KR102613001B1 - 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물 및 그 제조방법 - Google Patents

비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 하기 화학식 1로 표시되는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다:
<화학식 1>

상기 식에서,
R은 C1-C6 알킬, C6-C20 아릴, C2-C20 헤테로아릴, C3-C20 사이클로알킬 및 C2-C20 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며,
상기 각각의 C1-C6 알킬, C6-C20 아릴, C2-C20 헤테로아릴, C3-C20 사이클로알킬 및 C2-C20 헤테로사이클릴은 C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 알콕시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 보호된 히드록시(C1-C3)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬, 시아노(C1-C4)알킬, (C1-C4)알킬아미노, 디(C1-C4)알킬아미노, 할로겐, 시아노, 옥소, 니트로, 히드록시, 아미노, MeSO2―, MeSO2N(Me)(C1-C4)알킬, MeSO2NH(C1-C4)알킬, 보호된 CONH2, 보호된 카르복실산, H2NC(-O)CMe2(C1-C4)알킬, H2NC(-O)CHMe(C1-C4)알킬, H2NC(-O)CH2(C1-C4)알킬, ―OR, ―NR2, ―COOR', ―CONR'2, 및 ―SOkR'로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환기들에 의해서 선택적으로 치환된 것이고,
상기 k는 0, 1 또는 2이며, 상기 각각의 R'는 독립적으로 ―H, 알킬기, 시클로알킬기 또는 아릴기이다.
본 발명에 따르면, 이소성 후각 수용체에 대해서 선택적이고 특이적이면서도 매우 높은 활성을 갖는 효능제 화합물을 제공할 수 있는 바, 이소성 후각 수용체의 생리적 기능 및 분자 약리학을 연구하기 위한 기초를 제공할 수 있다.

Description

비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물 및 그 제조방법 {Agonist compound for olfactory receptors in non-olfactory tissues and method for preparing the same}
본 발명은 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
후각 수용체 (olfactory receptor, OR)는 G-단백질 커플링된 수용체 (G protein-coupled receptors, GPCRs)의 일종으로서, 냄새 물질의 분자적 특징들을 인식하고, 정보를 뇌로 전달한다. 일반적으로, ORs는 다양한 결합 친화도를 갖는 냄새 물질들과 결합한다. 냄새 물질들이 OR에 결합하게 되면, 후각-타입 G 단백질 (Golf)에 형태적 변화가 야기되고, 이는 하류 신호전달 경로의 활성화로 이어진다. 비록, GPCRs 중 ORs이 가장 큰 패밀리를 형성하지만 (인간에서 ~50% 및 마우스에서 ~70%), 현재까지 ORs의 X-선 결정 구조가 알려진 바는 없다.
비록 대부분의 ORs가 코 후각 상피 세포들 중에서 광범위하게 발현되며, 여기에서 적절한 생리적 기능들을 수행하지만, 비-후각 조직들 중의 ORs의 이소성 발현 (ectopic expression)에 대해서는 최근에야 연구가 이루어지고 있다 (비특허문헌 1). 또한, Flegel 등의 연구진들은 인간 조직의 광범위한 패널을 사용하여 이소성 발현된 후각 수용체들에 대한 RNA 서열 분석을 수행한 바도 있다 (비특허문헌 2). 관련해서, 본 발명자들 역시 췌장, 방광, 흉선, 심장 및 갑상선을 포함하는 다양한 다른 조직들에서 ORs가 이소성 발현되는 것을 보고한 바 있다 (비특허문헌 3 내지 6). 이러한 결과들은 비-후각 조직들 중 ORs가 냄새를 인식하는 것 이외에도 다른 생리적 역할을 수행할 수 있다는 점을 시사하는 것이다. 그러나, 비-후각 조직들 중 ORs의 기능들은 현재까지 거의 알려진 바가 없다.
막-결합된 ORs의 X-선 결정 구조들의 부족으로 인해서, ORs의 활성화 메카니즘은 분자 모델링 및 부위특이적 돌연변이를 사용하여 제안 및 분석된다 (비특허문헌 7). ORs가 분자적 수준에서 어떻게 다양한 리간드들을 인식하고 구별하는지를 이해하기 위해서는 특정 ORs에 대해서 특이적인 선택적 리간드들을 확인하는 것이 필수적이다. 비-후각 조직들에서 특정 ORs에 대한 민감하고 효능있는 리간드들은 ORs의 생리적 기능을 연구하기 위한 생물학적 화합물로서 활용될 수 있다. 비록 ORs에 대한 특정 냄새 물질들이 보고된 바 있지만, 이들은 1 내지 100 μM의 EC50 수치들을 갖는 ORs에 대한 약한 효능제들이다. 일반적으로, 작용기들 (예를 들어, 카르복실산, 알코올, 아민, 알데히드, 케톤, 티올 및 에스테르) 중 하나를 보유한 냄새 물질들은 다중의 ORs를 활성화한다. 비록, 일부 냄새 물질들이 특정 ORs에 대해서 특이성을 나타내는 것으로 보고된 바 있지만 (비특허문헌 8 내지 10), 대부분의 ORs의 분자적 약리학은 아직까지도 특성화되지 않은 채 남아 있는 바, 이는 ORs에 대한 선택적이고 특이적인 효능제가 부족하기 때문이다. 따라서, 비-후각 조직들에서 이소성 ORs를 선택적으로 활성화시키기 위해서 매우 효능있는 리간드들을 개발하는 것이 절실한 실정이다.
비특허문헌 1: N. Kang, J. Koo, Olfactory receptors in non-chemosensory tissues, Bmb Reports, 45 (2012) 612-622. 비특허문헌 2: C. Flegel, S. Manteniotis, S. Osthold, H. Hatt, G. Gisselmann, Expression Profile of Ectopic Olfactory Receptors Determined by Deep Sequencing, Plos One, 8 (2013). 비특허문헌 3: N. Kang, Y.Y. Bahk, N. Lee, Y. Jae, Y.H. Cho, C.R. Ku, Y. Byun, E.J. Lee, M.S. Kim, J. Koo, Olfactory receptor Olfr544 responding to azelaic acid regulates glucagon secretion in alpha-cells of mouse pancreatic islets, Biochemical and Biophysical Research Communications, 460 (2015) 616-621. 비특허문헌 4: N. Kang, H. Kim, Y. Jae, N. Lee, C.R. Ku, F. Margolis, E.J. Lee, Y.Y. Bahk, M.S. Kim, J. Koo, Olfactory Marker Protein Expression Is an Indicator of Olfactory Receptor-Associated Events in Non-Olfactory Tissues, Plos One, 10 (2015). 비특허문헌 5: H. Kim, N. Kang, K.W. Chon, S. Kim, N. Lee, J. Koo, M.S. Kim, MRPrimer: a MapReduce-based method for the thorough design of valid and ranked primers for PCR, Nucleic Acids Research, 43 (2015). 비특허문헌 6: S.H. Kim, Y.C. Yoon, A.S. Lee, N. Kang, J. Koo, M.R. Rhyu, J.H. Park, Expression of human olfactory receptor 10J5 in heart aorta, coronary artery, and endothelial cells and its functional role in angiogenesis, Biochemical and Biophysical Research Communications, 460 (2015) 404-408. 비특허문헌 7: C.A. de March, Y.Q. Yu, M.J.J. Ni, K.A. Adipietro, H. Matsunami, M.H. Ma, J. Golebiowski, Conserved Residues Control Activation of Mammalian G Protein-Coupled Odorant Receptors, Journal of the American Chemical Society, 137 (2015) 8611-8616. 비특허문헌 8: D.M. Ferrero, D. Wacker, M.A. Roque, M.W. Baldwin, R.C. Stevens, S.D. Liberles, Agonists for 13 Trace Amine-Associated Receptors Provide Insight into the Molecular Basis of Odor Selectivity, Acs Chem Biol, 7 (2012) 1184-1189. 비특허문헌 9: S.D. Liberles, L.B. Buck, A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium, Nature, 442 (2006) 645-650. 비특허문헌 10: A. Keller, H.Y. Zhuang, Q.Y. Chi, L.B. Vosshall, H. Matsunami, Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception, Nature, 449 (2007) 468-U466.
따라서, 본 발명에서는, 방광에서 발현되는 것으로 알려진 후각 수용체 895를 사용하여, 상기 후각 수용체 895에 대해서 특이적인 작용 활성을 갖는 합성 리간드들을 제공하고자 하였다.
이에, 본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 하기 화학식 1로 표시되는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물을 제공한다:
<화학식 1>
상기 식에서,
R은 C1-C6 알킬, C6-C20 아릴, C2-C20 헤테로아릴, C3-C20 사이클로알킬 및 C2-C20 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며,
상기 각각의 C1-C6 알킬, C6-C20 아릴, C2-C20 헤테로아릴, C3-C20 사이클로알킬 및 C2-C20 헤테로사이클릴은 C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 알콕시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 보호된 히드록시(C1-C3)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬, 시아노(C1-C4)알킬, (C1-C4)알킬아미노, 디(C1-C4)알킬아미노, 할로겐, 시아노, 옥소, 니트로, 히드록시, 아미노, MeSO2―, MeSO2N(Me)(C1-C4)알킬, MeSO2NH(C1-C4)알킬, 보호된 CONH2, 보호된 카르복실산, H2NC(-O)CMe2(C1-C4)알킬, H2NC(-O)CHMe(C1-C4)알킬, H2NC(-O)CH2(C1-C4)알킬, ―OR, ―NR2, ―COOR', ―CONR'2, 및 ―SOkR'로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환기들에 의해서 선택적으로 치환된 것이고,
상기 k는 0, 1 또는 2이며, 상기 각각의 R'는 독립적으로 ―H, 알킬기, 시클로알킬기 또는 아릴기이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 내지 7로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다:
<화학식 2>
<화학식 3>
<화학식 4>
<화학식 5>
<화학식 6>
<화학식 7>
.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비-후각 조직 중 후각 수용체는 후각 수용체 895일 수 있다.
또한, 본 발명은, 유기 용매 중 하기 화학식 8의 화합물 용액에 디메틸포름아미드-디메틸아세탈 (dimethylformamide-dimethylacetal, DMF-DMA)을 첨가해 줌으로써 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물의 제조방법을 제공한다:
<화학식 8>
<화학식 2>
.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유기 용매는 p-자일렌일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 알코올 중 상기 화학식 2의 화합물 및 아민 용액에 아세트산을 첨가해 줌으로써 하기 화학식 9의 화합물을 제조하는 단계를 더 포함할 수도 있다:
<화학식 9>
상기 식에서, R은 피롤리디닐, 피페리닐, 모르폴리닐, 아닐리닐 또는 2-아미노피리디닐기일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 알코올은 에탄올일 수 있다.
본 발명에 따르면, 이소성 후각 수용체에 대해서 선택적이고 특이적이면서도 매우 높은 활성을 갖는 효능제 화합물을 제공할 수 있는 바, 이소성 후각 수용체의 생리적 기능 및 분자 약리학을 연구하기 위한 기초를 제공할 수 있다.
도 1a 내지 1c는 방광에서, 이소성 냄새 물질 수용체인 Olfr895의 발현 프로파일을 도시한 도면이다.
도 2a 및 2b는 Olfr895의 이형 발현을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 화합물 4 및 대조군으로서 아세토페논이 Olfr895로 형질감염된 포유류 세포들 내로 칼슘 활성화를 유도하는 것을 도시한 도면이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서는, 방광에서 발현되는 것으로 알려진 후각 수용체 895를 사용하여, 상기 후각 수용체 895에 대해서 특이적인 작용 활성을 갖는 합성 리간드들을 제공하고자 하였다.
하기 실시예에서 상세하게 서술하는 바와 같이, 본 발명에서는 비-후각 조직 중 후각 수용체인 후각 수용체 895를 동정하고, 발현 벡터를 사용하여 이를 클로닝하였다. 이어서, 상기 후각 수용체 895에 대한 잠재적 후보물질들로서 일련의 에나미논계 리간드 화합물들을 제조한 다음, 공지된 후각 수용체 리간드 화합물들인 아세토페논 및 데하이드로아세트산 등과 효능제 활성을 비교 검증함으로써, 하기 화학식 1로 표시되는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물을 개발하였다:
<화학식 1>
상기 식에서,
R은 C1-C6 알킬, C6-C20 아릴, C2-C20 헤테로아릴, C3-C20 사이클로알킬 및 C2-C20 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며,
상기 각각의 C1-C6 알킬, C6-C20 아릴, C2-C20 헤테로아릴, C3-C20 사이클로알킬 및 C2-C20 헤테로사이클릴은 C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C1-C4 알콕시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 보호된 히드록시(C1-C3)알킬, 히드록시(C1-C4)알킬, 시아노(C1-C4)알킬, (C1-C4)알킬아미노, 디(C1-C4)알킬아미노, 할로겐, 시아노, 옥소, 니트로, 히드록시, 아미노, MeSO2―, MeSO2N(Me)(C1-C4)알킬, MeSO2NH(C1-C4)알킬, 보호된 CONH2, 보호된 카르복실산, H2NC(-O)CMe2(C1-C4)알킬, H2NC(-O)CHMe(C1-C4)알킬, H2NC(-O)CH2(C1-C4)알킬, ―OR, ―NR2, ―COOR', ―CONR'2, 및 ―SOkR'로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환기들에 의해서 선택적으로 치환된 것이고,
상기 k는 0, 1 또는 2이며, 상기 각각의 R'는 독립적으로 ―H, 알킬기, 시클로알킬기 또는 아릴기이다.
바람직하게는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 내지 7로 표시되는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다:
<화학식 2>
<화학식 3>
<화학식 4>
<화학식 5>
<화학식 6>
<화학식 7>
.
한편, 본 발명은, 유기 용매 중 하기 화학식 8의 화합물 용액에 디메틸포름아미드-디메틸아세탈 (dimethylformamide-dimethylacetal, DMF-DMA)을 첨가해 줌으로써 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물의 제조방법을 제공한다:
<화학식 8>
<화학식 2>
.
상기 유기 용매로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, p-자일렌 등의 용매를 사용할 수 있다.
또한, 상기 화학식 2의 화합물에 부가적인 반응을 수행함으로써 추가적인 후각 수용체 효능제 화합물을 제조할 수도 있는 바, 예를 들어, 알코올 중 상기 화학식 2의 화합물 및 아민 용액에 아세트산을 첨가해 줌으로써 하기 화학식 9의 화합물을 제조하는 단계를 더 수행해줄 수도 있다:
<화학식 9>
상기 식에서, R은 피롤리디닐, 피페리닐, 모르폴리닐, 아닐리닐 또는 2-아미노피리디닐기일 수 있다.
상기 알코올로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 에탄올 등의 알코올을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실험 과정
일반
화합물 및 용매들은 Aldrich 및 Acros로부터 구입하였다. 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼은 BRUKER Biospin AVANCE 600 MHz 및 300 MHz 스펙트로미터 상에서 측정하였다. 화학적 시프트는 적당한 유기 용매들 중에서 내부 TMS로부터 하류 쪽의 δ 수치로 기록하였다. 질량 스펙트럼은 Agilent 6530 Accurate mass Q-TOF LC/MS 스펙트로미터 상에서 측정하였다. HPLC는 Agilent HPLC 1260 Infinity 상에서 측정하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 실험은 Merck Silica Gel F254를 사용하여 수행하였다.
( E ) - 3-(3-( Dimethylamino )- acryloyl )-2- hydroxy -6-methyl-4 H - pyran -4-one (2)
p-자일렌 중 데하이드로아세트산의 용액 (840 mg, 5.00 mmol)에 디메틸포름아미드-디메틸아세탈 (DMF-DMA) (600 mg, 5.00 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에서 2 시간 동안 교반하였다. TLC로 반응 진행을 모니터링한 이후에, 과량의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 침전물 고체를 여과를 통해서 수집하고, 에탄올로부터 재결정화하였다. 결정화에 의한 정제를 통해서 (헥산/에틸 아세테이트 = 1:1, Rf = 0.23) 화합물 2를 옅은 갈색 고체로서 수율 82%로 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.14 (s, 3H, CH3), 3.00 (s, 3H, NCH3), 3.29 (s, 3H, NCH3), 5.90 (s, 1H, Ar-H), 6.46 (d, 1H, J= 12.2 Hz), 8.16 (d, 1H, J = 12.2 Hz). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 19.99, 38.22, 46.03, 90.59, 94.91, 104.75, 157.68, 161.82, 165.37, 184.41 (C=O), 184.59 (C=O). HRMS (ESI): [M+H]+ , calcd for C11H14NO4 (m/z): 224.0923, found: 224.0942.
에나미논 유도체들 (3- 5)의 합성을 위한 일반적 과정
에탄올 (20 mL) 중 화합물 2 (223 mg, 1.00 mmol) 및 적당한 아민 (1.00 mmol)을 아세트산 (1.20 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에서 2 시간 동안 교반하였다. TLC로 반응 진행을 모니터링한 이후에, 과량의 용매를 감압 하에서 제거하였다. 조합된 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 여과 및 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피에 의해서 정제함으로써 대응되는 에나미논 유도체들을 제조하였다.
( E ) - 2- Hydroxy -6-methyl-3-(3-( pyrrolidin -1- yl )- acryloyl )-4 H - pyran -4-one (3)
피롤리돈 (1.0 당량)을 사용하였다. 수율; 49%, Rf ; 0.31 (Hex/EA = 1/1), 1H NMR (300 MHz, CDCl3); δ 1.85-1.92 (m, 2H), 1.94-2.01 (m, 2H), 2.14 (s, 3H, CH3), 3.30 (t, 2H, J= 6.6 Hz), 3.71 (t, 2H, J= 6.6 Hz), 5.89 (s, 1H, Ar-H), 6.39 (d, 1H, J= 12.2 Hz, =CH-), 8.31 (d, 1H, J= 12.2 Hz, =CH-); 13C NMR (75 MHz, CDCl3); δ 19.99, 24.91, 24.99, 48.19, 53.67, 91.67, 94.86, 104.82, 153.51, 161.79, 165.26, 183.81, 184.64; HRMS (ESI); [M+H]+, calcd for C13H16NO4 (m/z); 250.1079, found; 250.1091
( E ) - 2- Hydroxy -6-methyl-3-(3-( piperidin -1- yl )- acryloyl )-4 H - pyran -4-one (4)
피페리딘 (1.0 당량)을 사용하였다. 수율: 54%, Rf = 0.45 (Hex/EA = 1/1), 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.63 (s, 6H), 2.14 (s, 3H, CH3), 3.44 (s, 2H), 3.62 (s, 2H), 5.90 (s, 1H, Ar-H), 6.58 (d, 1H, J= 12.3 Hz, =CH-), 8.14 (d, 1H, J= 12.3 Hz, =CH-), 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 19.99, 23.62, 25.41, 26.78, 47.18, 55.83, 89.63, 94.93, 104.79, 155.75, 157.67, 161.90, 165.27, 184.50 (C=O), 184.75 (C=O). HRMS (ESI): [M+H]+ , calcd for C14H18NO4 (m/z): 264.1235, found: 264.1250.
(E)- 2- Hydroxy -6-methyl-3-(3- morpholinoacryloyl )-4 H - pyran -4-one (5)
모르폴린 (1.0 당량)을 사용하고, 반응시간을 3시간으로 해주었다. 수율: 24%; Rf = 0.28 (Hex/EA = 1/1), 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.21 (s, 3H, CH3), 3.55 (t, 4H, J = 4.8 Hz, N-CH 2 -CH2-O-CH2-CH 2 -N), 3.80 (t, 4H, J = 4.8 Hz, N-CH2-CH 2 -O-CH 2 -CH2), 5.80 (s, 1H), 6.78 (d, 1H, J = 12.6 Hz, N-CH=CH), 8.00 (d, 1H, J = 12.6 Hz, N-CH=CH-); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.22, 46.31, 53.97, 65.82, 66.86, 91.88, 96.39, 104.35, 154.32, 162.48, 165.21, 184.34 (C=O) ,187.88 (C=O), HRMS (ESI): [M-H]- , calcd for C13H14NO5 (m/z): 264.0871, found: 264.0845.
에나미논 유도체들 (6- 7)의 합성을 위한 일반적 과정
에탄올 (15 mL) 중 화합물 2 (1.115 g, 5.00 mmol)의 용액에 적당한 아민 (5.00 mmol)을 첨가하였다. 과량의 아세트산 (2.5 mL)을 혼합 용액에 서서히 가해 주었다. 반응 혼합물을 환류 하에서 8 시간 동안 교반하였다. 고체를 침전, 여과하고, 차가운 에탄올로 세척하였다. 복수의 고체를 1H NMR 스펙트로스코피에 의해서 확인하였다.
(E)- 2- Hydroxy -6-methyl-3-(3-( phenylamino ) acryloyl )-4 H - pyran -4-one (6)
아닐린 (1.0 당량)을 사용하였다. 수율; 76%, Rf ; 0.75 (Hex/EA = 1/1), 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6); δ 2.18 (s, 3H, CH3), 6.02 (s, 1H), 7.09 - 7.13 (m, 2H), 7.27 - 7.30 (m, 2H), 7.36 - 7.41 (m, 2H), 8.55 (d, 1H, J = 10.1 Hz, -CH=CH-N), 11.13 (s, 1H, NH); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6); δ 19.65, 95.71, 96.45, 103.68, 116.63, 117.18, 124.23, 129.60, 129.74, 139.72, 148.52, 161.07, 166.21, 184.01, 186.92; HRMS (ESI); [M-H]-, calcd for C15H12NO4 (m/z); 270.0766, found; 270.0738.
(E)- 2- Hydroxy -6-methyl-3-(3-( pyridin -2- ylamino ) acryloyl )-4 H - pyran -4-one (7)
2-아미노피리딘 (1.0 당량)을 사용하였다. 수율; 18%, Rf ; 0.45 (Hex/EA = 1/1), 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6); δ 2.18 (s, 3H, CH 3), 6.09 (s, 1H), 6.98 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.11 (dd, 1H, J = 7.5 Hz, 5.1 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 13.2 Hz, -CH=CH-N), 7.78 (dt, 1H, J = 7.5 Hz & 1.8 Hz), 8.34 (dt, 1H, J = 5.1 Hz & 0.9 Hz), 9.00 (d, 1H, J = 13.2 Hz, -CH=CH-N), 11.38 (d, 1H, J = 12.6 Hz); 13C NMR(75 MHz, DMSO-d6); δ 20.20, 96.85, 98.38, 103.76, 112.53, 119.85, 139.47, 146.31, 148.99, 151.61, 161.41, 167.46, 184.34, 189.47; HRMS (ESI); [M-H]-, calcd for C14H11N2O4 (m/z); 271.0718, found; 271.0676.
후각 수용체 OR895의 클로닝 : 전장 OR895를 마우스 OE cDNA로부터 적당한 제한효소 부위들을 첨가한 프라이머들을 사용하여 증폭한 다음, olfr691 구조체 중의 대응되는 부위들 내로 접합시켰는 바, 상기 구조체는 pME18S 벡터 (Jennifer L. Pluznick로부터 기증 받음) 중에 N-말단 Lucy/Flag/Rho 태그들을 함유한다. Rho-olfr558 (MOR18-1) 및 Rho-OR51E1은 addgene (www.addgene.org)으로부터 구입하였다. 모든 구조체 플라스미들은 사용 전에 완전히 서열분석을 하였다.
이형 발현, 면역 형광, 및 웨스턴 블랏 : HEK293 세포들을 폴리-L-라이신이 코팅된 22-mm 커버슬립 상에 접종하고, 세포막 발현에 대한 공통된 효과들을 분석하기 위해서 보조 단백질들인 RTP1S, Ric8B, 및 Golf와 함께 OR 구조체를 형질감염시켰다. 요약하면, 임시로 형질감염된 세포들을 DPBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, 0.1% Triton X-100 및 4% 정상 말 혈청을 함유한 PBS 중의 마우스 단클론 항-Rhodopsin 항체 (1:1000, MABN15, Millipore)에, 4 ℃에서 1일 동안 노출시켰다. 결합된 일차 항체들을 검출하기 위해서, 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS 중에 희석된 Cy3-접합된 항-마우스 IgG (1:1000, Jackson Immuno-Research)를 실온, 암 조건에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 이후에, 커버슬립을 VECTASHIELD (Vector Laboratories)로 뒤집어서 슬라이드글라스 상에 탑재하였다. 영상을 공초점 레이저 스캐닝 생물학 현미경 LSM700 (Zeiss)을 사용하여 촬영하였다. 웨스턴 블랏 분석은 이전 보고에서 서술된 바와 같이 (N. Kang, Y.Y. Bahk, N. Lee, Y. Jae, Y.H. Cho, C.R. Ku, Y. Byun, E.J. Lee, M.S. Kim, J. Koo, Olfactory receptor Olfr544 responding to azelaic acid regulates glucagon secretion in alpha-cells of mouse pancreatic islets, Biochemical and Biophysical Research Communications, 460 (2015) 616-621; N. Kang, H. Kim, Y. Jae, N. Lee, C.R. Ku, F. Margolis, E.J. Lee, Y.Y. Bahk, M.S. Kim, J. Koo, Olfactory Marker Protein Expression Is an Indicator of Olfactory Receptor-Associated Events in Non-Olfactory Tissues, Plos One, 10 (2015)), 항-rho 항체 (1:5k)를 사용하여 수행하였다.
루시퍼라아제 분석: 루시퍼라아제 분석을 위해서는 Dual-Glo™ Luciferase Assay System (Promegam, Madison, WI)을 사용하였다. CRE-Luc (cAMP-responsive element firefly luciferase; Stratagene)을 사용하여 수용체 활성화를 측정하였다. 세포 생존도 및 형질감염 효율성에 대한 내부 대조군으로서 구성적으로 활성인 SV40 프로모터 (pRL-SV40; Promega)에 의해서 작동하는 Renilla 루시퍼라아제를 사용하였다. HEK293 세포들은 폴리-D-라이신-코팅된 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 각각의 96-웰 플레이트에 대해서, 1 ㎍의 CRE-Luc, 1 ㎍의 pRL-SV40, 총 2 ㎍의 모든 보조 단백질들 (RTP1S, Ric8B, 및 Golf) 및 5 ㎍의 OR 플라스미드 또는 pCI 빈 벡터를, Lipofectamine2000 (Invitrogen)을 사용하여 24 시간 동안 형질감염시켰다. 배지를 CD293 화학 조성 배지 (Invitrogen)로 대체하고, 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 CD293 중에 용해된 25 μl의 냄새 물질 용액으로 대체하고, 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 루시퍼라아제 및 Renilla 루시퍼라아제 활성을 측정하기 위한 프로토콜은 제조사에 의해서 서술된 바와 같이 수행하였다 (Promega). 파이어플라이 활성은 Renilla 루시퍼라아제의 대조군에 ㄷ대한 활성으로 정규화하였다. 발광도는 SpectraMax L 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 사용하여 측정하였다. 데이터는 Microsoft Excel 및 GraphPad Prism 4 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
Ca 2 + 영상화: 형질감염 24 시간 경과 후에, 세포들을 과용융 챔버 (superfusion chamber) 중 Ringer's 용액에 함유된 2 μM Fura-2/AM (Ca2 +-민감성 형광 염료, life technologies Carlsbad, CA, USA)과 함께 20분 동안 배양하였다. Ca2+ 염료 배양 이후에, 챔버를 역전 현미경 (NIKON ECLIPSE Ti)의 재물대 상에 위치시키고, 화학 효과 분석 이전에 Ringer's 용액 (115 mM NaCl, 2.5mM KCl, 1 mM CaCl2, 1.5 mM MgCl2, 4.5 mM HEPES, pH 7.4)으로 10 분 동안 세척하였다. Ringer's 용액은 연동 펌프 (peristaltic pump)로 튜브를 통과하여, 2 ml/min의 흐름 속도로 관류시켰다. 효능제 처리 이후에, 세포 생존도를 확인하기 위해서 300 μM ATP를 가해주었다. 세포내 Ca2 + 수준은 Fura-2 형광 비율 (340nm/380nm 여기, 510 nm에서 발광)로 측정하였다. 발광 형광은 Nikon S Fluor 20x 대물 렌즈를 통해서, CCD 카메라 (Andor Technology, Belfast, UK)를 사용하여 매 2초 마다 기록하였다. 형광 파일의 분석은 MetaFlour (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 개별적인 데이터들의 비교를 위해서 모든 유사색상 영상들은 분획 형광 변화 (fractional fluorescence change ΔF/F, Δ[Ca2+]i)로부터 변환하였는 바, 이는 세포내 칼슘 이온 농도 변화에 해당하는 것이며, 최대 유사색상 강도는 2.0 ± 0.1 AU (arbitrary linear units)로 제한되었다. 모든 유사색상 영상들은 4-7회의 독립적인 테스트들로부터 얻어진 대표 데이터들이다.
검토
본 발명에서는, 방광에서 발현되는 후각 수용체 895 (OR895)를 동정하고, 에나미논 (enaminone)을 함유하는 합성 리간드들의 효능제 활성을 스크리닝하였는 바, 에나미논은 뉴런 중 냄새-특이적 채널에 영향을 주는 화합물들에서 작용기로서 보고된 바 있는 물질이다 (T. Heinbockel, Z.J. Wang, P.L. Jackson-Ayotunde, Allosteric Modulation of GABAA Receptors by an Anilino Enaminone in an Olfactory Center of the Mouse Brain, Pharmaceuticals, 7 (2014) 1069-1090).
OR895는 Gene Altlas2 마이크로어레이 데이터를 사용하여 방광 중에서 동정하였으며, 생물정보학적 평가는 기존에 보고된 연구에서 서술된 바와 같다 (N. Kang, Y.Y. Bahk, N. Lee, Y. Jae, Y.H. Cho, C.R. Ku, Y. Byun, E.J. Lee, M.S. Kim, J. Koo, Olfactory receptor Olfr544 responding to azelaic acid regulates glucagon secretion in alpha-cells of mouse pancreatic islets, Biochemical and Biophysical Research Communications, 460 (2015) 616-621; N. Kang, H. Kim, Y. Jae, N. Lee, C.R. Ku, F. Margolis, E.J. Lee, Y.Y. Bahk, M.S. Kim, J. Koo, Olfactory Marker Protein Expression Is an Indicator of Olfactory Receptor-Associated Events in Non-Olfactory Tissues, Plos One, 10 (2015)).
본 발명에서는 OR895 및 세 가지 다른 ORs의 발현 수준을, 후각 신경구 (olfactory bulb, OB)를 대조군 조직으로서 사용하여, 방광 중에서 PCR 및 qPCR에 의해서 측정하였다 (도 1a 및 b). OR895의 발현 수준은 방광에서 다른 ORs에 비해서 높았으며, OB에서도 거의 동일하였다. 다음으로, OR895 발현에 대한 16 조직 검사를 통해서, 방광이 OR895를 독점적으로 발현하는 비-후각 조직이며, 후각 상피 및 구 (bulb)는 후각 수용체에 대한 양성 위치라는 사실을 확인하였다 (도 1c).
도 1a 내지 1c에는 방광에서, 이소성 냄새 물질 수용체인 Olfr895의 발현 프로파일을 도시하였다. 후각 수용체들 (ORs)이 방광에서 역할을 수행하는지 여부를 조사하기 위해서, GeneAtlas2 마이크로어레이를 ORs로서 재분석하였다. 도 1a를 참조하면, RT-PCR 분석에 의해서 4개의 ORs가 확인되었으며, 정제된 마이크로어레이에 의해서 상위 25개의 ORs 중 서열분석이 선택되었다. 도 1b를 참조하면, 분리된 4개 ORs의 mRNA를 방광 (BL) 및 후각구 (OB) 중에서 대조군 후각 조직들로서 qPCR에 의해서 정량하였다. 수치들은 mRNA ± SEM의 평균 fM으로서 표시하였으며, OB 및 BL 중 OR mRNA는 Olfr544 플라스미드 표준을 참조하여 정량하고, eEF-2 RNA에 정규화하였다. 방광 중 Olfr895의 발현은 OB와 거의 동일하였다. 도 1c에는, 다양한 조직들에서 (HT, 심장; DD, 십이지장; TR, 갑상선; LG, 폐; TT, 정소; SP, 비장; TM, 흉선; LV, 간; KD, 신장; PC, 췌장; ST, 위; SM, 평활근; AD, 지방 조직; M, DNA 사다리 마커) 대조군 조직들 (OB 및 OE, 후각 상피)로 Olfr895를 발현시킨 결과를 도시하였다. Olfr895는 비-후각 조직의 방광 및 정소에서 독점적으로 발현되었다.
또한, 정소 역시 OR-발현 양성형 조직인데, 이는 기존 문헌들에서도 보고된 바와 같이, 많은 ORs가 정소에서 발현되기 때문이다 (N. Kang, J. Koo, Olfactory receptors in non-chemosensory tissues, BMB reports, 45 (2012) 612-622; C. Flegel, S. Manteniotis, S. Osthold, H. Hatt, G. Gisselmann, Expression profile of ectopic olfactory receptors determined by deep sequencing, PloS one, 8 (2013) e55368).
N-말단 rho-태깅된 OR895를 포유류 발현 벡터 중에서 클로닝하였으며, HEK293 세포들 중에서 보조 단백질들과 함께 잠정적으로 형질감염시켰다. 세포막 발현은, 항-Rho 항체를 사용하여 비-투과성 면역형광 염색 (도 2a) 및 웨스턴 블랏 (도 2b)에 의해서 확인하였다. 항-Rho 항체는 막 투과 없이 OR895의 rho 태깅된 N-말단 도메인에 결합할 수 있는데, 이는 OR이 N-말단 측이 세포막의 세포외부 쪽에 노출된 7 막투과 (TM) 수용체이기 때문이다. OR895-발현된 세포들은 세포막에서 강하고, 불균일한 반점형 발현 패턴을 보여주었다. 또한, 대조군에 비해서 OR895의 뚜렷한 단백질 발현이 검출되었다 (도 2b).
도 2a 및 2b에는 Olfr895의 이형 발현을 도시하였다. 도 2a를 참조하면, 구조체는 pCI 벡터 중에 Rho-태깅된 olfr895를 포함하도록 디자인되었다. Olfr895의 세포막 발현은 잠정적으로 형질감염된 HEK293 세포들 중 Rho 항체에 의해서 확인하였다. 도 2b를 참조하면, Olfr895 발현은 웨스턴 블랏 분석에 의해서 항-rho 항체들의 존재에 의해서도 확인하였다.
OR895에 대한 활성화제로서 에나미논-함유 리간드들을 디자인하였으며, 이를 하기 합성개요 1에 도시된 바와 같이 합성하였다.
<합성 개요 1>
데하이드로아세트산을 구조적 변형을 위한 기본 골격으로서 사용하였다. 4H-pyran-4-one 골격을 함유하는 에나미논 유도체들 (3-7)의 합성은 상업적으로 구입가능한 데하이드로아세트산으로부터 2 단계에 걸쳐서 수행되었다. 데하이드로아세트산과 N,N-디메틸포름아미드 디메틸아세탈 (DMF-DMA)을 DMF 중에서 반응시키고, 산성 조건 하에서 아민-교환 반응을 수행함으로써 최종 화합물들 (3-7)을 우수한 수율로 제조하였다. 합성 에나미논 유도체들인 화합물 2-7에 의한 OR895의 효과적인 활성화를 아세토페논 및 데하이드로아세트산과 같은 기존에 공지된 OR 리간드들과 비교 평가하였는 바, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 이들은 각각 OR895를 164 μM 및 258 μM의 EC50 수치로 활성화한다.
화합물 EC 50 (mM )
데하이드로아세트산 258
2 12.3
3 0.09
4 0.009
5 0.68
6 0.39
7 6.48
아세토페논 164
피롤리딘 및 피페리딘과 같은 사이클릭 아민들로 치환된 새로이 합성된 피론 유도체들은 OR895에 대해서 강한 효능제 활성을 나타내었는 바, 그 EC50 수치들은 9 내지 90 nM이었다. 특히, 피페리딘 고리를 갖는 화합물 4는 예상치 못한 효능을 나타내었는 바, 그 EC50은 14 nM이었다.
화합물 4의 활성은, Ca2 + 영상화 기술에 의해서 화합물 4와 OR895와의 상호작용을 평가함으로써 확인하였는 바, 이는 OR895에 대한 화합물 4의 EC50이 다른 화합물들에 비해서 예기치 못하게 더 낮았기 때문이다. 화합물 4 및 아세토페논 (0 nM, 1 nM, 10 nM, 1 mM, 200 mM, 및 1 mM)을 처리함으로써 OR895 형질감염된 세포들에서의 Fura 2 AM 비율 척도 칼슘 영상화에 의해서 Ca2 + 유입을 측정하였다. 저농도로 화합물 4를 처리하는 경우, 1 nM 및 10 nM에서 세포내 Ca2 + 증가가 유도된 반면 (도 3a), 아세토페논의 경우 200 μM 및 1 mM (도 3b)에서 유도된 바, 이는 화합물 4가 OR895에 대한 강력한 활성화제라는 것을 의미한다.
도 3은 화합물 4가 Olfr895로 형질감염된 포유류 세포들 내로 칼슘 활성화를 유도하는 것을 도시한 도면이다 (왼쪽 패널). 대조군으로서, 동일한 농도의 아세토페논을 Olfr895로 형질감염된 포유류 세포들에 가해주었다 (오른쪽 패널). 각각의 영상들을 Fura2-AM 비율 척도 칼슘 영상화에 의해서 분석하였으며, 그 결과, 세포들이 효능제에 노출된 (20초) 이후에 세포내 칼슘 이동성 변화가 관찰되었다. Olfr895 형질감염된 세포들은 낮은 농도 조건 (1 nM 및 10 nM)에서도 화합물 4에 의해서 활성화된 반면, 아세토페논에 의해서는 높은 농도 (200 μM 및 1 mM)에서 활성화되었다. 대표 도면들은 4-7회의 독립적인 반복 실험의 결과이다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 3 내지 7로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물:
    <화학식 3>

    <화학식 4>

    <화학식 5>

    <화학식 6>

    <화학식 7>
    .
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 비-후각 조직 중 후각 수용체는 후각 수용체 895인 것을 특징으로 하는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물.
  4. 유기 용매 중 하기 화학식 8의 화합물 용액에 디메틸포름아미드-디메틸아세탈 (dimethylformamide-dimethylacetal, DMF-DMA)을 첨가해 줌으로써 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계를 포함하고,
    알코올 중 하기 화학식 2의 화합물 및 아민 용액에 아세트산을 첨가해 줌으로써 하기 화학식 9의 화합물을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물의 제조방법:
    <화학식 8>

    <화학식 2>

    <화학식 9>

    상기 <화학식 9>에서, R은 피롤리디닐, 피페리닐, 모르폴리닐, 아닐리닐 또는 2-아미노피리디닐기이다.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유기 용매는 p-자일렌인 것을 특징으로 하는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제4항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 비-후각 조직 중 후각 수용체에 대한 효능제 화합물의 제조방법.
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WO2006003094A2 (en) * 2004-06-29 2006-01-12 Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. Merocyanine derivatives
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