KR102612105B1 - 아세토박터 파스테우리아누스 a26 초산균 및 이의 용도 - Google Patents

아세토박터 파스테우리아누스 a26 초산균 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아세토박터 파스테우리아누스 A26 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 균주는 항균, 항고혈압, 항당뇨, 면역증진 및 피부미백 효과가 있다. 또한, 상기 균주 및 이의 배양액 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균용, 혈압 조절용, 혈당 조절용, 면역 증진용 및 피부 미백용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균 및 이의 용도{Acetobacter pasteurianus A26, and uses thereof}
본 발명은 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A26 초산균 및 이의 용도에 관한 것이다.
식초는 동서양을 막론하고 오랜 옛날부터 제조, 이용되어온 발효식품의 하나이며, 일상생활에서 쉽게 사용되는 신맛을 가지는 대표적인 조미료이다. 식초는 효모에 의해 당류 등의 원료를 알코올 발효한 후, 초산균으로 초산 발효시킨 전통 발효식품이다. 효모와 초산균은 신맛을 내는 초산 성분을 비롯하여 각종 휘발성 및 비휘발성 물질인 당, 유기산, 아미노산, 고급 알코올, 에테르 등 각종 영양물질을 생산한다. 일반적으로 식초는 식욕을 자극하는 향과 맛을 가져 음식물의 맛을 좋게 할 뿐 아니라 짠맛을 덜어주고 지방을 중화시켜 주는 작용을 한다. 또한 식초는 예로부터 가정에서 산미 조미료이자 식품을 저장하기 위한 방부제뿐만 아니라 살균제 및 치료제로도 널리 사용되고 있다.
식초는 질병 치료에도 효과적으로 사용되었다. 치통을 앓을 때 표주박 잎과 식초를 사용해 벌레를 잡았다는 조선시대 「묵재일기(1546, 이문건)」의 충치 치료에 대한 특이한 기록을 비롯해 식초의 따뜻한 성질을 이용해 종기와 종양 치료와 과다출혈과 어지럼증을 치료했다고 하는 「향약구급방(1236, 미상)」의 치료제와 「동의보감(1610, 허준)」의 식초의 약리적 특성에 관한 보고가 있다.(Korean J Food Culture, 25, 680-707 (2010)) 서양에서는 의학자 히포크라테스가 식초의 살균효과를 이용해 상처 치료제로 사용했고, 이집트 여왕 클레오파트라는 건강과 피부미용을 위해 식초를 즐겨 마셨다고 한다.
최근에는 생체 조직 내에서 쉽게 분해되어 피를 맑게 하고 열량을 빠르게 발생시켜 피로 해소에 효과가 크며 동맥경화, 고혈압 등의 성인병 예방효과, 식중독균의 살균효과 등 기능성 식품으로 인정되고 있다. 식초에 함유된 유기산과 아미노산 등은 질병에 대한 면역력을 높여 주고 위에서 흡수되어 산성 체질을 개선하는 효과가 있어 다양한 용도로의 개발이 진행되고 있다. 식초가 체액의 균형을 유지해 주고 각종 질병에 대한 면역력을 높이는 성질이 있는 것은 식초의 미생물을 이용한 발효과정을 통한 화학적 변화로 함유하게 되는 생리활성 물질들 때문이다.
초산균은 당류와 알코올을 산화시켜 알데히드, 케톤, 및 유기산 같은 대사산물을 주변 매질로 방출하므로 식초산업뿐만 아니라 생명공학 기술에 이용되고 있다. 초산균은 다른 미생물보다 적은 바이오매스를 이용해 많은 양의 초산을 생산하기 때문에 곡류식초 및 과일식초, 글루콘산 생산, 바이오 에너지 개발에 널리 사용되는 주요한 산업 미생물이다. 특히, 식초 제조에 있어서 가장 중요한 맛과 향은 발효 미생물인 초산균에 의해서 좌우된다. 이러한 초산균은 Acetobacteraceae family에 속하며, 현재까지 Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter 등의 19속(genus)이 보고되었다. Acetobacter 속은 알코올과 초산 내성이 강하여 산업적으로 가장 많이 사용하는 초산균이며, 식약처의 식초 생산용 GRAS(generally recognized as safe) 균주로 Acetobacter aceti, A. pasteurianus, Glu. oxydans, Glu. europaeus가 식품에 제한적으로 사용할 수가 있다(식품의 기준 및 규격, 제2021-69호, 2021.8.9).
최근, 품질이 우수한 발효식초에 대한 소비자의 관심이 높아지면서 식초 제조용 초산균 관련 연구가 관심을 받고 있다. 그러나 현재 보고된 대부분의 연구는 초산균을 이용한 식초 제조와 품질 특성 규명으로서 초산균의 균학적 특성과 생리활성에 관한 보고는 거의 없는 실정이다. 따라서, 본 발명자들은 식초로부터 우수한 초산균을 분리·동정하고 항균, 혈압조절, 혈당조절, 면역증진, 항산화 및 피부미백 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. 한국등록특허 10-2376622 2. 한국등록특허 10-2365420
1. Korean J Food Culture, 25, 680-707 (2010). 2. 식품의 기준 및 규격, 제 2021-69호, 2021.8.9.
본 발명의 목적은 항균, 혈압조절, 혈당조절, 면역증진, 항산화 및 피부미백 효과를 가지는 우수한 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KACC 92205P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A26 초산균을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균용, 혈압 조절용, 혈당 조절용, 면역 증진용, 항산화용 및 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균은 산을 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 항균, ACE(Angiotensin converting enzyme) 저해, 혈전 용해, α-글루코시다아제 저해, NF-κB 전사인자 활성, 사이토카인(cytokine) 생성, DPPH 또는 ABTS 라디칼 소거능 및 타이로시나아제(Tyrosinase) 저해 효과가 있다.
또한 본 발명은 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균 및 이의 배양액 또는 이들의 추출물은 항균용, 혈압 조절용, 혈당 조절용, 면역 증진용, 항산화용 및 피부 미백용 건강기능식품 조성물으로 사용될 수 있다.
도 1은 아세토박터(Acetobacteraceae) 과에 속하는 아세토박터(Acetobacter) 종 및 기타 구성원의 계통도이다.
도 2는 6주 초산균을 30℃에서 12일 동안 배양하면서 3일 간격으로 알코올 소비능을 계산한 결과이다.
도 3은 6주 초산균 배양액으로부터 얻은 상등액의 ACE 저해 결과이다.
도 4는 양성 대조군으로 사용한 플라스민을 농도 별로 표준 곡선을 작성하고, 6주 초산균의 혈전 용해능을 생성한 플라스민의 투명 환 대비(%)로 환산 것이다.
도 5는 6주 초산균의 α-글루코시다아제 저해 효과의 결과이다.
도 6는 RAW-BlueTM 대식세포에 6주 초산균의 배양액 농도를 각각 25, 50, 100 CFU/macrophage로 처리한 결과이다.
도 7는 6주 초산균의 NF-κB 활성을 양성대조군으로 LPS의 활성 대비 값으로 나타낸 결과이다.
도 8은 6주 초산균의 NO 생성량을 양성 대조군 LPS의 NO의 생성량에 대비 값으로 나타낸 결과이다.
도 9a는 6주 초산균의 TNF-α 생성량을 양성 대조군 LPS의 TNF-α 생성량에 대비 값으로 나타낸 결과이다.
도 9b는 6주 초산균의 IL-1ß 생성량을 양성 대조군 LPS의 IL-1ß 생성량에 대비 값으로 나타낸 결과이다.
도 9c는 6주 초산균의 IL-6의 생성량을 양성 대조군 LPS의 IL-6 생성량에 대비 값으로 나타낸 결과이다.
도 10a는 6주 초산균의 DPPH 라디칼 소거능을 조사한 결과이다.
도 10b는 6주 초산균의 ABTS 라디칼 소거능을 조사한 결과이다.
도 11은 6주 초산균의 타이로시나아제 저해 효과를 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KACC 92205P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스 (Acetobacter pasteurianus) A26 균주를 제공한다. 본 발명자는 상기 균주를 분리 동정하여 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 2017년 10월 23일자로 기탁하여 2017년 10월 30일에 수탁번호 KACC 92205P를 부여받았다.
상기 균주는 보리식초로부터 분리된 것이다. 본 발명의 균주를 분리 및 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용하였다. 또한, 본 발명에 사용한 초산균 배지는 2종류로서 분리는 고체배지를, 배양용은 액체배지를 사용하였다. 고체배지는 초산균을 분리 및 정성적인 산 생성능을 조사하기 위한 배지로서 yeast extract 0.5%, glucose 3%, CaCO3 1%, agar 2%, EtOH 5%을, 액체배지는 초산균 배양용 배지 및 정량적인 산 생성능과 활성화를 위해 yeast extract 0.5%, glucose 0.5%, glycerine 1%, MgSO4·7H2O 0.02%, EtOH 4%, acetic acid 2%를 첨가하여 각각의 목적에 맞게 사용하였다.
상기 균주는 산 생성능이 우수하다. 탄산칼슘의 함유로 불투명한 색상을 나타내던 고체배지는 초산(acetic acid)을 생성하는 상기 균주에 의해 탄산칼슘이 분해되면서 투명 환이 발생한다. 이때, 투명 환의 크기는 디지털 캘리퍼스로 지름을 측정하고, 상기 균주를 분리하였다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주 투명 환은 24 mm 정도였고, 대조군으로 사용한 Acetobacter pasteurianus CV3(KACC 17058) 투명 환의 크기는 18.2 mm였다(표 1).
상기 균주는 서열번호 1의 16S rDNA 서열인 것이다. 16S rDNA 서열은 PCR 방법을 이용하여 증폭한 뒤 ㈜제노셀에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 또한, 상기 16S rDNA 유전자 염기서열로 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 동정을 하였다. 그 결과, 아세토박터(Acetobacteraceae) 과에 속하는 아세토박터(Acetobacter) 종 및 기타 구성원의 계통도는 도 1에 나타내었다.
아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균의 알코올 분해능을 확인하였다. 초산균은 알코올과 같은 탄소원을 세포막에 있는 alcohol dehydrogenase(ADH)와 acetaldehyde dehydrogenase(ALDH)를 통해 초산을 포함한 여러 대사물질을 만들어 세포 밖으로 방출하여 배양 배지에 축적한다. 산성화된 주변 환경은 초산균에 스트레스이고 세포 내 항상성을 유지하기 위해 많은 에너지가 사용되기 때문에 초기 생육은 제한적이다. 점점 산에 내성이 생기면 초산 생산성의 전환율(Ethanol에서 Acetic acid로 전환)이 커지면서 초산의 생물 전환 효과는 증가하게 된다. 그러므로 초산균의 알코올 소비능은 초산균의 고산도 식초를 만드는 균주 선발에 중요한 지표라 생각한다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26(GY-A26)은 배양 12일에 알코올 소비능이 최대 96%로 산도는 4.9%, pH 3.6을 나타내었다(도 2 및 표 3).
본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항균용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 항균은 세레우스균(Bacillus cereus), 황색포도상 구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)에 대해 항균 효과를 가지는 것이다. 다만, 이에 한정하는 것은 아니다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주의 항균 효과는 유해 세균인 그람 양성(세레우스균과 황색포도상 구균)과 그람 음성(대장균과 쥐티푸스균) 세균에 대해 고체배지에서 한천(Agar) 확산법으로 측정하였다. 양성 대조군으로는 주요 유기산인 초산을 농도별로 비교하였다. 유기산은 방부제로 식품 안전용으로 많이 사용되고 FDA에서 일반적으로 안전한 물질(GRAS)로 인정되고 있으며, 유럽 연합 집행위원회와 FAO/WHO 식품 첨가물로 승인된 대사산물이다. 다양한 유형의 병원성 세균에 대한 유기산의 항균 효과는 타르타르산, 구연산, 젖산, 말산, 프로피온산 및 초산이며 그 중, 초산은 살모넬라 또는 대장균과 같은 세균의 오염을 제거하고 저장 기간을 연장하기 위해 가금류, 쇠고기 및 돼지고기를 포함한 육류의 대표적인 항균제로 쓰이고 있다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주는 그람양성 세균인 세레우스균과 황색포도상 구균 및 그람음성인 대장균과 쥐티푸스균에 대해 대부분 항균 효과를 나타내었다(표 4).
본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항고혈압용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 항고혈압은 ACE(Angiotensin converting enzyme) 저해 효과에 의한 것이다. 고혈압이 발생하는 작용에서 레닌 안지오텐신계(renin-angiotensin system) 는 혈압조절이 매우 중요한 역할을 한다. Angiotensin I converting enzyme (ACE)은 angiotensin I에서 angiotensin II를 합성하는 마지막 단계에 관여하는 효소이다. Angiotensin II는 A-II 수용체와 결합하여 동맥과 소동맥을 수축시키고 부신피질을 흥분시켜 알도스테론의 유리를 촉진해 결과적으로 혈압의 증가를 가져온다. 따라서 ACE 저해물질은 ACE의 활성을 억제함으로써 고혈압을 직접적으로 억제할 수 있다. ACE 저해 작용을 하는 대표적인 약물로는 captopril이 알려져 있어, 양성 대조군으로 사용하였다. 현재, 시판되는 항고혈압제인 captopril 0.1%는 138%, 0.01%는 78%의 ACE 저해 효과를 보였다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주는 64.8%로 양성 대조군인 captopril(0.01%)보다 조금 낮은 ACE 저해 효과를 보였다(도 3).
또한, 상기 항고혈압은 혈전 용해 효과에 의한 것이다. 일반적으로 지혈 과정에서 피브리노겐이 피브린으로 전환되어 혈전이 형성된다. 그러나 손상된 혈관이 회복되면서 혈전은 떨어져 나오고 플라스민에 의해 혈관의 흐름이 정상적으로 유지될 수 있기 때문에 이러한 혈전 용해 효과는 혈압을 정상적으로 유지하는 것과 관련이 있다. 따라서, 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 혈전 용해 효과를 피브린 평판에서 투명 환의 크기로 조사하였다. 플라스민 0.5 U(15 mm) 대비 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 혈전용해능은 80.0%(12 mm)의 효과를 나타내었다(도 4).
본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항당뇨용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 항당뇨는 α-글루코시다아제 저해 효과에 의한 것이다. α-글루코시다아제는 α-아밀라아제에 의해 이당류를 최종적으로 단당류로 분해하여 소장의 융모로 흡수되어 혈관으로 이동되기 때문에 이러한 효소의 활성 저해는 당질 가수분해와 흡수과정을 지연시킴으로 식후 혈당이 급격히 상승하는 것을 억제할 수 있다. α-글루코시다아제 저해제는 당뇨와 같은 당질 관련 질병을 위한 치료제 개발에 유용하다고 알려져 있다. 항당뇨 활성은 α-글루코시다아제 활성 저해 측정법으로 분석하였다. 양성 대조군으로 사용된 12.5 mg/mL acetic acid(AA 12.5)는 120.6%의 α-글루코시다아제 저해 효과를 보였고, 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주는 100% 이상의 α-글루코시다아제 저해 효과를 보였다(도 5).
본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
Tetrazolium-based colorimetric (MTT) assay를 통해 6주 초산균의 면역 활성을 보기 위한 대식세포 증식에 미치는 영향을 알아보았다. 살아 있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소 효소 작용으로 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium이 짙은 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan 결정으로 환원되는 정도를 측정하는 방법으로 이 파장(540 nm)에서 측정된 흡광도는 살아 있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주를 처리한 모든 농도에 대해서 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 것으로 나타났으며 대식세포가 활성화되어 세포 증식률이 증가하는 결과를 확인하였다(도 6).
상기 면역 증진은 NF-κB 전사인자 활성에 의한 것이다. NF-κB (nuclear factor-kappa B)는 cytokines와 lipopolysaccharide (LPS)와 같은 toll like receptor ligands를 포함한 다양한 자극인자에 대한 면역 반응에 관여하는 유전자들의 전사인자들을 활성화하는 중요한 인자이다. 대식세포 RAW-BlueTM는 NF-κB/AP-1 reporter cell line으로 mouse RAW 264.7 macrophages에서 유래된 세포로 NF-κB/AP-1 inducible SEAP reporter 유전자를 가지고 있어 면역 반응으로 자극되면 활성화 되어 지시약(Quanti blue)에 의해 분홍색이 파란색으로 변화하는 것을 통해 활성화 여부를 판단할 수 있다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주는 처리 농도 의존적 경향으로 NF-κB 활성을 증진했다. 특히 음성 대조군에 비하여 7-8배 활성을 나타내었다. 결과적으로 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주는 NF-κB/AP-1의 전사인자 활성을 높여 면역 증진 효과를 내는 것을 확인하였다(도 7).
6주 초산균의 면역 증진 효과를 알아보기 위해 Nitric oxide (NO) 생성량을 측정하였다. 정상적인 생체 내에서는 항산화 효소와 항산화 물질이 존재하여 보호 작용을 한다. 그러나 물리적, 화학적 영향으로 이상이 발생하면 활성산소가 생성되어 방어체계로 산화적 스트레스를 나타낸다. 이와 같은 기전으로 독성 물질 혹은 유해 물질 노출로 발생한 NO는 염증 반응의 indicator로서 혈액 응고 및 혈압조절 기능, 암세포에 대한 면역 기능 등에 중요한 역할을 한다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26(GY-A26)는 처리 균체 농도 의존적으로 NO 생성능을 나타내어 음성 대조군(control, medium)에 비해 2-4배의 효과를 나타냈다(도 8).
또한, 상기 면역 증진은 Cytokine 생성에 의한 것이다. Toll-like receptor (TLR)에 반응하는 물질(LPS 혹은 천연물)은 대식세포를 활성화하여 T세포와 B세포의 증식, 식균 작용을 위한 대식세포의 활성, 미생물 감염에 대한 방어 등의 2차 면역 반응을 조절할 수 있는 TNF-α와 IL-1ß, IL-6 등과 같은 사이토카인을 생산한다. TNF-α는 림프구에 의해 생산되는 염증 매개성 사이토카인으로 생체 면역 반응에서 단독적 혹은 IL-1 등과 같은 사이토카인과 복합적으로 작용하여 종양의 혈관을 훼손해 결과적으로 종양 괴사를 유발하거나, 미생물에 의한 감염 저항성을 향상하게 시킨다. IL-6는 감염과 조직손상에 따른 면역 초기반응에서 생성되는 주요한 반응 매개 물질로 TNF-α 등에 의해 유전자 발현이 자극되어 단핵세포, 대식세포, 간질세포 등에 의해 생성되어 급증 염증 반응을 촉진하거나 억제하는 역할을 한다. 또한 IL-1ß는 활성형인 caspase-1로 단백질 가수분해를 통해 프로단백질(proprotein)로써 활성화된 대식세포에 의해 생성되며 염증 반응의 매개체와 세포 증식, 분화, 자멸사를 포함한 다양한 세포 활성에 중요한 역할을 한다. 따라서, 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주의 면역 증진 효과를 알아보기 위해, Cytokine인 TNF-α와 IL-1ß, IL-6의 생성량 측정하였다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주는 대식세포를 자극하여 TNF-α 생산을 유도하면서 음성 대조군에 비해 7배의 활성을 보였다(도 9a). 상기 균주는 음성 대조군에 비해 농도 의존적으로 높은 IL-6 생성량을 보였다(도 9c).
본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
항산화제는 세포의 산화 스트레스를 감소시키고 인간의 질병을 치료하는 데 효과적인 물질로 알려져 있다. DPPH 라디칼(보라색)은 전자공여체인 항산화제와 만나면 전자를 얻어 환원(노란색/무색)이 되며 환원된 정도가 클수록 측정 흡광도 값은 작아지고 상대적으로 전자 공여능은 높아진다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주의 DPPH 라디칼 소거능은 대조군(A. pasteurianus CV3, 6.3%)보다 높은 항산화 활성을 나타내었다(도 10a).
ABTS 라디칼 소거능은 ABTS와 potassium persulfate 반응으로 ABTS 라디칼(청록색) 생성이 시료의 첨가 때문에 연한 녹색으로 decolorization되는 항산화능을 측정할 수 있다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주의 ABTS 라디칼 소거능은 대조군(11.31%)보다 높은 항산화의 활성을 나타내었다(도 10b).
본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 피부 미백은 타이로시나아제 저해 효과에 의한 것이다. 현대인의 각종 스트레스와 산화된 식품의 섭취로 인한 산화한 세포 대사에서 발생하는 reactive oxygen species(ROS)는 세포벽, 지질 막, 미토콘드리아 및 DNA와 같은 세포 구성 요소에 손상을 일으키며 인간의 노화 및 만성질환을 유발한다. 또한 피부는 자외선의 영향을 받기 쉬운 기관으로 멜라닌 증식으로 인한 피부노화가 쉽게 진행된다. 멜라닌 생성이 과도할 경우 기미, 주근깨, 검버섯, 피부노화 및 피부암 유발 등의 문제가 야기된다. 그러므로 많은 미량 영양소와 천연 페놀 화합물은 항산화 가능성이 있으며 피부가 UV 방사선에 노출될 때 자유 라디칼 생성을 줄이는 경향이 있다. 따라서 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소, 타이로시나아제, 이 효소의 억제제는 피부노화 치료에 잠재적인 미용 성분이 될 수 있고, 이에 따라 피부 탄력 회복, 수분 함량 증가, 콜라겐 합성 촉진 및 피부 미백 효과가 나타날 수 있다. 타이로시나아제 억제제는 효소 부위와 수소 결합을 형성하여 효소 활성을 낮추는 데 사용할 수 있는 페놀성 화합물에 있는 하이드록실기(hydrogen bond)의 수에 따라 달라질 수 있다. 타이로시나아제 억제는 이 효소가 색소 침착의 속도 제한 단계를 촉매하기 때문에 피부 미백제를 찾기 위한 가장 일반적인 접근 방식이다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주의 피부미백 효과를 알아보기 위하여 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주의 상등액을 tyrosinase inhibitor screening assay kit를 사용하여 타이로시나아제 저해 효과를 측정하였다. 타이로시나아제 저해제인 양성 대조군 0.75 mM kojic acid의 저해율 82.7%보다 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주의 타이로시나아제 저해율은 99-100%로 우수하였다(도 11).
바이오제닉 아민(BAs)은 아미노산의 탈탄산반응(decarboxylation) 또는 알데히드나 케톤의 아미노기 전이(transamination)를 통해 생성되며 화학구조를 바탕으로 지방족 바이오제닉 아민(aliphatic BAs)은 putrescine, putrescine, cadaverine, spermine, spermidine와 방향족 바이오제닉 아민(aromatic amine) 은 tyramine, phenylethylamine와 헤테로 고리모양 바이오제닉 아민(heterocyclic BAs) 은 histamine, tryptamine으로 알려져 있다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26 초산균을 대상으로 독소 물질인 바이오제닉 아민 생성 유무를 조사한 결과 바이오 제닉 아민을 생성 하지 않는 것을 확인할 수 있었고, 이것으로 안전성을 확립하였다(표 5).
상기 건강기능식품 조성물은 경구 및 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 당업계에서 사용 가능한 어떠한 제형으로도 사용될 수 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료 등으로 제형화될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물을 제조하는 과정에서 첨가되는 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 전체 중량의 0.001중량% 내지 100중량%로 포함할 수 있으며, 또한 100 mL를 기준으로 0.001g 내지 10g의 비율로 포함할 수 있으나, 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효 성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실험 예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실험 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험 예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 분리 및 산 생성능
식초로부터 초산균 분리용 YGC 고체배지(yeast extract 0.5%, glucose 3.0%, CaCO3 1.0%, agar 2.0%, ethanol %, w/v)에 100-200 uL를 spread plating하고 이를 30℃에서 2-3일간 배양하였다. 탄산칼슘의 함유로 불투명한 색상을 나타내던 고체배지는 초산(acetic acid)을 생성하는 초산균에 의해 탄산칼슘이 분해되면서 투명 환이 발생한다. 이때, 투명 환의 크기는 디지털 캘리퍼스로 지름을 측정하고, 초산균을 분리하였다.
탄산칼슘(CaCO3, 1.0%, v/v)이 첨가된 고체배지에서 분리 초산균이 분비한 산에 의해 투명 환(clear zone)을 크게 형성하는 6주를 선별하였다(표 1). 디지털 캘리퍼스로 측정한 결과, SR-A24와 JS-B7 초산균 투명 환이 30 mm 이상으로 산 생성능이 가장 우수하였고, GHUR-A11-2와 아세토박터 파스테우리아누스 A26(GY-A26)은 20 mm 이상, GHF-A37과 JS-C1은 20 mm 미만으로 나타났다. 분리한 6주의 초산균은 대조군으로 사용한 Acetobacter pasteurianus CV3(KACC 17058) 투명 환(18.2 mm)보다 초산 생성능이 뛰어났다.
아세토박터 종 투명 환 (mm)
GHUR-A11-2 23.5±0.2d2)
SR-A24 30.5±0.1b
GY-A26 24.1±0.1c
GHF-A37 19.1±0.2e
JS-B7 34.5±0.2a
JS-C1 18.5±0.1f
CV3(KACC 17058) 18.2±0.1g
1) 평균값±S.D. (n=3)
2) 같은 열에 문자는 투명 환 평균 값의 ducan의 다중 범위 검정에 의해 유의 차이 있음을 나타냅니다(p<0.001).
<실험예 2> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 동정
초산균의 동정은 16S rDNA 유전자 염기서열로 분석하였다. 프라이머는 universal PCR primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였고, PCR는 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다. PCR 산물의 염기서열은 ㈜제노셀에 의뢰하여 염기서열을 분석하였고, Phylogenetic tree는 The National Center for Biotechnology Information(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced Blast Search 프로그램을 통하여 GenBank에 보고된 표준 균주와의 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석한 후, MEGA V6.0을 이용하여 Tamura-Nei distance model과 neighborjoining method에 의해 계통도를 작성하였다.
하기 표 2는 초산균의 NCBI blast (basic local alignment search tool)에 의한 염기서열 분석 결과이다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26(GY-A26)는 A. pasteurianus와 높은 상동성을 나타냈으며 type strain인 A. pasteurianus LMG 1262와 16S rDNA 유전자 염기서열이 99.7% 일치하였다. 도 1은 아세토박터(Acetobacteraceae) 과에 속하는 아세토박터(Acetobacter) 종 및 기타 구성원의 계통도를 나타내었다.
초산균 종류 크기 (bp) 상동성이 가장 높은 생물 유사도(%)
GHUR-A11-2 1,304 A. pasteurianus 99.85
SR-A24 1,319 A. pasteurianus 99.78
GY-A26 1,305 A. pasteurianus 99.70
GHF-A37 1,305 A. pasteurianus 99.85
JS-B7 1,318 A. pasteurianus 99.85
JS-C1 1,341 A. pasteurianus 99.85
<실험예 3> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 알코올 분해능
초산균의 알코올 분해능을 조사하기 위해, ethanol assay kit (K-ETOH, Megazyme Co., Wicklow, Ireland)의 방법에 따라 흡광도(BioTek®, Gen5TM, Winooski, VT, USA) 340 nm에서 잔존한 알코올을 산출하였다. 기질인 알코올로부터 만들어지는 초산은 2가지 효소(alcohol dehydrogenase와 aldehyde dehydrogenase)의 작용으로 생성되기에 알코올 분해능은 두 단계로 분석된다. 처음에는 alcohol dehydrogenase (ADH) 촉매로 NAD+에 의해 에탄올이 acetaldehyde 산화되는 단계 I(A1)과 aldehyde dehydrogenase (Al-DH)와 NAD+ 존재에서 acetaldehyde가 acetic acid 산화되는 단계 II(A2)를 통해 NADH의 소멸 계수로 잔존 알코올을 측정하게 된다. 이는 두 단계에서 측정된 340 nm 흡광도(BioTek®, Gen5TM, Winooski, VT, USA)의 차이(A2-A1)로 결정된다.
각 초산균의 알코올 분해(%)는 아래의 식에 따라 계산하였다.
알코올 분해(%) = 100-[(A2-A1) 의 샘플/(A2-A1) 의 대조군 x100]
6주 초산균을 초기 pH 4로 조정한 액체배지(yeast extract 0.5%, glucose 0.5%, glycerin 1%, MgSO4·7H2O 0.02%, acetic acid 1%)에 4% 알코올을 첨가하여 30℃에서 12일 동안 배양하면서 3일 간격으로 알코올 소비능을 계산하였다(도 2). 이때 변화되는 초산균의 산도와 pH를 하기 표 3에 나타내었다.
초산균이 배양 환경에 적응하고 에너지원(알코올)을 최대로 소비하면서 산도가 점진적으로 높아지고 pH가 낮아지는 것을 볼 수 있다. 균주 GHUR-A11-2와 JS-C1는 배양 6일에 알코올 소비능이 최대 96%, 95%로 산도는 4.3%, 4.0%, pH 3.4, 3.5로 각각 투입된 알코올이 모두 초산발효로 전환되는 것을 알 수 있다. JS-B7 초산균은 배양 9일에 알코올 소비능이 최대 90%로 산도는 5.0%, pH 3.4의 효과를, 아세토박터 파스테우리아누스 A26(GY-A26)은 배양 12일에 알코올 소비능이 최대 96%로 산도는 4.9%, pH 3.6을 나타내었다. SR-A24와 GHF-A37은 알코올 소비능이 다른 균주에 비해 현저히 떨어지고 초산 생성과 이에 따른 pH 변화도 미미하였다. 위의 결과를 통해 알코올 소비능이 최대일 때 최대의 산 생성과 낮은 pH의 상관성을 볼 수 있었다.
배양일 종류 초산균
GHUR-A11-2 SR-A24 GY-A26 GHF-A37 JS-B7 JS-C1
3 산도 2.82±0.36a1) 1.87±0.19bc 1.96±0.07bc 1.62±0.23c 2.15±0.16b 1.99±0.02bc
pH 3.63±0.08c 3.89±0.05a 3.84±0.02ab 3.92±0.06a 3.76±0.09b 3.82±0.02ab
6 산도 4.29±0.26a 1.68±0.11d 2.71±0.23c 1.58±0.01d 3.68±0.07b 3.99±0.23ab
pH 3.38±0.07d 3.88±0.00a 3.63±0.02b 3.92±0.02a 3.48±0.06c 3.46±0.00c
9 산도 3.32±0.30c 1.75±0.16d 3.88±0.31b 1.63±0.11d 5.01±0.38a 3.43±0.17bc
pH 3.54±0.05bc 3.92±0.07a 3.49±0.01c 3.95±0.01a 3.38±0.02d 3.57±0.02b
12 산도 2.60±0.29b 1.82±0.01c 4.94±0.01a 1.65±0.01c 4.93±0.23a 2.87±0.24b
pH 3.84±0.02b 4.19±0.08a 3.59±0.01c 4.14±0.03a 3.62±0.01c 3.86±0.06b
1) 같은 행에 문자가 다른 평균은 ducan의 다중 범위 검정에 의해 유의하게 다릅니다(p<0.001).
<실험예 4> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 항균 활성
유해 세균(세레우스균, 황색포도상 구균, 대장균 및 쥐티푸스균)을 TSB (tryptic soy broth, L; pancreatic digest of casein 17 g, papaic digest of soybean 3 g, dextrose 2.5 g, sodium chloride 5 g, dipotassium phosphate 2.5 g) 액체배지에서 16시간 이상 배양시켜 활성화한 후, 0.6% TSA top agar에 0.1% (v/v)를 접종하여 평판배지 위에 덮고, 초산균(OD660=0.5) 배양액 50 uL을 흡수, 건조한 paper disc(ø8 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)를 올려놓은 후, 30℃에서 24시간 배양하였다. 항균력은 paper disc 주위에 형성된 저해 환의 지름(mm)을 3회 반복한 평균값으로 나타내었다. 또한 양성 대조군으로서 주요 유기산인 초산(acetic acid, AA)을 농도별(mg/mL)로 비교하였다.
하기 표 4는 초산균의 유해 세균 증식 억제 관련 항균력을 나타낸 것이다. 그람 양성 세균인 세레우스균과 황색포도상 구균 및 그람 음성인 대장균과 쥐티푸스균에 대해 대부분 항균 효과를 나타내었다.
6주 초산균은 황색포도상 구균, 대장균, 쥐티푸스균보다 그람 양성 세균인 세레우스균에 더 효과적인 항균력을 나타내었다. 그람 양성 세균은 외막을 가지고 있어서 그람 음성균보다 다양한 종류의 항균제에 민감하다고 알려져 있다. 초산균의 항균활성은 초산균이 생산하는 초산으로 인해, 주변 환경의 pH가 낮아져 유해 세균의 세포벽 및 세포막이 약화되고 세포 구조가 붕괴하여 세포의 내용물이 세포 외로 유출됨으로써 균의 성장이 억제되는 것으로 여겨진다.
종류 이름 저해 환 (mm)
세레우스균 황색포도상 구균 대장균 쥐티푸스균
그람 양성 그람 음성
균주 GHUR-A11-2 18.1±0.1g2) 13.2±0.1f 16.1±0.1g 15.1±0.2f
SR-A24 21.2±0.1e 15.1±0.2e 17.2±0.1f 19.3±0.1d
GY-A26 23.1±0.2d 18.2±0.1c 18.1±0.1e 15.1±0.2f
GHF-A37 20.3±0.1f 18.1±0.2c 17.3±0.1f 15.2±0.2f
JS-B7 24.2±0.2c 16.1±0.1d 21.1±0.2c 15.2±0.1f
JS-C1 25.1±0.1b 15.2±0.2e 20.2±0.1d 24.1±0.1b
양성
대조군		 AA-50 27.3±0.1 31.1±0.1 30.1±0.1 30.1±0.1
AA-25 20.2±0.2 24.1±0.1 24.2±0.2 22.1±0.1
AA-12.5 16.2±0.1 16.1±0.2 17.1±0.1 17.2±0.2
음성
대조군		 배지 8.1±0.1 8.1±0.1 8.1±0.1 8.1±0.1
<실험예 5> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 ACE (Angiotensin converting enzyme) 저해 활성
ACE (Angiotensin converting enzyme) 저해 활성은 초산균 배양액의 상등액 50 uL과 450 mM 붕산 나트륨 완충액(sodium borate buffer, pH 8.3) 2.5 mL에 녹인 2.5 mM 기질(Hippuryl-L-Leucine)을 50 uL 첨가한 후, 5분 동안 37℃에서 반응시켰다. 이에 10 mU ACE 용액 50 uL를 넣고 37℃에서 40분간 반응시켜 1 N HCl 250 uL를 가하여 반응을 정지시키고 ethyl acetate 1.5 mL를 가하여 30초간 교반한 후, 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액 1 mL를 취한다. 이 상등액을 heat-block 100℃에서 완전히 건조 시킨 후, 증류수 1 mL를 넣어 용해하고 228 nm 흡광도에서 측정하였다. 이때 대조군은 시료 대신에 증류수 50 uL를 사용하였고 Blank는 효소원을 첨가하기 전에 1N HCl 250 uL을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 효소원을 첨가하였다. 이때 양성 대조군은 ACE 저해제로 널리 사용되는 captopril을 사용하였고 ACE 저해율(inhibition rate)는 아래의 식에 따라 계산하였다.
ACE 저해율(%) = [(1-(S-SB/C-CB)) Х 100]
S: 샘플의 흡광도
C: 대조군의 흡광도
SB: 샘플 blank의 흡광도
CB: 대조군 blank의 흡광도
도 3은 6주 초산균 배양액으로부터 얻은 상등액의 ACE 저해 결과이다. 현재, 시판되는 항고혈압제인 captopril 0.1%는 138%, 0.01%는 78%의 ACE 저해 효과를 보였다. 식초에서 선발한 GHUR-A11-2와 SR-A24 및 JS-C1 초산균은 174.9%와 154.1%, 154.6%로 양성 대조군인 captopril(0.1%)보다 높은 ACE 저해 활성 효과를 보였다. 아세토박터 파스테우리아누스 A26(GY-A26)은 64.8%로, GHF-A37은 11.5%의 ACE 저해 활성을 보여 양성 대조군 0.01% captopril보다 낮은 효과를 나타내었다.
항고혈압제로 사용되는 captopril(0.1%)보다 높은 ACE 저해 효과를 발휘한 GHUR-A11-2, SR-A24 및 JS-C1 초산균의 어떤 물질이 효과적으로 영향력을 미치는지는 추가적인 연구가 필요하지만, 일반적으로 단백질의 아미드 결합과 페놀성 수산기 간의 수소결합에 의한 반응으로서 단백질과 복합체의 침전물을 형성하는 이러한 반응은 pH, 이온강도, 단백질 및 phenol 농도에 의한 상호작용으로 비경쟁적 효소를 저해함으로써 불활성화를 일으키는 것으로 보고되었다. 합성 고혈압 치료제의 부작용에 대비하여 식품 유래의 ACE 저해 활성물질에 관한 연구가 요구되는 시점에서 발효식초부터 6주 초산균이 ACE 저해 효과가 높아 식초산업 활용성이 기대된다.
<실험예 6> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 혈전 용해 효과
혈전 용해 효과는 Astrup과 Mullertz(1952)의 fibrin 평판법을 응용하여 측정하였다. 먼저 0.17 mol/L 붕산 나트륨 완충액(pH 7.8) 22 mL에 피브리노겐 110 mg을 실온에서 1시간 방치하면서 녹인 후, 여과지로 불용성 물질을 제거하였다. 붕산 나트륨 완충액으로 녹인 트롬빈 용액을 제조했다. 여과된 20 mL 피브리노겐 용액에 50 U/mL 트롬빈 용액 1 mL를 섞어 페트리디쉬에 부어 30분 방치하여 굳혔다. 여기에 8 mm paper disk를 올리고 초산 발효물의 상등액 20 uL를 주입하여 반응시켰다. 37℃에 6시간 이상 배양하면서 투명 환이 형성되는 것을 조사하였다. 양성 대조군으로 플라스민을 농도별로 사용하여 표준곡선을 작성하고 초산균의 혈전 용해 효과는 플라스민의 투명환 대비 %로 환산하였다.
혈전 용해 활성(%) = (샘플의 투명 환 직경)/(플라스민의 투명 환 직경) x 100
도 4는 양성 대조군으로 사용한 플라스민을 농도별로 표준곡선을 작성하고 이들 초산균의 혈전 용해 효과는 생성한 플라스민의 투명 환 대비(%)로 환산 것이다. 플라스민 0.5 U(15 mm) 대비 각 균주의 혈전 용해능은 SR-A24가 93.3%(14 mm)로 제일 높았고, GHUR-A11-2와 JS-B7은 73.3%(11 mm), 아세토박터 파스테우리아누스 A26(GY-A26)은 80.0%(12 mm), GHF-A37과 JS-C1은 60.0%(9 mm)의 효과를 나타냈다.
본 연구에서 6주 초산균은 혈전 용해능이 뛰어남을 확인하였다.
<실험예 7> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 α-글루코시다아제 저해 효과
항당뇨 효과는 α-글루코시다아제 활성 저해 측정법으로 분석하였다. α-글루코시다아제 활성 분석 키트(glucosidase activity assay kit, sigma-aldrich, Cat No. MAK123)에서 negative 효과를 100으로 시료의 효과를 환산하여 저해율을 구하였다. 균주 상등액 20 uL에 master reaction mix(assay buffer 200 uL + alpha-NPG substrate 8 uL) 200 uL를 혼합하였다. 흡광도 405 nm에서 초기 값(A405) initial을 측정하고, 이후 37℃에서 20분 반응시킨 후, 최종 흡광도(A405) final을 측정하였다. α-글루코시다아제 저해 비율 (%)은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
α-글루코시다아제 저해 비율 (%) = [(1-(A405final-A405initial/A405calibrator-A405water)) Х 100]
A405 calibrator = 20분 반응 후 calibrator 흡광도 값
A405 water = 20분 반응 후 water 흡광도 값
도 5는 6주 초산균의 α-글루코시다아제 저해 효과의 결과이다. 양성 대조군으로 사용된 12.5 mg/mL 초산(AA 12.5)는 120.6%의 저해능을 나타냈다. 초산균 GHF-A37(75.3%)과 JS-B7(68.0%)를 제외한 나머지 초산균의 항당뇨 활성은 100% 이상의 활성을 나타냈다(96.9%-103.1%).
양성 대조군으로 사용된 12.5 mg/mL acetic acid(AA 12.5)는 120.6%의 α-글루코시다아제 저해 효과를 보였고, 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주는 100% 이상의 α-글루코시다아제 저해 효과을 보였다.
<실험예 8> 세포 생존율 측정
8-1. 세포 배양
본 연구에 사용된 RAW-BlueTM 세포(InvivoGen, San Diego, LA, USA)는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)을 포함한 dulbecco's modified eagle medium (DMEM, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 계대는 2일에 한 번씩 시행하였으며, RAW-BlueTM 세포를 활성화하기 위해 주 1회는 zeocin(Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 양성 대조군은 lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli O111:B4, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 100 ng/mL의 농도를 처리한 것으로 사용하였다.
8-2. 세포 생존율 측정
RAW-BlueTM 세포의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. RAW-BlueTM 세포는 1x105 cell/mL의 농도로 96 well plate에 분주하였고 24시간 배양한 후, 균주의 농도 25, 50, 100 CFU/macrophage 균체를 처리하였다. 대조군에는 배지를 동량으로 처리하였다. 각 plate는 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하여 MTT assay를 수행하였다. 배양 완료 후 PBS (Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)를 이용하여 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액을 각 well에 200 uL씩 첨가하여 알루미늄 호일로 빛을 차단한 상태에서 4시간 동안 다시 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 150 uL를 각 well에 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해한 뒤 microplate reader (SpectraMax M2, Winooski, VT, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식률은 각각 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율(%)로 나타내었다.
세포 증식률(%)=(시료의 흡광도값/Blank의 흡광도 값) X 100
도 6는 RAW-BlueTM 대식세포에 6주 초산균의 배양액 농도를 각각 25, 50, 100 CFU/macrophage로 처리한 결과이다. 상기 초산균의 처리한 모든 농도에 대해서 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 것으로 나타났으며 대식세포가 활성화되어 세포 증식률이 증가하는 결과를 나타내었다. 그러므로 본 발명에서는 상기 초산균 배양액의 3가지 처리 농도를 사용하여 면역 활성 실험을 진행하였다.
<실험예 9> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 NF-κB 전사인자 활성
초산균의 면역 자극 효과를 RAW-BlueTM 대식세포를 이용하여 살펴보았다. RAW-BlueTM 세포는 1x105 cell/mL의 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후, 6주 초산균의 농도 25, 50, 100 CFU/macrophage 균체를 처리하여 다시 24시간을 배양하였다. 배양된 상층액 20 uL와 Quanti blue (InvivoGen, San Diego, LA, USA) 시약 200 uL를 혼합하여 암실에서 10분 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하여 NF-κB 활성 정도를 분석하였다. 양성 대조군은 lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli O111:B4, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 100 ng/mL의 농도를 처리한 것으로 사용하였고, 음성 대조군으로는 실험 배지를 사용하였다.
도 7는 6주 초산균의 NF-κB 활성을 양성대조군으로 사용된 LPS(1 ng/mL)가 생성한 활성 대비 fold 값으로 나타낸 것이다. GHF-A37을 제외한 5주 초산균은 처리 농도 의존적 경향으로 NF-κB 활성을 증진했다. 특히 JS-C1의 활성이 양성 대조군 LPS 처리 활성만큼 우수하였고 나머지 균주들도 음성 대조군에 비하여 7-8배 활성능을 나타냈다. 결과적으로 6주 초산균은 NF-κB/AP-1의 전사인자 활성 능을 높여 면역 증진 효과를 내는 것을 확인 하였다.
<실험예 10> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 Nitric oxide(NO) 생성량
정상적인 생체 내에서는 항산화 효소와 항산화 물질이 존재하여 보호 작용을 한다. 그러나 물리적, 화학적 영향으로 이상이 발생하면 활성산소가 생성되어 방어체계로 산화적 스트레스를 나타낸다. 이와 같은 기전으로 독성 물질 혹은 유해 물질 노출로 발생한 NO는 염증 반응의 indicator로서 혈액 응고 및 혈압조절 기능, 암세포에 대한 면역 기능 등에 중요한 역할을 한다.
6주 초산균에 대한 면역 증강을 확인하기 위하여 RAW-BlueTM 세포의 배양 상층액을 취하여 Griess 반응에 의한 NO2- 생성량을 측정하였다. NO 생성량은 대사산물인 nitrate(NO3-)와 nitrite (NO2-)의 생성 농도를 확인하는 것으로 이를 Griess 반응을 통해 확인할 수 있다. 질산환원효소를 이용하여 NO3-를 NO2-로 환원시키고 Griess 시약을 이용한 발색반응으로 NO2-의 농도를 측정하였다.
먼저 RAW-BlueTM 세포를 1x105 cell/mL의 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후, 6 균주의 농도 25, 50, 100 CFU/macrophage 균체를 처리하여 다시 24시간을 배양하였다. 배양 상층액 50 uL와 Griess reagent(Promega, Masison, WI, USA) 혼합물(1% sulfanilic acid, 0.1% N-1-naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride, 5% phosphoric acid) 100 uL를 잘 섞어 암실에서 10분 반응, 발색시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO2 의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
도 8은 RAW-BlueTM 세포에서 6주 초산균의 농도, 25, 50, 100 CFU/macrophage 균체를 처리하여 생성된 NO의 양을 대식세포에서 NO 생성을 유도하는 양성 대조군 LPS(1 ug/mL)가 생성한 NO의 양에 대비(fold 값)하여 나타낸 것이다. 초산균 GHUR-A11-2와 JS-C1의 경우 처리한 균체의 농도에 상관없이 LPS (1 ng/mL)을 처리하였을 때 생성된 NO 함량보다 높거나 비슷한 수준으로 생성되었다. JS-B7과 GHF-A37 균주 처리에서는 LPS 대비 0.7-0.9배의 NO 생성능이 낮은 농도 처리에서 나타났다. SR-A24와 아세토박터 파스테우리아누스 A26(GY-A26)는 처리 균체 농도 의존적으로 NO 생성능을 나타내어 음성 대조군(control, medium)에 비해 2-4배의 효과를 나타냈다.
대식세포는 숙주의 방어기구 일부로서 면역계에 매우 중요한 구실을 하여 외부물질 침입을 가장 먼저 인지하여 대식세포가 활성화되면 대식 능력의 증강, NO 및 cytokine 생성의 향상을 수반하여 결과적으로 암세포와 각종 유해균의 성장을 억제할 수 있는 것으로 여겨진다. 위의 결과를 통하여 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주는 대식세포를 활성화함으로 NO 생성을 증가시켜 면역 반응이 일어나는 초기에 생체 방어에 유리한 작용을 해서 면역 기능을 높일 것으로 생각된다.
<실험예 11> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 사이토카인(Cytokine) 생성량
Cytokine인 TNF-α와 IL-1ß, IL-6의 생성량 측정은 RAW-BlueTM 세포를 96 well plate에 1x105 cell/mL의 농도로 분주 24시간 후 6주 초산균의 농도 25, 50, 100 CFU/macrophage 균체를 처리하여 다시 24시간을 배양하였다. 배양 상층액을 모아서 각각의 ELISA kit (Invitogen, Themofisher Scientific In. Vienna, Austria)를 이용하여 측정하였다. 사이토카인(TNF-α와 IL-1ß, IL-6)의 항체가 코팅된 각각의 well plate에 상층액 100 uL를 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 상층액을 제거하고 PBS와 Tween 20 (Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO, USA)을 섞어 만든 washing buffer로 5회 이상 세척하였다. Detection antibody 용액을 넣어 항체와 반응시킨 후, Avidin과 결합된 Horseradish Peroxidase(HRP) 효소를 넣어 상온에서 15분 반응시켰다. 이후 HRP 효소에 대한 기질로 TMB 용액을 넣어 반응시켜 색상의 변화를 관찰하였다. 시료에 사이토카인이 생성되어 존재하면 색상의 변화가 나타나므로 이 변화를 통해 사이토카인의 생성량을 측정할 수 있다. Stop solution(H2SO4)을 넣어 HRP 효소와 TMB 기질의 반응을 종결시킨 후 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 9a는 RAW-BlueTM 세포에서 6주 초산균의 농도, 25, 50, 100 CFU/macrophage 균체를 처리하여 생성된 TNF-α의 양을 양성 대조군 LPS (1 ug/mL)가 생성한 TNF-α의 양에 대비(fold 값)하여 나타낸 것이다. 6주 초산균은 대식세포를 자극하여 TNF-α 생산을 유도하면서 상대적으로 낮은 농도에서도 우수한 활성을 나타내 GY-A26 균주를 제외한 모든 초산균은 양성 대조군보다 높은 활성을 나타내었다. GY-A26도 음성대조군에 비교해서는 7배의 활성을 보였다.
도 9b는 RAW-BlueTM 세포에서 6주 초산균의 농도, 25, 50, 100 CFU/macrophage 균체를 처리하여 생성된 IL-1ß의 양을 양성 대조군 LPS (1 ug/mL)가 생성한 IL-1ß의 양에 대비(fold 값)하여 나타낸 것이다. IL-1ß의 경우, GY-A26을 제외한 모든 균주에서 농도 의존적으로 유의적인 활성 증가세를 보여 주었다.
도 9c는 RAW-BlueTM 세포에서 6주 초산균의 농도, 25, 50, 100 CFU/macrophage 균체를 처리하여 생성된 IL-6의 양을 양성 대조군 LPS (1 ug/mL)가 생성한 IL-6의 양에 대비(fold 값)하여 나타낸 것이다. IL-6 생성능의 경우에는 음성 대조군에 비해 농도 의존적으로 활성이 증가하는 경향을 보였지만, 양성대조군보다는 상대적으로 낮은 활성을 나타냈다.
종합하면, 6주 초산균의 면역 활성은 양성 대조군 LPS보다 활성이 좋거나 비슷하였고 음성 대조군보다는 우수한 효과를 나타내었다. 또한, TNF-α와 IL-1ß 및 IL-6 사이토카인 생성을 다르게 활성화하여 다양한 면역자극을 유발하였다.
<실험예 12> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 항산화 활성
초산균의 항산화 활성은 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA) 유리기 소거능과 ABTS(2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA) 유리기 소거능으로 측정하였다.
12-1. DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 유리기 소거능
DPPH 유리기 소거 능은 각 초산균 상등액 0.2 mL에 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL를 가하여 암실에서 10분 반응시킨 후 525 nm 흡광도를 측정하여 소거능을 산출하였다.
도 10a는 6주 초산균의 DPPH 라디칼 소거능을 조사한 결과이다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균이고, 오차 막대는 SD를 나타낸다(p<0.001). 6주 초산균의 DPPH 라디칼 소거능은 대조군(액체배지, 6.3%)보다 5배(50.9%)에서 15배(85.4%)의 높은 항산화 활성을 나타내었다.
12-2. ABTS (2,2-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 유리기 소거능
ABTS 유리기 소거능은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온의 암소에 24시간 방치하여 radical을 형성시킨 후, ABTS 용액을 732 nm에서 흡광도가 0.700±0.030이 되도록 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)로 희석하여 사용하였다. 희석된 용액 950 uL에 각각의 초산균 상등액 50 uL를 가하여 암실에서 10분 반응시킨 후, 732 nm 흡광도를 측정하였다. 각 초산균의 ABTS 유리기 소거능(%)는 아래의 식에 따라 계산하였다.
ABTS 유리기 소거능(%) = 100-[OD of sample/OD of control] x100]
도 10b는 6주 초산균의 ABTS 라디칼 소거능을 조사한 결과이다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균이고, 오차 막대는 SD를 나타낸다(p<0.001). 6주 초산균의 ABTS 라디칼 소거능은 대조군(배지, 11.31%)보다 4-5배(42.7%-54.8%)의 활성 효과를 나타냈다. 따라서 활성 라디칼에 전자 공여능이 큰 전자공여체는 식품 중의 지방 산화를 억제하고 인체 내 활성 라디칼에 의한 노화를 억제하는 작용을 하므로 6주 초산균의 산업적 활용 가치가 기대된다.
<실험예 13> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 타이로시나아제(Tyrosinase) 저해 효과
인체 중 피부는 자외선의 영향을 받기 쉬운 기관으로 멜라닌 증식에 의한 피부노화가 쉽게 진행된다. 멜라닌 생성에서 가장 중요한 역할을 하는 효소가 타이로시나아제이기 때문에 피부 미백제의 개발에서 타이로시나아제 활성 저해 실험은 유용한 일차 평가법이다.
타이로시나아제 저해 효과 측정은 tyrosinase inhibitor screening assay kit (Abcam, Waltham, MA, USA)을 사용하였다. 96 well plate에 6주 초산균 배양 상등액과 0.75 mM kojic acid 대조군을 각각 20 uL씩 분주했다. 각 well에 타이로시나아제 효소 용액(48 uL buffer + 2 uL enzyme) 50 uL를 첨가한 후 25℃에서 10분 반응했다. 이어서 타이로시나아제 기질(substrate) 용액(23 uL buffer + 2 uL substrate + 5 uL enhancer) 30 uL를 넣은 후 2-3분마다 510 nm에서 흡광도를 측정했다. 적어도 30-60분간 측정하여 타임 포인트 2개를 선택하여 모든 샘플(S), 저해 대조군(IC; 0.75 mM kojic acid, tyrosinase inhibitor), 효소 대조군(EC; tyrosinase assay buffer)의 흡광도의 차(△A=A2-A1)에 의하여 다음과 같이 측정했다.
Relative inhibition (%) = [(Slope of EC-Slope S)/(Slope of EC)] X100
도 11은 6주 초산균의 저해 효과를 측정한 결과이다. 타이로시나아제 저해제인 양성 대조군 0.75 mM kojic acid의 저해율 82.7%보다 아세토박터 파스테우리아누스 A26 균주의 타이로시나아제 저해율은 99-100%로 우수하였다.
<실험예 14> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 바이오제닉 아민(BA) 생성 유무
6주 초산균을 초산균 배지에 히스타민(histamine)과 티라민(tyramine) 전구체 아미노산인 히스티딘과 티로신을 각각 100 ppm (0.1%, v/v) 되게 첨가하여 30℃, 7일 배양했다. 배양액을 채취(harvest)하여 상등액을 취하였다. 상등액 5 mL에 0.1 N HCl 25 mL을 가해 균질화하여 원심분리(4,000g, 4℃, 15 min)하고 여과(여과지 No. 2)한 후, 상등액 회수 조작을 2회 반복했다. 상등액을 합쳐 0.1 N HCl을 가해 50 mL로 적정했다. 6주 초산균의 배양 상등액 5 mL을 바이오제닉아민 유도체화를 거친 후, HPLC로 분석하였다.
표준용액(standard compound)과 내부표준용액(diaminoheptane)의 물질 분리 피크의 RT를 비교한 결과, 히스티딘과 티로신의 전구물질이 6주 초산균에 의해 히스타민(rt 17분)과 티라민(rt 22분)인 바이오제닉 아민(BAs)의 전환 피크를 전혀 볼 수 없었다. 따라서, 본 연구에 사용한 초산균 6주에 대한 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 것을 확인할 수 있었다(표 5).
균주명 수탁번호 바이오제닉아민(ppm)
히스타민 티라민
Acetobacter pasteurianus A11-2 KACC 92203P 불검출 불검출
Acetobacter pasteurianus A24 KACC 92204P 불검출 불검출
Acetobacter pasteurianus A26 KACC 92205P 불검출 불검출
Acetobacter pasteurianus A37 KACC 92206P 불검출 불검출
Acetobacter pasteurianus B7 KACC 92207P 불검출 불검출
Acetobacter pasteurianus C1 KACC 92208P 불검출 불검출
<실험예 15> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 항생제 내성
6주 초산균을 대상으로 14종류 항생제(Ampicillin, Erythromycin, Gentamicin, Streptomycin, Tetracycline, Vancomycin, Amikacin, Amoxicillin, Aztreonam, Ceftriaxone, Ciprofloxacin, Imipenem, Oxacillin, Tigecycline)에 대한 내성 여부를 확인하고자 하였다. 초산균 배지 조성 중 EtOH과 CaCO3를 제외한 고체배지에 Macfaland OD 600=0.5인 표준액과 농도를 맞춘 후, 하루 전 배양한 6주 초산균을 plate에 spreading 한 다음, E-test (biomerieux)에 14종류의 항생제에 대한 MIC (ug/mL) 분석하였다.
하기 표 6은 14개 항생제에 대한 항생제 최소억제농도(mg/mL) 검사 결과이다. 식약처 항생제기준의 한계치보다 높은 것을 저항성 균주로 판단하였다. 6주 초산균에 대해 반코마이스(Vancomycin)은 저항성을 나타냈다. All-2를 제외한 나머지 초산균들은 에리트로마이신(Erythromycin)에도 저항성을 나타냈다.
항생제의 역할이 세균의 세포벽 합성저해, 세포막 파괴, 세균의 단백질 합성 저해, 세균의 대사작용 방해를 통하여 세균을 사멸시키거나 성장을 억제하는데, 항생제에 대해 초산균이 내성을 가지는 것은 항생제 작용 효소를 파괴하여 세포벽 합성 방해를 저해하고, 항생제 흡수를 저하시켜 약제 농도 감소로 인하여 DNA 합성 저해 작용을 막고, 항생제의 표적을 변경시켜 구조변화로 약제가 결합하지 못하여 DNA 합성을 지속함으로 저항성을 보인다.
항생제
 판정 기준
(식약처)		 초산균
A11-2 A24 A26 A37 B7 C1
Amikacin 8 nt 6 nt nt nt
Amoxicillin 2 8 1.5 0.25 1.5 3
Ampicillin 2 1.5 0.75 1.5 1.5 1.5 0.75
Aztreonam >256 nt >256 nt nt nt
Ceftriaxone 1.5 nt 1.0 nt nt nt
Ciprofloxacin >256 nt >256 nt nt nt
Erythromycin 4 3 6 >256 >256 >256 6
Gentamicin 32 6 nt 12 nt nt nt
Imipenem 0.75 nt 1.0 nt nt nt
Oxacillin >256 nt >256 nt nt nt
Streptomycin 128 0.75 nt 1.5 nt nt nt
Tetracycline 4 0.75 2 1.5 0.50 1.5 1.0
Tigecycline 6 12 12 6 6 8
Vancomycin 4 >256 >256 >256 >256 >256 >256
<실험예 16> 아세토박터 파스테우리아누스 A26의 초산균 간의 길항작용
6주 초산균을 대상으로 초산균 간의 길항작용을 확인하고자 하였다. Type strain과 6주 초산균을 각각 배양할 때 두 초산균 사이 inhibition없이 잘 생육하는지 확인하고자 한다. 이는 이후 발효식초 제조시, 단일 초산균보다 복합 초산균을 사용하여 산도 및 향기성분을 배가하기 위한 목적이다.
기준 초산균(Type strain) Acetobacter syzygil (KACC no. 12233), A. pomorum (KACC no. 11998)에 대해서 6주 초산균의 생육도를 plate 상에서 보기 위하여, 초산균 액체배지에서 OD660=0.5 이상 되도록 배양한 후, type strain을 0.6% 초산균 배지 5 mL에 현탁하여 top agar plate를 만들었다. 그 위에 paper disc (8 mm)를 올리고 23주 초산균들의 상등액 50 uL를 접종하여 30℃에서 24시간 배양하여 6주 초산균과 type strain 초산균과의 생육을 확인했다.
하기 표 7은 기준 초산균에 대한 6주 초산균의 길항작용을 나타낸 결과이다. 생육저해 정도에 따라 "++", "+" 및"-"로 표시하였다. "-"로 표시된 6주 초산균들은 기준 초산균과 잘 어울려 생육이 활발한 것을 의미한다. 따라서, 6주 초산균들은 용도에 따라 복합 종균을 사용할 수 있음을 확인했다.
초산균 최종
산도		 길항작용
Acetobacter syzygil
(KACC no. 12233)		 Acetobacter pomorum
(KACC no. 11998)
A11-2 3.92 - -
A24 3.14 - -
A26 3.41 - -
A37 4.16 - -
B7 4.85 - -
C1 2.41 - -
농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC) KACC92205P 20171023
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Claims (14)

  1. 수탁번호 KACC 92205P로 기탁된 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus) A26 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항염증용 건강기능식품 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rDNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항염증용 건강기능식품 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 항염증은 NF-κB(Nuclear factor kappaB) 전사인자 활성 및 NO(Nitric Oxide) 생성 억제에 의한 것을 특징으로 하는 항염증용 건강기능식품 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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