JP2004329161A - Primer set and detection of bacteria - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主に酸性食品の細菌汚染検査に用いられるＰＣＲプライマーセット及びそのプライマーセットを用いた細菌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は乳糖やブドウ糖を分解して乳酸をつくる細菌の総称であり、ヨーグルトや発酵乳等の食品の製造に活用されている。その乳酸菌の中で、自然界のあらゆるところに生息するグラム陽性通性嫌気性細菌の一部の細菌群は、加工食品等に汚染し、風味の劣化や食品収納密閉容器の膨化等を引き起こす原因菌として知られている（Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ３４：５４１−５４５（１９７１）， Ｄａｋｉｎ Ｊ． Ｃ． ａｎｄ Ｊ． Ｙ． Ｒａｄｗｅｌｌ； Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｃａｕｓｉｎｇ ｓｐｏｉｌａｇｅ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ．； Ｉｎｔ． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４：３５５−３６０（２００１）， Ｌｙｈｓ Ｕ．， Ｈ． Ｋｏｒｋｅａｌａ Ｈ．， Ｐ． Ｖａｎｄａｍｍｅ， ａｎｄ Ｊ． Ｂｊｏｒｋｒｏｔｈ； Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ： ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｐｏｉｌａｇｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｉｎ ｍａｒｉｎａｔｅｄ ｈｅｒｒｉｎｇ．）。
【０００３】
マヨネーズや食酢のような低ｐＨ食品では、含有される酢酸の静菌作用により、一般的な汚染菌の増殖による食品腐敗は制御されている。しかし、このような酢酸等による低ｐＨ環境下においても増殖可能で、食品の腐敗、汚染原因となる乳酸菌（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌）が存在する。低ｐＨ食品製造事業所等で危機管理の対象菌となっている代表的な酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌としては、具体的にはラクトバチルスフラクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルスブレビス（Ｌ． ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルスブチェネリ（Ｌ． ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルスプランタラム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスパラカゼイ（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）の５菌種が挙げられる（「食品の腐敗変敗防止対策ハンドブック」、株式会社サイエンスフォーラム発行）。これらの酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、いずれもラクトバチラレス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目； ラクトバチラセ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科に属する。
【０００４】
これら酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌群を迅速かつ精度よく検出することは、低ｐＨ食品の製品や製造工程における品質管理手法を開発する上で非常に重要である。
【０００５】
従来主に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＡ Ｂｒｏｔｈ［Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ． （ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）］寒天培地のようなラクトバチルス属細菌を選択的に培養できる培地を用いることにより低ｐＨ食品の乳酸菌汚染の有無が判定されている。しかし、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌はいずれも増殖速度が遅いため、この方法では、細菌が視覚的に確認可能なコロニーにまで増殖するのに通常３〜５日間の培養時間を要し、即ち汚染状況の把握に長時間を要するという問題がある。
【０００６】
そこで、迅速な細菌検出方法としてＰＣＲを行うことが考えられる。乳酸菌をＰＣＲ法で検出するためのプライマーとしては、特許文献１、２又は３に記載のプライマーが知られている。しかし、これらは特定の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡを認識できるプライマーであり、低ｐＨ食品の汚染菌として問題となる酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の有無を一度に検出できるものではない。
【０００７】
一方、広範囲な細菌を一度に検出できるプライマーとして非特許文献１又は２に記載されたプライマーが知られている。しかし、これらはいずれも細菌一般、グラム陽性菌又はグラム陰性菌のように極めて広範囲の細菌種を対象としているため、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌に汚染されているか否かの判断には用い難い。しかもこれらのプライマーは植物のクロロプラストのＤＮＡも認識するため、食品の検査には使用し難い（本明細書の表１参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平０７−２８９２９５号公報（段落００２９、００３１等）
【０００９】
【特許文献２】
特開平１１−１５１０９７号公報（段落００６０、配列１〜２１等）
【００１０】
【特許文献３】
特開２００３−２５５号公報（請求項１、請求項２、段落００５５等）
【００１１】
【非特許文献１】
Ｊ． Ｄｅｎｔ． Ｒｅｓ． ７８：８５０−８５６（１９９９）Ｒｕｐｆ， Ｓ．， Ｋ． Ｍｅｒｔｅ， ａｎｄ Ｋ． Ｅｓｃｈｒｉｃｈ；Ｑｕ ａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｏｒａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． （第８５１頁等）
【００１２】
【非特許文献２】
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７：４６４−４６６（１９９９），Ｋｌａｕｓｅｇｇｅｒ， Ａ．， Ｍ． Ｈｅｌｌ， Ａ． Ｂｅｒｇｅｒ， Ｋ． Ｚｉｎｏｂｅｒ， Ｓ． Ｂａｉｅｒ， Ｎ． Ｊｏｎｅｓ， Ｗ． Ｓｐｅｒｌ， ａｎｄ Ｂ． Ｋｏｆｌｅｒ； Ｇｒａｍ ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ６２ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ． （第４６４〜４６５頁等）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できるＰＣＲ用プライマーセット及び酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できる方法を提供することを主目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を確認し、また公共のＤＮＡデータベースに収録されているその他の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、細菌以外の原生生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、食品中に含まれる植物又は動物のミトコンドリアの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、植物のクロロプラストの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を確認し、さらにこれらの遺伝子のアラインメント解析を行うことにより、以下の知見を得た。
▲１▼ 酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、特徴的な塩基配列として、１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）分子中に配列番号３の塩基配列（５’−ＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３’）及び配列番号４の塩基配列（５’−ＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡ−３’）を有する。この配列は、酢酸耐性乳酸菌群及びこれに類縁のラクトバチルス属に属する一部細菌の１６ＳｒＲＮＡに特異的な塩基配列であり、ラクトバチルス属細菌以外の細菌、その他の原生生物、植物、動物等には実質的に存在しない。従って、配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡの２本鎖を認識して増幅できるＰＣＲプライマーセットを用いることにより、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を検出でき、さらにラクトバチルス属細菌中の酢酸耐性乳酸菌群の類縁細菌を特異的に検出できる。
▲２▼ 配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡを認識して増幅できるプライマーセットとしては、配列番号１の塩基配列（５’− ＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３’）からなるプライマーと他のプライマーとのセット、配列番号２の塩基配列（５’−ＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’）からなるプライマーと他のプライマーとのセット、好ましくは、配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーとのセットが挙げられる。
【００１５】
配列番号１の塩基配列からなるプライマーは、配列番号３に相補的な配列部分にハイブリダイズでき、配列番号２の塩基配列からなるプライマーは、配列番号４の配列部分にハイブリダイズできるものである。
【００１６】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のプライマーセット、プライマー及び細菌の検出方法を提供する。
【００１７】
項１． 所定条件のＰＣＲに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセット。
【００１８】
項２． 細菌のＤＮＡ分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを特異的に検出可能に増幅するプライマーセット。
【００１９】
項３． 所定条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、細菌のＤＮＡ分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含まないＤＮＡを検出可能に増幅しないプライマーセット。
【００２０】
項４． 以下の（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとからなるプライマーセット。
（１） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
（３） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００２１】
項５． 以下の（１）又は（２）のプライマー。
（１） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００２２】
項６． 以下の（３）又は（４）のプライマー。
【００２３】
（３） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００２４】
項７． （ｉ）被験食品に含まれるＤＮＡを抽出する工程と、（ｉｉ）このＤＮＡを鋳型として項１から４のいずれかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程と、
（ｉｉｉ） ＤＮＡ増幅の有無を検出する工程と
を含む細菌の検出方法。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ） プライマー・プライマーセット
本発明のプライマーセットは、所定条件のＰＣＲに供されることにより酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ）を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーセットである。
【００２６】
本発明において、「１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅する」とは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全配列又はその部分配列を、何らかの手段で検出可能な程度までＰＣＲにより増幅することを意味する。
【００２７】
本発明において、「酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌」とは、ラクトバチルスフラクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルスブレビス（Ｌ． ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルスブチェネリ（Ｌ． ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルスプランタラム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びラクトバチルスパラカゼイ（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）をいう。
【００２８】
本発明のプライマーセットは、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の他に、酢酸耐性乳酸菌群に類縁のラクトバチルス属細菌の全て又は一部を検出可能に増幅するものであってもよい。
【００２９】
「酢酸耐性乳酸菌群に類縁の細菌」とは、酢酸耐性乳酸菌群と同様にラクトバチルス属に属し、酢酸耐性乳酸菌群に分子系統樹上極めて近く、酢酸耐性乳酸菌群と同様に低ｐＨ下での増殖が可能で、場合によっては低ｐＨの食品において、酢酸耐性乳酸菌群と同様に食品の腐敗、汚染の原因となる可能性を有する菌である。
【００３０】
また、実質的にラクトバチルス属細菌以外の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないことには、ラクトバチルス属細菌以外の全ての生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しない場合だけでなく、例外的にラクトバチルス属細菌以外の数種の生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅する場合も含まれる。
【００３１】
前記の所定条件は通常ＰＣＲにおいて採用される条件であればよいが、例えば、変性を８５〜９９℃程度で３０秒間〜１５分間程度まで、アニーリングを５０〜６８℃程度で５秒間〜１分間程度行い、ＤＮＡ伸長を６８〜７５℃程度で１０秒間〜１分間程度行い、反応液中のＭｇイオン濃度を１〜４ｍＭ程度とする条件が挙げられる。
【００３２】
ラクトバチルス属細菌の中の酢酸耐性乳酸菌及びその類縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子には、そのＤＮＡ分子中に配列番号３の塩基配列（５’−ＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３’）及び配列番号４の塩基配列（５’−ＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡ−３’）が特異的に含まれている。特に酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子には、そのＤＮＡ分子中に上記２配列が含まれている。従って、本発明のプライマーセットは、換言すれば、配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを特異的に検出可能に増幅するものといえる。
【００３３】
また上記２配列は、ラクトバチルス属細菌以外の生物種には、実質的に見出されない。従って、本発明のプライマーセットは、所定条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、１分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより、実質的に、１分子中に配列番号３の塩基配列及び配列番号４の塩基配列を含まないＤＮＡを検出可能に増幅しないプライマーセットと表現することもできる。
【００３４】
前述したように、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌は、主に低ｐＨ食品を汚染して風味の低下や食品の密閉包装容器の膨張等を引き起こす点で問題になっている危機管理の対象細菌群である。従って、これらの酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を一度に必ず検出でき、しかも、ラクトバチルス属細菌以外の細菌、細菌以外の原生生物、食品に含まれる植物及び動物の各１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を実質的に検出しない本発明のプライマーセットは、上記の危機管理対象菌群を精度よく検出できる、優れたプライマーセットである。
プライマーセットの具体例
本発明におけるプライマーの塩基配列には、その塩基配列及びその塩基配列において１〜３個程度の塩基が欠失、挿入又は置換された塩基配列が含まれる。
【００３５】
本発明のプライマーとしては、代表的には、以下の（１）若しくは（２）のプライマー、又は、（３）若しくは（４）のプライマーが挙げられる。（１）及び（２）のプライマーは、前述した配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列を認識できるプライマーであり、（３）及び（４）のプライマーは、前述した配列番号４の塩基配列を認識できるプライマーである。
（１） 配列番号１（５’− ＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣ−３’）における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００３６】
（２）のプライマーは、前記列記したいずれかの塩基配列の５’末端側に任意の塩基配列を有し、全体として最大３０塩基までの長さのＤＮＡからなるものである。（２）のプライマーにおいて、５’末端側に付加されて存在することがある前記任意の塩基配列は、１〜６個程度の塩基からなることが好ましい。この任意の塩基配列は付加されていないのが最も好ましい。
【００３７】
（１）又は（２）のプライマーの中では、塩基番号３〜１９の塩基配列からなるプライマー、塩基番号２〜１９の塩基配列からなるプライマー、若しくは、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー、又は、これらの塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマーが好ましく、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマーがより好ましい。
（３） 配列番号２（５’−ＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’）における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
【００３８】
（４）のプライマーは、前記列記したいずれかの塩基配列の５’末端側に任意の塩基配列を有し、全体として最大３０塩基までの長さのＤＮＡからなるものである。（４）のプライマーにおいて、５’末端側に付加されて存在することがある前記任意の塩基配列は、１〜６個程度が好ましい。この任意の塩基配列は付加されていないのが最も好ましい。
【００３９】
（３）又は（４）のプライマーの中では、塩基番号３〜１８の塩基配列からなるプライマー、塩基番号２〜１８の塩基配列からなるプライマー、若しくは、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー、又は、これらの塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマーが好ましく、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマーがより好ましい。
【００４０】
本発明のプライマーセットとしては、代表的には（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとの組み合わせが挙げられる。
【００４１】
（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとの組み合わせは、特に限定されずどのような組み合わせであってもよいが、配列番号１の塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマーとの組み合わせが最も好ましい。
製造方法
本発明のプライマーセットの各プライマーは、その塩基配列に基づき常法に従って合成することができる。また、プライマー合成メーカー（例えばサワディーテクノロジー社）から購入することもできる。
（ＩＩ） 細菌の検出方法
基本的構成
本発明の細菌の検出方法は、（ｉ）被験食品に含まれるＤＮＡを抽出する工程と、（ｉｉ）このＤＮＡを鋳型として上記説明した本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程と、（ｉｉｉ） ＤＮＡ増幅の有無を検出する工程と
を含む方法である。
対象食品
本発明方法の対象となる被験食品は、酢酸耐性乳酸菌に汚染し得る食品である限り特に限定されない。被験食品には加工食品の他にその原材料も含まれる。特に、酢酸耐性乳酸菌の増殖が問題となる食品が対象として好適である。このような食品として、例えば、マヨネーズ、ケチャップ、ドレッシング、醤油、つゆ、ウスターソース、中濃ソース、みりん、ウインナーソーセージ、ロングライフ牛乳等及びこれらの原材料が挙げられる。
【００４２】
ＤＮＡ 抽出工程
本発明においては、食品から分離培養した細菌からＤＮＡを抽出してもよいが、食品から直接ＤＮＡを抽出することもできる。
【００４３】
被験食品からのＤＮＡの調製方法は公知の方法を採用すればよい。例えば、被験食品に市販の界面活性剤を加え、８０〜１００℃程度で１〜１５分間程度加熱した後、冷却し、次いで遠心分離して上清を採取することによりＤＮＡを含有する試料を調製することができる。被験食品から調製されたＤＮＡ含有試料には、食品に細菌が含まれている場合には細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が含まれており、その他各種ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質等が含まれる。従って、この試料を常法に従って精製してＤＮＡを含む画分を得てもよい。
【００４４】
死菌がＰＣＲの結果に影響を与えると考えられる場合や、得られる菌数が少なすぎるために十分量のＤＮＡを得ることができないが酢酸耐性乳酸菌の検出感度を高めたい場合には、例えば以下の方法でＤＮＡを抽出すればよい。先ず、ＭＲＡ培養液（日水製薬）のようなラクトバチルス属細菌の選択培地を塩酸等でｐＨ６．０程度に調整し、この選択培地で被験食品を２０〜３０℃程度で培養する。培養時間は、被験食品中に存在する細菌数によっても異なるが、通常１２〜３６時間程度とすればよい。培養液を５０〜３００×ｇ程度で遠心分離し、得られる上清をさらに、２０００〜１４０００×ｇ程度で遠心分離する。被験食品に細菌が含まれていれば、得られる沈殿には通常細菌が含まれる。この沈殿を１０％キレックス液［１０％（Ｗ／Ｖ）キレックス（バイオラッド社）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０］２００μＬ中に懸濁後、ヒートブロックを用いて１００℃前後で５分間程度加熱することにより溶解し、細菌溶解物を２０００〜１４０００×ｇ程度で遠心分離した上清を採取することによりＤＮＡ含有試料を調製することができる。
【００４５】
食品の種類によっても異なるが、食品１ｇ当たり１０〜２０ｃｆｕ程度の酢酸耐性乳酸菌が含まれていれば、被験食品を上記のようにして２４時間程度培養することにより、ＰＣＲにより酢酸耐性乳酸菌由来のＤＮＡを検出できる。
【００４６】
食品１ｇ当たりに含まれる酢酸耐性乳酸菌の数が１０ｃｆｕ未満の場合の検査等で、さらに、検出感度を高くしたい場合は、被験食品量を増やしたり、培養時間を延長させたりすればよい。
【００４７】
ＰＣＲ 工程
ＰＣＲを行うにあたっては、上記説明した本発明のプライマーセットを用いる。具体的には、（１）又は（２）のプライマーと（３）又は（４）のプライマーとのセット、特に、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのセットを用いることが好ましい。
【００４８】
ＰＣＲ条件は特に限定されず、ＰＣＲ装置毎に最適条件を定めればよいが、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置の場合、以下の条件が挙げられる。
反応液：例えば、ＰＣＲ反応用のキットであるＴａｋａｒａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）のようなリアルタイムＰＣＲ専用のＰＣＲ反応液を用いる。
ＰＣＲサイクル条件：
・２本鎖ＤＮＡの熱変性：９５℃で５秒間
・プライマーの一本鎖ＤＮＡへのアニーリング：６６℃で１０秒間
・ＤＮＡ伸長：７２℃で２０秒間
この反応を通常３０〜３５サイクル程度行うことにより、目的ＤＮＡを検出可能な程度に増幅することができる。
【００４９】
ＰＣＲ装置としては、ブロックタイプ、リアルタイムＰＣＲタイプ等の市販の装置を使用できる。迅速にＤＮＡを増幅するためにはキャピラリータイプのリアルタイムＰＣＲ装置を用いることが好ましい。
【００５０】
ＤＮＡ 増幅の確認工程
ＤＮＡ増幅の有無の確認は、通常、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーンＩなどで核酸染色することにより行える。また、リアルタイムＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的に短時間でＤＮＡ増幅の有無が確認される。例えば、ＰＣＲ反応液中にサイバーグリーンＩを添加した場合では、サイバーグリーンＩが二本鎖ＤＮＡに結合したときに発する蛍光値から増幅産物量をサイクル毎にモニター可能であり、さらに、ＰＣＲ後に融解曲線分析を行うことによりＰＣＲ増幅産物が目的の増幅産物であるかどうかを確認できる。判断が困難な場合は、増幅産物の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認すればよい。
【００５１】
ＰＣＲによりＰＣＲ産物が検出される場合は、酢酸耐性乳酸菌が被験食品に存在していたと判定できる。またＰＣＲ産物が検出されない場合は、酢酸耐性乳酸菌は被験食品に存在していなかったと判定できる。酢酸耐性乳酸菌が存在する場合は、アガロースゲル電気泳動により、２０３塩基対程度の大きさのバンドが検出される。
【００５２】
被験食品の酢酸耐性乳酸菌による汚染の有無をさらに精度よく判定する必要がある場合には、ＰＣＲ増幅断片が酢酸耐性乳酸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来するものであることを確認することがより好ましい。
【００５３】
確認方法としては、例えばＰＣＲ増幅断片を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片について制限断片長多型解析を行う方法が挙げられる。この際使用する制限酵素はＰＣＲ増幅断片を切断し制限断片長多型を示し得るものであれば特に限定されない。制限酵素は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できるが、２種以上を組み合わせて使用することが望ましい。制限断片長多型は、例えば、アガロース電気泳動やサザンブロット法により検出することができる。
【００５４】
また、ＰＣＲ増幅断片の塩基配列を常法により決定し、その塩基配列を公共のＤＮＡデータベースの塩基配列と比較することによっても、ＰＣＲ増幅断片が酢酸耐性乳酸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来するものであることを確認することができる。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び試験例を示して詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】
実施例１（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の標準菌株に対する検出感度の確認）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＪＣＭ １１３４Ｔ株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ株をそれぞれＭＲＳ液体培地（ｐＨ６．０）を用いて培養した。各菌株の培養液からＰＵＲＥＧＥＮＥ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｇｅｎｔｒａ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を用いて、ＤＮＡ溶液を調整した。各菌株のＤＮＡ量を測定し、各菌株のゲノムの分子量を３．０Ｍｂｐと概算してゲノムのコピー数を２コピー／μＬ程度、２０コピー／μＬ程度、２×１０２コピー／μＬ程度、２×１０３コピー／μＬ程度及び２×１０４コピー／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液をそれぞれ調整した。
【００５７】
一方、配列番号１及び配列番号２の各ＤＮＡプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。上記各被験ＤＮＡ溶液１μＬをＰＣＲ反応用のキットであるＴａｋａｒａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）の説明書に従って調整して総量２０μＬのＰＣＲ反応液を調整した。すなわち、２μＬの１０×Ｒ−ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）、０．１６μＬの２５０ｍＭ Ｍｇ２＋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒ−ＰＣＲ、０．４μＬのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各１０ｍＭ）、０．２μＬ のＴａＫａｒａ ＥＸ ＴａｑＴＭ Ｒ−ＰＣＲ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）、０．８μＬの０．１２５％ ＳＹＢＲＴＭ ＧｒｅｅｎＩ （Ｆｍｃ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＵＳＡ）、１．０μＬのＤＮＡプライマー液（配列番号１のＤＮＡプライマー及び配列番号２のＤＮＡプライマーを各々５μＭ含有）及び１６．４４μＬの蒸留水を含む１９μＬの調整液に、被験ＤＮＡ溶液１μＬを加えて２０μＬにしたＰＣＲ反応液を調整した。
【００５８】
ＰＣＲはロシュ・ダイアグノスティックス社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを用いて次のように行った。すなわち、初期変性を９５℃で１分間行った後、９５℃で５秒間、６６℃で１０秒間、及び７２℃で２０秒間、蛍光測定（ＰＣＲによる増幅産物の測定）を１サイクルとし、これを３５サイクル行い、続いて増幅産物の融解曲線分析のために、９７℃で０秒、６０℃で１０秒後、０．２℃／秒の速度で９７℃まで昇温させると同時に連続的に蛍光測定により各温度に対する増幅産物の二本鎖ＤＮＡ量を測定し、最後に４０℃まで降温させた。
【００５９】
ＰＣＲ終了後、融解曲線解析を同ＰＣＲ装置上のソフトウェアで行い、増幅産物のＴｍ値を求めることで特異的な増幅産物の有無を判定した。さらに、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ社）を用いて１．８％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認することにより、増幅産物の有無を確認した。
【００６０】
ＰＣＲ後の反応液を電気泳動した後のゲルを図１に示す。レーン１〜５はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ株を示し、図１のレーン６〜１０はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＪＣＭ １１３４Ｔを示す。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを、レーンＢはネガティブコントロールを示す。
【００６１】
図１の結果から、配列番号１のＤＮＡプライマーと配列番号２のＤＮＡプライマーとをセットで使用することにより、反応液中に２〜２０コピー程度のゲノムＤＮＡが存在すれば前記のＰＣＲ条件でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ株やＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＪＣＭ １１３４Ｔ株ＤＮＡを検出できることが確認された。
【００６２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＪＣＭ １０５９Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＪＣＭ １１１５Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ １１４９Ｔ株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＪＣＭ ８１３０Ｔ株について同様にしてゲノムＤＮＡコピー数を変化させてＰＣＲを行ったところ、いずれの菌種のＤＮＡにおいても、２〜２０コピー程度のゲノムＤＮＡが存在すれば、同様に検出できることが確認された。
【００６３】
実施例２（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌の標準菌株に対する反応性の確認）
実施例１と同様にしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＪＣＭ １１３４Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＪＣＭ １０５９Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＪＣＭ １１１５Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ １１４９Ｔ株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＪＣＭ ８１３０Ｔ株のＤＮＡ溶液を調整し、ゲノムのコピー数が２×１０４コピー／μＬ程度の被験ＤＮＡ溶液をそれぞれ調整した。
【００６４】
これらの各菌株のＤＮＡに対する配列番号１のＤＮＡプライマーと配列番号２のＤＮＡプライマーとのプライマーセットの反応性を調べるために、上記の各被験ＤＮＡ溶液１μＬに対する同ＤＮＡプライマーセットを用いたＰＣＲを実施例１と同様にして実施した。ＰＣＲ増幅産物の有無を、実施例１と同様にしてアガロースゲルによる電気泳動で確認した。
【００６５】
ＰＣＲ後の反応液を電気泳動した後のゲルを図２に示す。図２のレ−ン１〜６はそれぞれＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＪＣＭ １１３４Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ株、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＪＣＭ １０５９Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＪＣＭ １１１５Ｔ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ １１４９Ｔ株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＪＣＭ ８１３０Ｔ株を示す。図２から、配列番号１のＤＮＡプライマーと配列番号２のＤＮＡプライマーとをセットで使用することにより、上記乳酸菌（酢酸耐性乳酸菌とその類縁菌１種）６種を検出できることが確認された。
【００６６】
実施例３（酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌以外の細菌及びその他の生物由来ＤＮＡとの反応性の確認）
以下の表１に示す各細菌株及び各真菌株をそれぞれに適合する培地を用いて培養し、実施例１と同様にしてＤＮＡ溶液を調整した。各ＤＮＡ溶液のＤＮＡ量を測定し、各細菌株ＤＮＡは濃度５ｐｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整し、各真菌株ＤＮＡは濃度１ｎｇ／μＬにした被験ＤＮＡ溶液を調整した。また、市販の小麦粉、トウモロコシ、ジャガイモ、ナタネ、及びダイズからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてそれぞれの植物ＤＮＡを抽出した。各ＤＮＡ溶液のＤＮＡ量を測定し、小麦ＤＮＡは濃度８ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整し、トウモロコシ、ジャガイモ、ナタネ及びダイズのＤＮＡは濃度３ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液をそれぞれ調整した。また、ヒトＭＣＦ−７細胞（大日本製薬社）からＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてヒトＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ溶液のＤＮＡ量を測定し、濃度３ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整した。ウシ及びニワトリの精製ＤＮＡはＣｅＭｉｎｅｓ社から購入し、サケの精製ＤＮＡはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。各ＤＮＡ溶液のＤＮＡ量を測定し、ウシ及びニワトリＤＮＡは濃度３ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整し、サケＤＮＡは濃度１ｎｇ／μＬ程度にした被験ＤＮＡ溶液を調整した。
【００６７】
これらの各生物のＤＮＡに対する配列番号１のＤＮＡプライマーと配列番号２のＤＮＡプライマーとのプライマーセット（ＬＡ１−２０３）の反応性を調べるために、上記の各被験ＤＮＡ溶液１μＬに対する同ＤＮＡプライマーセットを用いたＰＣＲを実施例１と同様にして実施した。ＰＣＲ増幅産物の有無を、実施例１と同様にしてアガロースゲルによる電気泳動で確認した。
【００６８】
また、配列番号１及び２のプライマーセット（ＬＡ１−２０３）に代えて前述した非特許文献１に記載の細菌一般を検出できるプライマーセット（ｐｒｂａｃ）を用いて同様にしてＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲは次の反応条件に置換して実施した。すなわち、初期変性を９５℃で１分間行った後、９５℃で５秒間、５９℃で１０秒間、及び７２℃で２０秒間、蛍光測定（ＰＣＲによる増幅産物の測定）を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。
【００６９】
これらのＰＣＲの結果を次の表１及び表２に示す。表中＋は電気泳動によりバンドが検出されたことを示し、マイナスはバンドが検出されなかったことを示す。
【００７０】
【表１】
【表２】
表１及び表２に示す結果から、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのセットを用いたＰＣＲにより、酢酸耐性乳酸菌５種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＪＣＭ １０５９Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＪＣＭ １１１５Ｔ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ １１４９Ｔ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＪＣＭ ８１３０Ｔ株）及びその類縁のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する一部細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅できることが判明した。
【００７３】
これに対して、公知のプライマーセットであるｐｒｂａｃを用いた場合は、広く細菌が検出され、さらに植物から抽出されたＤＮＡが検出された。なお、塩基配列解析の結果、植物由来のＤＮＡからｐｒｂａｃによって増幅されたＰＣＲ増幅産物はクロロプラストの１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ断片であることが確認された。
【００７４】
図３は各種細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて作成された分子系統樹であり、配列番号１及び配列番号２の各ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲにおいて検出された各菌株を＋で示している。
【００７５】
図３から、配列番号１及び配列番号２のＤＮＡプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことで、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて作成された分子系統分類上においても一群の菌群に分類可能な主要５種の酢酸耐性乳酸菌群とこれに類縁の菌群とを特異的に検出できたことがわかる。
【００７６】
実施例４（食品中の酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の検出）
一般生菌に汚染されていないことを予め確認済みの市販のマヨネーズ及び食酢に、代表的な酢酸耐性乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ株を指標菌として、それぞれの食品１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度となるように添加したもの及び、無添加のものを調整した。それぞれ食品重量の９倍量のＭＲＳ液体培地（ｐＨ６．０）を加え、ストマッカーを用いて無菌的に攪拌混合した。
【００７７】
これらの食品希釈混合液１０ｍＬを１５ｍＬ容の培養管に移して密栓後、３０℃で２０時間〜２８時間、静置培養した。ＰＣＲで使用するＤＮＡ溶液の調整のために、０時間、２０時間、２４時間及び２８時間後の培養液を１．３ｍＬづつ採取した。
【００７８】
採取した培養液を１００×ｇで１分間遠心した後の上清をさらに１３，０００×ｇで５分間遠心して沈殿を得た。この沈殿を洗浄するために０．５ｍＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）に懸濁後、１３，０００×ｇで５分間遠心して沈殿を得た。この沈殿に１０％キレックス液［１０％（Ｗ／Ｖ）キレックス（バイオラッド社）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０］２００μＬを加えて沈殿を懸濁後、ヒートブロックを用いて９９℃で５分間加熱し、１３，０００×ｇで３分間遠心した上清を採取した。上清中にはＤＮＡが含まれており、ＰＣＲに使用するＤＮＡ溶液とした。
【００７９】
得られたＤＮＡ溶液１μＬを試料とし、実施例１に記載されたと同様の方法でＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認した。アガロースゲルによる電気泳動パターンを図４に示す。
【００８０】
図４の（Ａ）は市販マヨネーズの場合の電気泳動パターンであり、図４の（Ｂ）は市販食酢である場合の電気泳動パターンである。また、図（Ａ）、（Ｂ）ともに、レーン１、２、３及び４は、細菌を添加せずに食品の培養時間を０、２０、２４及び２８時間にしたサンプルである。またレーン５、６、７及び８は、食品に細菌を添加した後ＤＮＡを抽出する前の培養時間を０、２０、２４及び２８時間にしたサンプルである。
【００８１】
図４の（Ａ）に示すように、市販マヨネーズ１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ株の指標菌が存在する場合、ＤＮＡ抽出前の食品培養時間を２４時間以上にすれば、前記ＰＣＲによってその細菌ＤＮＡを検出できることがわかる。また、図４の（Ｂ）に示すように、市販食酢１ｇあたり１０〜２０ｃｆｕ程度のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＪＣＭ １１１７Ｔ株の指標菌が存在する場合、ＤＮＡ抽出前の食品培養時間を２４時間以上にすれば、前記ＰＣＲによってその細菌ＤＮＡを検出できることがわかる。
【００８２】
【発明の効果】
本発明により、酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できるＰＣＲ用のプライマー及び酢酸耐性乳酸菌群に属する細菌を迅速かつ精度よく検出できる方法が提供された。
【００８３】
さらにいえば、本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲを行うことにより、酢酸耐性乳酸菌を一括して検出できる。具体的には、酸性食品の腐敗において問題となるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉの食品等への混入の有無を従来の寒天培養法よりもより迅速に検査することができる。
【００８４】
従って、本発明のプライマーセットは、汚染頻度が比較的低い食品を対象にした細菌検査の一次スクリーニングに好適に使用できる。すなわち、本発明のプライマーセットを用いた一次スクリーニングにより細菌が検出された場合には、食品の製造工程や製品に対する適切な措置をより迅速に執ることが出来る。また、必要に応じて、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析の実施や二次スクリーニングとして特定乳酸菌に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、菌種を同定することもできる。
【００８５】
また、従来の細菌一般を広く検出できるプライマーを使用する場合は、目的細菌以外の混入生物のＤＮＡや食品由来のＤＮＡまで検出されるが、本発明のプライマーを用いることにより、酢酸耐性乳酸菌を検出できるとともに、ラクトバチルス属細菌以外の混入生物由来のＤＮＡや食品由来のＤＮＡを実質的に検出せず、即ち高精度の検出が行える。
【００８６】
特に、本発明のプライマーは食品である植物や動物のＤＮＡを検出しないため、食品から細菌を分離培養した上でそのＤＮＡを抽出する必要がなく、食品から直接ＤＮＡを抽出するだけで、又は食品をおよそ２４時間培養した培養液からＤＮＡを抽出するだけで、そのＤＮＡをＰＣＲに供することができる。それにより、検査時間を大幅に短縮することができる。
【００８７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】酢酸耐性乳酸菌の検出感度を示す図である。
【図２】配列番号１及び２のプライマーセットにより乳酸菌６種を検出できたことを示す図である。
【図３】細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子配列に基づいた分子系統樹及び、配列番号１及び２のプライマーセットにより検出可能な細菌群を示す図である。
【図４】被験食品の培養時間と酢酸耐性乳酸菌の検出の有無との関係を示す図である。（Ａ）は市販マヨネーズ、（Ｂ）は市販食酢の結果を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a PCR primer set mainly used for bacterial contamination inspection of acidic foods and a method for detecting bacteria using the primer set.
[0002]
[Prior art]
Lactic acid bacteria are a general term for bacteria that decompose lactose and glucose to produce lactic acid, and are used in the production of foods such as yogurt and fermented milk. Among the lactic acid bacteria, some of the gram-positive facultative anaerobic bacteria that live in all parts of nature contaminate processed foods and cause deterioration of flavor and swelling of closed food containers. (J. Appl. Bacteriol. 34: 541-545 (1971), Dakin J. C. and J. Y. Radwell; Lactobacilli caus- ing spoilage of foie res. : 355-360 (2001), Lyhs U., H. Korkeala H., P. Bandamme, and J. Bjorkroth; Lactobacillus alimentiarius: a specific spoilage organism in marginalized herring.).
[0003]
In low-pH foods such as mayonnaise and vinegar, food decay due to the growth of general contaminating bacteria is controlled by the bacteriostatic action of the acetic acid contained. However, there are lactic acid bacteria (bacteria belonging to the group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria) that can be proliferated even in a low pH environment due to such acetic acid and the like, and cause food spoilage and contamination. Examples of bacteria belonging to a representative group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria which are subject to crisis management at low-pH food manufacturing establishments and the like include Lactobacillus fructivorans and Lactobacillus brevis (L. lactis). brevis), Lactobacillus buchneri (L. buchneri), Lactobacillus plantarum (L. plantarum), and Lactobacillus paracasei (L. paracasei). , Science Forum Inc.). All of the bacteria belonging to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group belong to the order Lactobacillares; Lactobacillaceae.
[0004]
It is very important to rapidly and accurately detect these bacterial groups belonging to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group in developing low-pH food products and quality control techniques in the manufacturing process.
[0005]
Conventionally, Lactobacilli MRA Broth [Difco Laboratories Inc. (BD Difco)] The presence or absence of lactic acid bacteria contamination of low pH foods is determined by using a medium such as agar medium that can selectively culture Lactobacillus bacteria. However, since the growth rate of any of the bacteria belonging to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group is low, this method usually requires a culture time of 3 to 5 days for the bacteria to grow to a visually confirmable colony, There is a problem that it takes a long time to grasp the contamination status.
[0006]
Therefore, it is conceivable to perform PCR as a rapid bacterial detection method. As primers for detecting lactic acid bacteria by the PCR method, primers described in
[0007]
On the other hand, primers described in Non-Patent
[0008]
[Patent Document 1]
JP-A-07-289295 (paragraphs 0029, 0031, etc.)
[0009]
[Patent Document 2]
JP-A-11-151097 (paragraph 0060, sequences 1-21 etc.)
[0010]
[Patent Document 3]
JP-A-2003-255 (
[0011]
[Non-patent document 1]
J. Dent. Res. 78: 850-856 (1999) Rupf, S.M. , K .; Merte, and K. Eschrich; Quantiation of bacteria in oral samples by competitive polymerase chain reaction. (Page 851, etc.)
[0012]
[Non-patent document 2]
J. Clin. Microbiol. 37: 464-466 (1999), Klausegger, A .; , M .; Hell, A .; Berger, K .; Zinober, S.M. Baier, N .; Jones, W.C. Sperl, and B.S. Kofler; Gram type-specific broad-range PCR amplification for rapid detection of 62 pathogenic bacteria. (Pages 464 to 465, etc.)
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a primer set for PCR that can rapidly and accurately detect bacteria belonging to the group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria and a method that can quickly and accurately detect bacteria belonging to the group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventor has conducted repeated studies, confirmed the base sequence of the 16S rRNA gene of a bacterium belonging to the group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria, and confirmed the 16S rRNA gene of another bacterium contained in a public DNA database. The following findings were obtained by confirming the 16S rRNA gene of the protist other than the above, the 16S rRNA gene of the mitochondria of the plant or animal contained in the food, and the 16S rRNA gene of the chloroplast of the plant, and further performing an alignment analysis of these genes. Was.
{Circle around (1)} Bacteria belonging to the group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria have, as characteristic nucleotide sequences, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (5′-CTTGAGTGCAGAAGAGGAC-3 ′) and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in the DNA (16SrDNA) molecule encoding 16S rRNA. It has a base sequence (5'-GAGGGTTTCCGCCCTCTA-3 '). This sequence is a nucleotide sequence specific to 16S rRNA of an acetic acid-resistant lactic acid bacterium group and a bacterium belonging to the genus Lactobacillus related thereto, and is used for bacteria other than the genus Lactobacillus, other protists, plants, animals, and the like. Is substantially absent. Therefore, by using a PCR primer set capable of recognizing and amplifying a double strand of DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, bacteria belonging to the acetic acid-resistant lactic acid bacterium group can be detected. The related bacteria of the acetic acid-resistant lactic acid bacterium group can be specifically detected.
{Circle around (2)} A primer set capable of recognizing and amplifying a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 includes a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (5′-CTTGAGTGCAGAAGAGGAC-3 ′) and others. A primer set consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 and a primer set consisting of the primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 (5′-TGAAGTGCGGAAAACCCTC-3 ′), and preferably a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the base of SEQ ID NO: 2 A set with a primer consisting of a sequence is exemplified.
[0015]
The primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can hybridize to a sequence portion complementary to SEQ ID NO: 3, and the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 can hybridize to the sequence portion of SEQ ID NO: 4.
[0016]
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following primer sets, primers, and methods for detecting bacteria.
[0017]
[0018]
[0019]
[0020]
(1) The base sequence of
(2) the base sequence of
(3) the base sequence of
(4) the base sequence of
[0021]
(1) The base sequence of
(2) the base sequence of
[0022]
[0023]
(3) the base sequence of
(4) the base sequence of
[0024]
(Iii) detecting the presence or absence of DNA amplification;
A method for detecting bacteria comprising:
[0025]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(I) Primer / Primer set
The primer set of the present invention is subjected to PCR under predetermined conditions to detectably amplify the 16S rRNA gene (DNA encoding 16S rRNA) of a bacterium belonging to the group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria, but is subjected to PCR under the same conditions. Thus, the primer set does not substantially detectably amplify the 16S rRNA gene of organisms other than Lactobacillus bacteria.
[0026]
In the present invention, “amplify the 16S rRNA gene so as to be detectable” means that the entire sequence of the 16S rRNA gene or a partial sequence thereof is amplified by PCR to an extent that can be detected by any means.
[0027]
In the present invention, “a bacterium belonging to an acetic acid-resistant lactic acid bacterium group” refers to Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bucheneri, Lactobacillus plantarum. (L. plantarum) and L. paracasei.
[0028]
The primer set of the present invention may detectably amplify all or part of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus related to the group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria, in addition to the bacteria belonging to the group of acetic acid-resistant lactic acid bacteria.
[0029]
"Bacteria related to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group" refers to the genus Lactobacillus, similar to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group, very close to the molecular phylogenetic tree to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group, and at low pH as in the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group It is a bacterium that can grow and, in some cases, has the potential to cause food spoilage and contamination in low pH foods, similar to acetic acid-resistant lactic acid bacteria.
[0030]
In addition, the fact that 16S rRNA genes of organisms other than Lactobacillus bacteria are not detectably amplified substantially means not only the case where 16S rRNA genes of all organisms other than Lactobacillus bacteria are not detectably amplified, but also exceptional cases. This includes the case where 16S rRNA genes of several organisms other than Lactobacillus bacteria are detectably amplified.
[0031]
The above-mentioned predetermined conditions may be conditions usually employed in PCR. For example, denaturation is performed at about 85 to 99 ° C. for about 30 seconds to about 15 minutes, and annealing is performed at about 50 to 68 ° C. for about 5 seconds to about 1 minute. DNA extension is performed at about 68 to 75 ° C. for about 10 seconds to about 1 minute, and the Mg ion concentration in the reaction solution is set to about 1 to 4 mM.
[0032]
In the 16S rRNA gene of acetic acid-resistant lactic acid bacteria and related bacteria among Lactobacillus genus bacteria, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (5′-CTTGAGTGCAGAAGAGGAC-3 ′) and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (5 ′ -GAGGGTTTCCGCCCTTCA-3 ′) is specifically contained. In particular, the 16S rRNA gene of a bacterium belonging to the acetic acid-resistant lactic acid bacterium group contains the above two sequences in its DNA molecule. Therefore, it can be said that the primer set of the present invention specifically amplifies the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in a detectable manner.
[0033]
Further, the above two sequences are not substantially found in species other than bacteria of the genus Lactobacillus. Therefore, the primer set of the present invention, when subjected to PCR under predetermined conditions, substantially amplifies the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in one molecule in a detectable manner. Can be expressed as a primer set that does not detectably amplify DNA that does not substantially contain the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in one molecule when subjected to PCR under the same conditions. You can also.
[0034]
As described above, the bacteria belonging to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group are the target bacteria groups for crisis management, which are mainly problematic in that they contaminate low-pH foods and cause a decrease in flavor and expansion of closed food packaging containers. It is. Therefore, bacteria belonging to these acetic acid-resistant lactic acid bacteria groups can always be detected at one time, and furthermore, each 16S rRNA gene of bacteria other than bacteria of the genus Lactobacillus, protists other than bacteria, and plants and animals contained in food is substantially detected. The primer set of the present invention is an excellent primer set that can accurately detect the above-mentioned group of microorganisms subject to crisis management.
Specific examples of primer sets
The base sequence of the primer in the present invention includes the base sequence and the base sequence in which about 1 to 3 bases have been deleted, inserted or substituted in the base sequence.
[0035]
Representative examples of the primer of the present invention include the following primers (1) and (2), and primers (3) and (4). The primers (1) and (2) are primers capable of recognizing a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 3, and the primers (3) and (4) are base primers of the aforementioned SEQ ID NO: 4. It is a primer that can recognize the sequence.
(1) The base sequence of
(2) the base sequence of
[0036]
The primer of (2) has an arbitrary base sequence at the 5 'end of any of the above-listed base sequences, and is composed of DNA having a length of up to 30 bases as a whole. In the primer of (2), the optional base sequence which may be added to the 5'-terminal side is preferably composed of about 1 to 6 bases. Most preferably, this arbitrary base sequence is not added.
[0037]
Among the primers of (1) or (2), a primer consisting of a base sequence of
(3) The base sequence of
(4) the base sequence of
[0038]
The primer of (4) has an arbitrary base sequence at the 5 'end of any of the above-listed base sequences, and is composed of DNA having a length of up to 30 bases as a whole. In the primer of (4), the number of the optional base sequence which may be added to the 5 'terminal side is preferably about 1 to 6. Most preferably, this arbitrary base sequence is not added.
[0039]
Among the primers of (3) or (4), a primer consisting of a base sequence of
[0040]
The primer set of the present invention typically includes a combination of the primer (1) or (2) and the primer (3) or (4).
[0041]
The combination of the primer of (1) or (2) with the primer of (3) or (4) is not particularly limited and may be any combination. A combination of a primer consisting of a sequence and a primer consisting of the base sequence of
Production method
Each primer of the primer set of the present invention can be synthesized according to a conventional method based on the base sequence. It can also be purchased from a primer synthesis manufacturer (for example, Sawasdee Technology).
(II) Bacteria detection method
Basic configuration
The method for detecting bacteria of the present invention comprises: (i) a step of extracting DNA contained in a test food; (ii) a step of performing PCR using the DNA as a template and the above-described primer set of the present invention; iii) detecting the presence or absence of DNA amplification;
It is a method including.
Target food
The test food to be subjected to the method of the present invention is not particularly limited as long as it can be contaminated with acetic acid-resistant lactic acid bacteria. Test foods include processed foods as well as their raw materials. In particular, foods in which the growth of acetic acid-resistant lactic acid bacteria poses a problem are suitable as targets. Examples of such foods include mayonnaise, ketchup, dressing, soy sauce, soup, Worcester sauce, medium-concentrated sauce, mirin, wiener sausage, long-life milk, and the like, and raw materials thereof.
[0042]
DNA Extraction process
In the present invention, DNA may be extracted from bacteria separated and cultured from food, or DNA may be directly extracted from food.
[0043]
Known methods may be used for preparing DNA from the test food. For example, a sample containing DNA is prepared by adding a commercially available surfactant to a test food, heating at about 80 to 100 ° C. for about 1 to 15 minutes, cooling, and then centrifuging to collect the supernatant. can do. The DNA-containing sample prepared from the test food contains the bacterial 16S rRNA gene when the food contains bacteria, and also includes various other RNAs, DNAs, and proteins. Therefore, this sample may be purified according to a conventional method to obtain a fraction containing DNA.
[0044]
When the dead bacteria are considered to affect the results of PCR, or when it is not possible to obtain a sufficient amount of DNA because the number of obtained bacteria is too small but want to increase the detection sensitivity of acetic acid-resistant lactic acid bacteria, for example, DNA may be extracted by the method described above. First, a selective medium for a bacterium belonging to the genus Lactobacillus such as an MRA culture solution (Nissui Pharmaceutical) is adjusted to about pH 6.0 with hydrochloric acid or the like, and the test food is cultured at about 20 to 30 ° C. in this selective medium. The culture time varies depending on the number of bacteria present in the test food, but may be generally about 12 to 36 hours. The culture solution is centrifuged at about 50 to 300 × g, and the resulting supernatant is further centrifuged at about 2000 to 14000 × g. If the test food contains bacteria, the resulting precipitate usually contains bacteria. This precipitate is suspended in 200 μL of a 10% Chelex solution [10% (W / V) Chelex (Bio-Rad), 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0], and then suspended in a heat block. A DNA-containing sample can be prepared by lysing by heating at about 5 ° C. for about 5 minutes, and collecting the supernatant obtained by centrifuging the bacterial lysate at about 2000 to 14000 × g.
[0045]
Depending on the type of food, if the amount of acetic acid-resistant lactic acid bacteria of about 10 to 20 cfu is contained per gram of food, the test food is cultured for about 24 hours as described above, and DNA derived from acetic acid-resistant lactic acid bacteria is obtained by PCR. Can be detected.
[0046]
In tests where the number of acetic acid-resistant lactic acid bacteria contained in 1 g of food is less than 10 cfu, and when it is desired to further increase the detection sensitivity, the amount of test food may be increased or the culture time may be extended.
[0047]
PCR Process
In performing PCR, the above-described primer set of the present invention is used. Specifically, it is preferable to use a set of the primer of (1) or (2) and the primer of (3) or (4), particularly a set of the primer of SEQ ID NO: 1 and the primer of SEQ ID NO: 2.
[0048]
The PCR conditions are not particularly limited, and the optimum conditions may be determined for each PCR device. For example, in the case of a real-time PCR device, the following conditions may be mentioned.
Reaction solution: For example, Takara Ex Taq which is a kit for PCR reactionTM A PCR reaction solution dedicated to real-time PCR such as R-PCR Version (Takara Bio, Otsu, Japan) is used.
PCR cycle conditions:
-Thermal denaturation of double-stranded DNA: 95 ° C for 5 seconds
-Annealing of primer to single-stranded DNA: 10 seconds at 66 ° C
DNA extension: 72 ° C. for 20 seconds
By carrying out this reaction usually for about 30 to 35 cycles, the target DNA can be amplified to a detectable degree.
[0049]
As the PCR device, a commercially available device such as a block type or a real-time PCR type can be used. In order to rapidly amplify DNA, it is preferable to use a capillary type real-time PCR device.
[0050]
DNA Amplification confirmation process
Confirmation of the presence or absence of DNA amplification can be usually performed by separating the PCR product by agarose gel electrophoresis and staining the nucleic acid with ethidium bromide, Cyber Green I or the like. When PCR is performed using a real-time PCR device, the presence or absence of DNA amplification is automatically confirmed in a short time by the detection system of the device. For example, when Cyber Green I is added to the PCR reaction solution, the amount of amplification product can be monitored for each cycle from the fluorescence value emitted when Cyber Green I binds to the double-stranded DNA, and further, after the PCR, By performing curve analysis, it can be confirmed whether or not the PCR amplification product is the target amplification product. If the determination is difficult, the size of the amplification product may be confirmed by agarose gel electrophoresis.
[0051]
When a PCR product is detected by PCR, it can be determined that acetic acid-resistant lactic acid bacteria were present in the test food. When no PCR product is detected, it can be determined that acetic acid-resistant lactic acid bacteria were not present in the test food. When acetic acid-resistant lactic acid bacteria are present, a band having a size of about 203 base pairs is detected by agarose gel electrophoresis.
[0052]
When it is necessary to more accurately determine the presence or absence of contamination of the test food with acetic acid-resistant lactic acid bacteria, it is more preferable to confirm that the PCR-amplified fragment is derived from the 16S rRNA gene of acetic acid-resistant lactic acid bacteria.
[0053]
As a confirmation method, for example, there is a method of performing restriction fragment length polymorphism analysis on a DNA fragment obtained by treating a PCR amplified fragment with a restriction enzyme. The restriction enzyme used at this time is not particularly limited as long as it can cleave the PCR amplified fragment and show a restriction fragment length polymorphism. One type of restriction enzyme can be used alone, or two or more types can be used in combination, but it is preferable to use two or more types in combination. The restriction fragment length polymorphism can be detected by, for example, agarose electrophoresis or Southern blotting.
[0054]
Also, the PCR amplified fragment is derived from the 16S rRNA gene of the acetic acid-resistant lactic acid bacterium by determining the base sequence of the PCR amplified fragment by a conventional method and comparing the base sequence with the base sequence of a public DNA database. You can check that.
[0055]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited thereto.
[0056]
Example 1(Confirmation of detection sensitivity against standard strains of bacteria belonging to acetic acid-resistant lactic acid bacteria group)
Lactobacillus casei JCM 1134TStrains and Lactobacillus fructivorans JCM 1117TEach strain was cultured using MRS liquid medium (pH 6.0). A DNA solution was prepared from a culture solution of each strain using a PUREGENE DNA Isolation Kit (Gentra, Minneapolis, USA). The DNA amount of each strain was measured, and the molecular weight of the genome of each strain was estimated to be 3.0 Mbp, and the copy number of the genome was about 2 copies / μL, about 20 copies / μL, and 2 × 102Copy / μL, 2 × 103Copy / μL and 2 × 104Each test DNA solution was prepared at about copy / μL.
[0057]
On the other hand, each DNA primer of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 was synthesized using a DNA synthesizer. 1 μL of each of the above test DNA solutions was added to Takara Ex Taq, a PCR reaction kit.TM A PCR reaction solution having a total volume of 20 μL was prepared by adjusting according to the instructions of R-PCR Version (Takara Bio, Otsu, Japan). That is, 2 μL of 10 × R-PCR Buffer (Mg2+free), 0.16 μL of 250 mM Mg2+Solution for R-PCR, 0.4 μL dNTP Mixture (10 mM each), 0.2 μL TaKara EX TaqTM R-PCR (5 units / μL), 0.8 μL of 0.125% SYBRTM Green I (Fmc Bioproducts, Rockland, USA), 1.0 μL of a DNA primer solution (containing 5 μM each of the DNA primer of SEQ ID NO: 1 and the DNA primer of SEQ ID NO: 2) and 19 μL of a preparation solution containing 16.44 μL of distilled water Then, 1 μL of a test DNA solution was added to the mixture to prepare a 20 μL PCR reaction solution.
[0058]
PCR was performed as follows using LightCycler manufactured by Roche Diagnostics. That is, the initial denaturation was performed at 95 ° C. for 1 minute, and the fluorescence measurement (measurement of the amplification product by PCR) was defined as one cycle at 95 ° C. for 5 seconds, at 66 ° C. for 10 seconds, and at 72 ° C. for 20 seconds. Perform 35 cycles, and then 0 seconds at 97 ° C., 10 seconds at 60 ° C., then increase the temperature to 97 ° C. at a rate of 0.2 ° C./sec. By measurement, the amount of double-stranded DNA of the amplification product at each temperature was measured, and finally the temperature was lowered to 40 ° C.
[0059]
After completion of PCR, melting curve analysis was performed using software on the same PCR device, and the presence or absence of a specific amplification product was determined by determining the Tm value of the amplification product. Furthermore, electrophoresis was performed on a 1.8% agarose gel using a Mupid mini gel electrophoresis tank (ADVANCE), and the gel was stained with an ethidium bromide solution to confirm the presence or absence of amplification of the target band. The presence or absence was checked.
[0060]
The gel after electrophoresis of the reaction solution after PCR is shown in FIG. Lanes 1-5 are Lactobacillus fructivorans JCM 1117TIn FIG. 1,
[0061]
From the results of FIG. 1, it can be seen that by using the DNA primer of SEQ ID NO: 1 and the DNA primer of SEQ ID NO: 2 as a set, if about 2 to 20 copies of genomic DNA are present in the reaction solution, Lactobacillus fructivorans JCM 1117TStrains and Lactobacillus casei JCM 1134TIt was confirmed that strain DNA could be detected.
[0062]
Lactobacillus brevis JCM 1059TLactobacillus buchneri JCM 1115TStrain, Lactobacillus plantarum JCM 1149TStrains and Lactobacillus paracasei JCM 8130TWhen PCR was performed with the genomic DNA copy number changed in the same manner for the strains, it was confirmed that any kind of DNA could be similarly detected if about 2 to 20 copies of genomic DNA were present.
[0063]
Example 2(Confirmation of reactivity to standard strains of bacteria belonging to acetic acid-resistant lactic acid bacteria group)
Lactobacillus fructivorans JCM 1117 in the same manner as in Example 1.TLactobacillus casei JCM 1134TStrain, Lactobacillus brevis JCM 1059TLactobacillus buchneri JCM 1115TStrain, Lactobacillus plantarum JCM 1149TStrains and Lactobacillus paracasei JCM 8130TA DNA solution of the strain was prepared and the genome copy number was 2 × 104Each test DNA solution of about copy / μL was prepared.
[0064]
In order to examine the reactivity of the primer set of the DNA primer of SEQ ID NO: 1 and the DNA primer of SEQ ID NO: 2 with respect to the DNA of each of these strains, PCR was performed using 1 μL of each test DNA solution using the same DNA primer set. It carried out similarly to Example 1. The presence or absence of the PCR amplification product was confirmed by agarose gel electrophoresis in the same manner as in Example 1.
[0065]
FIG. 2 shows a gel after electrophoresis of the reaction solution after PCR.
[0066]
Example 3(Confirmation of reactivity with bacteria other than bacteria belonging to acetic acid-resistant lactic acid bacteria group and DNA derived from other organisms)
Each of the bacterial strains and fungal strains shown in Table 1 below were cultured in a medium suitable for each, and a DNA solution was prepared in the same manner as in Example 1. The DNA amount of each DNA solution was measured, and a test DNA solution having a concentration of about 5 pg / μL was prepared for each bacterial strain DNA, and a test DNA solution having a concentration of 1 ng / μL was prepared for each fungal strain DNA. In addition, each plant DNA was extracted from commercially available flour, corn, potato, rapeseed, and soybean using DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). The DNA amount of each DNA solution was measured, and the test DNA solution was adjusted to about 8 ng / μL for wheat DNA, and the test DNA solution was adjusted to about 3 ng / μL for corn, potato, rape and soybean DNA. did. In addition, human DNA was extracted from human MCF-7 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) using DNeasy Tissue Mini Kit (Qiagen). The DNA amount of the DNA solution was measured, and a test DNA solution having a concentration of about 3 ng / μL was prepared. Bovine and chicken purified DNA were purchased from CeMines, and salmon purified DNA was purchased from BD Bioscience Clontech. The DNA amount of each DNA solution was measured, and a test DNA solution having a concentration of about 3 ng / μL was prepared for bovine and chicken DNA, and a test DNA solution having a concentration of about 1 ng / μL was prepared for salmon DNA.
[0067]
In order to examine the reactivity of the primer set (LA1-203) of the DNA primer of SEQ ID NO: 1 and the DNA primer of SEQ ID NO: 2 with respect to the DNA of each of these organisms, the above DNA primer set for 1 μL of each test DNA solution was used. The used PCR was carried out in the same manner as in Example 1. The presence or absence of the PCR amplification product was confirmed by agarose gel electrophoresis in the same manner as in Example 1.
[0068]
In addition, PCR was performed in the same manner using the primer set (prbac) capable of detecting bacteria in general described in
[0069]
The results of these PCRs are shown in Tables 1 and 2 below. In the table, + indicates that a band was detected by electrophoresis, and minus indicates that no band was detected.
[0070]
[Table 1]
[Table 2]
From the results shown in Tables 1 and 2, five types of acetic acid-tolerant lactic acid bacteria (Lactobacillus fructivorans JCM 1117) were obtained by PCR using a set of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.T, Lactobacillus brevis JCM 1059T, Lactobacillus buchneri JCM 1115T, Lactobacillus plantarum JCM 1149TAnd Lactobacillus paracasei JCM 8130TIt has been found that a DNA fragment derived from the 16S rRNA gene of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus and its related strains can be specifically amplified.
[0073]
On the other hand, when prbac, which is a known primer set, was used, bacteria were widely detected, and further, DNA extracted from plants was detected. As a result of the nucleotide sequence analysis, it was confirmed that the PCR amplification product amplified from plant-derived DNA by prbac was a DNA fragment encoding 16S rRNA of chloroplast.
[0074]
FIG. 3 is a molecular phylogenetic tree created based on the 16S rRNA gene sequences of various bacteria, and each strain detected by PCR using each DNA primer of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is indicated by +.
[0075]
From FIG. 3, it can be seen that by performing PCR using the DNA primer sets of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, the main five strains that can be classified into a group of fungi on the molecular phylogenetic classification created based on the 16S rRNA gene sequence It can be seen that the acetic acid-tolerant lactic acid bacteria group of the species and the related bacteria group were specifically detected.
[0076]
Example 4(Detection of bacterial 16S rRNA gene belonging to acetic acid-resistant lactic acid bacteria group in food)
Commercially available mayonnaise and vinegar, which have been confirmed not to be contaminated by general viable bacteria, have been added to Lactobacillus fructivorans JCM 1117, a typical acetic acid-resistant lactic acid bacterium.TUsing the strain as an indicator bacterium, those added and about 10-20 cfu per 1 g of each food were prepared. An MRS liquid medium (pH 6.0) in an
[0077]
10 mL of the diluted food mixture was transferred to a 15-mL culture tube, sealed, and cultured at 30 ° C. for 20 to 28 hours. In order to adjust the DNA solution used for PCR, 1.3 mL of the culture solution was collected at 0 hour, 20 hours, 24 hours and 28 hours.
[0078]
The collected culture was centrifuged at 100 × g for 1 minute, and the supernatant was further centrifuged at 13,000 × g for 5 minutes to obtain a precipitate. To wash the precipitate, the suspension was suspended in 0.5 mL of a TE buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), and centrifuged at 13,000 × g for 5 minutes to obtain a precipitate. 200 μL of a 10% Chelex solution [10% (W / V) Chelex (Bio-Rad), 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0] was added to the precipitate, and the precipitate was suspended. The mixture was heated at 99 ° C. for 5 minutes and centrifuged at 13,000 × g for 3 minutes to collect a supernatant. The supernatant contained DNA and was used as a DNA solution for PCR.
[0079]
Using 1 μL of the obtained DNA solution as a sample, PCR was carried out in the same manner as described in Example 1, and the presence or absence of a PCR amplification product was confirmed. FIG. 4 shows the electrophoresis pattern on the agarose gel.
[0080]
FIG. 4A is an electrophoresis pattern for commercially available mayonnaise, and FIG. 4B is an electrophoresis pattern for commercially available vinegar. In both FIGS. (A) and (B),
[0081]
As shown in FIG. 4A, about 10 to 20 cfu of Lactobacillus fructivorans JCM 1117 per gram of commercially available mayonnaise.TIn the case where the indicator bacteria of the strain exist, it can be understood that the bacterial DNA can be detected by the PCR if the food culture time before DNA extraction is set to 24 hours or more. In addition, as shown in FIG. 4B, about 10 to 20 cfu of Lactobacillus fructivorans JCM 1117 per 1 g of commercially available vinegar.TIn the case where the indicator bacteria of the strain exist, it can be understood that the bacterial DNA can be detected by the PCR if the food culture time before DNA extraction is set to 24 hours or more.
[0082]
【The invention's effect】
According to the present invention, a primer for PCR that can rapidly and accurately detect bacteria belonging to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group and a method that can quickly and accurately detect bacteria belonging to the acetic acid-resistant lactic acid bacteria group have been provided.
[0083]
Furthermore, by performing PCR using the primer set of the present invention, acetic acid-resistant lactic acid bacteria can be detected collectively. Specifically, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus plantarum, which is a problem in the spoilage of acidic foods, and the fact that a rapid culture test for the presence or absence of cold foods in the presence of cold weather is more effective than the conventional method of incorporation of cold weather into food. it can.
[0084]
Therefore, the primer set of the present invention can be suitably used for the primary screening of a bacterial test for a food with relatively low contamination frequency. That is, when bacteria are detected by the primary screening using the primer set of the present invention, appropriate measures for the food production process and the product can be taken more quickly. If necessary, the bacterial species can also be identified by performing base sequence analysis of the PCR amplification product or performing PCR using a primer set specific to a specific lactic acid bacterium as a secondary screening.
[0085]
In addition, when a primer capable of widely detecting conventional bacteria in general is used, even DNA of contaminating organisms other than the target bacterium and DNA derived from food can be detected. In addition, DNA derived from contaminating organisms other than bacteria of the genus Lactobacillus or DNA derived from food can be substantially not detected, that is, highly accurate detection can be performed.
[0086]
In particular, since the primer of the present invention does not detect DNA of plant or animal which is a food, there is no need to separate and culture bacteria from the food and then extract the DNA. The DNA can be subjected to PCR simply by extracting the DNA from a culture solution obtained by culturing for about 24 hours. Thereby, the inspection time can be significantly reduced.
[0087]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the detection sensitivity of acetic acid-resistant lactic acid bacteria.
FIG. 2 is a diagram showing that six lactic acid bacteria could be detected by the primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2.
FIG. 3 is a diagram showing a molecular phylogenetic tree based on a bacterial 16S rRNA gene sequence and a group of bacteria that can be detected by the primer sets of SEQ ID NOS: 1 and 2.
FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the culture time of a test food and the presence or absence of detection of acetic acid-resistant lactic acid bacteria. (A) shows the results of commercial mayonnaise, and (B) shows the results of commercial vinegar.
Claims (7)
（１） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。
（３） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。A primer set comprising the following primer (1) or (2) and the primer (3) or (4):
(1) The base sequence of base numbers 10 to 19, the base sequence of base numbers 9 to 19, the base sequence of base numbers 8 to 19, the base sequence of base numbers 7 to 19, the base sequence of base numbers 6 to 19 in SEQ ID NO: 1 It consists of a sequence, a base sequence of base numbers 5 to 19, a base sequence of base numbers 4 to 19, a base sequence of base numbers 3 to 19, a base sequence of base numbers 2 to 19, or a base sequence of base numbers 1 to 19 Primer.
(2) the base sequence of base numbers 10 to 19, the base sequence of base numbers 9 to 19, the base sequence of base numbers 8 to 19, the base sequence of base numbers 7 to 19, and the base sequences of base numbers 6 to 19 in SEQ ID NO: 1 A sequence, a base sequence of base numbers 5 to 19, a base sequence of base numbers 4 to 19, a base sequence of base numbers 3 to 19, a base sequence of base numbers 2 to 19, or a base sequence of base numbers 1 to 19 'Primer consisting of DNA of up to 30 bases included on the terminal side.
(3) the base sequence of base numbers 9 to 18, the base sequence of base numbers 8 to 18, the base sequence of base numbers 7 to 18, the base sequence of base numbers 6 to 18, the base sequence of base numbers 5 to 18 in SEQ ID NO: 2 A primer comprising a sequence, a base sequence of base numbers 4 to 18, a base sequence of base numbers 3 to 18, a base sequence of base numbers 2 to 18, or a base sequence of base numbers 1 to 18.
(4) the base sequence of base numbers 9 to 18, the base sequence of base numbers 8 to 18, the base sequence of base numbers 7 to 18, the base sequence of base numbers 6 to 18, the base sequence of base numbers 5 to 18 in SEQ ID NO: 2 Sequence, a base sequence of base numbers 4 to 18, a base sequence of base numbers 3 to 18, a base sequence of base numbers 2 to 18, or a base sequence of base numbers 1 to 18, up to 30 bases including a base sequence of base numbers 1 to 18 Primer consisting of DNA.
（１） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列からなるプライマー。
（２） 配列番号１における塩基番号１０〜１９の塩基配列、塩基番号９〜１９の塩基配列、塩基番号８〜１９の塩基配列、塩基番号７〜１９の塩基配列、塩基番号６〜１９の塩基配列、塩基番号５〜１９の塩基配列、塩基番号４〜１９の塩基配列、塩基番号３〜１９の塩基配列、塩基番号２〜１９の塩基配列、又は、塩基番号１〜１９の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。The following primer (1) or (2):
(1) The base sequence of base numbers 10 to 19, the base sequence of base numbers 9 to 19, the base sequence of base numbers 8 to 19, the base sequence of base numbers 7 to 19, the base sequence of base numbers 6 to 19 in SEQ ID NO: 1 It consists of a sequence, a base sequence of base numbers 5 to 19, a base sequence of base numbers 4 to 19, a base sequence of base numbers 3 to 19, a base sequence of base numbers 2 to 19, or a base sequence of base numbers 1 to 19 Primer.
(2) the base sequence of base numbers 10 to 19, the base sequence of base numbers 9 to 19, the base sequence of base numbers 8 to 19, the base sequence of base numbers 7 to 19, and the base sequences of base numbers 6 to 19 in SEQ ID NO: 1 A sequence, a base sequence of base numbers 5 to 19, a base sequence of base numbers 4 to 19, a base sequence of base numbers 3 to 19, a base sequence of base numbers 2 to 19, or a base sequence of base numbers 1 to 19 'Primer consisting of DNA of up to 30 bases included on the terminal side.
（３） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列からなるプライマー。
（４） 配列番号２における塩基番号９〜１８の塩基配列、塩基番号８〜１８の塩基配列、塩基番号７〜１８の塩基配列、塩基番号６〜１８の塩基配列、塩基番号５〜１８の塩基配列、塩基番号４〜１８の塩基配列、塩基番号３〜１８の塩基配列、塩基番号２〜１８の塩基配列、又は、塩基番号１〜１８の塩基配列を３’末端側に含む最大３０塩基のＤＮＡからなるプライマー。The following primer (3) or (4):
(3) the base sequence of base numbers 9 to 18, the base sequence of base numbers 8 to 18, the base sequence of base numbers 7 to 18, the base sequence of base numbers 6 to 18, the base sequence of base numbers 5 to 18 in SEQ ID NO: 2 A primer comprising a sequence, a base sequence of base numbers 4 to 18, a base sequence of base numbers 3 to 18, a base sequence of base numbers 2 to 18, or a base sequence of base numbers 1 to 18.
(4) the base sequence of base numbers 9 to 18, the base sequence of base numbers 8 to 18, the base sequence of base numbers 7 to 18, the base sequence of base numbers 6 to 18, the base sequence of base numbers 5 to 18 in SEQ ID NO: 2 Sequence, a base sequence of base numbers 4 to 18, a base sequence of base numbers 3 to 18, a base sequence of base numbers 2 to 18, or a base sequence of base numbers 1 to 18, up to 30 bases including a base sequence of base numbers 1 to 18 Primer consisting of DNA.
（ｉｉｉ） ＤＮＡ増幅の有無を検出する工程と
を含む細菌の検出方法。(I) a step of extracting DNA contained in the test food; and (ii) a step of performing PCR using the DNA as a template and the primer set according to any one of claims 1 to 4,
(Iii) a step of detecting the presence or absence of DNA amplification.
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