KR102606728B1 - 철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 hdb8077 균주 및 이의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물 - Google Patents
철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 hdb8077 균주 및 이의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주(Bacillus siamensis HDB8077 strain, 수탁번호 KCCM12989P) 및 상기 균주의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 배양물은 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주 배양액에 철피석곡 꽃 분말을 첨가하여 배양한 것으로서 모근강화 효능, 모발성장 효능, 남성형 탈모 완화 효능, 세라마이드 생합성 효소의 발현 증강 효능 등이 있어 다기능성 모발용 조성물로 용이하게 이용가능하다.
Description
본 발명은 철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주(Bacillus siamensis HDB8077 strain, 수탁번호 KCCM12989P) 및 상기 균주의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물에 관한 것이다.
사람의 모발은 피부 및 두피를 보호하는 일차적인 역할 뿐 아니라, 사회적 및 성적 의사소통에 있어서 고유의 역할을 하므로 매우 중요하다.
모발의 주기는 생장기(anagen phase), 퇴행기(catagen phase), 휴지기(telogen phase)로 구성되며, 주기를 반복하면서 발모와 탈모를 반복하며 모발을 유지한다. 모발의 생장기는 남성 3~5년, 여성 4~6년, 퇴화기는 30~45일, 휴지기는 3~4개월 정도이다. 휴지기의 최종 단계가 되면 자연적으로 새로운 모발이 생성되는 발생기가 시작되어 모발이 유지된다. 탈모는 자연스러운 현상이므로, 탈모질환으로 인식되는 탈모증(Alopecia)은 상대적으로 휴지기 상태의 모발이 많아 모발이 적어 보이는 상태를 말한다.
탈모의 원인은 아직 정확히 알려지지 않았으나, 모발의 성장에 영향을 미치는 주요인자로, 모발의 주기 조절과 관련된 모유두(dermal papilla)의 증식 억제 또는 기능저하, 남성호르몬 작용에 의한 모발주기의 비정상화, 두피로의 혈류량 저하로 인한 모발 주기의 비정상적변화, 항압제, 정신적 스트레스, 물리적 자극 및 환경오염 등이 거론되고 있다.
과거에는 중, 장년층에서 탈모가 주로 빈발했지만, 최근에는 무스, 퍼머, 염색, 드라이 열에 의한 모발과 두피 손상, 사회 환경적인 스트레스의 증가, 식생활의 서구화로 인한 음식의 변화 등이 원인이 되어 20~30대 젊은 층에서도 두드러지게 탈모가 발생하고 있으며, 또한 남성형 탈모 뿐만 아니라 여성형 탈모도 증가하고 있는 추세이다.
이러한 이유로 전 세계적으로 탈모 방지를 위한 많은 치료제들이 시판되고 있으나, 아직도 치료효과를 만족할 수 있는 약물이나 기술은 미미한 실정이다. 현재 탈모 초기에는 국소 도포제인 '미녹시딜(minoxidil)'이나 경구용 약제인 '프로페시아(finasteroid 성분)'를 사용하면 어느 정도 탈모의 진행을 늦출 수 있는 것으로 알려져 있으나, 이미 진행된 탈모에 대해서는 정상으로 회복하는데 어려움이 있으며, 원하지 않는 부위에서 체모가 자라거나, 발기부전, 성욕 감퇴 등의 성기능 저하와 어지럼증, 두통, 부종 및 피부 발진 등의 부작용이 나타날 수 있으며, 복용 시 기형아 출산의 우려가 있어 여성에게 처방될 수 없는 문제점이 있다.
이 가운데 '미녹시딜'은 미국 FDA의 승인을 받은 약물로 정확한 치료 기전은 아직 명확하지 않으나, 다양한 성장인자와 같은 단백질 분비를 통해 모발주기에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있는 모유두 세포(dermal papilla cells; DPCs)의 세포사멸(apoptosis) 저하를 통해 모유두 세포(DPCs)의 성장을 증식시키는 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 또한, 5-알파 리덕타제(5-alpha reductase) 억제제인 '프로페시아'와 같은 약물들은 탈모를 유발하는 남성 호르몬인 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)의 생성을 억제시켜 남성형 탈모가 진행되는 것을 예방하는 것으로 알려져 있어, 어떠한 물질에 대한 5-알파 리덕타제(5-alphareductase)의 활성 억제 효과나 모유두 세포(DPCs)의 성장 증식 효과를 측정하는 것은 해당 성분이 얼마나 효과적으로 탈모를 방지하고 모발 성장에 기여하는지를 알 수 있는 지표로 활용될 수 있다.
모발은 케라틴 단백질로 구성되어 있으며, 진피에 있는 모낭으로부터 발생하여 성장한다. 두피 모낭은 모유두 세포, 각질형성세포, 내측 및 외측 모근초 세포, 및 멜라노사이트로 구성되어 있고, 이 중 모낭 모유두 세포는 특수 섬유모세포의 하나로, 모낭 발생의 기초가 된다. 또한, 모낭 모유두 세포는 모발 성장과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다.
최근 다양한 연구기관에서 육모 및 탈모 기전에 관여하는 많은 조절인자들에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 성장기, 퇴행기 및 휴지기의 모발주기에 관한 여러 인자들과 그들의 수용체를 이용한 육모효과에 대한 연구가 지속적으로 보고되고 있다. 모발의 성장에 영향을 미치는 성장인자로는 EGF 및 EGFF, VEGF 및 VEGFR, HGF/SF 및 c-MET, FGF 패밀리 및 FGFR, IGF 및 IGF-IR, TGF-β 및 TGF-βR 등이 있으며, 모유두의 활성을 조절하여 모발주기에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, 돌출 부위(bulge region)에 있는 모낭 줄기세포의 증식 또는 분화에 Wnt 경로(pathway) 및 Bmp 신호(signaling)가 결정적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.
한편, 최근 환경오염, 약물의 오남용 등에 따른 부작용과 함께 사회의 환경적인 스트레스 등으로 탈모 인구는 계속하여 증가하고 있으며, 젊은 층에서도 탈모현상 발생이 빈번해지고 있고, 외모를 중시 여기는 사회적 풍조의 변화로 인해 탈모 방지를 위한 새로운 제제들의 개발이 대두되고 있다.
또한, 현재 개발된 탈모 방지 제제들 중에서 특히 합성화합물 제제의 경우, 피부에 각종 부작용을 일으키는 문제점이 있어 최근에는 탈모 방지 효과를 가지는 제제를 천연으로부터 얻으려는 시도가 계속되고 있다.
이에, 본 발명자들은 철피석곡의 꽃으부터 분리된 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주 및 이의 철피석곡 꽃 배양물이 모근강화, 모발성장 촉진 또는 탈모방지 효능이 있어 모발성장 또는 탈모방지를 위한 헤어케어용 화장료 조성물로 이용 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주(Bacillus siamensis HDB8077 strain, 수탁번호 KCCM12989P) 및 상기 균주의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주(Bacillus siamensis HDB8077 strain, 수탁번호 KCCM12989P)에 관한 것이다.
상기 균주는 철피석곡 꽃의 헤어케어 기능을 증강시키는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 상기 균주는 철피석곡 꽃의 모근강화, 모발성장 촉진 또는 탈모방지 효능을 증강시키는 것을 특징을 한다.
또한 본 발명은 상기 균주의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 배양물은 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주의 배양액에 철피석곡 꽃 분말을 첨가한 후 30~40℃에서 20~48시간 동안 배양한 것이다.
상기 헤어케어 화장료 조성물은 모근강화, 모발성장 촉진 또는 탈모방지 효능이 있는 것을 특징으로 한다.
상기 철피석곡 꽃 배양물은 0.45㎛ 이하의 기공을 갖는 필터로 여과된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 필터로서 0.20~0.45㎛의 기공을 갖는 필터인 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 발모, 탈모개선, 두피개선 등을 위한 다양한 화장료 조성물로 제형화될 수 있다. 바람직하게는 헤어 비누, 헤어 샴푸, 헤어 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 헤어 로션, 헤어토닉, 헤어 무스, 헤어 스프레이, 헤어 겔, 헤어 팩, 헤어 앰플, 헤어 오일 등으로 제조가능하다.
상기 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주의 철피석곡 꽃 배양물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 수분을 제거할 수 있다. 또한, 상기 철피석곡 꽃 배양물은 물, 1,3-부틸렌글리콜 또는 이의 혼합용액과 같은 다양한 용매에 녹여 여러 형태의 제형으로 제조 가능하다.
철피석곡 꽃 배양 전, 전배양액 제조를 위한 본 발명의 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주의 배양조건은 100~200rpm, 30~40℃ 조건으로 60~72시간인 것이 바람직하다. 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주는 tryptic soy agar (TSA)에서 고체배양된 것을 tryptic soy broth(TSB)에 액체 배양하여 이용할 수 있다.
상기 철피석곡 꽃 배양물은 일반적으로 헤어 또는 두피 제품에 이용되는 성분 모두를 포함할 수 있다. 예를 들면 유화제, 점증제, 유제, 계면활성제, 윤활제, 알코올류, 수용성 고분자제, 겔화제, 안정화제, 비타민, 무기염류, 유화제, 향료 같은 일반적인 보조 성분을 포함할 수 있다.
보다 더 자세하게는, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용목적에 따라 그 첨가량을 화장료 조성물 고유의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택할 수 있다. 상기 성분들의 첨가량은 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 0.1~10 중량%, 바람직하게는 0.1~6 중량%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 철피석곡 꽃 배양물을 포함하는 탈모방지용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 외용제로서 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 본 발명에서는 피부 도포를 통해 적용되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주(Bacillus siamensis HDB8077 strain, 수탁번호 KCCM12989P) 및 상기 균주의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 배양물은 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주 배양액에 철피석곡 꽃 분말을 첨가하여 배양한 것으로서 모근강화 효능, 모발성장 효능, 남성형 탈모 완화 효능, 세라마이드 생합성 효소의 발현 증강 효능 등이 있어 다기능성 모발용 조성물로 용이하게 이용 가능하다.
도 1은 본 발명의 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주의 16s rRNA 염기서열(서열번호 1)을 나타낸다.
도 2는 일반 발모 모델에서의 철피석곡 꽃 배양물에 대한 VEGF mRNA 발현 증가활성을 나타낸다.
도 3은 일반 발모 모델에서의 철피석곡 꽃 배양물에 대한 Wnt10b(도 3a) 및 KGF(도 3b)의 mRNA의 발현 증가활성을 나타낸다.
도 4는 남성형 탈모 모델에서의 철피석곡 꽃 배양물에 대한 AR(도 4a) 및 DKK-1(도 4b)의 발현 억제 활성을 나타낸다.
도 5는 철피석곡 꽃 배양물의 두피세포 내 세포장벽 보호인자인 SPT 발현 증가활성을 나타낸다.
도 6은 철피석곡 꽃 배양물의 두피세포 내 활성산소 제거 효능을 나타낸다.
도 2는 일반 발모 모델에서의 철피석곡 꽃 배양물에 대한 VEGF mRNA 발현 증가활성을 나타낸다.
도 3은 일반 발모 모델에서의 철피석곡 꽃 배양물에 대한 Wnt10b(도 3a) 및 KGF(도 3b)의 mRNA의 발현 증가활성을 나타낸다.
도 4는 남성형 탈모 모델에서의 철피석곡 꽃 배양물에 대한 AR(도 4a) 및 DKK-1(도 4b)의 발현 억제 활성을 나타낸다.
도 5는 철피석곡 꽃 배양물의 두피세포 내 세포장벽 보호인자인 SPT 발현 증가활성을 나타낸다.
도 6은 철피석곡 꽃 배양물의 두피세포 내 활성산소 제거 효능을 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<제조예 1: 균주의 분리 및 동정>
철피석곡 꽃 1 g을 멸균된 식염수 10 mL에 넣고 현탁한 후 연속희석하고 BCP (bremocresol purple) 고체배지에 도말하였다. 37℃, 24시간 배양 후 모양에 따라 콜로니를 선별하고 BCP 고체배지에 연속 계대하여 순수 분리하였다.
분리된 균주는 1ℓ 당 1.5% 펩톤(w/v), 0.5% 소이빈 펩톤(w/v), 0.5% 염화 나트륨(w/v), 1.5% 한천(w/v)가 되도록 물에 용해하여 121~123℃에서 60분간 멸균한 것을 이용하여 배양하였다.
균주의 형태학적 특성을 확인하기 위해, LB 한천 평판배지에서 37℃ 조건에서 1일간 배양했을 때, 세포의 형태는 간균(연쇄상)이며, 운동성은 없는 것으로 확인된다. 균주의 포자형성능은 확인되지 않으며, 그람(Gram) 양성의 균주이다. 균주균락의 형태는 반투명 회색빛을 띠는 원형의 매끄러운 균락을 짓는 것이 확인된다. 균주의 생리학적 특성을 확인하였을 때, 25~50℃에서 배양가능하고, 최적 생육온도는 37℃이다. 생육가능한 pH는 6.0~7.5이고, 최적 생육 pH는 6.0~6.5인 것으로 나타났다. 최적 생육시간은 18 시간이며 최소 16시간, 최대 2일 동안 배양 가능하다. 통성 호기성 균주로서 가스는 생성하지 않은 것을 확인하였다.
분리된 균주 HDB8077의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 서열비교를 통한 계통유전학적 분석(phylogenetic analysis)을 수행하였다. 블라스트 유사성 조사 프로그램(Blast similarity search program: National Institute of Biotechnology Information)을 이용하여 HDB8077 균주의 16S rRNA(서열번호 1, 도 1)을 분석한 결과, 바실러스 시아멘시스 균주의 서열에 99%의 가장 높은 상동성을 나타내었다.
또한 GenBank에 등록된 동일 계열의 균주들(Strains)의 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후, 계통수(phylogenetic tree)에서의 위치를 판별하였고, 계통수 상에서 16S rRNA 유전자는 바실러스 시아멘시스에 가장 가까운 위치에 배치되었다. 상기와 같이 본 발명의 균주를 분자생물학적으로 동정한 결과를 이용하여 바실러스 시아멘시스로서 서열번호 1의 16s rRNA를 갖는 HDB8077 균주(Bacillus siamensis HDB8077 strain, 수탁번호 KCCM12989P)로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM, http://www.kccm.or.kr/)에 기탁하였다.
<실시예 1. 철피석곡 꽃 배양액 제조>
바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주의 single colony를 멸균된 TSB(Tryptic Soy Broth, BD Difco)에 접종한 후 37℃ 170rpm에서 5시간 동안 배양하였다. 이 후 Autoclave하여 멸균된 철피석곡 꽃 분말을 액체 배양액 100g 대비 5g을 첨가하여 37℃, 170rpm, 24시간 동안 배양하여 본 발명에서 시료로 사용할 철피석곡 꽃 배양액을 제조하였다. 철피석곡 꽃 배양액은 0.3㎛ 필터 여과하여 균체를 제거 한 후 완전 농축하여 파우더화 하였다.
<비교예 1. 철피석곡 꽃 사균액 반응물 제조>
바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주의 single colony를 멸균된 TSB Broth(Difco)에 접종한 후 37℃ 170rpm에서 5시간 동안 배양하였다. 이 후 배양액 자체를 autoclave를 이용하여 121℃ 조건에서 15분 동안 멸균처리하고, 여기에 멸균된 철피석곡 꽃 분말을 멸균 배양액 100g 대비 5g을 첨가하여 37℃, 170rpm, 24시간 동안 반응하여 본 발명에서 시료로 사용할 철피석곡 꽃 사균 반응물을 제조하였다. 철피석곡 꽃 사균 반응물은 0.3㎛ 필터 여과하여 균체를 제거 한 후 완전 농축하여 파우더화 하였다.
<비교예 2. 철피석곡 꽃 추출물 제조>
철피석곡 꽃 분말을 정제수 100g 대비 5g을 첨가하여 37℃, 170rpm, 24시간 동안 추출한 뒤 0.3㎛ 필터 여과하고 완전 농축하여 파우더화 하여 본 발명에서 시료로 사용할 철피석곡 꽃 추출물을 제조하였다.
<실험예 1. 세포배양>
DPCs (Human Dermal Papilla cell: 모유두세포) 및 HHGMC (Human Hair Germinal Matrix Cell:모모세포) 세포를 사용하였으며, DPCs 세포주는 10%(v/v) 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS), 1%(v/v) 안티바이오틱스 (Anti-biotics)가 함유된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지를 사용하였으며, HHGMC 세포주는 5%(v/v) 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS), 1%(v/v) 페니실린/스트립토마이신 용액 (penicillin/streptomycin solution, S/P), 1%(v/v) 중간엽줄기세포 성장 공급원 (mesenchymal stem cell growth supplement, MSCGS)을 함유한 MSCM (Mesenchymal Stem Cell Medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2조건에서 배양하였다.
<실험예 2. 모근강화 효능 확인을 위한 VEGF 발현 확인>
모근강화 효능을 평가하기 위하여 VEGF (Vascullar Endotherial Growth Factor) 유전자 발현 실험을 qRT-PCR을 통해 수행하였다. 6 well multi plate(corning)에 10%(v/v) 소혈청이 함유된 DMEM 배지와 모유두세포(DPCs,세포바이오)를 2.5×105cells/well로 2㎖씩 접종하여 24시간 배양 후 각 well을 serum free배지로 교체하였다. serum free 배지에 시료를 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 이 때 각 시료는 25~100㎍/㎖가 되도록 처리하였고, 효능을 평가에 사용된 Minoxidil은 배지 내에 총 농도가 1㎍/㎖가 되게 처리하였다.
다음으로 PBS를 이용하여 washing 후 배양된 세포에 QIAzol®(QIAGENL®, USA)을 처리하여 Cell lysis 진행 후 제조사 (QIAGENL®)에서 제공하는 protocol을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Qubit®fluoremeter with RNA BR Assay kit를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA 합성은 cDNA 합성 Kit (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하였고 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR Kit (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다.
PCR에 사용된 VEGF, β-actin primer는 코스모진텍사(Korea)에서 합성하여 사용하였으며 primer sequence는 표 1에 나타내었다. 이에 대한 결과는 도 2에 나타내었다.
| Primer | Sense | Antisense |
| VEGF | 5'-TGC AGA TTA TGC GGA TCA AAC C-3' | 5'-TGC ATT CAC ATT TGT TGT GCT GTA G-3' |
| β-actin | 5'-GGC ACC CAG CAC AAT GAA G-3' | 5'-CCG AT C CAC ACG GAG TAC TTG-3' |
cDNA 합성 반응 조건은 VEGF, β-actin 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 25초, 40 사이클이다. Control은 시료처리를 하지 않았으며, 양성대조군으로 사용된 Minoxidil은 모근강화 및 모발성장을 유도하는 물질로 알려져 있다.
VEGF는 모낭(Hair follicle)에서 혈관(blood vessels) 형성을 유도하며 모낭 주위의 혈관 생성을 통해 모발의 성장기에 영양분을 공급하며, 세포의 증식(Proliferation), 이동(migration)을 유도한다.
도 2의 분석결과 본 발명의 실시예 1의 철피석곡 꽃 배양물이 혈행개선을 통해 모근에 영양분을 공급하여 모근을 강화하는 것을 알 수 있다.
<실험예 3. 모발성장 인자 Wnt10b 및 KGF의 유전자 발현 확인>
모발성장과 관련된 인자인 Wnt10b, KGF에 대해 HHGMC (Human Hair Germinal Matrix Cell)를 이용하여 실험예 2와 같이 qRT-PCR을 수행하되, 프라이머 서열은 하기 표 2의 서열을 참고하여 수행하였다. 이에 대한 결과는 도 3에 나타내었다.
| Primer | Sense | Antisense |
| Wnt10b | 5'-CAT CCA GGC ACG AAT GCG A-3' | 5'-CGG TTG TGG GTA TCA ATG AAG A-3' |
| KGF | 5'-AAG GGA CCC AGG AGA TGA AGA-3' | 5'-TGC CAC AAT TCC AAC TGC C-3' |
| β-actin | 5'-GGC ACC CAG CAC AAT GAA G-3' | 5'-CCG ATC CAC ACG GAG TAC TTG-3' |
도 3a와 도 3b 확인 결과, 실시예 1의 철피석곡 꽃 배양물의 모발성장 효능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있다.
<실험예 4. 남성형 탈모인자 AR 및 DKK-1의 유전자 발현 확인>
남성형 탈모와 관련된 인자인 AR 및 DKK-1에 대해 모낭에 중심부에 위치한 HDP (Human Dermal papilla Cell)를 이용하여 실험을 수행하였다. AR(Androgen receptor)에 의해 DHT(Dihydrotestosteron)가 모낭에 전달되면 탈모가 발생하며, 따라서 AR의 발현을 저해 시키게 되면 DHT가 모낭에 전달되는 것을 저해함으로 초기 탈모를 완화할 수 있다. 또한, 탈모 진행 시 DKK-1(dickkopf-1) 발현이 증가하여 hair follicle의 사멸을 유도하게 됨으로 철피석곡 꽃 배양물이 이들 인자를 저해하는지 확인하였다.
DKK-1, AR에 대해 실험예 2와 같이 qRT-PCR을 수행하되, 프라이머 서열은 하기 표 3의 서열을 참고하여 수행하였다. 이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다.
| Primer | Sense | Antisense |
| AR | 5'-CCT GGC TTC CGC AAC TTA CAC-3' | 5'-GGA CTT GTG CAT GCG GTA CTC A-3' |
| DKK-1 | 5′-ATT CCA ACG CTA TCA AGA ACC-3′ | 5′-CCA AGG TGC TAT GAT CAT TAC C-3′ |
| β-actin | 5'-GGC ACC CAG CAC AAT GAA G-3' | 5'-CCG ATC CAC ACG GAG TAC TTG-3' |
도 4a와 도 4b 확인 결과, 실시예 1의 철피석곡 꽃 배양물이 AR(Androgen Receptor) 발현을 저해하고 hair follicle 사멸을 유도하는 DKK-1(dickkopf-1) 발현 저해능도 나타내 남성형 탈모 완화 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.
<실험예 5. 두피의 세포장벽 보호인자 SPT의 유전자 발현 확인>
두피 장벽 강화 효능을 확인하기 위해 Human Normal Keratinocyte에서 세라마이드 생합성에 관여하는 효소들의 발현을 유도시키는 인자인 SPT(Serine palmitoyl transferase)에 대한 실험을 진행하였으며, 결과는 도 5에 나타내었다.
| Primer | Sense | Antisense |
| SPT | 5'- TGG TCA TTT GGC CCA GGT C-3' | 5'- TCC CAA CCA TTG GCT TCA CAT C-3' |
| β-actin | 5'-GGC ACC CAG CAC AAT GAA G-3' | 5'-CCG ATC CAC ACG GAG TAC TTG-3' |
도 5를 참고할 때, 실시예 1의 철피석곡 꽃 배양물이 두피 세포의 보습인자인 세라마이드 생합성 효소인 SPT 발현을 증가시켜 두피 세포 장벽이 개선되는 것을 확인할 수 있다.
<실험예 6. ROS 활성 저해를 통한 두피 항산화 효능 확인>
항산화 효능을 평가하기 위하여 인간유래 각질세포인 HaCaT 세포주에서 H2O2를 이용하여 활성산소 저해 효능평가를 진행 하였다. 96 well multi-plate(Thermo)에 10% 소혈청이 함유된 DMEM 배지와 HaCaT 세포주를 3X104 cells/96well의 농도로 100 ㎕씩 접종하여 24시간 배양 후 각 well을 serum free 배지로 교체 후 시료를 연속희석법으로 처리하였다. 24시간 동안 배양 후 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution, 한독바이오테크)를 이용하여 washing을 진행한다. 배양된 세포에 20μM의 H2DCFDA(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, Sigma)를 30분 처리 후 HBSS(를 이용하여 과잉 염색된 형광을 washing 한다. Plate에 H2O2 처리 군과 비 처리군을 10분간 배양 한뒤 HBSS로 washing 후 microplate reader(spark 10M Elisa reader)를 이용하여 492 nm에서 형광값을 측정한다. Buffer 제거 후 0.5% Triton X-100(Duksan)을 50㎕씩 첨가하고, BCA solution(Sigma) 50㎕을 첨가하여 BCA 단백질 정량법을 이용하여 단백질의 발현 정도를 측정한다. 앞서 측정한 형광값과 단백질양을 통해 ROS activity를 계산하며, Standard curve는 BSA를 이용하여 작성하였으며, 이에 대한 실험결과는 도 6에 나타내었다.
도 6을 참고할 때, 실시예 1의 철피석곡 꽃 배양물이 각질 세포 내의 라디컬 생성을 억제하여 우수한 항산화 효능을 발휘함을 알 수 있다.
<제형예 1. 헤어 로션의 제조>
본 발명의 철피석곡 꽃 배양물을 2.0%(w/w)가 되게 정제수와 1,3-Butylene Glycol로 용해한 것을 원료로 하여, 하기 표 5의 조성으로 헤어 로션을 제조하였다.
| 성분 | 중량(%) |
| 세토스테아릴알코올 | 2.0 |
| 염화스테아릴트리에틸암모늄 | 0.5 |
| 히드록시에틸셀룰로오즈 | 0.1 |
| 피톡톤올아민 | 0.1 |
| 실시예 1 복합 추출물의 2%(w/w) 수용액 | 2.0 |
| 향료 | 0.1 |
| 색소 | 0.1 |
| 정제수 | 잔량 |
| Total | 100 |
<
제형예
2.
헤어 토닉의
제조>
본 발명의 철피석곡 꽃 배양물을 2.0%(w/w)가 되게 정제수와 1,3-Butylene Glycol로 용해한 것을 원료로 하여, 하기 표 6의 조성으로 헤어 토닉을 제조하였다.
| 성분 | 중량(%) |
| 레조시놀 | 0.1 |
| 멘톨 | 0.05 |
| 판테놀 | 0.2 |
| 살리실산 | 0.1 |
| 토코페릴아세티에트 | 0.1 |
| 염산피리독신 | 0.1 |
| 피마자유 | 5.0 |
| 철피석곡 꽃 배양물의 2%(w/w) 수용액 | 2.0 |
| 색소 | 0.1 |
| 향료 | 0.1 |
| 에탄올 | 0.3 |
| 정제수 | 잔량 |
| Total | 100 |
<
제형예
3.
헤어
컨디셔너의 제조>
본 발명의 철피석곡 꽃 배양물을 2.0%(w/w)가 되게 정제수와 1,3-Butylene Glycol로 용해한 것을 원료로 하여, 하기 표 7의 조성으로 헤어 컨디셔너를 제조하였다.
| 성분 | 중량(%) |
| 세탄올 | 3.5 |
| 자기유화형 모노스테아린산글리세린 | 1.5 |
| 프로필렌 글리콜 | 2.5 |
| 염화스테아릴메틸벤질 암모늄(25%) | 7.0 |
| 파라옥시안식향산메틸 | 0.3 |
| 철피석곡 꽃 배양물의 2%(w/w) 수용액 | 5.0 |
| 색소 | 0.1 |
| 향료 | 0.1 |
| 정제수 | 잔량 |
| Total | 100 |
[수탁기관]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM12989P
수탁일자 : 20210520
<110> HYUNDAI BIOLAND CO., LTD.
<120> Bacillus siamensis HDB8077 strain isolated from Dendrobium
candidum flower and haircare cosmetic composition contained
culture of Dendrobium candidum flower using thereof
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1490
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus siamensis
<400> 1
gtcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct 60
tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact 120
gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tctgaaccgc atggttcaga 180
cataaaaggt ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt 240
gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac 300
tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 360
gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc 420
tgttgttagg gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540
cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 600
ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga 660
attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac 720
tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt 840
gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg 1020
ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt 1140
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200
acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa 1260
gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc 1320
tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380
acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aacctttatg 1440
gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtgaag tctaaaaggg 1490
Claims (7)
- 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주(Bacillus siamensis HDB8077 strain, 수탁번호 KCCM12989P)로서,
상기 균주의 배양용 배지에 철피석곡 꽃 분말을 첨가한 후 30~40℃에서 20~48시간 동안 배양하여 얻은 배양물이 모근강화, 모발성장 촉진 또는 탈모방지 효능을 포함하는 헤어케어 기능이 있는 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는 철피석곡 꽃으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 바실러스 시아멘시스 HDB8077 균주. - 삭제
- 제1항의 균주의 배양용 배지에 철피석곡 꽃 분말을 첨가한 후 30~40℃에서 20~48시간 동안 배양한 배양물을 함유하는 것을 특징으로 하는 모근강화, 모발성장 촉진 또는 탈모방지 효능이 있는 헤어케어 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 균주의 배양용 배지에 철피석곡 꽃 분말을 첨가한 후 30~40℃에서 20~48시간 동안 배양한 배양물을 함유하는 것을 특징으로 하는 모근강화, 모발성장 촉진 또는 탈모방지 효능이 있는 탈모방지용 약학 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020210108762A KR102606728B1 (ko) | 2021-08-18 | 2021-08-18 | 철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 hdb8077 균주 및 이의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210108762A KR102606728B1 (ko) | 2021-08-18 | 2021-08-18 | 철피석곡 꽃으로부터 분리된 바실러스 시아멘시스 hdb8077 균주 및 이의 철피석곡 꽃 배양물을 함유하는 헤어케어 화장료 조성물 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230026758A KR20230026758A (ko) | 2023-02-27 |
| KR102606728B1 true KR102606728B1 (ko) | 2023-11-24 |
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| KR102326641B1 (ko) | 2019-06-25 | 2021-11-17 | 주식회사 현대바이오랜드 | 메밀새싹 추출물을 함유하는 모근강화, 모발성장 촉진 또는 탈모방지용 조성물 |
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-
2021
- 2021-08-18 KR KR1020210108762A patent/KR102606728B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
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| NCBI GenBank 접근 번호 MT826225 (2020.08.09.)* |
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