JP2012187067A - Method for quantifying bacterium of genus lactobacillus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法に関する。 The present invention relates to a method for quantifying Lactobacillus genus bacteria.
乳酸菌の１種であるラクトバチルス属細菌は、ヒトの腸内、口腔内、表皮等に棲息するヒトの常在菌であり、ある種のラクトバチルス属細菌は免疫賦活など、ヒトに有益な機能をもたらす。また、ラクトバチルス属細菌は、ヨーグルト、乳酸菌飲料の製造など、飲食品製造において古くから用いられている。一方、ラクトバチルス属細菌は、酸性条件下にあっても耐酸性能・増殖能を有し、飲食品の汚染事故の原因菌ともなり得る。そのため、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保にあっては、ラクトバチルス属細菌の制御が非常に重要である。このように、ラクトバチルス属細菌は産業上功罪の両面を有する微生物であり、ラクトバチルス属細菌を正確に検出、定量する技術が求められている。 Lactobacillus genus bacteria, which is a kind of lactic acid bacteria, are human resident bacteria that inhabit human intestine, oral cavity, epidermis, etc., and certain Lactobacillus bacteria have functions that are beneficial to humans, such as immunostimulation Bring. Lactobacillus bacteria have been used for a long time in the production of foods and drinks such as yogurt and lactic acid bacteria beverages. On the other hand, bacteria of the genus Lactobacillus have acid resistance and proliferation ability even under acidic conditions, and can be a causative bacterium of food and beverage contamination accidents. Therefore, control of Lactobacillus genus bacteria is very important in hygiene management of food and drink and ensuring freshness of raw materials. Thus, a Lactobacillus genus bacterium is a microorganism having both industrial merits and demerits, and a technique for accurately detecting and quantifying the Lactobacillus bacterium is required.
ラクトバチルス属細菌を検出する方法としては、特定の選択培地を用いて嫌気的に培養し、培地からラクトバチルス属細菌のＤＮＡを抽出し、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により特定領域のＤＮＡ断片を増幅し、確認する方法が知られている。特許文献１〜２及び非特許文献１には、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる、ラクトバチルス属細菌検出用核酸プライマーが記載されている。
As a method for detecting Lactobacillus bacteria, anaerobic culture is performed using a specific selective medium, DNA of Lactobacillus bacteria is extracted from the medium, and polymerase chain reaction (PCR) method is performed using specific primers. A method for amplifying and confirming a DNA fragment in a specific region is known.
本発明は、正確、簡便かつ迅速なラクトバチルス属細菌の定量が可能な、ラクトバチルス属細菌の定量方法を提供することを課題とする。また、本発明はこの方法に適用可能な定量キットを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for quantifying Lactobacillus bacteria, which enables accurate, simple and rapid quantification of Lactobacillus bacteria. Another object of the present invention is to provide a quantitative kit applicable to this method.
本発明者は、特許文献１〜２及び非特許文献１に記載されている、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーについて検討を行った。その結果、後述の実施例でも示すように、前記プライマーを用いた場合、ラクトバチルス属細菌だけではなく、ヒトに対する病原性を有する白色ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）や、ヒトのニキビの原因菌の１種であるプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）も検出されることが明らかになった。したがって、特許文献１〜２及び非特許文献１に記載のプライマーを用いた従来の方法では、ラクトバチルス属細菌と、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスとを区別することができず、試料に含まれるラクトバチルス属細菌を正確に定量することができない。さらに、前記方法によりラクトバチルス属細菌を正確に定量するには、ラクトバチルス属細菌の同定工程が必要となり、迅速性に欠ける。
This inventor examined the nucleic acid primer which consists of the oligonucleotide represented by the base sequence of
上記問題点に鑑み、本発明者は鋭意検討を行った。具体的には、プロピオニバクテリウム・アクネスの検出に配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが用いられているが（例えば、Eishi Y．et al.，J．Clin．Microbiol.，40，p．198-204，2002参照）、データベースで検索したところ、プロピオニバクテリウム・アクネス以外にラクトバチルス属細菌も配列番号３に記載の塩基配列を有することを見出した。さらに、ラクトバチルス属細菌、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスのうち、配列番号１〜３に記載の塩基配列全てを有するのは、ラクトバチルス属細菌のみであることを見出した。これらの知見に基づき、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに蛍光色素で標識された配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いて、プローブのハイブリダイゼーション及びＤＮＡ断片の増幅反応を行うことでラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見出した。さらには、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブに代えて、白色ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌の１６Ｓ ｒＲＮＡには存在しない、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いることによっても、ラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。 In view of the above problems, the present inventor has intensively studied. Specifically, an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is used for detection of Propionibacterium acnes (see, for example, Eishi Y. et al., J. Clin. Microbiol. , 40, p. 198-204, 2002), and a database search revealed that, in addition to Propionibacterium acnes, Lactobacillus bacteria also have the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Further, among the Lactobacillus bacteria, White staphylococci, Staphylococcus aureus and Propionibacterium acnes, it is found that only Lactobacillus bacteria have all the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 3. It was. Based on these findings, a nucleic acid primer comprising an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3 labeled with a fluorescent dye It was found that the Lactobacillus genus bacteria can be accurately quantified by performing probe hybridization and DNA fragment amplification reaction using the probe comprising the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence described in 1. Furthermore, in place of the probe consisting of the oligonucleotide represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, a specific base of 16S rRNA of Lactobacillus bacteria not present in 16S rRNA of S. aureus and S. aureus It has been found that accurate quantification of Lactobacillus bacteria is also possible by using a probe comprising an oligonucleotide represented by a sequence. The present invention has been completed based on these findings.
本発明は、蛍光色素で標識された、下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、
前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び
測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、
を含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
In the present invention, at least one probe comprising the oligonucleotide of any one of the following (c) to (f) labeled with a fluorescent dye is hybridized to DNA or rRNA of Lactobacillus genus bacteria in a sample. The process of
A step of amplifying a DNA fragment of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus in a specimen, using a nucleic acid primer comprising the oligonucleotide of the following (a) and the oligonucleotide of the following (b):
A step of measuring the fluorescence intensity obtained by the amplification reaction, and a step of quantifying Lactobacillus genus bacteria in the specimen based on the measured fluorescence intensity;
And a method for quantifying a bacterium belonging to the genus Lactobacillus .
(A) Oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and Lactobacillus ( Lactobacillus ) An oligonucleotide that can be used to amplify a partial base sequence of 16S rDNA of the genus bacteria (b) One or several oligonucleotides represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 And (c) an oligonucleotide that can be used for amplification of a partial base sequence of 16S rDNA of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus (c) represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3. Or one or several bases deleted, substituted, or inserted in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Or added to and and Lactobacillus (Lactobacillus) bacteria capable of hybridizing oligonucleotides to partial nucleotide sequence of 16S rDNA (d) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 4 Oligonucleotide (e) SEQ ID NO: 1 or several bases deleted, substituted, inserted or added in the described base sequence and capable of hybridizing to a partial base sequence of 16S rDNA of Lactobacillus bacteria 5. An oligonucleotide represented by the base sequence described in 5, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a bacterium belonging to the genus Lactobacillus Oligonucleotide hybridizable to a partial base sequence of 16S rDNA (F) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and Lactobacillus Oligonucleotides capable of hybridizing to a partial base sequence of 16S rDNA of ( Lactobacillus ) genus bacteria
また、本発明は、前記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量キットに関する。 The present invention also includes a nucleic acid primer comprising the oligonucleotide (a) and the oligonucleotide (b), and at least one probe comprising any of the oligonucleotides (c) to (f). The present invention relates to a quantification kit for bacteria belonging to the genus Lactobacillus .
本発明の定量方法によれば、正確、簡便かつ迅速にラクトバチルス属細菌を定量することができる。また、本発明の定量キットは、前記方法に好適に適用することができる。 According to the quantification method of the present invention, Lactobacillus bacteria can be quantified accurately, simply and quickly. The quantification kit of the present invention can be suitably applied to the above method.
本発明のラクトバチルス属細菌の定量方法は、蛍光色素で標識された、下記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなるプローブを検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、を含むものである。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
本発明の方法によれば、従来のラクトバチルス属細菌の検出方法においてラクトバチルス属細菌とともに検出される白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別でき、被検体に含まれるラクトバチルス属細菌を網羅的に定量することができる。
なお、本発明において、「ラクトバチルス属細菌の定量」とは、被検体におけるラクトバチルス属細菌密度の定量、被検体におけるラクトバチルス属細菌由来のＤＮＡ量の定量、などを特徴的に指すものとする。
また、本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
In the method for quantifying Lactobacillus bacteria of the present invention, a probe consisting of any one of the following oligonucleotides (c) to (f) labeled with a fluorescent dye is hybridized to DNA or rRNA of Lactobacillus bacteria in a sample. A step of soy, a step of amplifying a DNA fragment of Lactobacillus bacteria in a sample using a nucleic acid primer comprising the oligonucleotide (a) and the oligonucleotide (b) below, and the fluorescence obtained by the amplification reaction A step of measuring the intensity, and a step of quantifying Lactobacillus bacteria in the specimen based on the measured fluorescence intensity.
(A) Oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and Lactobacillus ( Lactobacillus ) An oligonucleotide that can be used to amplify a partial base sequence of 16S rDNA of the genus bacteria (b) One or several oligonucleotides represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 And (c) an oligonucleotide that can be used for amplification of a partial base sequence of 16S rDNA of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus (c) represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3. Or one or several bases deleted, substituted, or inserted in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Or added to and and Lactobacillus (Lactobacillus) bacteria capable of hybridizing oligonucleotides to partial nucleotide sequence of 16S rDNA (d) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 4 Oligonucleotide (e) SEQ ID NO: 1 or several bases deleted, substituted, inserted or added in the described base sequence and capable of hybridizing to a partial base sequence of 16S rDNA of Lactobacillus bacteria 5. An oligonucleotide represented by the base sequence described in 5, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a bacterium belonging to the genus Lactobacillus Oligonucleotide hybridizable to a partial base sequence of 16S rDNA (F) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and Lactobacillus Oligonucleotide that can hybridize to 16S rDNA partial base sequence of ( Lactobacillus ) genus bacteria According to the method of the present invention, white staphylococci detected together with Lactobacillus bacteria in the conventional method for detecting Lactobacillus bacteria, yellow Staphylococcus and Propionibacterium acnes can be clearly distinguished from Lactobacillus bacteria, and Lactobacillus bacteria contained in the subject can be quantified comprehensively.
In the present invention, “quantification of Lactobacillus bacteria” characteristically refers to quantification of Lactobacillus bacteria density in a subject, quantification of the amount of DNA derived from Lactobacillus bacteria in a subject, and the like. To do.
In this specification, “stringent conditions” include, for example, the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]. XSSC (1 x SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 x Denhardt and 100 mg / mL herring sperm DNA together with the probe 65 The condition is that the temperature is constant at 8 ° C. for 8 to 16 hours for hybridization.
本発明における「ラクトバチルス属細菌」とは、グラム陽性桿菌であり、乳酸を産生する微生物の総称である。ラクトバチルス属細菌としては、下記のものが知られているが、本発明はこれらに制限するものではない。 The “Lactobacillus bacterium” in the present invention is a general term for microorganisms that are gram-positive bacillus and produce lactic acid. The following are known as Lactobacillus bacteria, but the present invention is not limited to these.
発明者等は、図１〜５及び後述の実施例で示すように、ラクトバチルス属細菌、並びに白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の解析を行った。その結果、ラクトバチルス属細菌に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡの領域を見い出した。そして、この可変領域にハイブリダイズ可能な少なくとも３種のオリゴヌクレオチドを用いることにより、ラクトバチルス属細菌の正確な定量が可能となることを見い出した。 The inventors analyzed the base sequences of 16S rRNA of Lactobacillus bacteria and S. aureus, S. aureus and Propionibacterium acnes as shown in FIGS. . As a result, a region of 16S rRNA specific to Lactobacillus bacteria was found. And it discovered that the accurate quantification of the Lactobacillus genus bacteria was attained by using the at least 3 sort (s) of oligonucleotide which can hybridize to this variable region.
本発明に用いるオリゴヌクレオチドが認識する、ラクトバチルス属細菌類、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を図１〜５及び配列番号７〜１１に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、配列番号７〜１１に記載の塩基配列は、それぞれ、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）JCM 1132株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp．lactis）BCRC 11051株の１６Ｓ ｒＲＮＡの全塩基配列、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）ATCC 14990株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（Staphylococcus aureus subsp．aureus）ATCC 12600株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列及びプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）JCM 6473株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列を示す。
The nucleotide sequences of 16S rRNA of Lactobacillus bacteria, S. aureus, S. aureus, and Propionibacterium acnes recognized by the oligonucleotide used in the present invention are shown in FIGS. 1 to 5 and SEQ ID NOs: 7 to 11. This will be described based on the base sequence. The base sequences described in SEQ ID NOs: 7 to 11 are the partial base sequence of 16S rRNA of Lactobacillus acidophilus JCM 1132 strain, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis BCRC, respectively. 110S 16S rRNA full nucleotide sequence, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 16S rRNA partial nucleotide sequence, Staphylococcus aureus subsp. Aureus ATCC 12600 strain 16S The partial base sequence of rRNA and the partial base sequence of 16S rRNA of Propionibacterium acnes
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac1 primerともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac2 primerともいう）はそれぞれ、図１〜２に示すように、配列番号７に記載の塩基配列のうち３３３位〜３５１位までの領域及び６６０位〜６７７位までの領域、並びに配列番号８に記載の塩基配列のうち３６７位〜３８５位までの領域及び６９４位〜７１１位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
なお、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、図３〜４に示すように、配列番号９及び１０に記載の塩基配列のうち６６２位〜６７９位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。しかし、配列番号９及び１０に記載の塩基配列には、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。さらに、図５に示すように、配列番号１１に記載の塩基配列には、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。
The oligonucleotide (a) (also referred to herein as Lac1 primer) and the oligonucleotide (b) (also referred to herein as Lac2 primer) each have a sequence as shown in FIGS. The region from position 333 to position 351 and the region from position 660 to position 677 in the base sequence described in No. 7 and the region from position 367 to position 385 and the position from position 694 to position 364 of the base sequence described in SEQ ID NO: 8 It is an oligonucleotide that can hybridize to the region up to position 711 under stringent conditions.
In addition, as shown in FIGS. 3 to 4, each of the oligonucleotides (b) can be hybridized under stringent conditions to the region from position 662 to position 679 of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 and 10. It is. However, in the base sequences described in SEQ ID NOs: 9 and 10, there is no region where the oligonucleotide (a) can hybridize. Furthermore, as shown in FIG. 5, the base sequence described in SEQ ID NO: 11 does not have a region where the oligonucleotides (a) and (b) can hybridize.
前記（ｃ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、Lac3 probeともいう）は、図１〜２に示すように、配列番号７に記載の塩基配列のうち５２７位〜５５０位までの領域及び配列番号８に記載の塩基配列のうち５６１位〜５８４位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。
なお、図３〜４に示すように、配列番号９及び１０に記載の塩基配列には、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域は存在しない。また、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドは、図５に示すように、配列番号１１に記載の塩基配列のうち５１８位〜５４１位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。
The oligonucleotide (c) (also referred to as Lac3 probe in the present specification), as shown in FIGS. 1 and 2, is a region from the 527th to 550th positions and the SEQ ID NO: 8 is an oligonucleotide capable of hybridizing under stringent conditions to the region from position 561 to position 584 of the base sequence described in 8.
In addition, as shown to FIGS. 3-4, the area | region which can hybridize with the oligonucleotide of said (c) does not exist in the base sequence of
上記１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の解析結果に基づき、蛍光色素で標識された、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブを検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせ、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片を増幅反応を行い、該増幅反応によって発光する蛍光の強度を検出することにより、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別して検体中のラクトバチルス属細菌を網羅的に定量する。 Based on the analysis result of the base sequence of the 16S rRNA, a probe comprising the oligonucleotide of (c) labeled with a fluorescent dye is hybridized to the DNA or rRNA of Lactobacillus bacteria in the sample, and (a) And a nucleic acid primer comprising the oligonucleotide (b) is used to amplify the DNA fragment of the genus Lactobacillus in the sample, and by detecting the intensity of fluorescence emitted by the amplification reaction, white staphylococci, yellow The bacterium Staphylococcus and Propionibacterium acnes are clearly distinguished from Lactobacillus bacteria, and Lactobacillus bacteria in the sample are comprehensively quantified.
さらに、後述の実施例でも示すように、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を解析した結果、ほぼ全てのラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列中に、前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドの塩基配列と同じ配列が、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域と前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域との間に存在することが明らかとなった。したがって、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブに代えて、前記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）からなるプローブを用いても、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスと、ラクトバチルス属細菌とを明確に区別して検体中のラクトバチルス属細菌とを網羅的に定量することができることを見い出した。 Furthermore, as shown also in the below-mentioned Example, as a result of analyzing the base sequence of 16S rRNA of Lactobacillus genus bacteria, in the base sequence of 16S rRNA of almost all Lactobacillus bacteria, the above (c) to (f) It is clear that the same sequence as the nucleotide sequence of any of the oligonucleotides exists between the region where the oligonucleotide (a) can hybridize and the region (b) where the oligonucleotide can hybridize It became. Therefore, in place of the probe made of the oligonucleotide (c), the probe made of the above (d), (e) or (f) may be used, but S. aureus, S. aureus and Propionibacterium acnes It was found that Lactobacillus bacteria in a specimen can be comprehensively quantified by clearly distinguishing from Lactobacillus bacteria.
本発明に用いる前記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個）の塩基の欠失、置換、挿入又は付加されており、かつラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド又はハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法（Science，227，1435，1985）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を２として解析を行うことにより算出することができる。
The oligonucleotides (a) to (f) used in the present invention are preferably oligonucleotides represented by the base sequences set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, respectively. Further, the oligonucleotide used in the present invention may be an oligonucleotide represented by a base sequence having 70% or more homology to the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1-6. Is more preferably 80% or more, the homology is more preferably 90% or more, and the homology is particularly preferably 95% or more. In addition, the oligonucleotide used in the present invention has one or several oligonucleotides (preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3) in the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6. , More preferably 1 to 2, particularly preferably 1), which is deleted, substituted, inserted or added, and can be used for amplification of a partial base sequence of 16S rDNA of Lactobacillus bacteria It may be a nucleotide or a hybridizable oligonucleotide. Further, an appropriate base sequence may be added to the oligonucleotides (a) to (f).
The base sequence homology is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985) or the like. Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development), the parameter Unit size to compare (ktup) is set to 2 and the calculation is performed. Can do.
前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。 The binding mode of the oligonucleotide may be not only a phosphodiester bond existing in a natural nucleic acid but also a phosphoramidate bond, a phosphorothioate bond, or the like.
前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製したり、試薬メーカーから購入することができる。また、ラクトバチルス属細菌の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。 The oligonucleotide can be prepared by a normal synthesis method such as chemical synthesis using an automatic DNA synthesizer or can be purchased from a reagent manufacturer. It is also possible to excise directly from a gene of Lactobacillus bacteria using a restriction enzyme or the like, or after cloning and isolating and purifying the gene and then excising using a restriction enzyme or the like. It is preferable to prepare by chemical synthesis because it is easy to operate and can obtain a certain quality of oligonucleotide in a large amount and at low cost. Moreover, what was refine | purified using the adsorption column, the high performance liquid chromatography, and the electrophoresis method after synthesis | combination can also be used. In addition, an oligonucleotide having a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted, inserted or added can be synthesized using a conventional method.
前記プローブの標識に用いる蛍光色素は、オリゴヌクレオチドを標識して、核酸の測定及び検出に通常用いられるものを使用できる。具体的には、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類（例えば、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）やテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）又はこれらの誘導体）、Ａｌｅｘａ類、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン（rhodamine）又はその誘導体（例えば、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミンＢ、ローダミン６ＧＰ、ローダミン３ＧＯ、５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等）、テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ ｒｅｄ）、ボデピー（ＢＯＤＩＰＹ）類（商標名；モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社製、米国）、ＲＯＸ、ＪＯＥ、ＢＨＱ類が挙げられる。このうち、フルオレセイン又はその誘導体類が好ましく、ＦＡＭがより好ましい。 As the fluorescent dye used for labeling the probe, those usually used for the measurement and detection of nucleic acids by labeling oligonucleotides can be used. Specifically, fluorescein or a derivative thereof (for example, carboxyfluorescein (FAM), tetrachlorofluorescein (TET), hexachlorofluorescein (HEX) or a derivative thereof), Alexa, Cy3, Cy5, rhodamine (rhodamine) ) Or derivatives thereof (eg, rhodamine 6G (R6G), rhodamine B, rhodamine 6GP, rhodamine 3GO, 5-carboxyrhodamine 6G (CR6G), tetramethylrhodamine (TAMRA), etc.), Texas Red (TEXAS red), Bodepy (BODIPY) ) (Trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), ROX, JOE, and BHQ. Among these, fluorescein or its derivatives are preferable, and FAM is more preferable.
オリゴヌクレオチドを蛍光色素で標識するには、通常の標識法のうちの所望のものを利用することができる（例えば、Nature Biotechnology、第14巻、第303〜308頁、1996年；Applied and Environmental Microbiology、第63巻、第1143〜1147頁、1997年；Nucleic acids Research、第24巻、第4532〜4535頁、1996年参照）。
例えば、5’末端に蛍光色素を結合させる場合は、先ず常法に従って5’末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、−(ＣＨ2)n−ＳＨ基を導入する。この場合、ｎは３〜８の整数、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、オリゴヌクレオチドの3’末端に蛍光色素を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの3’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、−(ＣＨ2)n−ＮＨ2基を導入する。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペーサーとして、例えば−(ＣＨ2)n−ＳＨ基を導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７の整数である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光体基又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、核酸プローブの鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（例えば、Analytical Biochemistry、第225巻、第32−38頁（1998年参照））。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
To label the oligonucleotide with a fluorescent dye, any of the usual labeling methods can be utilized (eg, Nature Biotechnology, Vol. 14, pp. 303-308, 1996; Applied and Environmental Microbiology 63, pp. 1143-1147, 1997; Nucleic acids Research, Vol. 24, pp. 4532-4535, 1996).
For example, when a fluorescent dye is bound to the 5 ′ end, first, for example, a — (CH 2 ) n —SH group is introduced as a spacer into the phosphate group at the 5 ′ end according to a conventional method. In this case, n is an integer of 3 to 8, preferably 6. A labeled oligonucleotide can be synthesized by binding a fluorescent dye having SH group reactivity or a derivative thereof to this spacer. In addition, a fluorescent dye can be bound to the 3 ′ end of the oligonucleotide. In this case, for example, a — (CH 2 ) n —NH 2 group is introduced as a spacer into the OH group at the 3′-position C of ribose or deoxyribose. Further, a phosphate group is introduced, and, for example, a — (CH 2 ) n —SH group is introduced as a spacer into the OH group of the phosphate group. In these cases, n is an integer of 3-8, preferably 4-7. A labeled oligonucleotide can be synthesized by binding a phosphor group reactive to an amino group and an SH group or a derivative thereof to the spacer. It is also possible to introduce a fluorescent dye molecule into the strand of the nucleic acid probe (for example, Analytical Biochemistry, Vol. 225, pages 32-38 (see 1998)). The oligonucleotide labeled with the fluorescent dye synthesized as described above can be purified by chromatography such as reverse phase to obtain a nucleic acid probe used in the present invention.
本発明に用いるプローブは、発光が抑制された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドであり、ラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片の標的配列にハイブリダイズし、該配列の増幅反応により該蛍光色素が発光し、増幅反応中に蛍光が減衰しないものが好ましい。 The probe used in the present invention is an oligonucleotide labeled with a fluorescent dye whose emission is suppressed, hybridizes to a target sequence of a DNA fragment of Lactobacillus bacteria, and the fluorescent dye emits light by an amplification reaction of the sequence. Those that do not attenuate fluorescence during the amplification reaction are preferred.
標的核酸にハイブリダイズしたときに蛍光の発光を抑制するには通常の方法を採用することができる。例えば、２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブを用いる方法、蛍光標識されたプローブの末端においてグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の塩基対形成時に蛍光発光が抑制される蛍光物質を用いる方法、などを採用することができる。
２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブを用いる場合、前記消光剤としては、その吸収スペクトルと前記蛍光色素の蛍光スペクトルとがオーバーラップするものが好ましく、具体的には、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ類（商標名、Biosearch Technologies社製）、ＱＸＬ５２０等のＱＸＬ類（商標名；ＡｎａＳｐｅｃ社）、Iowa black FQ（商品名）、Iowa black RQ（商品名）、ＢＯＤＩＰＹＦＬ及びＱＳＹ７ｄｙｅが挙げられ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡが好ましく、ＴＡＭＲＡがより好ましい。
蛍光標識されたプローブの末端においてグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の塩基対形成時に蛍光発光が抑制される蛍光色素を用いる場合、前記蛍光色素の具体例としては、フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、ボデピー類、ローダミン又はその誘導体（例えば、ＣＲ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ）などが挙げられる。
In order to suppress fluorescence emission when hybridized with the target nucleic acid, a usual method can be employed. For example, a method using a probe in which one of two ends is labeled with a fluorescent dye and the other is modified with a quencher, and fluorescence is emitted when base pairs of guanine (G) and cytosine (C) are formed at the end of the fluorescently labeled probe. It is possible to employ a method using a fluorescent substance in which the suppression is suppressed.
When using a probe in which one of the two ends is labeled with a fluorescent dye and the other is modified with a quencher, the quencher preferably has an overlapping absorption spectrum and the fluorescence spectrum of the fluorescent dye. Specifically, DNP, TAMRA, DABCYL, BHQs (trade names, manufactured by Biosearch Technologies), QXLs such as QXL520 (trade names; AnaSpec), Iowa black FQ (trade names), Iowa black RQ (trade names) , BODIPYFL and QSY7dye, DNP and TAMRA are preferable, and TAMRA is more preferable.
When a fluorescent dye whose fluorescence emission is suppressed at the time of base pairing of guanine (G) and cytosine (C) at the end of the fluorescently labeled probe is used, specific examples of the fluorescent dye include fluorescein or a derivative thereof (for example, , FITC), bodepies, rhodamine or derivatives thereof (for example, CR6G, TAMRA).
本発明に用いるプローブは、２つの末端の一方が蛍光色素で標識され他方が消光剤で修飾されたプローブが好ましく、5’末端側が蛍光色素で標識され、3’末端側が消光剤で修飾されており、ラクトバチルス属細菌のＤＮＡにアニーリニングしている間は前記蛍光色素の発光が前記消光剤により抑制され、ＤＮＡポリメラーゼにより前記プローブが分解されると発光の抑制が解除され前記蛍光色素が発光するプローブがより好ましい。 The probe used in the present invention is preferably a probe in which one of two ends is labeled with a fluorescent dye and the other is modified with a quencher, the 5 ′ end is labeled with a fluorescent dye, and the 3 ′ end is modified with a quencher. During the annealing to the DNA of Lactobacillus bacteria, the emission of the fluorescent dye is suppressed by the quencher, and when the probe is decomposed by DNA polymerase, the suppression of the emission is released and the fluorescent dye emits light. More preferred is a probe.
本発明において、前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる１種又は２種以上のプローブを用いることができる。
本発明において、前記プローブをラクトバチルス属細菌のＤＮＡ又はｒＲＮＡにハイブリダイズさせる条件としては特に制限はない。
In the present invention, one type or two or more types of probes comprising the oligonucleotides of any of the above (c) to (f) can be used.
In the present invention, the conditions for hybridizing the probe to DNA or rRNA of Lactobacillus bacteria are not particularly limited.
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス属細菌のＤＮＡ断片の増幅を行う。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-based Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが迅速性及び簡便性の観点から好ましい。 In the present invention, a DNA fragment of Lactobacillus bacteria in a sample is amplified using a nucleic acid primer comprising the oligonucleotides (a) and (b). The method for amplifying a DNA fragment is not particularly limited. The polymerase chain reaction (PCR) method, LCR (Ligase Chain Reaction) method, SDA (Strand Displacement Amplification) method, NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification) method, RCA (Rolling) Conventional methods such as -circle amplification) and LAMP (Loop mediated isothermal amplification) can be used. In the present invention, it is preferable to use the PCR method from the viewpoint of rapidity and simplicity.
ＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９０〜９８℃で１秒間〜１５分間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応及びＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を５０〜７０℃で１０〜９０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約２０〜４０サイクル行う。
The conditions for the PCR reaction are not particularly limited as long as the target DNA fragment can be amplified to a detectable level.
As a preferable example of PCR reaction conditions, for example, a heat denaturation reaction in which a double-stranded DNA is made into a single strand is performed at 90 to 98 ° C. for 1 second to 15 minutes, and annealing is performed to hybridize the primer pair to the single-stranded DNA. A reaction and an elongation reaction for allowing DNA polymerase to act are performed at 50 to 70 ° C. for 10 to 90 seconds, and these are defined as one cycle for about 20 to 40 cycles.
ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては特に制限はなく、一般的に核酸増幅反応に使用できるものであればよい。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼの中には、エキソヌクレアーゼ活性を有するものがある。しかし、このようなＤＮＡポリメラーゼを用いると、増幅反応中に標識プローブを分解し、分解された標識プローブが非特異的にＤＮＡにハイブリダイズする場合がある。したがって、本発明において、エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。
There is no restriction | limiting in particular as DNA polymerase used for PCR reaction, What is necessary is just what can generally be used for nucleic acid amplification reaction. For example, Taq DNA polymerase, KOD DNA polymerase and the like can be mentioned.
Some DNA polymerases have exonuclease activity. However, when such a DNA polymerase is used, the labeled probe may be degraded during the amplification reaction, and the degraded labeled probe may hybridize non-specifically to DNA. Therefore, in the present invention, it is preferable to use a DNA polymerase having no exonuclease activity, for example, KOD DNA polymerase.
本発明において、前記増幅反応の際又は前記増幅反応の後、増幅反応により、プローブがハイブリダイズする標的核酸から遊離した蛍光色素の蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定手段としては特に制限はなく、蛍光顕微鏡等通常の手段を採用することができる。
また、本発明において、前記増幅反応と蛍光強度の測定を同時（リアルタイム）に行う方法（例えば、リアルタイム検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法）により行ってもよい。
In the present invention, during or after the amplification reaction, the fluorescence intensity of the fluorescent dye released from the target nucleic acid to which the probe hybridizes is measured by the amplification reaction. There is no restriction | limiting in particular as a measurement means of fluorescence intensity, A normal means, such as a fluorescence microscope, is employable.
In the present invention, the amplification reaction and the fluorescence intensity may be measured simultaneously (in real time) by a method (for example, real time detection polymerase chain reaction (PCR) method).
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からＤＮＡを調製する方法としては、ラクトバチルス属細菌の定量を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
There is no restriction | limiting in particular as a test substance used in this invention, Food-drinks itself, the raw material of food-drinks, an isolated microbial cell, a cultured microbial cell, etc. can be used.
The method for preparing DNA from a sample is not particularly limited as long as DNA having a sufficient degree of purification and quantity for quantifying Lactobacillus bacteria can be obtained, and can be used in an unpurified state. It can also be used after pretreatment such as extraction, concentration and purification. For example, it can be purified by extraction with phenol and chloroform, or purified using a commercially available extraction kit to increase the purity of the nucleic acid. In addition, DNA obtained by reverse transcription of RNA in a subject can also be used.
本発明のラクトバチルス属細菌の定量キットは、前記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを含むものである。このキットは、ラクトバチルス属細菌の定量方法に用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プローブ及びプライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、細菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。 The Lactobacillus quantification kit of the present invention comprises at least the nucleic acid primer comprising the oligonucleotide (a) and the oligonucleotide (b), and any one of the oligonucleotides (c) to (f). One type of probe is included. This kit can be used in a method for quantifying Lactobacillus bacteria. In addition to the nucleic acid probe and primer, the kit of the present invention includes a label detection substance, a buffer solution, a nucleic acid synthesizing enzyme (DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, etc.), an enzyme substrate (dNTP, rNTP, etc.) depending on the purpose. And the like, which contain substances usually used for detecting bacteria.
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on an Example, this invention is not limited to this.
試験例１
インターネット上でRibosomal Database Project II（RDPII）（http://rdp.cme.msu.edu/）に公開されている解析ソフト（Probe mach）を用いて、同データベースに登録されているラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び／又は配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれているかの確認を行った。なお、解析方法は解析ソフトの操作方法に従った。その結果を表２〜４に示す。表２〜４において、ラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に配列番号１〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれている場合は「○」、含まれていない場合「−」と記載した。
さらに、同データベースに登録されているブドウ球菌科細菌、ブドウ球菌属細菌、乳酸桿菌科細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス科細菌、ロイコノストック科細菌、連鎖球菌科細菌及びプロピオニバクテリア科細菌の数、並びに、配列番号１〜６のいずれかに記載の各塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に含まれている細菌の数を確認した。その結果を表５〜６に示す。
Test example 1
Lactobacillus genus bacteria registered in the database using the analysis software (Probe mach) published on Ribosomal Database Project II (RDPII) (http://rdp.cme.msu.edu/) on the Internet A region capable of hybridizing with the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 and 2 and the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can hybridize to the base sequence of 16S rRNA An oligonucleotide represented by the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 3 to 6 is downstream of the region and / or upstream of a region where the oligonucleotide represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 can hybridize. It was confirmed whether a hybridizable region was included. The analysis method followed the operation method of the analysis software. The results are shown in Tables 2-4. In Tables 2 to 4, when the 16S rRNA base sequence of Lactobacillus bacteria contains a region capable of hybridizing with the oligonucleotide represented by the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, “O”, and “-” when not included.
In addition, staphylococcal bacteria, Staphylococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Lactobacillus bacteria, Enterococcus bacteria, Leuconostocaceae bacteria, Streptococcus bacteria and Propionibacterium bacteria registered in the database The number of bacteria in which the region capable of hybridizing with the oligonucleotide represented by each base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 is contained in the base sequence of 16S rRNA was confirmed. The results are shown in Tables 5-6.
表２〜５に示したように、ほぼ全てのラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれることが明らかとなった。
これに対して、表５及び６に示したように、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、の両者とも１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に含むラクトバチルス属細菌以外の細菌類は存在しない。
このように、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に、配列番号１及び２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域、並びに配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の下流及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域の上流に配列番号３〜６のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域が含まれるのは、ラクトバチルス属細菌に限られることが判明した。
As shown in Tables 2 to 5, the region that can be hybridized with the oligonucleotides represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 to the nucleotide sequences of almost all Lactobacillus bacteria 16S rRNA, and the sequence SEQ ID NOs: 3 to 6 downstream of the region capable of hybridizing with the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of No. 1 and upstream of the region capable of hybridizing with the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. It became clear that the region | region which can hybridize with the oligonucleotide represented by the base sequence in one of these is contained.
On the other hand, as shown in Tables 5 and 6, the region represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2 can be hybridized and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1. Represented by the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 6 downstream of the region capable of hybridizing with the oligonucleotide and upstream of the region capable of hybridizing with the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2. There are no bacteria other than the Lactobacillus genus bacteria that both contain in the nucleotide sequence of the 16S rRNA, both of the regions to which the oligonucleotides can hybridize.
Thus, the region where the oligonucleotides represented by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 can hybridize to the base sequence of 16S rRNA, and the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 The oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 6 downstream of the hybridizable region and the upstream of the region capable of hybridizing with the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 It has been found that the region that can hybridize is limited to Lactobacillus bacteria.
実施例
（１）プライマーの設計
配列番号１の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Lac1 primer）及び配列番号２の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Lac2 primer）を設計し、つくばオリゴ（株）に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入した。
また、配列番号３の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプローブ（Lac3 probe）（5’末端を蛍光色素ＦＡＭで修飾し、3’末端を消光剤ＴＡＭＲＡで修飾したTaqMan PCR用プローブ）を、つくばオリゴ（株）に合成依頼し入手した。
Example (1) Primer design A primer composed of the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (Lac1 primer) and a primer composed of the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (Lac2 primer) were designed. The synthesis was commissioned to Tsukuba Oligo Co., Ltd. (demineralized product, 0.02 μmol scale) and purchased.
In addition, a probe (Lac3 probe) consisting of an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (TaqMan PCR probe in which the 5 ′ end is modified with a fluorescent dye FAM and the 3 ′ end is modified with a quencher TAMRA) Obtained synthesis request from Tsukuba Oligo Co., Ltd.
（２）検体の調製
本発明の有効性の評価に用いる微生物としては、白色ブドウ球菌JCM2414T株、黄色ブドウ球菌JCM2413株、プロピオニバクテリウム・アクネスJCM6425株、ラクトバチルス・アシドフィルスJCM1021株、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティスJCM1107株を用いた。
白色ブドウ球菌JCM2414T株、黄色ブドウ球菌JCM2413株及びプロピオニバクテリウム・アクネスJCM6425株は、SCDLP寒天培地（日本製薬社製）にて３７℃で１日培養した。ラクトバチルス・アシドフィルスJCM1021株及びラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティスJCM1107株は、MRS寒天培地（和光純薬社製）にて３７℃で２日間培養した。
(2) Preparation of specimen As microorganisms used for evaluating the effectiveness of the present invention, white staphylococcus JCM2414T strain, Staphylococcus aureus JCM2413 strain, Propionibacterium acnes JCM6425 strain, Lactobacillus acidophilus JCM1021 strain, Lactobacillus Delbrecki subsp. Lactis JCM1107 strain was used.
S. aureus JCM2414T strain, S. aureus JCM2413 strain and Propionibacterium acnes JCM6425 strain were cultured on SCDLP agar medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical) at 37 ° C. for 1 day. The Lactobacillus acidophilus JCM1021 strain and the Lactobacillus delbrecchi subsp. Lactis JCM1107 strain were cultured at 37 ° C. for 2 days on an MRS agar medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、PBS溶液１ｍＬに懸濁後、14000rpmにて3分間遠心分離を行い、さらに上清を除去して、菌体を回収した。
回収した菌体に、下記表７に示す組成のDNA Isilation buffer２００μＬ、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール水溶液（25:24:1[vol/vol/vol]、Invitrogen社）２００μＬ及び高圧滅菌したガラスビース（粒径約０．１ｍｍ、アズワン社）３００ｍｇを添加し、ボルテックスにて５分間攪拌した。14000rpm、２０℃で１０分間遠心分離を行い、水相１５０μＬを回収した。この水相に共沈剤（エタ沈メイト、和光純薬工業社）１μＬ及び３Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（pH5.2）１５μＬを添加した。さらに、１００％エタノールを３７５μＬ（回収量の２．５倍量）加え、14000rpm、４℃で１０分間、遠心分離してＤＮＡペレットとし、上清を除去した。沈殿に７０％エタノール２００μＬを添加し、14000rpm、４℃で１０分間遠心分離して沈殿の洗浄を行った。上清を除去して回収したＤＮＡペレットを滅菌水５０μＬに再溶解し、回収したＤＮＡを精製した。
なお、前記DNA Isilation bufferは、１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液２ｍＬ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１ｍＬ、１Ｍ ＮａＣｌ溶液１ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）溶液１ｍＬ及び滅菌水４ｍＬを混合し、フィルター滅菌して調製した。
(3) Preparation of genomic DNA Each bacterial cell was collected from an agar medium using a platinum loop, suspended in 1 mL of PBS solution, centrifuged at 14000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. Was recovered.
To the collected cells, 200 μL of DNA Isilation buffer having the composition shown in Table 7 below, 200 μL of phenol / chloroform / isoamyl alcohol aqueous solution (25: 24: 1 [vol / vol / vol], Invitrogen) and high-pressure sterilized glass beads (grains) 300 mg) was added and stirred for 5 minutes by vortexing. Centrifugation was performed at 14000 rpm and 20 ° C. for 10 minutes, and 150 μL of the aqueous phase was recovered. To this aqueous phase, 1 μL of a coprecipitation agent (Eta Precipitate Mate, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 15 μL of 3M sodium acetate buffer (pH 5.2) were added. Further, 375 μL of 100% ethanol (2.5 times the amount recovered) was added, and centrifuged at 14000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes to form a DNA pellet, and the supernatant was removed. To the precipitate, 200 μL of 70% ethanol was added, and the precipitate was washed by centrifugation at 14000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes. The DNA pellet recovered by removing the supernatant was redissolved in 50 μL of sterile water, and the recovered DNA was purified.
The DNA Isilation buffer was mixed with 2 mL of 10% Triton-X solution, 1 mL of 10 mM EDTA solution, 1 mL of 1M NaCl solution, 1 mL of 10% SDS solution, 1 mL of 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) solution and 4 mL of sterilized water. Prepared by filter sterilization.
（４）ラクトバチルス属細菌の定量
前記（３）で調製したゲノムＤＮＡ溶液をＤＮＡテンプレートとし、下記組成のＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液
ゲノムＤＮＡ溶液 ５μＬ
TaqMan Universal PCR Master Mix
（DNAポリメラーゼ試薬、商品名、アプライドバイオシステムズ社） １５μＬ
Lac1 primer（配列番号１） ２５０ｎＭ
Lac2 primer（配列番号２） ２５０ｎＭ
Lac3 probe（配列番号３) １００ｎＭ
滅菌水 バランス
全量 ３０μＬ
(4) Quantification of Lactobacillus bacteria Using the genomic DNA solution prepared in (3) as a DNA template, a PCR reaction solution having the following composition was prepared.
PCR reaction solution Genomic DNA solution 5μL
TaqMan Universal PCR Master Mix
(DNA polymerase reagent, trade name, Applied Biosystems) 15 μL
Lac1 primer (SEQ ID NO: 1) 250 nM
Lac2 primer (SEQ ID NO: 2) 250 nM
Lac3 probe (SEQ ID NO: 3) 100 nM
Sterilized water balance
Total volume 30μL
前記ＰＣＲ反応液について、下記PCR条件で、リアルタイム検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりＰＣＲ反応を行い、下記蛍光検出装置及び制御ソフトウェアを用いてＤＮＡ量の定量を行っった。
＜PCR条件＞
1.変性温度：95℃、10分
2.変性温度：95℃、15秒
3.アニール及び伸長反応温度：60℃、60秒
（上記2〜3の反応を最大40サイクル繰り返した。）
＜蛍光検出装置＞
7500 Real Time PCR System（商品名、アプライドバイオシステムズ社）
＜制御ソフトウェア＞
7500 System SDS Software（商品名、アプライドバイオシステムズ社）
定量結果を図６に示す。
About the said PCR reaction liquid, PCR reaction was performed by the real-time detection polymerase chain reaction (PCR) method on the following PCR conditions, and the amount of DNA was quantified using the following fluorescence detection apparatus and control software.
<PCR conditions>
1. Denaturation temperature: 95 ° C, 10 minutes
2. Denaturation temperature: 95 ° C, 15 seconds
3. Annealing and elongation reaction temperature: 60 ° C., 60 seconds (The above 2-3 reactions were repeated up to 40 cycles.)
<Fluorescence detection device>
7500 Real Time PCR System (trade name, Applied Biosystems)
<Control software>
7500 System SDS Software (trade name, Applied Biosystems)
The quantitative results are shown in FIG.
図６の結果からも明らかなように、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマー、並びに前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかのオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種のプローブを組み合わせて用いることにより、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡ断片を増幅させることなくラクトバチルス属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ断片のみが増幅され、ＤＮＡ断片の増幅に伴って傾向強度も増大し、正確な乳酸菌の定量が可能となることが確認された。 As is clear from the results of FIG. 6, the nucleic acid primer comprising the oligonucleotides (a) and (b) and at least one probe comprising any one of the oligonucleotides (c) to (f) When used in combination, only the 16S rDNA fragment of Lactobacillus bacteria is amplified without amplifying the 16S rRNA fragment of S. aureus, Staphylococcus aureus and Propionibacterium acnes, and tends to increase with the amplification of the DNA fragment. It was confirmed that the strength increased and accurate quantification of lactic acid bacteria became possible.
比較例
DNAポリメラーゼ試薬としてTaqMan Universal PCR Master Mixに代えてPower SYBR Green Master Mix（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、Lac3 probeをＰＣＲ反応液には添加しなかったこと以外は同様にして、実施例と同様の試験操作を行った。その結果を図７に示す。
Comparative example
In the same manner as in Example 1 except that Power SYBR Green Master Mix (trade name, Applied Biosystems) was used instead of TaqMan Universal PCR Master Mix as a DNA polymerase reagent, and Lac3 probe was not added to the PCR reaction solution. The same test operation was performed. The result is shown in FIG.
図７の結果からも明らかなように、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーのみを用いてＤＮＡ断片の増幅を行った場合、ラクトバチルス属細菌だけではなく、白色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌及びプロピオニバクテリウム・アクネスの１６Ｓ ｒＲＮＡも増幅されてしまう。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いた従来のラクトバチルス属細菌の検出方法では、ラクトバチルス属細菌を特異的に検出することはできず、ラクトバチルス属細菌の定量を正確に行うこともできない。 As is apparent from the results of FIG. 7, when DNA fragments were amplified using only the nucleic acid primers comprising the oligonucleotides (a) and (b), not only Lactobacillus bacteria, but also white staphylococci S. aureus and Propionibacterium acnes 16S rRNA are also amplified. Therefore, in the conventional method for detecting Lactobacillus bacteria using the nucleic acid primer comprising the oligonucleotides (a) and (b), Lactobacillus bacteria cannot be specifically detected, and Lactobacillus bacteria Cannot be accurately determined.
Claims (6)
下記（ａ）のオリゴヌクレオチド及び下記（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなる核酸プライマーを用いて、検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌のＤＮＡ断片を増幅する工程、
前記増幅反応により得られた蛍光強度を測定する工程、及び
測定した蛍光強度に基づいて検体中のラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌を定量する工程、
を含む、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の定量方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド A step of hybridizing at least one probe consisting of an oligonucleotide of any one of the following (c) to (f) labeled with a fluorescent dye to DNA or rRNA of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus ,
A step of amplifying a DNA fragment of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus in a specimen, using a nucleic acid primer comprising the oligonucleotide of the following (a) and the oligonucleotide of the following (b):
A step of measuring the fluorescence intensity obtained by the amplification reaction, and a step of quantifying Lactobacillus genus bacteria in the specimen based on the measured fluorescence intensity;
A method for quantifying a bacterium belonging to the genus Lactobacillus , comprising:
(A) Oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and Lactobacillus ( Lactobacillus ) An oligonucleotide that can be used to amplify a partial base sequence of 16S rDNA of the genus bacteria (b) One or several oligonucleotides represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 And (c) an oligonucleotide that can be used for amplification of a partial base sequence of 16S rDNA of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus (c) represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3. Or one or several bases deleted, substituted, or inserted in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Or added to and and Lactobacillus (Lactobacillus) bacteria capable of hybridizing oligonucleotides to partial nucleotide sequence of 16S rDNA (d) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 4 Oligonucleotide (e) SEQ ID NO: 1 or several bases deleted, substituted, inserted or added in the described base sequence and capable of hybridizing to a partial base sequence of 16S rDNA of Lactobacillus bacteria 5. An oligonucleotide represented by the base sequence described in 5, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a bacterium belonging to the genus Lactobacillus Oligonucleotide hybridizable to a partial base sequence of 16S rDNA (F) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and Lactobacillus Oligonucleotides capable of hybridizing to a partial base sequence of 16S rDNA of ( Lactobacillus ) genus bacteria
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド Lactobacillus comprising a nucleic acid primer comprising the following oligonucleotide (a) and the following (b) oligonucleotide, and at least one probe comprising any of the following oligonucleotides (c) to (f): A quantification kit for bacteria.
(A) Oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and Lactobacillus ( Lactobacillus ) An oligonucleotide that can be used to amplify a partial base sequence of 16S rDNA of the genus bacteria (b) One or several oligonucleotides represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 And (c) an oligonucleotide that can be used for amplification of a partial base sequence of 16S rDNA of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus (c) represented by the base sequence of SEQ ID NO: 3. Or one or several bases deleted, substituted, or inserted in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Or added to and and Lactobacillus (Lactobacillus) bacteria capable of hybridizing oligonucleotides to partial nucleotide sequence of 16S rDNA (d) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 4 Oligonucleotide (e) SEQ ID NO: 1 or several bases deleted, substituted, inserted or added in the described base sequence and capable of hybridizing to a partial base sequence of 16S rDNA of Lactobacillus bacteria 5. An oligonucleotide represented by the base sequence described in 5, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a bacterium belonging to the genus Lactobacillus Oligonucleotide hybridizable to a partial base sequence of 16S rDNA (F) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and Lactobacillus Oligonucleotides capable of hybridizing to a partial base sequence of 16S rDNA of ( Lactobacillus ) genus bacteria
While the 5 ′ end of the probe is labeled with a fluorescent dye, the 3 ′ end of the probe is modified with a quencher, and while the probe is annealed to the DNA of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus, The quantification kit according to claim 5, wherein light emission of the dye is suppressed by the quencher, and when the probe is decomposed by DNA polymerase, the light emission suppression is canceled and the fluorescent dye emits light.
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