는 결과인지 확인하기 위하여, 프로바이오틱 락토바실러스 속에 공통적인 프라이머쌍을 사용한 PCR을 진행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 5의 29개의 락토바실러스 속 균주들을 동시에 확인하기 위해 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종 특이 프라이머인 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머를 제작하였다. 상기 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 프라이머 및표 2에 기재된 29개의 균주를 이용하여 상기 실시예와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 또한, 상기 29개의 락토바실러스 속 이외에도 다른 속인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis,ATCC 6051), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidumATCC 29521), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve,ATCC 15700), 비피도박테리움 인펀티스(Bifidobacterium infantis,ATCC 15697), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum,ATCC 15707), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis,ATCC 19433) 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faeciumATCC 19434)를 대조군으로 사용하였다.In order to confirm that the above-described embodiment results to the results of any amplification product is also produced to nine strains that are performing a multiplex PCR in the 5 (Table 2), the result has to do with whether to perform PCR, it is common in the probiotic Lactobacillus PCR was performed using primer pairs. Specifically, in order to simultaneously identify 29 Lactobacillus strains of Example 5, a primer having a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, which is a probiotic Lactobacillus genus specific primer, was prepared. PCR was performed under the same conditions as in the above example using the primers described in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 and 29 strains described in Table 2 . In addition, the genus Bacillus subtilis ( ATCC 6051), Bifidobacterium bifidum ATCC 29521, Bifidobacterium breve ( ATCC 15700), in addition to the 29 Lactobacillus genus a Bifidobacterium inpeon tooth (Bifidobacterium infantis, ATCC 15697), Bifidobacterium ronggeom (Bifidobacterium longum, ATCC 15707), Enterococcus faecalis (Enterococcus faecalis, ATCC 19433) and Enterococcus passive help (Enterococcus faecium ATCC 19434) Used as a control.

그 결과, 상기 29개의 모든 균주에서 락토바실러스 특이적인 PCR 증폭산물을 생산해 내었으며, 대조군인 바실러스, 비피도박테리움 및 엔테로코커스는 PCR 증폭산물을 생산하지 않았다. 따라서, 다중 PCR을 이용한 프로바이오틱 락토바실러스 균주 동정법은 락토바실러스 속 균주만을 특이적으로 검출함을 알 수 있었다.As a result, Lactobacillus-specific PCR amplification products were produced in all 29 strains, and controls Bacillus, Bifidobacterium and Enterococcus did not produce PCR amplification products. Therefore, it was found that the probiotic Lactobacillus strain identification method using multiple PCR specifically detects only Lactobacillus strains.

<실시예 7> 프로바이오틱 락토바실러스 함유 균제품으로부터 락토바실러스 균주의 동정Example 7 Identification of Lactobacillus Strains from Probiotic Lactobacillus-Containing Bacterial Products

본 발명의 다중 PCR을 이용하여 시판되는 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종 함유 제품으로부터 락토바실러스 속 균주를 동정할 수 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 6종류의 프로바이오틱 락토바실러스 균주 함유 제품으로부터 균주를 분리한 후 이 균주에 대해 다중 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행 방법은 상기 실시예 2에 기재된 것과 동일하게 수행하였다. 또한, 각각의 균주에 대해서는 API 검사법을 병행하여 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 혼합액을 이용한 다중 PCR 결과와 비교하여 락토바실러스 속 균종 동정의 정확도를 측정하였다.Lactobacillus sp. Strains were identified from the commercially available probiotic Lactobacillus sp. Species containing product using multiple PCR of the present invention. Specifically, the strains were isolated from the six probiotic Lactobacillus strain-containing products, and PCR was performed on the strains using multiple primers. PCR was carried out in the same manner as described in Example 2. In addition, for each strain, the accuracy of the identification of the genus Lactobacillus was determined by comparing the results of multiple PCR using a primer mixture having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10 in parallel with the API test.

그 결과, 다중 PCR 동정은 분양 균주의 목록과 3 균주에서만 동일한 결과를 보였으며, 이러한 결과는 API 검사법의 결과와도 유사하였다. API 검사법은 데이터베이스에 포함되지 않는 균주들에 대해서도 근처의 유연 균주으로 표시됨을 감안할 때 다중 PCR 동정법과 API 검사법은 83.3%(5/6)의 일치도를 보였다(표 3).As a result, multiple PCR identification showed the same result only in the list of pre-distributed strains and 3 strains, and these results were similar to those of the API test. Considering that the API test is indicated as a nearby flexible strain even for the strains not included in the database, the multiple PCR identification method and the API test method showed an agreement of 83.3% (5/6) ( Table 3 ).

균제품으로부터 락토바실러스 균주 동정 결과Lactobacillus strain identification results from bacterial products 락토바실러스 함유 균제품Lactobacillus-containing fungi 다중 PCRMultiplex PCR API 검사법API inspection method 제품명product name 표시 균주 명(Species)Display strain name (Species) 동정 결과Identification result 동정 결과* Identification result * 정확도*(ID; %)Accuracy * (ID;%) AA L. acidophilusL. acidophilus L. acidophilusL. acidophilus L. acidophilusL. acidophilus 98.998.9 BB L. acidophilusL. acidophilus L. acidophilusL. acidophilus L. acidophilusL. acidophilus 99.999.9 CC L. acidophilusL. acidophilus L. gasseriL. gasseri L. acidophilusL. acidophilus 68.368.3 DD L. acidophilusL. acidophilus L. rhamnosusL. rhamnosus L. paracaseiL. paracasei 78.678.6 EE L. acidophilusL. acidophilus L. rhamnosusL. rhamnosus L. rhamnosusL. rhamnosus 97.697.6 FF L. rhamnosusL. rhamnosus L. rhamnosusL. rhamnosus L. rhamnosusL. rhamnosus 99.899.8

상기에서 ID는 API 검사 결과에 대한 정확도로 데이터베이스에 있는 미생물 종과의 관계에서 얼마나 가까운 성질을 가지고 있는지에 대한 결과로써 ID %가 높을수록 확률적으로 거의 근접한 미생물로 판단한다.In the above, the ID is a result of how close the properties of the microbial species in the database are to the accuracy of the API test result.

상기 API 결과에서는 락토바실러스 카제이와 락토바실러스 파라카제이를 유사균주으로 규정하기 때문에 모두 동일하게 락토바실러스 파라카제이라고 표기되었다.In the above API results, because Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei are defined as similar strains, both were labeled as Lactobacillus paracase.

<실시예 8> 락토바실러스 속 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석<Example 8> 16S rRNA gene sequence analysis of the strain of the genus Lactobacillus

상기 실시예 7에서 수행한 프로바이오틱 락토바실러스 균주 함유 제품에 표기되어 있는 함유 균주명 (표시 균주명)과 다중 PCR 동정, 그리고 API 검사 결과가 모두 다른 제품에 대하여 정확한 동정을 수행하기 위해 이들 중 C제품으로부터 분리된 균주(이하 'C'라 약칭함)와 D제품으로부터 분리된 균주 (이하 'D'라고 약칭함)의 분자생물학적 동정을 실시하였다. 이를 위하여 C와 D를 각각 MRS 고체배지(DifcoTMLactobacilli MRS Broth, Difco 및 1.5% 한천)에 접종하여 37℃에서 2일간 배양하여 활성화시킨 후 지름 2 ㎜ 정도의 단일 콜로니(colony)를 취하여 600 ㎚ 파장에서 0.8-1.0 정도의 탁도를 가지도록 상기 콜로니를 멸균수에 현탁시켜 -20℃에 저장하여 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 균주 각각의 16S rRNA 유전자를 분리하기 위해 상기 멸균수에 현탁된 샘플을 서열번호 13 및 서열번호 14로 기재되는 프라이머를 1:1 비율로 섞은 혼합 프라이머와 결합시켜 콜로니 PCR 방법으로 증폭시켰다. 상기 증폭된 16S rRNA 유전자 분획물을 1% TAE 완충액(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)을 사용하여 0.75% 아가로스 겔 상에서의 전기영동 방법으로 분리하였다. 전기영동이 끝난 겔을 에티듐-브로마이드 염색 및 UV 조사한 후 원하는 DNA 단편이 있는 젤을 일정한 크기로 절단하였고, 유전자크린 키트(Gene Clean Kit, Bio101)를 사용하여 DNA를 정제하고BamHI과XhoI 제한효소로 이중 절단하여 pcDNA3.1/Hygro(+)(5.6 kb) 플라스미드 벡터(Invitrogen)에 연결하였다. C와 D의 16S rRNA 유전자가 pcDNA3.1/Hygro(+) 플라스미드 벡터에 연결된 플라스미드(각각 7.1 kb)로 대장균 숙주세포를 형질전환 시킨 후 형질전환 된 세포만을 선별하여 대량 배양함으로써 원하는 플라스미드를 대량 확보하였다. 확보된 플라스미드는 다시 유전자크린 키트로 정제하였으며 16S rRNA 유전자 단편은 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 기재되는 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 반응은 싸이클 시퀀싱 키트(cycle sequencing kit, Perkin Elmer)와 염료 종결제(dye terminator)를 사용하여 실시하였고, 자동 DNA 서열 분석기(ABI prism 310 automatical DNA sequencer)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 또한, 분석한 염기서열을 이미 알려진 균주의 16S rRNA 유전자 염기 서열과의 유사성을 비교하기 위해 블라스트 유사성 조사 프로그램(Blast similarity search program : National Institute of Biotechnology Information)으로 비교하였다. 또한, 실제적인 분자생물학적 동정을 위하여 GenBank에 등록된 9개의 속과 락토바실러스속 내의 85개의 종 그리고 락토바실러스 애시도필러스와 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 젠세니이 등을 포함하는 애시도필러스 군의 33개 균주에 대한 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후 계통수(phylogenic tree)에서의 위치를 판별하였다. 다중 서열 정렬 프로그램(multiple sequence alignment program)은 ClustalX를 사용하였다.In order to perform accurate identification on the products containing the different strain name (labeled strain name), multiple PCR identification, and API test results indicated on the probiotic Lactobacillus strain-containing product performed in Example 7, Molecular biological identification of strains isolated from C product (hereinafter abbreviated as 'C') and strains isolated from D product (hereinafter abbreviated as 'D') was performed. To this end, C and D were inoculated in MRS solid medium (Difco TM Lactobacilli MRS Broth, Difco and 1.5% agar), respectively, incubated at 37 ° C. for 2 days to activate, and a single colony having a diameter of 2 mm was taken and 600 nm. The colonies were suspended in sterile water to have a turbidity of about 0.8-1.0 at a wavelength and stored at −20 ° C. to be used as a template for PCR reaction. To isolate 16S rRNA genes of each strain, the samples suspended in sterile water were amplified by colony PCR method by combining primers described in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 with a mixed primer mixed in a 1: 1 ratio. The amplified 16S rRNA gene fractions were separated by electrophoresis on 0.75% agarose gel using 1% TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA). After the electrophoresis gel was stained with ethidium-bromide and UV irradiated, the gel containing the desired DNA fragment was cut to a certain size. The DNA was purified using a Gene Clean Kit (Bio101) and BamH I and Xho I Double digestion with restriction enzymes was linked to the pcDNA3.1 / Hygro (+) (5.6 kb) plasmid vector (Invitrogen). 16S rRNA genes of C and D were transformed into E. coli host cells with plasmids (7.1 kb each) linked to the pcDNA3.1 / Hygro (+) plasmid vector, and only the transformed cells were selected and cultured in large quantities to secure the desired plasmid. It was. The obtained plasmid was purified again with a gene clean kit, and 16S rRNA gene fragments were analyzed for nucleotide sequences using primers set forth in SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17. Sequencing reactions were performed using a cycle sequencing kit (Perkin Elmer) and dye terminator, and sequence analysis was performed using an ABI prism 310 automatical DNA sequencer. . In addition, the analyzed sequences were compared with a blast similarity search program (National Institute of Biotechnology Information) to compare the similarities with known 16S rRNA gene sequences. In addition, nine genera registered in GenBank and 85 species in the genus Lactobacillus and Lactobacillus ashidophilus and Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasteria, Lactobacillus gensenyi, etc. Multiple sequence alignments were performed with 16S rRNA gene sequences for 33 strains of the Ashdophilus group, followed by determination of their position in the phylogenic tree. Multiple sequence alignment program was used for ClustalX.

그 결과, C와 D의 16S rRNA 유전자는 각각 1,531 bp와 1,528 bp 길이를 가지고 있었다. 블라스트 유사성 조사 검색 결과, C는 락토바실러스 가쎄리 균주인 BLB1b(GI: 7621501), DSM 20243(GI: 175028), KC5a(GI: 7621522), KC36a(GI: 7621508), KC26(GI: 7621513), BLB3(GI: 7621499), KC29(GI: 7621514), TL33a(GI: 7621530)와 99.1-99.7%로 평균 99.5%의 높은 유사도를 나타내었다. 이에 반하여, 락토바실러스 애시도필러스 균주인 ATCC 4356, NCDO 1748, BMF6Lb6과는 평균 90.8%의 상동성을 나타내어 상기 균주는 락토바실러스 가쎄리로 판단되었다. 또한 계통수 위치 판별 결과, C의 16S rRNA 유전자는 락토바실러스 가쎄리에 가장 가까운 위치에 배치되었다(도 4).As a result, the 16S rRNA genes of C and D were 1,531 bp and 1,528 bp in length, respectively. As a result of blast similarity investigation, C is BLB1b (GI: 7621501), DSM 20243 (GI: 175028), KC5a (GI: 7621522), KC36a (GI: 7621508), KC26 (GI: 7621513), Higher similarities were 99.5% with BLB3 (GI: 7621499), KC29 (GI: 7621514), and TL33a (GI: 7621530), 99.1-99.7%. In contrast, the Lactobacillus ashidophilus strains ATCC 4356, NCDO 1748, BMF6Lb6 showed an average homology of 90.8%, and the strain was determined to be Lactobacillus gasery. In addition, as a result of phylogenetic position determination, the 16S rRNA gene of C was located at the position closest to the Lactobacillus gasteria ( FIG. 4 ).

또한, D의 염기서열은 락토바실러스 람노서스 균주인 F11(GI: 7621503), ATCC 7469(GI: 1848056), DSM 20021(GI: 175023)과 각각 99.5, 99.3, 98.4%의 상동성으로 평균 99.1%의 상동성을 보였다. 이에 반하여, 락토바실러스 애시도필러스 균주인 ATCC 4356, NCDO 1748, BMF6Lb6과는 평균 82.3%의 상동성을 나타내어 D 균주는 락토바실러스 람노서스로 판단되었으며, 계통수에서의 위치 판별 결과 계통수 상에서 D의 16S rRNA 유전자는 락토바실러스 람노서스에 가장 가까운 위치에 배치되었다(도 4).In addition, the nucleotide sequence of D was 99.1% with 99.5, 99.3, and 98.4% homology with Lactobacillus rhamnosus strains F11 (GI: 7621503), ATCC 7469 (GI: 1848056), and DSM 20021 (GI: 175023), respectively. Showed homology. On the contrary, the D strain was determined to be Lactobacillus rhamnosus with an average of 82.3% homology with the Lactobacillus ashidophilus strains ATCC 4356, NCDO 1748, and BMF6Lb6. The rRNA gene was located at the position closest to the Lactobacillus rhamnosus ( FIG. 4 ).

따라서, 16S rRNA 유전자를 이용한 분자생물학적 동정결과 C는 락토바실러스 가쎄리로 D는 락토바실러스 람노서스로 판정할 수 있었으므로, 제품의 표시 균주명과 API 시험법 그리고 다중 PCR 동정법 중 PCR 결과만이 분자생물학적 동정과 정확히 일치함을 알 수 있었다. 이러한 이유는 표시 균주명은 비교적 오래된 동정법 및 동정기준을 이용하였기 때문일 것으로 생각되며, API 결과는 그 데이터베이스의 제한성과 배양결과의 미묘한 차이에서 비롯된 데이터 분석의 오류에 기인한 것으로 사료된다. 이에 반하여 다중 PCR 방법은 8종의 락토바실러스 종들 간 정확한 유전자의 차이에 근거한 방법으로써 유사균주 내역 그리고 균주의 배양상태 및 사멸 여부에 상관없이 항상 동일한 결과를 나타내는 동정 방법이므로 이 방법을 사용할 경우 기존의 동정법보다 휠씬 신속하고 정확하며 재현성 있는 결과를 제공함을 알 수 있었다.Therefore, as a result of molecular biological identification using the 16S rRNA gene, C could be determined to be Lactobacillus gasteria and D to Lactobacillus rhamnosus, only the PCR result of the labeled strain name, API test method and multiple PCR identification method of the product were molecules. It can be seen that this is exactly the same as the biological identification. The reason for this may be due to the use of relatively old identification methods and identification criteria, and the API results may be due to data analysis errors resulting from the limitations of the database and subtle differences in culture results. In contrast, the multiplex PCR method is based on the exact difference of genes among 8 Lactobacillus species, and it is an identification method that always shows the same result regardless of the history of similar strains and the culture status and death of the strain. It was found to be much faster, more accurate and more reproducible than the identification method.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 속 균종에 특이적인 프라이머를 이용한 다중 PCR 방법은 락토바실러스 속 균종을 간편하고 신속, 정확하게 동정할 수 있으므로, 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 이용한 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강 보조식품, 정장약품 및 캡슐제제의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the multiple PCR method using a primer specific for the Lactobacillus spp. Of the present invention can easily and quickly and accurately identify the Lactobacillus spp. It can be used to develop raw materials for dairy products, livestock farm feed, cosmetics, dietary supplements, formal medicines and capsules.

<110> ILDONG PHARMACEUTICAL CO., LTD <120> Method for identification of microorganism of lactobacillus species <130> 4p-02-46 <150> KR-2003-12777 <151> 2003-02-28 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. acidophilus reverse primer <400> 1 aactatcgct tacgctacca ctttgc 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. bulgaricus forward primer <400> 2 ctgtgctaca cctagagata ggtgg 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus forward primer <400> 3 tggtcggcag agtaactgtt gtcg 24 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. gasseri reverse primer <400> 4 atttcaagtt gagtctctct ctcttctcgg 30 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L paracasei reverse primer <400> 5 ccggccagct atgtattcac tgaca 25 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. plantarum reverse primer <400> 6 ctagtggtaa cagttgatta aaactgctgg g 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. rhamnosus reverse primer <400> 7 gcggttatgc gatgcgaatt tctattatt 29 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L. reuteri forward primer <400> 8 acctgattga cgatggatca ccagt 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus species reverse primer <400> 9 ccaccttcct ccggtttgtc a 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus species forward primer <400> 10 agggtgaagt cgtaacaagg tagcc 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific forward primer <400> 11 ggaaacagrt gctaataccg 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific reverse primer <400> 12 cyctcaaaac traacaaagt ttc 23 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8-F <400> 13 gggggatcca gagtttgatc ctggctca 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8-R <400> 14 gggctcgagt accttgttac gacttcacc 29 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-F <400> 15 taatacgact cactataggg 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGH-R <400> 16 tagaaggcac agtcgagg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID13S-F <400> 17 taactacgtg ccagcagc 18<110> ILDONG PHARMACEUTICAL CO., LTD <120> Method for identification of microorganism of          lactobacillus species <130> 4p-02-46 <150> KR-2003-12777 <151> 2003-02-28 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> L. acidophilus reverse primer <400> 1 aactatcgct tacgctacca ctttgc 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> L223 bulgaricus forward primer <400> 2 ctgtgctaca cctagagata ggtgg 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus forward primer <400> 3 tggtcggcag agtaactgtt gtcg 24 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> L. gasseri reverse primer <400> 4 atttcaagtt gagtctctct ctcttctcgg 30 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L paracasei reverse primer <400> 5 ccggccagct atgtattcac tgaca 25 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> L. plantarum reverse primer <400> 6 ctagtggtaa cagttgatta aaactgctgg g 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> L. rhamnosus reverse primer <400> 7 gcggttatgc gatgcgaatt tctattatt 29 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> L. reuteri forward primer <400> 8 acctgattga cgatggatca ccagt 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus species reverse primer <400> 9 ccaccttcct ccggtttgtc a 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus species forward primer <400> 10 agggtgaagt cgtaacaagg tagcc 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific forward primer <400> 11 ggaaacagrt gctaataccg 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus specific reverse primer <400> 12 cyctcaaaac traacaaagt ttc 23 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8-F <400> 13 gggggatcca gagtttgatc ctggctca 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8-R <400> 14 gggctcgagt accttgttac gacttcacc 29 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-F <400> 15 taatacgact cactataggg 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGH-R <400> 16 tagaaggcac agtcgagg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID13S-F <400> 17 taactacgtg ccagcagc 18

Claims (6)

서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머.Lactobacillus genus species specific primer selected from the group consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8. 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머.A common primer of the genus Lactobacillus, characterized in that it is selected from the group consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. 1) 검사체를 주형으로 하고 제 1항의 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 및 제 2항의 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용하여 다중 PCR을 수행하는 단계; 및1) performing multiplex PCR using the test sample as a template and using at least one primer selected from the primers of claim 1 and at least one primer selected from the primers of claim 2; And 2) 단계 1의 PCR 반응 산물의 증폭 여부 및 증폭 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 락토바실러스 속 균종의 동정방법.2) Identification method of the genus Lactobacillus comprising the step of confirming whether the amplification of the PCR reaction product of step 1 and the size of the amplification product. 제 3항에 있어서, 검사체는 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 포함하고 있는 시료로부터 배양한 균주의 콜로니 또는 균주로부터 분리한 염색체 DNA인 것을 특징으로 하는 동정방법.4. The method according to claim 3, wherein the test specimen is chromosomal DNA isolated from colonies or strains of strains cultured from a sample containing a strain of the probiotic Lactobacillus strain. 제 3항에 있어서, 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종은 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 루테리로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 동정방법.The genus species of Probiotic Lactobacillus are Lactobacillus ashidophyllus, Lactobacillus vulgaris, Lactobacillus cascai, Lactobacillus paracaze, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasteria, Lactobacillus fluctus. At least one selected from the group consisting of lantarum and Lactobacillus luterii. 제 3항에 있어서, 시료는 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 함유하는 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품 및 캡슐제제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동정방법.The method of claim 3, wherein the sample is selected from the group consisting of fermented milk, baby food, dairy products, livestock farm feed, cosmetics, dietary supplements, formal medicines and capsules containing the strain of the genus Probiotic Lactobacillus Way.
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