KR101216729B1 - 소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 물질을 생산하는 방법 - Google Patents
소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 물질을 생산하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 소나무(Pinus densiflora) 잎 분말을 제조하는 단계; 상기 소나무 잎 분말에 물을 첨가하고 열수 추출법을 수행하는 단계; 상기 열수 추출에 의해 제조된 추출액을 제거하고, 소나무 잎 분말 잔류물을 수득하고 건조시키는 단계; 및 상기 건조된 소나무 잎 분말 잔류물에 헥산을 첨가하고 용매 추출법을 수행하는 2차 추출 단계를 포함하는 소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추출방법에 의해 제조된 추출물은 통상적으로 사용되는 용매 추출법에 의해 제조된 추출물에 비하여, 우수한 항균 활성을 가질 뿐만 아니라 항산화 활성도 우수하므로, 식품 부패 등과 관련하여 천연 항생제가 요구되는 분야 및 제품의 산화로 인한 품질 저하를 예방하거나, 노화 등 활성산소 등에 의해 발생되는 질환 등을 예방하기 위해 항산화 물질이 사용되는 분야, 구체적으로 식품 분야, 화장품 분야 및 의약 분야를 포함한 다양한 산업분야에 폭 넓게 응용될 수 있다.
본 발명의 추출방법에 의해 제조된 추출물은 통상적으로 사용되는 용매 추출법에 의해 제조된 추출물에 비하여, 우수한 항균 활성을 가질 뿐만 아니라 항산화 활성도 우수하므로, 식품 부패 등과 관련하여 천연 항생제가 요구되는 분야 및 제품의 산화로 인한 품질 저하를 예방하거나, 노화 등 활성산소 등에 의해 발생되는 질환 등을 예방하기 위해 항산화 물질이 사용되는 분야, 구체적으로 식품 분야, 화장품 분야 및 의약 분야를 포함한 다양한 산업분야에 폭 넓게 응용될 수 있다.
Description
본 발명은 천연물질로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 물질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성이 우수한 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
항생제란 통상적으로 항미생물제를 총칭하는 것으로, 특히 세균에 대한 항균작용을 하는 물질, 상세하게는 세균이 세포벽이나 단백질 등을 합성하는 시스템을 저해시킴으로써 뛰어난 항균작용을 하는 물질 또는 이러한 물질로부터 제조된 것을 의미한다. 항생제의 성분은 주로 곰팡이로부터 추출된 것이 주를 이루었으며, 오늘날 세균 감염에 의한 질병 등을 치료하기 위해 많이 사용되고 있다. 가장 대표적인 항생제로는 영국인 의사 알렉산더 플레밍이 1928년에 제조한 페니실린이다. 페니실린은 인류가 세균에 본격적으로 대응하기 위해 제조한 최초의 항생제였다. 페니실린 이후에 개발된 대표적인 항생제로는 페니실린 보다 효과가 탁월한 것으로 인정되는 메티실린(methicillin)이 있다. 메티실린은 페니실린의 화학구조를 일부 변경하여 제조한 것이다.
상기 메티실린은 베타-락탐계 항생제(beta-lactam class of antibiotics)로 분류되며, 상기 베타-락탐계 항생제는 페니실린-결합 단백질(penicillin-binding proteins, PBPs)와 결합을 형성한 후 이 단백질의 활성을 제거함으로써 약효를 발휘하는 것이다.
항생제 내성 세균이란 특정 항생제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 세균을 말한다. 예를 들어, 상기한 페니실린의 약효가 전혀 듣지 않는 페니실린 내성 황색포도상구균이 이에 해당된다. 이 외에도, 1961년 최초로 학계에 보고되었으며, 그 후로 전세계적으로 주요 병원 내 감염균이 되고 있는 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)이 있다. 상기, MRSA는 페니실린이나 메티실린의 항생제에도 내성을 나타낼 수 있는 독특한 유전자를 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 MRSA는 건강한 사람에게는 감염이 되지 아니하고 주로, 면역력이 약한 환자나 수술을 마친 환자에게 감염이 되나, 감염이 되는 경우에는 패혈증이나 폐렴을 일으켜 사망케 하는 것으로 보고 되어 있다.
최근에는 건강한 사람들도 MRSA에 감염되는 일이 증가하고 있다. 미국 의학계나 공중보건학계는 MRSA와 같이 여러 항생제에도 약효가 듣지 않는 병원균(다약제 내성 병원균)에 의한 감염의 증대를 크게 우려하고 있다. 예를 들어, 1984년에 알래스카 토착민에서의 황색포도상구균의 확산과 2000년 8월 그 주민들에게서 피부감염증이 확산된 경우를 들 수 있다. 이는 MRSA가 종래에 알려진 것처럼 병원에서 환자로부터 감염되는 것만이 아니라, 지역사회에서의 공공생활을 통해서도 감염될 수 있음이 확인된 것이다.
우리나라에서도 최근 2년 동안 경남지역의 어린이 40여명이 MRSA에 감염된 것으로 보고 되었으며, 감염증상인 포도상구균 열상 피부증후군을 치료받은 어린이들을 서울대 진단검사의학과에서 재검사한 결과 MRSA 감염으로 최종 확인되었으며, 감염 어린이들이 병원에 입원하거나 항생제를 복용한 적이 없었던 것으로 드러나, 그 지역사회의 주변환경으로부터 MRSA에 감염된 것으로 추정되고 있다. 또한, 식품의약품안전청과 질병관리본부가 발표한 결과에 의하면, 서울대병원 등 전국 10개 대학병원에 대한 항생제 내성 모니터링 결과 전년보다 항생제 내성률이 10%나 높아졌다고 발표하였으며, 혈액에서 검출된 황색포도상구균 중, MRSA의 비율이 2004년도 61.2%에 비해 10% 높게 나온 71.6%인 것으로 보고 되어 있다.
또한, 국가 경제의 급속한 성장에 따른 경제 사회적 환경의 변화와 생활 방식의 변화로 최근 국민 식생활 수준이 향상되었다. 특히, 식품 산업이 발달함에 따라 식품의 유통 및 저장과정에서 발생하기 쉬운 식품의 부패나 변질의 원인이 되는 미생물의 증식을 억제하기 위한 연구가 계속되고 있다.
식품의 변질을 방지하기 위한 방법으로 가열처리나 레토르트 (retort) 등의 살균기술을 이용한 물리적인 방법과 식품의 저장 및 유통과정 중에 부패 및 변질을 일으키는 미생물을 사멸시키거나 증식을 억제시키는 식품보존제를 첨가하는 방법이 널리 사용되고 있다. 그러나, 상기 물리적인 처치를 통한 방법은 식품의 영양성분 파괴 및 품질저하 등을 유발하는 단점을 가지고 있다. 또한, 기존에 주로 사용되는 식품보존제인 화학합성 보존제의 경우, 장기간 섭취할 경우 이들이 체내에 축적되면서 돌연변이나 기형을 유발하는 등의 안전성 문제가 제기되고 있다.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 인체에 해가 적은 천연물로부터 항균 활성이 우수할 뿐만 아니라 항산화 활성이 우수하여, 식품이나 화장품 등 장기 보관이 요구되는 제품의 변질 또는 부패를 억제 또는 예방할 수 있는 물질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연 물질로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 물질을 추출하는 방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 식품 또는 화장품 등의 부패 또는 변질을 예방 또는 억제하기 위하여 사용될 수 있는 천연물질 유래 물질에 관하여 연구하던 중, 식물에 존재하는 항균 물질 또는 항산화 물질의 활성은 추출 용매 또는 추출 조건에 따라 상이할 수 있다는 점에 착안하여 연구를 진행하던 중, 기존 주로 제조되었던 소나무 추출물인 소나무 열수 추출물을 제조하고 남은 잔여물에 헥산 용매를 첨가하고 추가로 추출과정을 수행하는 경우, 항균활성이 강하고, 항균 스펙트럼이 넓을 뿐만 아니라 항산화 활성도 뛰어난 추출물을 제조할 수 있다는 점을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 있어서, 소나무(Pinus densiflora)란 상록성 침엽교목으로서 우리나라를 비롯하여 중국이나 일본 등 전 아시아 지역의 임야에서 널리 자생하고, 저비용으로 손쉽게 솔잎을 얻을 수 있는 장점이 있다. 상기 소나무는 일 예로 적송(Pinus densiflora Sieb & Zucc.), 해송(Pinus thumbergii Parlatore), 금강소나무(Pinus densiflora Sieb & Zucc. For. erecta Uyeki), 구주소나무(Pinus sylvestris L.), 솔잣나무(Pinus pinea Cupressus Sempervirens) 등일 수 있고, 바람직하게는 적송일 수 있다.
본 발명에 있어서, 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 물질이란 균에 대한 항균 활성과 항산화 활성을 모두 가진 물질을 의미하며, 조성물 또는 추출물일 수 있다.
본 발명은 소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 소나무(Pinus densiflora) 잎 분말을 제조하는 단계; 상기 소나무 잎 분말에 물을 첨가하고 열수 추출법을 수행하는 단계; 상기 열수 추출에 의해 제조된 추출액을 제거하고, 소나무 잎 분말 잔류물을 수득하고 건조시키는 단계; 및 상기 건조된 소나무 잎 분말 잔류물에 헥산을 첨가하고 용매 추출법을 수행하는 2차 추출 단계를 포함하는 소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 소나무(Pinus densiflora) 잎 분말을 제조하는 단계는 상기 소나무 잎을 세척하는 공정; 상기 세척된 소나무 잎을 건조하는 공정 및 상기 건조된 소나무 잎을 분말화하는 공정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 소나무 잎을 분말하는 공정은 소나무 잎과 추출용매의 접촉면적을 최대로 증가시켜 추출수율을 높이기 위한 것으로, 최종 단계에서 수득된 추출물의 항산화 활성 및 항균 활성 물질을 최대한 유지하면서, 추출 수율을 높이기 위하여, 상기 소나무 잎을 50 내지 70℃, 바람직하게는 60℃에서 열풍건조하고 파쇄하는 방법으로 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 소나무 잎을 건조하는 공정은 60℃ 조건에서 열풍 건조법으로 수행할 수 있고, 상기 분말화하는 공정은 믹서 또는 분쇄기를 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 분말화하는 공정은 믹서 또는 분쇄기를 이용하여 건조된 소나무 잎을 분쇄한 후, 체를 이용하여 균질화하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 소나무 잎 분말에 물을 첨가하고 열수 추출법을 수행하는 단계는 추출수율을 높이면서도, 유효성분의 파괴를 최소화하기 위하여, 60℃ 내지 100℃, 바람직하게는 70℃ 내지 90℃, 더욱 바람직하게는 75℃ 내지 85℃, 가장 바람직하게는 80℃에서 수행할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 열수 추출법을 수행하는 단계는 상기 소나무 잎 분말 1 kg을 기준으로 열수 750 ml 내지 1,850 ml, 바람직하게는 1,000 ml 내지 1,600 ml, 더욱 바람직하게는 1,200 ml 내지 1,400 ml를 첨가하여 열수 추출법을 수행하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 열수 추출법의 온도 조건은 60℃ 내지 100℃, 바람직하게는 70℃ 내지 90℃, 더욱 바람직하게는 75℃ 내지 85℃, 가장 바람직하게는 80℃일 수 있고, 상기 열수 추출과정의 기간은 4시간 내지 24시간, 바람직하게는 6시간 내지 20시간, 더욱 바람직하게는 8시간 내지 16시간, 가장 바람직하게는 12시간일 수 있다.
상기 소나무 잎 분말 잔류물을 수득하고 건조시키는 단계는 상기 열수 추출법을 수행한 후, 소나무 열수 추출액을 포함한 액체를 제거하고, 남아 있는 소나무 잎 분말 잔류물을 수득하는 과정 및 상기 수득된 잔류물을 건조하는 과정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 소나무 열수 추출액을 포함한 액체를 제거하는 과정은 상기 열수 추출법을 수행한 결과물을 여과하여, 액체를 제거하고 고체 즉, 소나무 잎 분말 잔류물을 수득하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 여과 과정은 일 예로, 여과지를 이용하는 여과법으로 수행할 수 있다.
상기 과정에 의해 수득된 소나무 잎 분말 잔류물은 일반적으로 소나무 열수 추출액 제조 과정에서 순도 또는 제품의 품질 향상을 위해 추출과정을 수행한 후, 여과과정을 추가로 수행하고, 그 과정에서 제거되는 부산물과 같은 것으로 받아들여졌으나, 본 발명에서는 상기 열수 추출과정에서 수득되는 상기 소나무 잎 분말 잔류물를 이용하여 항균 활성 및 항산화 활성을 갖는 물질 즉, 추출물을 추가로 생산하는 것이므로, 자원 절약 및 환경 보호란 측면에서 그 경제적 효과 및 환경적 효과가 더욱 크다고 할 것이다.
상기 수득된 잔류물을 건조하는 과정은 통상의 분말 건조법, 일 예로 건조기를 이용한 건조법을 통하여 수행할 수 있다.
상기 2차 추출단계는 상기 건조된 소나무 잎 분말 잔류물에 헥산을 첨가하고 용매 추출하는 방법으로 수행할 수 있다.
상세하게, 상기 용매 추출법은 용매의 특성과 유효성분의 안정성을 고려하여 추출수율을 높이면서도, 유효성분의 파괴를 최소화하기 위하여, 40℃ 내지 80℃, 바람직하게는 50℃ 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 55℃ 내지 65℃, 가장 바람직하게는 60℃에서 수행할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 2차 추출단계는 상기 열수 추출 전 사용된 소나무 잎 분말 1 kg을 기준으로, 헥산 750 ml 내지 1,850 ml, 바람직하게는 1,000 ml 내지 1,600 ml, 더욱 바람직하게는 1,200 ml 내지 1,400 ml를 첨가하여 용매 추출법을 수행하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 헥산을 이용한 용매 추출법의 온도 조건은 40℃ 내지 80℃, 바람직하게는 50℃ 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 55℃ 내지 65℃, 가장 바람직하게는 60℃일 수 있고, 상기 열수 추출과정의 기간은 4시간 내지 24시간, 바람직하게는 6시간 내지 20시간, 더욱 바람직하게는 8시간 내지 16시간일 수 있다.
상기 2차 추출과정에 의해 수득된 항균 활성 및 항산화 활성을 갖는 추출물에 대해서 사용조건 및 사용방법에 따라, 추가로 여과지를 이용한 여과과정, 감압농축법 등을 이용한 농축과정 또는 동결건조법 등을 이용한 건조과정을 추가로 수행할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 추출방법은 기존 소나무 열수 추출물 제조 공정에서 부산물로 폐기 등의 처리를 하였던 잔류물을 재사용함으로써, 환경적인 측면과 경제적인 측면이 우수할 뿐만 아니라, 본 발명의 추출방법에 의해 제조된 추출물은 기존 소나무 추출물에 비하여 항균 스펙트럼이 넓고, 항균 활성이 우수할 뿐만 아니라 항산화 활성도 우수하다는 장점이 있다.
따라서, 본 발명의 추출방법에 의해 제조된 추출물은 뛰어난 항균 활성 및 항산화 활성에 의해, 식품, 화장품 또는 의약품 등과 같은 장기 보관이 요구되는 제품의 부패나 변질을 억제하고 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 뛰어난 항산화 활성이 있으므로, 이러한 항산화 활성과 관련하여 각종 질병의 완화 또는 예방을 위하거나, 피부 노화 등의 노화 방지의 목적 등과 관련된 다양한 기능을 갖는 식품, 일 예로 기능성 식품의 원료로 사용될 수 있다.
본 발명은 기존 방법에서 부산물로 폐기 등의 처리를 하였던 잔류물을 사용하여 항균 활성 및 항산화 활성이 우수한 물질, 즉 항균 활성 및 항산화 활성이 우수한 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 기존 추출법에 의해 제조된 추출물에 비하여 항균 스펙트럼도 넓고, 항균 활성도 우수할 뿐만 아니라, 항산화 활성도 우수하고, 기존 열수 추출법을 이용한 추출물 제조 과정에서 부산물로 폐기 등의 처리를 하였던 잔류물을 사용하는 것이므로 경제성뿐만 아니라 환경적인 측면에서도 우수하여, 식품 또는 화장품과 같은 부패나 변질을 억제하고 예방해야 하는 제품이 사용되는 식품, 의약품 또는 화장품 등의 첨가제 또는 기능성 원료로 다양한 산업분야에 폭 넓게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 추출물을 제조하는 과정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 항균활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 상기 도 2에서 1은 본 발명의 추출법에 의해 제조된 열수 추출법을 수행한 후, 헥산 용매 추출법을 추가로 수행한 추출물(HWH)의 항균 활성을 측정한 사진이고, 2는 열수 추출법을 수행한 후, 에탄올 용매 추출법을 추가로 수행한 비교예(HWE)의 항균 활성을 측정한 사진이며, 3은 헥산 용매 추출법에 의해 제조된 추출물의 항균 활성을 측정한 사진이고, 4는 에탄올 용매 추출법에 의해 제조된 추출물의 항균 활성을 측정한 사진이며, 5는 열수 추출법에 의해 제조된 추출물의 항균 활성을 측정한 사진이고, A는 상기 추출물을 50 mg/ml 처리한 디스크(paper disk)를 나타내고, B는 상기 추출물을 5 mg/ml 처리한 디스크(paper disk)를 나타내며, C는 상기 추출물을 0.5 mg/ml 처리한 디스크(paper disk)를 나타내고, D는 상기 추출물을 0.05 mg/ml 처리한 디스크(paper disk)를 나타내며, 도 2a는 대장균(E. coli)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이고, 도 2b는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이고, 도 2c는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이고, 도 2d는 PRSA(penicillin resistant Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이고, 도 2e 및 도 2f는 MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 항산화활성에 관한 일 실시예에 따른 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 항산화활성에 관한 일 실시예에 따른 추출물의 FRAP assay(Ferric-reducing antioxidant power)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 4에서 BHT는 butylated hydroxytoluene를 의미하고, Proanthocyanidin은 96% grape seed proanthocyanidin을 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 추출물의 항균활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 상기 도 2에서 1은 본 발명의 추출법에 의해 제조된 열수 추출법을 수행한 후, 헥산 용매 추출법을 추가로 수행한 추출물(HWH)의 항균 활성을 측정한 사진이고, 2는 열수 추출법을 수행한 후, 에탄올 용매 추출법을 추가로 수행한 비교예(HWE)의 항균 활성을 측정한 사진이며, 3은 헥산 용매 추출법에 의해 제조된 추출물의 항균 활성을 측정한 사진이고, 4는 에탄올 용매 추출법에 의해 제조된 추출물의 항균 활성을 측정한 사진이며, 5는 열수 추출법에 의해 제조된 추출물의 항균 활성을 측정한 사진이고, A는 상기 추출물을 50 mg/ml 처리한 디스크(paper disk)를 나타내고, B는 상기 추출물을 5 mg/ml 처리한 디스크(paper disk)를 나타내며, C는 상기 추출물을 0.5 mg/ml 처리한 디스크(paper disk)를 나타내고, D는 상기 추출물을 0.05 mg/ml 처리한 디스크(paper disk)를 나타내며, 도 2a는 대장균(E. coli)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이고, 도 2b는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이고, 도 2c는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이고, 도 2d는 PRSA(penicillin resistant Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이고, 도 2e 및 도 2f는 MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 항산화활성에 관한 일 실시예에 따른 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 항산화활성에 관한 일 실시예에 따른 추출물의 FRAP assay(Ferric-reducing antioxidant power)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 4에서 BHT는 butylated hydroxytoluene를 의미하고, Proanthocyanidin은 96% grape seed proanthocyanidin을 의미한다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 추출물의 제조방법
본 실험에 사용한 소나무 잎은 2007년 7월 지리산에서 채취한 적송잎으로, 상기 적송잎을 물로 세척하고 60℃에서 열풍건조한 후, 믹서로 분말화시켜 제조하였다.
본 발명의 실시예인 열수헥산 추출물(Hot water-hexane, HWH)과 비교예 1 내지 비교예 4는 도 1에 기재된 방법에 의해 제조하였다.
보다 구체적으로, 비교예 1인 적송잎 열수 추출물은 상기 적송잎 분말 3 kg에 물 4,000 ml를 첨가하여 80℃에서 12시간 동안 정치하여 추출하는 과정으로 제조하였다. 비교예 2인 헥산 추출물은 상기 적송잎 분말 3 kg에 헥산 4,000 ml를 첨가하여 60℃에서 12시간 동안 정치하여 추출하는 과정으로 제조하였다. 비교예 3인 에탄올 추출물은 상기 적송잎 분말 3 kg에 에탄올 4,000 ml를 첨가하여 80℃에서 12시간 동안 정치하여 추출하는 과정으로 제조하였다. 비교예 4인 열수에탄올 추출물(Hot water-ethanol, HWE)은 상기 적송잎 분말 3 kg에 물 4,000 ml를 첨가하고, 80℃에서 12시간 동안 추출한 뒤 여과하여, 추출액을 포함한 액체를 제거하고 남은 잔류물을 수거해 건조시킨 후, 추가로 에탄올 4,000 ml를 첨가하고 80℃에서 12시간 동안 용매 추출법을 수행하여 제조하였다.
본 발명의 실험예인 열수헥산 추출물은 상기 적송잎 분말 3 kg에 물 4,000 ml를 첨가하고, 80℃에서 12시간 동안 추출한 뒤 여과하여, 추출액을 포함한 액체를 제거하고 남은 잔류물을 수거해 건조시킨 후, 추가로 헥산 4,000 ml를 첨가하고 60℃에서 12시간 동안 용매 추출법을 수행하여 제조하였다.
상기 제조한 각각의 추출물은 모두 여과지(Whatman No 3, England)를 이용하여 여과한 다음, 회전 증류기(rotary evaporator)를 이용하여 60℃에서 감압농축한 후 동결 건조하였다. 상기 동결건조된 각각의 추출물은 항균 활성 및 항산화 활성을 위한 실험 전까지 -20℃에 보관하였다.
실시예
2: 추출물의 항균활성 측정
실시예
2-1.
사용균주
및 배지
항균활성 측정에는 그람 양성 대표세균인 B. subtilis(ATCC 6633), 그람 음성 대표세균인 E. coli (KCTC 2223), 황색포도상구균(S. aureus) 표준균주(ATCC 33594), 페니실린(penicillin)에 대해 내성을 나타내는 PRSA (penicillin resistant S. aureus, ATCC 13301) 및 methicillin에 대해 내성을 나타내는 MRSA(methicillin resistant S. aureus, ATCC 33591 및 ATCC 33593)를 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, 대한민국)로부터 분양받아 사용하였다.
생장배지로는 B. subtilis와 E. coli는 Luria-Bertani 배지(LB 배지, 10 g bacto tryptone, 5 g yeast extract, 50 g NaCl, 증류수 1 L)를 사용하였고, 황색포도상구균, PRSA 및 MRSA는 nutrient 배지(30 g beef extract, 50 g peptone, 증류수 1 L)를 사용하였다.
실시예
2-2. 항균활성 측정(
Paper
Disk
method
)
상기 실시예 1에서 제조된 추출물의 항균활성 측정은 페이퍼 디스크법(paper disc method)으로 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 2-1의 각 균주를 상기 실시예 2-1의 액체 배지 4 ml에 접종하여 37℃에서 18시간씩 3회 계대 배양한 뒤, 시험균 농도를 650 nm에서 optical density(O.D) 값이 0.5가 되도록 배양하였다. 상기 배양을 마친 후, 한천 배지(agar plate)에 골고루 도말하고, 배지 표면 위에 지름이 6 mm인 멸균 디스크(disc)를 고정시켰다. 상기 실시예 1에서 제조한 동결건조한 추출물을 최종 농도가 0.005mg/ml, 0.05mg/ml, 0.5mg/ml, 5mg/ml 및 50 mg/ml가 되도록 농도를 조절하여 dimethlysulfoxide(DMSO)로 녹이고, membrane filter(0.45 μm)로 제균시킨 후에, 상기 제균시킨 각 농도의 추출물을 각 5 μl씩 디스크에 완전히 흡수시켰다.
상기 각 균을 도말시킨 배지에, 상기 추출물을 완전히 흡수시킨 디스크를 배치시키고, 37℃의 배양기(incubator)에서 24시간 동안 배양시켰다. 상기 배양 후, 배지에 형성된 생육저해환(clear zone)을 비교 관찰하여, 항균활성을 확인하였으며, 그 결과를 도 1 및 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에 기재된 저해환의 크기는 저해환의 지름에서 디스크의 지름(6 mm)를 차감한 크기이고, '-' 표시는 저해환이 생기지 않은 것을 의미한다. 상기 균주 중, 그람 음성 세균에 해당하는 장내세균인 대장균(E. coli)의 경우에는 실험예 및 비교예 모두 모든 농도에서 저해환이 발생되지 않는 것으로 확인되어, 소나무 잎의 용매 추출물은 대장균에 대해서는 항균 활성을 갖지 않는 것으로 확인되었다.
| 추출물 종류 |
농도 (mg/ml) |
저해환 크기(mm) | ||||
| 균주 | ||||||
|
Bacillus
subtilis
|
S. aureus (ATCC 33594) |
PRSA (ATCC 13301) |
MRSA (ATCC 33591) |
MRSA (ATCC 33593) |
||
| HWH | 50 5 0.5 0.05 0.005 |
12.12±0.07 11.52±0.14 9.66±0.17 2.60±0.12 - |
13.12±0.30 10.52±0.27 9.32±0.17 8.66±0.17 - |
13.72±0.13 13.46±0.26 9.66±0.17 8.32±0.17 - |
15.32±0.33 12.80±0.30 10.20±0.17 7.34±0.17 - |
13.20±0.30 11.66±0.17 9.66±0.17 8.32±0.17 - |
| HWE | 50 5 0.5 0.05 0.005 |
11.86±0.07 10.86±0.23 8.66±0.09 1.80±0.10 - |
12.00±0.13 10.8±0.21 8.00±0.08 8.66±0.17 - |
13.00±0.29 11.60±0.14 11.20±0.16 7.32±0.17 - |
14.12±0.52 11.00±0.28 9.32±0.17 8.00±0.08 - |
14.12±0.07 8.34±0.17 8.34±0.17 7.32±0.17 - |
| Hexane | 50 5 0.5 0.05 0.005 |
8.14±0.07 7.00±0.09 - - - |
12.00±0.07 10.80±0.21 8.00±0.16 8.66±0.17 - |
9.32±0.24 7.86±0.07 7.00±0.13 - - |
11.00±0.28 8.32±0.17 7.20±0.10 - - |
10.00±0.09 8.14±0.06 7.00±0.05 - - |
| Ethanol | 50 5 0.5 0.05 0.005 |
7.14±0.08 6.13±0.09 - - - |
8.34±0.16 7.00±0.19 - - - |
9.32±0.17 7.52±0.26 - - - |
8.32±0.17* 7.32±0.17* - - - |
8.20±0.10 7.00±0.13 - - - |
| Hot water | 50 5 0.5 0.05 0.005 |
- - - - - |
32.00±1.73 23.32±1.15 16.66±0.57 - - |
- - - - - |
39.32±1.52 18.00±1.73 16.00±1.00 - - |
29.20±1.53 22.00±1.00 16.60±0.58 - - |
상기 도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 비교예 1인 열수 추출물(Hot water)의 경우에는 황색포도상구균의 표준 균주인 S. aureus ATCC 33594와 메티실린(methicillin) 내성균주(MRSA)인 MRSA ATCC 33591 및 MRSA ATCC 33593에 대해서만 항균활성을 보이고, 식품의 부패에 대한 대표적 원인균 중 하나인 고초균(B. subtilis)에 대해서는 항균 활성이 없는 것으로 확인되어, 항균 스펙트럼이 좁은 것으로 확인되었다.
본 발명의 실험예 및 비교예 1을 제외한 비교예 2 내지 비교예 4의 경우에는 식품 부패의 대표적 원인균인 고초균 및 황색포도상구균과 항생제 내성균인 PRSA 및 MRSA에 대해 모두 항균 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
상기 실험예 및 비교예 2 내지 비교예 4 중에서, 실험예인 열수헥산 추출물(Hot water-hexane, HWH)의 항균 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 열수헥산 추출물은 모든 균주에 대하여 0.05 mg/ml의 농도에서부터 저해환이 확인되어 항균 활성을 갖는 것으로 확인된 반면, 비교예 3인 에탄올 추출물의 경우에는 이의 100 배인 5 mg/ml의 농도에서부터 저해환이 확인되었고, 비교예 2인 헥산 추출물의 경우에는 고초균에 대해서는 5 mg/ml의 농도에서부터 저해환이 확인되었으며, 항생제 내성이 있는 황색포도상구균인 PRSA 및 MRSA에 대해 0.5 mg/ml의 농도에서부터 저해환이 확인되었다.
또한, 비교예 4인 열수에탄올 추출물의 경우에는 실험예와 동일한 함량인 0.05 mg/ml의 농도에서부터 저해환이 확인되기는 하였으나, 항균 활성과 관련하여, 대부분 저해환의 크기가 1 mm 이상 적은 것으로 확인되어 실험예인 열수헥산 추출물에 비하여 항균 활성이 낮은 것으로 확인되었다.
즉, 본 발명의 실험예인 열수헥산 추출물은 고초균, 황색포도상구균 표준균주 및 항생제 내성균주인 PRSA와 MRSA에 대해 모두 항균 활성을 가지고 있고, 최소저해농도(MIC, minimum inhibitory concentration)의 측면에서 헥산 추출물(비교예 2) 및 열수 추출물(비교예 1)에 비해서는 10%, 에탄올 추출물(비교예 4)에 비해서 약 1%로 항균 활성이 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.
실시예
2-3.
열안정성의
측정
대부분의 가공식품들은 기호성이나 저장성을 높이기 위해 열처리 공정을 거치는 경우가 많기 때문에, 식품의 보존성 향상 또는 식품의 변질 방지를 위해 첨가 또는 처리되는 물질은 열에 안정한 항균성을 가질 것이 요구된다.
이러한 측면에서, 상기 실시예 1에서 제조된 추출물의 항균활성의 열 안정성을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
우선, 상기 실시예 1에서 제조된 추출물을 최종 농도가 50 mg/ml가 되도록 농도를 조절하여 dimethlysulfoxide(DMSO)로 녹이고, membrane filter(0.45 μm)로 제균시켰다. 상기 제균시킨 추출물을 80℃에서 60분, 100℃ 또는 121℃에서 10분 또는 20분간 열처리한 후, 상기 각각의 조건에서 열처리한 추출물을 각 5 μl씩 디스크에 완전히 흡수시켰다.
상기 디스크를 이용하여 상기 실시예 2-2의 방법으로 페이퍼 디스크법(paper disc method)을 수행하였다. 보다 구체적으로, 상기 각 균을 도말시킨 배지에, 상기 열처리한 추출물을 완전히 흡수시킨 디스크를 배치시키고, 37℃의 배양기(incubator)에서 24시간 동안 배양시켰다. 상기 배양 후, 배지에 형성된 생육저해환(clear zone)을 비교 관찰하여, 항균활성을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2에 기재된 저해환의 크기는 저해환의 지름에서 디스크의 지름(6 mm)를 차감한 크기이고, '-' 표시는 저해환이 생기지 않은 것을 의미한다.
| 추출물 종류 |
열처리 조건 (℃/min) |
저해환 크기(mm) | ||||
| 균주 | ||||||
| Bacillus subtilis (ATCC 6633) |
S. aureus (ATCC 33594) |
PRSA2) (ATCC 13301) |
MRSA3) (ATCC 33591) |
MRSA (ATCC 33593) |
||
| HWH | 80/60 100/10 100/20 121/10 121/20 |
12.12±0.32 12.23±0.05 12.53±0.19 12.60±0.17 12.17±0.21 |
13.22±0.24 13.43±0.14 13.32±0.17 13.18±0.19 13.44±0.21 |
13.32±0.13 13.16±0.16 13.22±0.19 13.52±0.13 13.24±0.22 |
15.62±0.15 15.45±0.28 15.23±0.13 15.56±0.08 15.41±0.05 |
13.20±0.21 13.24±0.14 13.16±0.17 13.30±0.19 13.53±0.24 |
| HWE | 80/60 100/10 100/20 121/10 121/20 |
11.43±0.08 11.52±0.21 11.21±0.07 11.28±0.13 11.43±0.21 |
12.20±0.22 12.14±0.15 12.32±0.11 12.54±0.07 12.11±0.09 |
13.33±0.29 13.42±0.14 13.21±0.16 13.11±0.07 13.32±0.09 |
14.53±0.21 14.33±0.14 14.51±0.19 14.11±0.09 14.67±0.05 |
14.22±0.07 14.16±0.07 14.52±0.21 14.13±0.17 14.32±0.22 |
| Hexane | 80/60 100/10 100/20 121/10 121/20 |
8.14±0.07 8.00±0.13 8.34±0.37 8.33±0.13 8.21±0.09 |
12.22±0.09 12.36±0.21 12.22±0.07 12.37±0.22 12.29±0.19 |
9.13±0.14 9.22±0.09 9.07±0.21 9.31±0.22 9.28±0.20 |
11.22±0.17 11.35±0.09 11.38±0.08 11.30±0.19 11.27±0.28 |
10.11±0.13 10.13±0.05 10.00±0.07 10.16±0.13 10.22±0.20 |
| Ethanol | 80/60 100/10 100/20 121/10 121/20 |
7.67±0.07 7.88±0.16 7.66±0.21 7.80±0.15 7.59±0.09 |
8.54±0.06 8.61±0.09 8.69±0.13 8.49±0.22 8.59±0.07 |
9.52±0.07 9.59±0.15 9.62±0.19 9.68±0.21 9.62±0.09 |
8.42±0.20 8.62±0.16 8.92±0.11 8.76±0.09 8.88±0.07 |
8.22±0.12 8.10±0.18 8.20±0.11 8.31±0.09 8.35±0.07 |
| Hot water | 80/60 100/10 100/20 121/10 121/20 |
- - - - - |
30.50±0.22 30.77±0.30 31.21±0.19 29.55±0.19 30.89±0.36 |
- - - - - |
37.59±0.28 37.32±0.52 36.87±0.38 37.89±0.76 36.87±0.07 |
27.50±1.53 27.88±1.00 26.37±0.58 28.57±0.68 27.72±0.07 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 각 조건에서 수행한 각 추출물의 경우, 상기 표 1에 열처리를 수행하지 않은 비열처리 시료를 50 mg/ml를 처리한 것과 비교하여, 생육저해환의 크기의 변화가 거의 없는 것으로 보아 상기 실시예 1에서 제조한 적송잎 추출물의 항균 활성은 열에 대하여 안정한 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 표 2에 의하면 본 발명의 실험예인 열수헥산 추출물의 경우 항균 스펙트럼이 넓고, 항균활성이 우수할 뿐만 아니라, 열에 대한 안정성도 우수하여, 유해균에 의한 제품의 부패 또는 변질을 억제 또는 예방하기 위한 용도로 널리 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
실시예
3: 추출물의 항산화 활성 측정
실시예
3-1:
DPPH
법에 의한 전자
공여능을
통한 항산화 활성 측정
실시예 1에서 제조된 추출물의 항산화 활성과 관련하여, 자유 라디칼의 제거능(free radical scavenging)을 Brand-Williams의 방법을 응용한 DPPH 법(DPPH method)으로 측정하였다.
보다 구체적으로, 각 추출물을 99% 메탄올(99% methanol)에 여러 농도(최종농도: 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 250 μg/ml 및 500 μg/ml)로 희석시켰다.
적송잎 추출물의 전자 공여능은 1,1-diphenyl1-2-picrylhydrayl(DPPH, Sigma)를 사용하여 측정하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 추출물 1 ml와 DPPH 용액(5.9 mg / 100 ml in methanol) 2 ml를 혼합한 후, 실온 및 차광 조건에서 30분간 반응(incubation)시켰다. 상기 반응 후에, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 DPPH 자유라디칼 제거능은 하기 계산식 1에 의해 계산하였다. 하기 계산식 1에서 A0는 상기 추출물로 반응하기 전의 대조군(control)의 흡광도를 의미하고, A1은 해당 추출물로 반응시킨 후 측정된 흡광도를 의미한다. 상기 측정된 흡광도를 도 3 및 하기 표 3에 나타내었다.
[계산식 1]
DPPH 자유라디칼 소거능(%) = [(A0-A1)/A0] X 100
| 추출물 종류 | 항산화 활성(IC50, μg/ml) |
| 실험예 1(HWH) | 53 ± 0.49 |
| 비교예 1(Hot water) | 102 ± 0.96 |
| 비교예 2(Hexane) | 82 ± 0.73 |
| 비교예 3(Ethanol) | 120 ± 1.37 |
| 비교예 4(HWE) | 140 ± 0.62 |
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 실험예 1의 열수헥산 추출물이 가장 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 10 μg/ml 내지 250 μg/ml의 농도 범위에서 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 것이 확인되었고, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, IC50에서도 53 μg/ml로 가장 우수한 것으로 확인되었다. 반면, 비교예 중에서 항균 활성이 우수한 것으로 확인되었던, 비교예 4(HWE)의 경우에는 항산화 활성이 가장 나쁜 것으로 확인되었다. 또한, 열수 추출물(비교예 1) 및 에탄올 추출물(비교예 3)의 경우에는 IC50에서도 100 μg/ml가 넘는 것으로 확인되어, 본 발명의 실험예인 열수헥산 추출물은 다른 추출법에 의해 제조된 추출물에 비하여 항산화활성이 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.
실시예
3-2: 추출물의 항산화 활성
측정2
(
FRAP
assay
에 의한 조사)
실시예 1에서 제조된 추출물의 항산화 활성과 관련하여, Benzie and Strain의 방법을 응용하여 FRAP assay를 수행하였다. 상기 FRAP assay는 항산화제에 의하여 산화 제3철(Fe3 +)을 산화 제2철(Fe2 +)로 환원되는 정도를 측정하여, 항산화제의 항산화능을 확인하는 방법이다.
보다 구체적으로, 각 추출물을 99% 메탄올에 여러 농도(최종농도: 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 250 μg/ml 및 500 μg/ml)로 희석한 후, 희석시료 1 ml에 0.2 M potassium phosphate buffer(pH 6.6) 2.5 ml 및 1% (w/v) potassium ferricyanide(MP biomedicals LLC, USA) 2.5 ml를 첨가하고 혼합하였다. 상기 혼합용액을 50℃에서 20분 동안 반응시킨 후 실온까지 냉각시켰다. 그 후, 10% trichloroacetic acid(Junsei Kagaku, 일본)을 2.5 ml 첨가한 후, 시료 2.5 ml를 분리하고, 2차 증류수(ddH2O) 2.5 ml와 혼합하였다. 상기 증류수를 혼합한 시료에 0.1%(w/v) FeCl3 0.5 ml를 첨가하고, 30분간 반응시켰다. 상기 반응 후에, 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교군으로 항산화능이 확인된 비타민 C(L-(+)-ascorbic acid, Sigma, USA), 갈산(gallic acid), 프로안토시아니딘(PA) 및 BHT(butylated hydroxytoluene, Sigma, USA)를 사용하였다. 상기 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 실험예의 열수헥산 추출물이 환원력이 가장 높아 가장 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 실험예의 열수헥산 추출물은 기존에 항산화 활성이 뛰어난 것으로 알려진 비교군 중에서 프로안토시아니딘 및 BHT 보다 더욱 우수한 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 열수헥산 추출법에 의해 생산된 추출물은 항산화능이 기존 다른 추출법에 의해 생산된 추출물 보다 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 추출법에 의해 제조된 추출물은 기존 추출법에 의해 제조된 추출물에 비하여, 식품 부패 또는 변질과 관련된 균주에 대한 항균 스펙트럼이 넓고, 항균 활성도 우수할 뿐만 아니라 항산화 활성도 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 우리나라 전역에 분포되어 있는 소나무로부터 수득한 소나무 잎을 이용하는 것일 뿐만 아니라, 일반적으로 소나무 열수 추출물을 제조하는 과정에서 발생되는 부산물로 폐기 등의 처리를 하였던 잔류물을 재사용한다는 점에서 경제적 측면 및 환경적인 측면에서 우수한 장점이 있다.
따라서, 본 발명의 추출물 제조방법에 의해 제조된 추출물은 장기간 보관이 요구되고, 보관 중에 부패나 변질을 억제하고 예방해야 하는 제품이 사용되는 식품, 의약품 또는 화장품 등과 관련된 다양한 산업분야에 폭 넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (2)
- 소나무(Pinus densiflora) 잎을 열풍건조한 후 분말화하여 소나무 잎 분말을 제조하는 단계;
상기 소나무 잎 분말에 물을 첨가하고 80℃의 조건에서 12시간 동안 열수 추출법을 수행하는 단계;
상기 열수 추출에 의해 제조된 추출액을 제거하고, 소나무 잎 분말 잔류물을 수득하고 건조시키는 단계; 및
상기 건조된 소나무 잎 분말 잔류물에 헥산을 첨가하고 60℃의 조건에서 12시간 동안 용매 추출법을 수행하는 2차 추출 단계
를 포함하는 소나무로부터 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) 및 PRSA(penicillin resistant Staphylococcus aureus)에 대하여 항균 활성을 가진 추출물을 제조하는 방법. - 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100082800A KR101216729B1 (ko) | 2010-08-26 | 2010-08-26 | 소나무로부터 항균 활성 및 항산화 활성을 가진 물질을 생산하는 방법 |
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| 논문1: 한국식품저장유통학회지 |
| 논문2: 생명과학회지 |
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