KR102600823B1 - 가변 도메인 vl 및 vhh 유도체를 기반으로 한 고친화성, 응집 안정성 항체 - Google Patents

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스타니슬라프 루돌포비치 에브도키모프
발레리 블라디미로비치 솔로비예프
율리야 세르게예브나 체르니흐
올가 블라디미로브나 곤챠로바
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타치아나 베니아미노브나 체르놉스카야
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Abstract

제안하는 것은 경쇄의 가변 도메인 VL과 유도체 VHH를 조합한 형태인, 가변 도메인을 함유하는 IgG 유형의 단일클론 항체이다. 이러한 항체는 위치 44 및/또는 45(카벳 넘버링 방식에 따름), 또는 이의 조합에 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 기술된 항체는 친화성 증가 및 응집 안정성 향상을 나타낸다.

Description

가변 도메인 VL 및 VHH 유도체를 기반으로 한 고친화성, 응집 안정성 항체 {HIGH AFFINITY AND AGGREGATIVELY STABLE ANTIBODIES ON THE BASIS OF VARIABLE DOMAINS VL AND A DERIVATIVE VHH}
면역글로불린(Ig)이라고도 불리는 항체는 척추동물의 체액 면역에서 주요 역할을 하는 용해성 혈액 또는 간질액 당단백질이다. 항체는 다양한 구조의 이종 생물학적, 화학적 물질(항원)에 대한 반응으로 B 세포에 의해 생산된다. 특정 항원에 대한 높은 특이성 및 높은 친화성으로 인해, 그리고 무한한 항원 목록에 대항하여 항체를 생산하는 능력으로 인해, 기초 의학 연구 및 응용 의학 연구에 사용될 가장 중요한 시약들 중 하나가 항체 및 이의 유도체이다.
고전적 항체[1,2]는 2개의 동일한 중쇄 H 사슬(하나의 가변 VH 도메인, 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 그리고 CH1과 CH2 사이의 힌지드(hinged) 도메인) 및 2개의 동일한 경쇄 L 사슬(가변 도메인 VL 및 불변 도메인 CL 함유)을 함유하는 큰 다량체 단백질(IgG ~150kDa)로 표시된다. 4개의 사슬 분자는 이 사슬들을 연결하는 비-공유 결합 및 공유(이황화) 결합을 보유한다. 파파인 프로테아제는 항체 분자를 2개의 단편, 즉 Fab(항원 결합 단편) 및 Fc(결정성 단편)로 붕괴시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 이 분자의 하나의 영역(Fab)은 이의 항원 관련 특이성을 한정하고, 다른 영역(Fc)은 항원 제거를 목표로 하는 작동인자(effector) 기능을 발휘한다[3,4]. H 사슬의 CH1 도메인과 CH2 도메인은 Fab 영역의 이동성 및 세포 위에 노출된 Ig 작동인자 수용체와 IgG 분자의 상호작용을 보장해주는 힌지(hinge) 영역에 의해 이격되어 있다. CH2 도메인은 세포 활성화를 매개하는 Fcγ 수용체(ADCC 및 ADCP) 및 보체 시스템 분자(CDC)와 결합하는 영역들을 함유한다. 또한, 이 도메인은 모든 면역글로불린 이소타입(isotype)들에 대한 탄수화물의 부착 지점인 부위를 함유한다. CH3 도메인은 IgG 이량체의 안정성을 꽤 상당히 좌우하고, 항체의 약동학 성질뿐 아니라 체내에서 항체의 대사 및 분포를 확립시켜주는 세포 표면 상의 FcRn 수용체와 상호작용한다. 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)의 상보성 결정 영역(CDR)들의 조합은 항원 결합 단편을 형성하는 반면, 가변 도메인과 불변 도메인의 프레임워크(framework) 영역은 항원 인식에 직접 관여하지 않는다. 고전적 항체의 최소화된 Fab 유도체는 링커(linker) 서열에 의해 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들이 연결되어 있는 일본쇄 작제물이다(scFv).
낙타과 동물(낙타, 라마, 비큐나)의 혈액에서 단순 구조의 특이적인 비고전적 항체 상당량의 발견은 매우 귀중한 발견이었다[5]. 이러한 항체들(중쇄 항체, HCAb)은 경쇄가 전혀 없는 이량체의 단일 단축된 중쇄(CH1 도메인이 없는)로 이루어진다. HCAb의 항원 결합 단편은 하나의 중쇄 가변 도메인(VHH)으로만 구성되고, 이것은 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 연결된다. VHH는 꽤 종종 단일-도메인 항체, "나노바디(nanobody)", "미니항체" 또는 "나노항체"라 불린다. 이와 같이 분리된 모노-도메인 구조는 작은 크기(12 내지 15KDa) 외에도, 고전적 IgG 항체에 비해 많은 장점, 즉 응집, 화학적 및 열적 안정성이 있는 것으로 나타났다. VHH 항체는 박테리아 및 효모 세포에서 성공적으로 클로닝되고 발현될 수 있다. 이러한 성질을 가진 이 항체들은 애블링스 컴패니(Ablynx Company)에 의해 치료적 방향으로 개발되었고, 실험실 및 산업 크로마토그래피 방향으로 개발되었다(CaptureSelect 친화성 제품).
단일 Ig 중쇄 이량체를 함유하는 중쇄 항체는 낙타과의 각종 대표들로부터 수득된 혈청에서 면역글로불린의 전기영동적 분석에 의해 최초로 발견되었다[5]. HCAb의 상대적 분율은 라마 및 비큐나에서 약 15 내지 25%(모든 IgG 중에서)부터 낙타에서 약 60 내지 80%로 다양하다[6].
적어도 낙타과의 경우에, 비고전적 HCAb는 비교적 최근에 고전적 항체 유전자의 발전으로부터 초래된 것으로 추정된다. HCAb 및 고전적 항체의 경우에 2개의 중쇄 불변 도메인인 CH2 및 CH3은 고도로 보존적이다. HCAb에는 고전적 항체의 제1 불변 도메인인 CH1에 해당하는 도메인이 없다. 단봉낙타 게놈은 약 50개의 VH- 및 40개의 VHH-유래의 유전자, 그 다음 D-분절, J-분절의 다수의 유전자 및 불변 영역(Cμ, Cγ, Cε 및 Cα)을 암호화하는 유전자로 구성된 클러스터를 함유한다. Cγ 유전자 중 일부가 HCAb(돌연변이가 CH1 도메인의 상실을 초래한다)를 형성하고 다른 것들이 고전적 항체(CH1 도메인이 남아있는)를 형성하는 작용을 하는 것이 분명하다. D 분절과 J 분절의 동일 유전자들은 VH 유전자 중 하나 또는 VHH 유전자 중 하나에 무작위로 연결될 수 있다. 이것은 VH- 및 VHH-유전자가 동일한 유전자좌에 위치한다는 것을 나타낸다[7-10].
비고전적 항체의 가변 도메인(VHH)과 고전적 항체의 가변 도메인(VH)의 조직은 사람 IgG3 서브클래스의 VH 도메인이 낙타과의 VH 및 VHH와 높은 상동성을 갖고 있듯이, 매우 유사하다. 두 경우 모두, V 도메인들은 3개의 초가변 상보성 결정 영역(CDR)을 둘러싸고 있는 4개의 보전적 프레임워크 영역 FR을 함유한다. 또한, 두 경우 모두, 면역글로불린 V 도메인에 전형적인 3D 구조는 2개의 β 층으로 구성되고, 이 중 하나의 층은 4개의 아미노산 서열을 함유하고 다른 층은 5개의 아미노산 서열을 함유한다[11, 12]. 이 구조에서 총 3개의 CDR은 V-도메인의 한쪽 측면에서 클러스터를 형성하고, 여기서 항원 인식에 참여하며 β 구조를 연결하는 루프에 위치한다. 하지만, 단일 도메인 VHH의 기능과 관련해서는 중요한 여러 가지 차이가 있다. 즉, VHH의 CDR1과 CDR3은 상당히 확장되어 있다. VHH의 상보성 결정 영역은 종종 두 단편에 한꺼번에(보통 CDR1 및 CDR3에, 이보다는 적게는 CDR2 및 CDR3에) 시스테인 잔기를 함유한다. VHH 결정 구조의 연구는 이러한 시스테인 잔기들이 이황화 결합을 형성하여 이 항체들의 루프 구조에 안정성을 추가로 제공한다는 것을 밝혀냈다[12]. VHH의 가장 강하면서 재현가능한 독특한 특징은 2번째 프레임워크 영역에서 4개의 소수성 아미노산이 친수성 아미노산으로 치환된 것을 보유하는 것이다(카벳 넘버링(Kabat numbering)에 따라 Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly[13]). VH 도메인의 이러한 프레임워크 영역은 소수성 아미노산 잔기들이 풍부한, 고도로 보존적인 영역이고 경쇄 가변 도메인 VL에 결합하는데 필수적이다. VHH 도메인은 이러한 면에서 매우 다르다: 소수성 아미노산의 친수성 아미노산으로의 치환은 VHH와 VL의 결합을 불가능하게 한다. 또한, 이러한 치환은 재조합 단백질로써 수득될 때 VHH(나노항체)의 높은 용해성을 설명해준다[14].
HCAb 및 고전적 항체에 가능한 파라토프(항체의 항원 결합 부분)의 목록은 크게 다를 수 있는 것으로 나타난다. 이 두 항체 유형은 동일한 유기체에 공존하는 바, 서로 경쟁하는 것이 아니라 보완적인 것으로 추정할 수 있다. 예를 들어, 두 항체의 유형은 똑같은 동물을 면역화한 후 항원 물질의 다양한 에피토프들에 있어서, 아주 유사하게, 배타적으로 또는 서로 다른 비율로 나타날 수 있다는 것이 반복적으로 관찰되었다. 고전적 2-도메인 항체에 비해, 단일 도메인 항체에 대해 예상되는 다양성이 낮은 파라토프의 가능성에도 불구하고, 많은 공보들은 다소 광범위한 항원들의 가장 다양한 에피토프들에 대하여 HCAb를 수득할 수 있음을 분명하게 입증해 보였다[15]. 명백히, 이것은 확장된 CDR1 및 CDR3 영역 때문인 것이다. 또한, 우리는 면역화 중에 항체의 친화성 성숙 동안 축적할 것 같은 VHH의 놀랄 만큼 많은(고전적 항체의 V 도메인에 비해) 수의 체세포 과돌연변이를 주목할 것이다[16]. X선 회절 분석은 VHH의 항원 결합 루프 영역이 고전적 V 도메인에 일반적이지 않은 구조를 형성할 수 있다는 것을 밝혀냈다[12,16]. 고전적 항체의 VH-도메인과 VL-도메인에서는 전체 6개의 CDR들이 항원 결합에 거의 동일하게 기여하는 반면; VHH에서는 CDR3이 파라토프의 형성에 일반적으로 가장 중요하다. VHH의 CDR3(VH 또는 VL에서는 아니다)은 흔하지 않은 긴 손가락 구조를 형성할 수 있어, 항원 구조 내로 깊이 들어갈 수 있고, 특히 효소의 활성 부위를 검출할 수 있는 것으로 발견되었다[12]. 작은 크기의 VHH의 항원 결합 영역 및 독특한 파라토프를 형성하는 능력은 어떻게 HCAb가 수득될 수 있고, 고전적 항체에서는 접근할 수 없던 에피토프를 인식할 수 있는지를 설명해준다(예컨대, 효소를 효과적으로 저해하는 항체의 생산)[17].
단일 도메인 VHH의 치료적 용도는, 고전적 IgG 항체에 비해 전부 독특한 특이성의 높은 잠재성 때문에, 유기체로부터 빠르게 제거됨으로 인해서 때로 제한적이다. 이에, VHH 구조의 약동학을 향상시키기 위해 디자인된 해법은 여러가지가 있으며, 그 예로는 PEG와의 화학적 접합 및 제거율 감소를 매개하는 폴리펩타이드에 대한 공유 결합(예컨대, 3주 이하의 반감기를 보유하는 HSA 또는 Fc-융합 단백질)을 포함한다[18,19,20]. 재조합 기술에 의해 VHH에 부착되고, 인간 혈액에서 상기 성분들(HSA 및 IgG)과 고친화성 비공유 상호작용을 할 수 있는 작은 펩타이드들이 성공적으로 사용되었다[21]. 하지만, 이러한 시도들의 기술적 유효성 및 면역원성은 의심의 여지가 있으며, 임상 단계 또는 그 이전의 연구 단계에서 이의 사용 가능성은 여전히 조사 중이다.
또한, 약제로써 항체 사용 시의 가장 큰 제한들은 이들의 응집성 및 화학적 안정성, 친화성 및 면역원성 때문이다. 단일클론 항체의 대부분은 쥐 항체를 기반으로 하여 수득되는 바, 인간에게서 이러한 항체들의 정기적인 사용은 항체 요법에 대한 면역 반응(예, 알러지 반응)의 발달을 일으킨다. 이러한 유형의 면역 반응은 최종적으로 적어도 효능의 부족, 및 최악에는 잠재적 아나필락시 반응을 초래한다. 다른 한편, 응집 또는 화학적으로 불안정한 치료 항체는 약물의 치료적 성질을 시간이 경과할수록 감소시키고, 인간 환자에게 투여 시 면역원성을 증가시킬 수 있다.
전술한 바에 따라, 기능적 및 치료적 특징이 향상되고(이전에 공지된 항체들에 비해), 특히 응집, 화학적 및 열적 안정성이 증가하고, 친화성이 향상되고, 동시에 산업적 규모로 쉽게 수득할 수 있는, VHH 기반의 항체를 개발하는 것이 중요하다.
발명의 배경
본 발명의 배경은 VHH 도메인을 함유하는 다양한 항체 작제물에 대한 정보를 제공한다.
PCT/EP2008/066368 공보는 Fc 단편과 결합된, 이산된(discrete) 가변 도메인을 함유하는 항체를 기술한다. 나노바디는 IgE형 항체로부터 수득된 Fc를 보유한 가변 도메인으로써 사용될 수 있다. 상기 도메인 및 Fc 단편들은 힌지 도메인에 위치한 링커를 통해 연결될 수 있다.
특허출원 US 2009/0202979는 인간 항체의 불변 영역에 직접 연결된 완전한 VHH 항체 또는 이의 일부를 함유하는 항체를 개시했다.
또한, 항체의 이화학적 성질 및 생물학적 성질에 영향을 미치는 아미노산 치환은 공지되어 있다.
예를 들어, US 20110028348 출원은 수득된 항체의 친수성을 향상시키기 위해 위치 35, 45, 47, 93 내지 100 및 100a에 아미노산 치환이 도입된 중쇄 가변 도메인을 기술한다.
현재, 면역원성을 감소시키고 응집 안정성을 향상시키기 위하여 분리된 VHH 및 VH 단일도메인의 구조를 최적화하는 방법들은 개발되어 있다.
즉, 빈케(Vincke) 등[22]은 특징적인 아미노산들에서 Glu-49 → Gly 및 Arg-50 → Leu 치환 시, 더욱 안정하지만 덜 용해성인 신규 도메인이 수득되게 한다는 것을 발견했다. 프레임워크 영역에서의 다른 치환들, 즉 FR-2 Phe-42 → Val 및 Gly/Ala-52 → Trp는 H3 루프의 재배향으로 인하여 항원에 대한 항체 친화성에 중대한 것으로, 해리 상수가 6 내지 10배 증가한다(6.85·10-3 l/sec). Phe-42 → Val 치환은 수득된 항체의 안정성을 감소시켰다. VH 서열에서 Gly-49 및 Leu-50의 치환은 이 도메인의 안정성을 저하시켰고, VHH에서의 Glu-49 및 Arg-50 인간화는 안정한 가변 도메인을 수득할 수 있게 했다.
고전적 VHH의 입체구조의 음영(shading) 효과를 상쇄시키는 짧은 HCDR3 영역의 존재 하에, VH 특징적인 Trp-47 → Gly-47 치환 및 Tyr-37 → Val-37, Glu-4 → Gly-44 및 Arg-45 → Leu-45의 도입 후, 분리된 VHH 도메인은 VJ 도메인과 결합하는 능력을 재생시킬 수 있다는 것은 문헌에 공지되어 있다[24].
고전적 IgG 구조의 치료 항체의 증가된 응집 안정성과 이 항체의 감소된 면역원성 사이의 관계는 많은 연구들에서 입증되었고, 허멜링(Hermeling) 등 2004[25]의 리뷰 문헌에 정리되어 있다. 하지만, VHH 도메인을 함유하고, 전체 크기의 인간 IgG 내에 존재하는 경쇄 가변 도메인에 결합한 항체로 밝혀진 것은 전혀 없었다.
따라서, 향상된 안정성과 친화성, 양호한 발현 및 낮은 면역원성을 나타내는 항체의 신규 포맷에 대한 개발은 여전히 필요한 실정이다.
이 외에도, 수득하기 쉽고, 향상된 응집 안정성 및 증가된 친화성 및 포유동물 세포 배양물에서의 높은 발현 수준이 있는 분자들에 대한 개발과 관련하여, 종래에 기술된 시도들은 전혀 없었다.
앞서 언급한 바에 따라, 본 발명은 먼저 전체 크기의 인간 IgG의 경쇄 가변 도메인에 결합할 수 있고, 천연의 IgG와 유사한 작제물의 형성을 초래하지만(이에 따라 면역원성이 낮고), 향상된 응집 안정성, 증가된 친화성 및 치료적 단일클론 항체의 구조를 보유하는, VHH 유도체를 함유하는 항체를 기술하기 위한 것이다.
도 1. 응집 저항성 VHH 기반의 항체 개발 및 최적화를 위한 순서도.
도 2, 3, 4. 다양한 아미노산 치환을 함유하는 VHHIgG1 항체의 SDS-PAGE.
도 5. 라마의 조합적 Fab 라이브러리를 합성하기 위한 순서도.
도 6. 파지 디스플레이 Fab 라이브러리를 클로닝하기 위한 파지미드.
도 7. A) 인간 IL-17A에 대하여 특이적인 Fab 내의 라마 가변 VHH 도메인의 서열. B) 인간 IL-17A에 대하여 특이적인 3VHHFab 내의 라마 경쇄 가변 도메인의 서열.
도 8. IL-17A와의 결합에 관하여, VHH Fab 클론의 비교용 동역학적 파라미터를 시험하기 위해 수득한 센소그램(sensogram).
도 9. 3개의 다른 VHH 돌연변이체의 아미노산 서열.
도 10, 11. 3개의 VHH 돌연변이체의 응집 안정성.
도 12, 13. 3개의 VHH 돌연변이체의 친화성.
도 14. VHHIgG1VK4B11, mut1VHHIgG1 및 mut4VHHIgG1 길항물질을 이용하여 IL-17A의 저해에 의한 IL-6 생산 억제에 대한 세포 시험.
도 15, 16. 인간 경쇄를 함유하는 mut4 VHHFab의 키메라성 변형체의 분리.
도 17. mut4 VHHIgG1VK3c8, mut4 VHHIgG1VK1A7 및 mut4 VHHIgG1VK4E12 길항물질을 이용한 IL-17A의 저해에 의한 IL-6 생산 억제에 대한 세포 시험.
도 18, 19. m4 VHHc8의 44번 및 45번 위치에 돌연변이를 가진 항체를 함유하는 산물에 대해 수행된 변성 조건 하의 단백질 전기영동.
도 20. FR2에서 위치 F44 및 45에 돌연변이를 함유하는 m4VHHc8 길항물질을 이용한 IL-17A의 저해에 의한 IL-6 생산 억제에 대한 비교 세포 시험.
도 21. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 상호작용을 결정하는 m4VHHc8의 FR2 중의 위치 44 및 45에서의 다른 돌연변이들의 안정성 및 기능적 성질을 보여주는 다이아그램.
도 22. 다양한 기원의 IL-17A와 BCD 109 상호작용의 동역학적 파라미터들의 측정(시험은 Octet RED96 장비를 사용하여 수행했다).
도 23. 다양한 기원의 IL17A와 BCD109 상호작용의 동역학적 파라미터들에 대해 수득된 결과(시험은 Octet RED 96 장비를 사용하여 수행했다).
도 24. 열 스트레스 처리 전과 후의 BCD109 항체들에 의해 수득되는 크로마토그램.
본원에 사용된 "단일클론 항체"는 본 명세서에 다른 언급이 없는 한, 라마로부터 수득된 항체, 키메라(chimeric) 항체, 인간화된(humanized) 항체 또는 완전 인간 항체를 의미한다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 예컨대 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술들과 선행 기술에 공지된 다른 기술들과의 조합에 의해 생산될 수 있다.
"단일클론 항체"는 단일 카피 또는 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함한 클론으로부터 수득되는 항체를 의미하는 것이지, 이의 생산 방법을 의미하는 것은 아니다. "단일클론 항체"는 무손상(intact) 항체(전체 또는 전체 길이의 Fc 영역을 보유), 사실상 무손상 항체, 항원-결합 영역을 함유하는 항체 일부 또는 단편, 예컨대 라마 유래의 Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편, 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체일 수 있다. "Fab" 단편은 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인뿐만 아니라 가변 중쇄 도메인 및 제1 불변 중쇄 도메인(CH1)을 함유한다. "F(ab')2" 항체 단편은 C 말단 영역에서 힌지드 시스테인 잔기에 의해 주로 공유결합된 한쌍의 Fab 단편을 함유한다. 또한, 항체 단편들 사이에는 다른 화학적 결합도 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
또한, 본원에 사용된 "단일클론 항체"는 VHH 및 VL을 암호화하는 DNA를 링커(linker) 서열을 이용하여 결합시켜 수득할 수 있는 일본쇄 Fv일 수 있다. 단백질이 표적(예, 에피토프 또는 항원)에 대해 특이적 또는 선호적 결합을 하는 능력을 유지하는 한, "항체"란 용어에 속한다. 항체는 글리코실화될 수 있거나, 글리코실화되지 않을 수 있으며, 모두 본 발명의 범위에 속한다.
본원에 사용된 "유도체(derivative)" 또는 항체 "변형체(variant)"란 용어는 모(parental) 항체 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가, 결실 및/또는 치환됨에 의해 모 서열과 다른 아미노산 서열을 가진 분자를 의미한다. 바람직한 양태에 따르면, 항체는 모 항체의 FR 영역 또는 CDR 영역에 적어도 하나(예컨대, 1개 내지 약 10개, 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개)의 아미노산 치환을 함유한다. 본 출원은 변형 항체의 서열에 관한 동일성 또는 상동성을, 서열들을 정렬하고, 필요하다면 절단하여 동일성이 최대 퍼센트인 서열을 달성하도록 한 후, 모 항체의 잔기와 동일한 변형 항체의 서열에 존재하는 아미노산 잔기의 퍼센트로써 정의한다.
항체 유도체(모 항체 유래)는 모 항체가 결합하는 것과 같은 항원 또는 바람직하게는 에피토프에 결합하는 능력을 유지하거나, 바람직하게는 모 항체를 능가하는 성질 또는 생물학적 활성을 하나 이상 나타내는 것이다. 예를 들어, 이 항체는 모 항체와 비교했을 때, 더 우수한 응집 안정성, 더 강한 친화성, 향상된 약동학 또는 항원 생물학적 활성을 저해하는 증가된 능력을 보유하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 "VHH-유도체"란 용어는 모 항체의 서열에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해, 모 VHH 항체의 서열과 다른 아미노산 서열을 보유하는 VHH 항체의 유도체를 의미한다. 바람직한 양태에 따르면, VHH 항체는 모 항체의 FR 영역 또는 CDR 영역에 적어도 하나(예컨대, 1개 내지 약 10개, 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개)의 아미노산 치환을 함유한다.
항체 유도체는 모 항체가 결합하는 것과 같은 항원 또는 바람직하게는 에피토프에 결합하는 능력을 유지하거나, 바람직하게는 모 항체를 능가하는 적어도 하나의 성질 또는 생물학적 활성을 나타내는 것이다. 예를 들어, 이 항체는 모 항체와 비교했을 때, 더 우수한 응집 안정성, 더 강한 친화성, 향상된 약동학 또는 항원 생물학적 활성을 저해하는 증가된 능력을 보유하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 "모 VHH 항체" 또는 "초기 VHH 항체" 또는 "야생 VHH 항체"는 VHH 변형체를 생산하는데 사용되는 아미노산 서열로 암호화된, 면역화 또는 비-면역화된 낙타과 동물로부터 분리된 VHH 항체를 의미한다. 모 항체는 낙타과로부터 유래되는 프레임워크 서열(VHH 가변 도메인과 관련해서)을 보유할 수 있지만, 경쇄 가변 도메인의 프레임 서열은 완전하게 또는 실질적으로 인간 기원인 것이 바람직하다.
본원에 사용된 "모" 항체, "초기" 항체 또는 "야생" 항체는 변형체를 생산하는데 사용되는 아미노산 서열로 암호화된 항체를 의미한다. 모 항체는 낙타과로부터 유래되는 프레임워크 서열(VHH 가변 도메인과 관련해서)을 보유할 수 있지만, 경쇄 가변 도메인의 프레임 서열은 완전하게 또는 실질적으로 인간 기원인 것이 바람직하다.
본원에 사용된, "특이적으로 결합하는"이란 용어는 특이적 결합 과정에 관여하는 한 부분이 특이적 결합 파트너(파트너들) 외의 다른 분자들에는 유의적으로 결합하지 않는 상황을 의미한다. 또한, 이 용어는 예컨대 본 발명에 따른 항체의 항원 결합 부위가 다수의 항원들이 운반하고 있는 특정 에피토프에 특이적인 경우에도 적용되며; 이 경우에 항원 결합 부위를 가진 특정 항체는 다양한 에피토프 운반 항원들과 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 인간 IL-17(IL-17A)에 특이적으로 결합하지만, 인간 IL-17B, IL-17C, IL-17D 또는 IL-17E에는 특이적으로 결합하지 않는다. 더구나, 본 발명의 단일클론 항체는 인간 IL-17 및 게잡이원숭이 유래의 IL-17에 특이적으로 결합하지만, 래트 IL-17 또는 뮤린 IL-17에는 특이적으로 결합하지 않는다.
본원에 사용된, "바람직하게 결합한다"란 용어는 선행 기술에 공지된 절차(예를 들면, 경쟁적 ELISA 또는 Octet 기구를 이용하여 수득한 KD 측정값)에 따라 측정 시, 항체가 임의의 다른 항원에 결합하는 것보다 특정 항원에 적어도 20% 이상, 바람직하게는 약 50% 이상 더 결합하거나, 또는 2배, 20배, 50배 또는 100배 더 결합하는 상황을 의미한다. 항체는 한 항원 내의 하나의 에피토프에 바람직하게 결합할 수 있지만, 동일 항원의 다른 에피토프에는 결합하지 않을 수 있다. 즉, 본 발명의 항체는 인간 IL-17에는 바람직하게 결합하나, 래빗 IL-17에는 결합하지 않는다.
본원에 사용된 "에피토프"란 용어는 항체의 하나 또는 여러 항원 결합 부위를 통해 항체에 의해 인식되어 항체에 결합할 수 있는 분자 일부를 의미한다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 표면 활성 기를 함유하고, 특이적인 3D 구조 특징을 보유한다. "저해성 에피토프" 및/또는 "중화성 에피토프"는 무손상 항원 분자 및 상기 에피토프에 특이적인 항체에 결합하는 정황에서처럼, 분자의 활성 또는 이 분자를 함유하는 유기체의 활성을 생체내 또는 시험관내에서 상실 또는 감소시키는 에피토프를 의미한다.
본원에 사용된 "에피토프"란 용어는 동물, 바람직하게는 마우스 및 인간과 같은 포유동물에서 항원성 및/또는 면역원성 활성을 나타내는 폴리펩타이드 단편을 의미한다. 본원에 사용된 "항원성 에피토프"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있고 선행 기술에 공지된 임의의 기술(예컨대, 표준 면역분석법)로 검출할 수 있는 폴리펩타이드 단편이다. 항원 에피토프는 반드시 면역원성은 아니지만, 면역원성을 보유할 수 있다. 본원에 사용된 "면역원성 에피토프"는 선행 기술의 임의의 방법으로 측정된 것처럼, 동물 중에서 항체 반응을 야기하는 폴리펩타이드 단편으로써 정의된다. "비선형 에피토프" 또는 "입체구조적 에피토프"는 에피토프-특이적 항체와 결합하는, 항원 단백질 내의 비인접 폴리펩타이드(아미노산)을 함유한다.
본 발명에 따른 항체를 언급할 때 표현된 "기능적 활성" 또는 "기능적 특징" 또는 "생물학적 활성" 또는 "활성"이란 용어는 본원에 사용된 것처럼 호환될 수 있고, 비제한적으로 에피토프/항원 친화성 및 특이성; 생체내 또는 시험관내에서 IL-17을 중화시키거나 IL-17에 길항작용하는 능력; IC50; 항체 안정성 및 항체의 생체내 면역원성을 포함한다. 선행 기술에서 확인된 다른 생물학적 성질 또는 항체 특징들로는, 예컨대 교차 반응성(즉, 표적 펩타이드의 비-인간 상동체 또는 다른 단백질 또는 표적과의 반응) 및 포유동물 세포에서 높은 단백질 발현 수준을 유지하는 능력을 포함한다. 전술한 성질 또는 특징들은 선행 기술에 알려진 절차, 예컨대 비제한적으로 ELISA, 경쟁적 ELISA, 옥테트 분석, 시험관내 또는 생체내 제한 없는 중화 분석, 수용체 결합, 사이토킨 또는 성장인자의 생산 및/또는 방출, 시그널 형질도입 및 인간, 영장류 또는 임의의 다른 급원을 비롯한 다양한 급원에서 수득되는 조직 절편의 면역 조직화학 연구를 사용하여 관찰하거나, 측정하거나 평가할 수 있다.
본원에 사용된 "단일클론 항체"의 집단은 동종성 또는 본질적으로 동종성 항체 집단(즉, 이 집단에 존재하는 항체의 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 약 97 또는 98% 이상, 더 바람직하게는 적어도 99%가 ELISA에서 동일한 항원/에피토프와 경쟁할 것이고, 또는 더 바람직하게는 아미노산 서열에 관한 한 동일한 항체이다)을 의미한다.
천연의 전체 크기의 항체는 4개의 폴리펩타이드 사슬(전체 길이의 약 50 내지 70 KDa의 2개의 H 중쇄 및 전체 길이의 약 25 KDa의 2개의 L 경쇄)이 이황화 결합에 의해 결합되어 있는 면역글로불린 분자로 표현된다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 항원과의 결합에 역할을 하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 도메인을 함유한다. 각 사슬의 카르복시 말단 도메인은 주로 작동인자 기능에 역할을 하는 불변 영역을 결정한다. 경쇄는 카파 및 람다로 분류되고 특정한 불변 영역을 보유한다. 각 경쇄는 가변 N-말단 경쇄 영역(이하, VL 또는 VK라 지칭함) 및 단일 도메인으로 이루어진 불변 경쇄 영역(CL 또는 CK)을 함유하는 것을 특징으로 한다. 중쇄는 γ, δ, α, μ 및 ε으로 분류되고 면역글로불린의 클래스들, 즉 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 규정하고; 이들 중 일부는 추가로 서브클래스(이소타입), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 세분될 수 있다. 각 중쇄 유형은 특정 불변 영역 Fc를 특징으로 한다. 각 중쇄는 가변 N-말단 영역(이하 VH라 지칭함) 및 불변 영역 CH를 함유한다. 불변 중쇄 영역은 IgG, IgD 및 IgA의 경우 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어지고, IgM 및 IgE의 경우에는 4개의 도메인(CH1, CH2, CH3 및 CH4)으로 이루어진다. 또한, VH, VHH 및 VL은 더욱 보존적인 프레임워크 영역(FR)이 사이에 끼여있는 소위 초가변 영역(상보성 결정 영역, CDR)으로 세분될 수 있다. 각 가변 도메인은 N 말단부터 C 말단까지 다음과 같은 순서로 배치된 3개의 CDR과 FR을 함유한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4.
본원에서, 3개의 중쇄 CDR은 "HCDR1, HCDR2 및 HCDR3"으로 지칭되는 반면, 3개의 경쇄 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"으로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적으로 상호작용하는 아미노산 잔기를 대부분 함유한다. CDR 잔기들은 카벳 넘버링 방식에 따라 번호가 매겨지고 위치한다.
"항원"이란 용어는 항체가 반응할 수 있는 항원 표적을 의미하고, 본 기술분야에서 전문가들이 사용하는 방식과 같은 방식으로 사용되며, 비제한적으로 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리사카라이드, 당단백질, 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA) 또는 화학적 항원, 수용체 또는 인터루킨을 포함한다. 인터루킨은 다양한 그룹의 인터루킨, 예컨대 인터루킨 1(알파 및 베타), 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 17, 인터루킨 18 및 인터루킨 33을 포함할 수 있다.
또한, "항원"이란 용어는 본 발명의 항체를 생산하기 위한 목적인, 동물(예, 라마)의 면역화에 사용되는 물질을 나타내는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 정황에서, "항원"은 더 광범위한 의미를 가질 수 있고, 항원의 정제된 형태뿐 아니라 미정제된 형태 또는 완전히 분리되지 않은 형태 또는 정제된 항원 산물, 예컨대 세포, 세포 용해물 또는 상청액, 세포 분획, 예컨대 단백질-운반체와 접합된 추가 합텐을 가진 세포막 등을 커버할 수 있다. 면역화에 사용되는 항원은 본 발명의 항체가 최종적으로 결합할 수 있는 항원 표적과 구조적으로 동일한 항원을 반드시 의미하는 것은 아니다. 보통, 면역화에 사용되는 항원은 항원 표적의 축소 형태로써, 예컨대 면역원성 에피토프를 함유하는 단편이다. 면역화에 사용되는 항원에 대한 더 세부사항은 문헌에 기술되어 있고, 이 기술분야의 전문가에게는 익숙할 수 있다.
각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역들은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. 따라서, 무손상 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 보유한다. 이기능성(bifunctional) 또는 이-특이성(bi-specific) 항체 외에, 2개의 결합 부위는 동일하다. 본 출원에 따르면, "항원 결합 영역", "항원 결합 부위", 또는 "항원 결합 도메인"은 본원에 사용된 것처럼 호환가능하고 항원과 상호작용하는 아미노산 잔기를 함유하여 항체에 항원에 대한 특이성 및 친화성을 제공하는 항체 영역을 의미한다. 이 항체 단편은 항원 결합 잔기의 적당한 입체구조를 유지하는데 필수적인 프레임 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직하게는, VHH 항원 결합 영역의 CDR 또는 본 발명의 항체의 전체 항원 결합 영역은 전부 낙타과에서 유래하거나 또는 실질적으로 낙타과 기원인 것이고, 항체의 특정 성질(예, KD, koff 또는 IC50)을 향상시키기 위해 변화된 특정 아미노산 잔기, 예컨대 다양한 아미노산 잔기(예컨대, 표 6 참조)로 치환된 특정한 아미노산 잔기를 함유한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 프레임워크 영역은 낙타과 기원인 것, 또는 인간 기원인 것, 또는 실질적으로 인간 기원인 것이며(인간 기원의 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%), 카벳 넘버링에 따른다.
"항체 단편"은 전체 크기의 항체의 활성을 가진 항체 단편으로 표현될 수 있다. 이 항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab Fv 및 scFv로 표현될 수 있다.
또한, "IL-17" 또는 "IL-17A"로 지칭되기도 하는 "인터루킨 17"은 20 내지 30kD의 동종이량체성 당단백질이다. 인간 IL-17의 유전자는 155개의 아미노산으로 이루어지고, 19개의 아미노산 시그널 서열과 136개의 아미노산 성숙 분절을 보유하는 단백질을 암호화한다. 인간 IL-17A의 아미노산 서열은 래빗, 마우스 및 래트의 아미노산 서열과 각각 80%, 63% 및 58% 유사하다. 인간 IL-17A의 아미노산 서열은 게먹이원숭이의 IL-17A와 97% 정도 동일하다.
본원에 사용된 본 발명의 항-IL-17 단일클론 항체(이하, 본 발명의 항체"라고 지칭됨)와 관련하여 적용된 "항체"란 용어는 단일클론 항체를 의미한다.
본원에 사용된, 본 발명의 항체의 활성과 관련하여 "저해한다" 또는 "중화시킨다"란 용어는 검체 저해의 발달 또는 정도, 예컨대 비제한적으로 생물학적 활성(예컨대, IL-17의 활성) 또는 성질, 질환 또는 증상을 차단, 예방, 제한, 지연, 정지, 감소 또는 유의적으로 반전시키는 능력을 의미할 것이다. 본 발명에 따른 항체와 IL-17의 결합은 IL-17 활성을 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 저해 또는 중화시킨다.
핵산 또는 단백질 산물(예, 항체)과 관련하여, "분리된"이란 용어는 천연 급원에서 보통 배합되어 있는 적어도 하나의 오염 물질로부터 동정 및 분리된 핵산 분자 또는 단백질 분자를 의미한다. 바람직하게는, "분리된 항체"는 특별한 항원 특이성을 가진 다른 항체를 실질적으로 함유하지 않는 항체이다(예를 들면, 본 발명의 약학 조성물은 IL-17A에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 함유하고, IL-17A 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 실질적으로 함유하지 않는다).
본원에 사용된 "카벳 넘버링 방식" 또는 "카벳에 따른 넘버링"이란 용어는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역에 존재하는 다른 아미노산 잔기보다 더욱 가변적인(즉, 초가변적인) 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 시스템을 의미한다(Kabat et al. Ann. NY Acad. Sci., 190: 382-93(1971); Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242(1991)).
폴리뉴클레오타이드는 다른 폴리뉴클레오타이드와 기능성 결합을 갖고 있다면 "기능적으로 결합된" 것이다. 예를 들어, 프로모터(promotor) 또는 인헨서(enhancer)는 서열 전사에 영향을 미친다면 암호화 서열에 기능적으로 결합된 것이다. 폴리펩타이드는 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 결합되어 있다면, 바람직하게는 이들이 동일한 오픈 리딩 프레임에 위치한다면 다른 폴리펩타이드에 "기능적으로 결합된다".
본원에 사용된 "DNA 작제물"이란 용어는 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA 또는 이의 단편을 의미한다. 일반적으로, 항체(예컨대, 본 발명의 항체)를 암호화하는 DNA 또는 이의 단편은 오픈 리딩 프레임 내에서 다른 폴리펩타이드(예컨대, IL-2 수용체와 같은 다른 사이토킨의 수용체의 도메인 또는 영역)를 암호화하는 적어도 하나의 다른 DNA 단편에 기능적으로(작동적으로) 결합되고, 그 다음 적당한 발현 벡터에 삽입된다. 보통, DNA 작제물은 특정 항체 부위를 암호화하는 여러 DNA 단편들이 리딩 프레임 내에서 기능적으로 결합되어, 전체 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 연속된(solid) 작제물을 제공하는 방식으로 제조된다. 예를 들어, DNA 작제물은 N 말단부터 C 말단까지 항체를 암호화할 것이다. 이러한 항체들은 발현되고, 분리된 후, 활성에 관하여 평가될 수 있다.
"벡터"란 용어는 합성적으로 그리고 생명공학을 통해 수득되는 핵산을 의미하고, 특정한 당해 분야의 서열 기능적 인자들의 세트로 알려진 서열을 함유한다. 특정 벡터들은 이들이 도입된 숙주 세포들에서 자율적으로 복제할 수 있는 반면, 다른 벡터들은 숙주 세포 게놈 내에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 일부 벡터들은 이들이 기능적으로 결합된 유전자의 발현을 매개할 수 있다. 이 출원에서, 이러한 벡터들은 "재조합 발현 벡터"(또는 "발현 벡터")라 불리고; 이러한 벡터의 예들은 선행 기술에 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 "세포", "숙주 세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이란 용어들은 호환가능하고, 본 발명에 따른 임의의 분리된 폴리뉴클레오타이드, 또는 본 발명의 항체 서열을 함유하는 임의의 재조합 벡터(재조합 벡터)의 수용체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 의미한다. 숙주 세포는 개별 숙주 세포로부터 수득되는 세대들을 포함하고; 이 세대들은 자연적 돌연변이, 우발적 돌연변이, 또는 의도적 돌연변이 및/또는 변화로 인하여 최초 숙주 세포와 완전히 동일할 필요는 없다(형태 또는 전체 DNA 보체와 관련하여). 숙주 세포는 재조합 벡터에 의해 형질전환되거나, 형질도입되거나 또는 감염된 세포, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 발현하는 단일클론 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터(숙주 염색체에 혼입되거나 혼입되지 않은)를 함유하는 숙주 세포는 또한 "재조합 숙주 세포"라 지칭될 수도 있다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포(예컨대, ATCC CRL-9096), NS0 세포, SP2/0 세포, COS 세포(ATCC, 예컨대, CRL-1650, CRL-1651) 및 HeLa(ATCC CCL-2)이다. 본 발명에 사용되는 또 다른 숙주 세포로는 식물 세포, 효모 세포, 기타 포유동물 세포 및 원핵생물 세포를 포함한다.
항체와 항원 표적(항원) 사이에 "특이적 결합"이란 용어는 면역학적 특이성을 의미한다. 항체는 하나의 항원 에피토프에 다른 항원 에피토프보다 더 강하게 결합한다면 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 특이적 결합은 유사한 항원 에피토프를 운반하는 다른 항원들과의 교차반응성을 배제하지는 않는다.
본 발명의 항체에 존재하는 VL 도메인은 VL 람다형 또는 VL 카파형일 수 있다. "VL 도메인"이란 용어는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는, VL 람다 및 VL 카파 이소타입을 모두 커버한다.
"약학 조성물"이란 용어는 본 발명의 항체의 치료적 유효량 + 부형제(운반체, 희석제, 매개제, 용매 및 다른 부형제 등)를 함유하는 포뮬레이션 및/또는 조성물을 커버한다.
"이용" 또는 "치료"란 용어는 본 발명의 항체가 결합할 수 있는 수용체에 의해 매개되는 질환 또는 질병의 재발률을 감소시키거나, 차도를 보이거나 질병 과정을 치료하고 경감시키는데 사용되는, 본 발명의 항체 또는 이를 함유하는 약학 조성물의 이용 능력에 적용된다.
본 발명은 증가된 친화성과 향상된 응집 안정성을 보유하고, 가변 도메인이 경쇄의 가변 도메인 VL과 VHH-유도체의 조합으로 표현되는, 인간화된 단일클론 항체, 바람직하게는 IgG형 항체를 제공한다.
한 양태에 따르면, 본 발명의 항체의 VHH 유도체는 위치 44X245X3 에 아미노산 치환을 함유할 수 있고, 여기서 X2 = G, A, V, S, T; X3 = A, V, T, H; 또는 이의 조합(44 및 45는 아미노산 치환 위치를 나타낸다)이다. 이하, 아미노산 치환 위치는 카벳 넘버링 방식을 사용하여 표시한다(http://www.bioinf.org.uk/abs/).
다른 양태는 낙타과 동물일 수 있는 면역화된 동물로부터 분리된 VHH를 함유하는 초기 IgG 항체에 비해, 향상된 응집 안정성의 VHH 유도체를 보유하는 본 발명의 항체를 수반한다.
본 발명의 다른 양태는 낙타과의 면역화된 동물로부터 분리된 항체 중쇄의 가변 도메인인 VHH-유도체를 함유하는 항체를 수반한다. 여기서, VHH-유도체는 위치 44 및 45에서 다음과 같은 치환을 제외하고는, 인간에게 전형적인 추가 아미노산 치환을 임의의 위치에 보유할 수 있다:
a) 44X2, 여기서 X2 = G, A, V, S, T;
b) 45X3, 여기서 X3 = A, V, T, H;
또는 이의 조합.
다른 양태는 낙타과의 비면역화된 동물로부터 분리된 중쇄 가변 도메인으로 표현될 수 있는 VHH-도메인을 함유하는 본 발명의 항체를 수반한다. 여기서, VHH-유도체는 위치 44 및 45에서 다음과 같은 치환을 제외하고는, 인간에게 전형적인 추가 아미노산 치환을 임의의 위치에 보유할 수 있다:
a) 44X2, 여기서 X2 = G, A, V, S, T;
b) 45X3, 여기서 X3 = A, V, T, H;
또는 이의 조합.
다른 양태는 인간 항체의 유도체인 경쇄 가변 도메인 VL을 함유하는 본 발명의 항체를 수반한다. 본 발명의 추가 양태에서, 경쇄 가변 도메인 VL은 동물 항체의 인간화된 단편이다.
또 다른 양태는 시스테인-44(카벳 넘버링 방식)를 함유하는 VHH-유도체 및 시스테인-100(카벳 넘버링 방식)을 함유하는 경쇄 가변 도메인 VL을 함유하는 본 발명의 항체를 수반한다.
본 발명의 다른 양태는 다음과 같은 이소타입, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중 어느 하나인 항체를 수반한다.
다른 양태로는 IgG의 일부로써 비-천연의 변형 Fc를 함유하는 본 발명의 항체를 수반한다.
다른 양태로는 10mg/ml 이상의 농도로 사용하고 4℃의 온도에서 6개월 넘게 저장했을 때 응집체의 함량이 초기 용액 중의 함량에 비해 5% 이하로 증가하는 정도의 응집 안정성을 보유하는 본 발명의 항체를 수반한다. 본 발명의 추가 양태에 따르면, 항체는 10mg/ml 이상의 농도로 사용하고 37℃의 온도에서 2주 넘게 저장했을 때 응집체의 함량이 초기 용액 중의 함량에 비해 5% 이하로 증가하는 정도의 응집 안정성을 보유한다. 본 발명의 또 다른 추가 양태는 10mg/ml 이상의 농도로 사용하고 42℃의 온도에서 48시간 넘게 저장했을 때 응집체의 함량이 초기 용액 중의 함량에 비해 5% 이하로 증가하는 정도의 응집 안정성을 보유하는 항체를 수반한다. 본 발명의 또 다른 추가 양태는 10mg/ml 이상의 농도로 사용하고 50℃의 온도에서 6시간 넘게 저장했을 때 응집체의 함량이 초기 용액 중의 함량에 비해 5% 이하로 증가하는 정도의 응집 안정성을 보유하는 항체를 수반한다.
한 양태는 해리 상수 KD가 10-9 M 이하인 항체를 수반한다. 또 다른 양태는 항체-항원 상호작용 결합 상수 kon(1/Ms)이 105 l/Ms 이상인 본 발명의 항체를 수반한다. 본 발명의 또 다른 양태는 항원-항체 해리 상수 dis(1/s)가 10-4 l/s 이하인 항체를 수반한다.
또한, 본 발명은 항체 단편을 제안한다. 이 항체 단편은 항체 서열의 일부이고, 생물특이적 항체 변형체를 포함하는, 경쇄, 중쇄, 이 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인으로 표현될 수 있다. 본 발명의 다른 양태는 Fab의 일부인 경쇄, 중쇄, 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인으로 표현되는 항체 단편을 수반한다. 본 발명의 항체 단편은 scFv의 일부인 경쇄, 중쇄, 이 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인으로 표현될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 생산 방법을 제안한다. 이 항체 생산 방법은 다음 중에서 선택되는 단계들, 즉 당업계에 잘 알려져 있는 직접 돌연변이유발, 디스플레이법, 유전자공학, 생화학 및 고성능 생명공학법 중에서 선택되는 단계들을 수반할 수 있고, 낙타과 항체의 VHH 도메인 중 여러 위치들에 직접 돌연변이유발하기 위한 방법을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 청구된 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 작제물, 및 본 발명의 하나 또는 여러 DNA 작제물을 함유하는 발현 벡터를 제공한다.
더욱이, 본 발명은 상기 발현 벡터 또는 DNA 작제물을 함유하는 세포주를 제안한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 단편을 수득하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 세포주를 배양하는 단계, 그 다음 수득된 항체 또는 이의 활성 단편을 분리 및 정제하는 단계를 수반하여, 인간화된 단일클론 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법을 제안한다.
또한, 본 발명은 하나 또는 여러 약학적으로 적합한 부형제, 희석제 또는 운반체와 함께 항체 또는 이의 단편을 함유하는 약학 조성물을 제안한다. 조성물 수득을 위한 기술의 세부사항은 특별한 생명공학 안내서, 예컨대 [25]에 설명되어 있다.
본 발명의 다른 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 활성 분자 내에 항체 또는 이의 단편을 수반하며, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 3개의 초가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 함유하는 낙타과 중쇄 가변 도메인(VHH)의 유도체(이때,
상기 HCDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열: G-T-F-A-T-X32-X33-X34-X35(카벳 지수에 따라 넘버링)(이때, X32는 S, N, K, R, E, W, Q, D, A, V 및 F를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X33은 P 및 S를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이며; X34는 M 및 I를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X35는 G, N, S, A, L, I, R, V 및 Q를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이다)를 함유하고;
상기 HCDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열: X50-I-X52-X52a-S-G-X55-D-R-I-Y-A-D-S-V-K-G(이때, X50은 A, G 및 L을 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X52는 S, D 및 E를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이며; X52a는 P 및 A를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X55는 G, S, T, L, R, D, E, K, A 및 W를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이다)를 함유하며;
상기 HCDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열: C-A-X94-X95-X96-X97-F-X99-X100-X100a-X100b-X100c-X100d-X100e-X100f-D-Y-D-S(이때, X94는 K, S, T, V, D 및 G를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고, X95는 R 및 K를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이며; X96은 G, R, Y, H, D, W 및 K를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X97은 R, A, V, S, L 및 H를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X99는 D, E, G, A, R, V, K 및 Q를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이며; X100은 G, S 및 N을 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X100a는 G, T, P, V, R, N 및 K를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이며; X100b는 V, S, T, L, Y, A, H, G 및 I를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X100c는 Y, W 및 S를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X100d는 R, V, L, Y, A, W, K, G, Q 및 I를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이며; X100e는 T, L, A 및 S를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이고; X100f는 T, L, G, P, N, A, Q, F, I 및 D를 함유하는 그룹 중에서 선택되는 아미노산이다)를 함유한다); 및
b) 인간 항체의 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 인간화된 항체의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 항체 또는 이의 단편을 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 3개의 초가변 영역(즉,
G-T-F-A-T-S-P-M-G(서열번호 4)의 아미노산 서열을 함유하는 HCDR1;
A-I-S-P-S-G-G-D-R-I-Y-A-D-S-V-K-G(서열번호 5)의 아미노산 서열을 함유하는 HCDR2;
C-A-V-R-R-R-F-D-G-T-S-Y-Y-T-G-D-Y-D-S(서열번호 6)의 아미노산 서열을 함유하는 HCDR3)을 함유하는 중쇄 가변 도메인(VHH)의 유도체;
b) 인간 항체의 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 인간화된 항체의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 항체 또는 이의 단편을 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 도메인(VHH)의 유도체 및 인간 항체의 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 인간화된 항체의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 항체를 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고 VHH-유도체를 함유하며, 이 가변 도메인이 서열번호 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 함유하는, 항체 또는 이의 단편을 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 서열번호 7의 아미노산 서열을 함유하는 VHH-유도체 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 함유하는 인간 항체의 경쇄 가변 도메인(VL)을 함유하는 항체를 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, VHH-유도체 및 서열번호 8과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 인간 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 함유하는 항체 또는 이의 단편을 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고 서열번호 9의 아미노산 서열을 함유하는 중쇄, 및 서열번호 10의 서열을 함유하는 인간 항체 경쇄의 가변 도메인(VL)을 함유하는 항체를 수반한다. 다른 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고 서열번호 9 및/또는 서열번호 10과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 경쇄를 함유하는 항체를 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 인간 IL-17A에 대한 결합 친화성이 KD ≤10-10 M인 것을 특징으로 하는 본 발명의 항체를 수반한다. 다른 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 인간 IL-17A에 대한 동역학적 결합 상수 kon(1/Ms)가 105 l/Msec 이상인 항체를 수반한다. 다른 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 인간 IL-17A에 대한 동역학적 해리 상수 dis(1/s)가 10-5 l/sec 이하인 항체를 수반한다. 대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 임의의 특이적 활성 시험으로 검사된 임의의 파라미터와 관련하여, 인간 IL-17A의 활성을 50% 이상으로 저해하는 항체를 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고 포유동물, 효모 또는 박테리아 세포에 의해 생산되는 항체를 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 천연 Fc에 비해 Fc 영역에 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 함유하고, 이 치환이 천연 Fc를 보유한 항체에 비해, 항체의 이화학적 성질 및 약동학적 성질을 향상시키고 IL-17A에 결합하는 항체의 능력을 상실시키지 않는, 항체를 수반한다.
대안적 양태는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 DNA 작제물을 제안한다. 더구나, 본 발명은 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 하나 이상의 DNA 작제물을 함유하는 발현 벡터를 제안한다. 또한, 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체를 수득하기 위한 벡터를 함유하는 숙주 세포도 제안되었다.
또한, 본 발명은 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법으로써, DNA 작제물을 함유하는 숙주 세포를 배양 배지에서 상기 항체 또는 이의 단편을 수득하기에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 추가로 상기 항체 또는 이의 활성 단편을 분리 및 정제하는 단계를 특징으로 하는 방법을 제안한다.
또한, 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체, 및 하나 이상의 약학적으로 적합한 부형제, 희석제 또는 운반체를 함유하는 약학 조성물이 제안되었다. 이 조성물은 추가로 TNF-α 저해제들 중에서 선택되는 활성 약학적 성분을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 IL-17A 매개의 질환 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. IL-17A 매개의 질환 또는 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응 관절염, 척추관절병증, 전신홍반루푸스, 크론병, 궤양대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존적 진성당뇨병, 갑상선염, 천식, 알러지 장애, 건선, 피부염, 전신 경화증, 이식편대숙주 질환, 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 죽상경화증, 파종혈관내응고, 가와사키 질환, 그레이브스 질환, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 질환, 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 신장 병발이 있는 현미경적 다발성혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈 증후군, 악액질, 감염, 침습, 후천성 면역결핍증후군, 급성 횡단 척수염, 헌팅톤무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 발작, 원발담즙성간경변, 용혈빈혈, 악성종양, 심부전, 심근경색, 애디슨병, 다분비자가면역증후군 I형 및 II형, 슈미츠 증후군, 급성호흡곤란증후군, 탈모, 원형탈모, 혈청음성 관절병증, 관절병증, 라이터 증후군, 건선 관절병증, 궤양대장염 관련 관절병증, 장병성 활막염, 클라미디아, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절병증, 죽종증 질환/만성 경화증, 아토피성 알러지, 자가면역 수포 질환, 천포창, 낙엽천포창, 유사천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈빈혈, 쿰즈 양성 용혈빈혈, 후천성 악성빈혈, 소아 악성빈혈, 근통성 뇌척수염/만성피로증후군, 만성 활동 간염증, 뇌 거대 동맥염, 원발 경화성간염, 잠재 자가면역간염, 후천성 면역결핍증후군(AIDS), AIDS 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근병증, 여성 불임, 난소 기능 부전, 조기 난소 부전, 폐 섬유증, 간질성 폐 질환과 연관된 잠재성 혼합 결합 조직 질환, 간질성 폐질환과 연관된 전신 경피증, 간질성 폐 질환과 연관된 류마티스성 관절염, 폐 질환과 연관된 전신 홍반성 루푸스, 폐질환과 연관된 피부근염/다발근염, 폐질환과 연관된 쇼그렌 질환, 폐 질환과 연관된 강직성 척추염, 미만성 폐 혈관염, 폐질환과 연관된 혈철소증, 약물에 의한 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 유발 섬유증, 폐쇄 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤이 있는 폐 질환, 후 감염성 간질성 폐 병리, 통풍성 관절염, 자가 면역 간염, 자가 면역성 간염 유형 I (고전적 자가면역 또는 루푸스 모양 간염), 자가면역 간염 유형 II(항-LKM 항체 연관성), 자가면역성 저혈당, 각피증식증( acanthokeratodermia)이 있는 B형 인슐린 내성증, 부갑상선 기능 저하증, 급성 이식 관련 면역 질환, 만성 이식 관련 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 유형 I 건선, 유형 II 건선, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구 감소증, NOS-신장 질환, 사구체신염, 현미경적 신장 다발혈관염, 라임 병, 원반 모양 홍반 루푸스, 특발성 NOS-남성 불임, 항정자 면역성, 다발성 경화증 (모든 유형), 교감 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿파스처 증후군, 결절성 다발동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸씨병, 전신 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야스 질환/관절염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선기능항진증, 자가면역 갑상선기능저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 1차 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알코올성 간경변, 알코올에 의한 간 손상, 담즙울체, 특이한 간 질환, 약물에 의한 간염, 비알코올성 지방 간염, 알러지 및 천식, 그룹 B 연쇄구균 감염(GBS), 정신 장애(우울증 및 정신분열증 포함), Th1- 및 Th2-매개 질환, 급성 및 만성 통증(다양한 형태), 악성종양, 예컨대 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 대장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 무베타지단백혈증(abetalipoproteinaemia), 말단 청색증, 급성 및 만성 감염 및 만연, 급성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 선암, 심방 전위(atrial ectopics), AIDS 치매 복합체, 알코올에 의한 간염, 알러지성 결막염, 알러지성 접촉 피부염, 알러지성 비염, 동종 이식 거부, 알파-I 항트립신 결핍증, 측면 근위축성 경화증, 빈혈, 협심증, 전각세포 변성, 항-CD3 치료, 항인지질 증후군, 수용체에 대항한 과민 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 관상 동맥 경화증, 동정맥루, 운동 실조, 심방 세동(불변성 또는 발작성), 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 뼈 이식 거부, 골수 이식(BMT) 거부, 다발갈래차단, 버킷 림프종, 화상, 심장 부정맥, 심근 기절 증후군, 심장 종양, 심근병증, 우회에 대한 염증 반응, 연골 이식 거부, 뇌 피질의 변성, 소뇌 장애, 혼란 또는 다초점 심방 빈맥, 화학 요법에 의한 장애, 만성 골수구성 백혈병(CML), 만성 알코올 중독, 만성 염증성 병변, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄성 폐 질환, 만성 살리실산염 중독, 결장직장암, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉 피부염, 폐 심장, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥 질병, 배양 음성 패혈증, 낭포성 섬유증, 사이토킨 요법에 의한 장애, 권투 선수의 뇌 질환, 탈수초성 질환, 뎅기 출혈열, 피부염, 피부학적 증상, 당뇨, 진성당뇨병, 당뇨병-관련된 아테롬성 동맥경화성 혈관 질환, 미만성 루이 소체 질환, 울혈 확장형 심근증, 기저핵 질환, 중년의 다운 증후군, CNS 도파민 차단제에 의해 유도된 운동 장애, 약물 감수성, 습진, 뇌척수염, 심장 내막염, 내분비병증, 후두개염, 엡스타인 바 바이러스 감염, 피부홍통증, 추체 외로 및 소뇌 증상, 가족성 적혈구포식성 림프조직구 증식증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드리히 운동 실조, 말초 동맥 질환, 진균 패혈증, 가스 봉소염, 위궤양, 사구체 신염, 임의 기관 또는 조직 이식 거부, 그램 음성 패혈증, 그램 양성 패혈증, 세포내 유기체에 의한 육아종, 털 세포 백혈병, 할러포르텐-스파츠 병, 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장 이식 거부, 혈색소 침착증, 혈액 투석, 용혈성 요독증후군 / 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 출혈, 간염 (A), 다발갈래 부정맥, HIV 감염/HIV-신경병증, 호지킨 병, 운동 과다 운동 장애, 과민 반응, 과민 관련 폐렴, 고혈압, 과소운동성 운동 장애, 시상 하부-뇌하수체-부신 축 검사, 특발성 애디슨 병, 특발성 폐 섬유증, 항체 - 매개 세포 독성, 무력증, 유아 근위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 바이러스 A, 이온화 방사선에 노출, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 허혈/재관류에 의한 질환, 허혈성 뇌졸중, 소아 류마티스성 관절염, 소아 척추 근위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레지오넬라증, 리슈만 편모충증, 나병, 피질척수 손상, 지방성수종, 간 이식 거부, 림프 수종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌막염, 수막구균혈증, 대사/특발성 질환, 편두통, 다발적 미토콘드리아 장애, 혼합 결합-조직 질환, 단일 클론 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다발성 변성(멘셀 데제린 토마스 시-드래거 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 미코박테리움 아비움, 결핵균, 골수이형성 증후군, 심근 경색, 심근 허혈성 질환, 인두 암, 신생아 만성 폐 질환, 신장염, 신장증, 신경 퇴행성 질환, 신경성 근육 위축 I, 호중구감소성 발열, 비호지킨 림프종, 복부 대동맥 갈래 폐쇄, 동맥 폐쇄성 질환, OKT3® 치료, 고환염/부고환염, 고환염/정관 수술 반전 작업, 장기비대증, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암, 부신생물 질병/종양 관련 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증성 질환, 연중 비염, 심낭 질환, 말초 아테롬성 동맥경화증 (atherlosclerotic) 질환, 말초 혈관 질환, 복막염, 악성 빈혈, 주폐포자충 폐렴, POEMS 증후군(다발성 신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 단일클론 혈장-증식성 질환 및 피부 변화), 관류후 증후군, 펌프 헤드 증후군, 심장절개술후 경색후 증후군, 자간전증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 치료, 레이노 현상과 질병, 레이노 병, 레프섬(Refsum) 병, 정기적으로 좁은 QRS 빈맥, 신장 혈관 고혈압, 재관류 손상, 제한 심근병증, 육종, 피부 경화증 질환, 노인성 무도병, 루이 소체 치매, 혈청 음성 관절염, 쇼크, 겸상 적혈구 질환, 피부 동종 이식 거부 반응, 피부 변화, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특정 부정맥, 척추 운동 장애, 척수 소뇌성 저하, 연쇄상 구균 근염, 소뇌의 구조적 손상, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심장혈관 매독, 전신 아나필락시스, 포괄적 전신성 염증 반응 증후군, 전신 발병 소아 류마티스 관절염, T 세포 또는 FAB ALL, 모세 혈관 확장, 혈전 경화증, 혈소판 감소증, 독성, 이식, 외상 / 출혈, 과민 반응 유형 III, 과민 반응 유형 IV, 불안정형 협심증, 요독증, 요로 패혈증, 두드러기, 심장 판막 질환, 정맥류, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 곰팡이 감염, 중요한 뇌염/무균성 뇌막염, 중요한 적혈구포식성 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군, 윌슨 병, 임의 기관 또는 조직에 대한 이종이식 거부, 급성 관상 동맥 증후군, 급성 특발성 다발신경염, 급성 염증 탈수초성 신경근 신경병증, 급성 허혈, 성인 발병 스틸씨 병, 원형 탈모증, 아나필락시스, 항인지질 항체 증후군, 재생 불량성 빈혈, 관상 동맥 경화증, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 자가 면역 피부염, 연쇄상 구균 감염과 관련된 자가면역 장애, 자가 면역 장질환, 자가 면역 청력 손실, 자가 면역 림프 증식성 증후군(ALPS), 자가 면역 심근염, 자가 면역 조기 난소 부전, 안검염, 기관지 확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 치명적인 항인지질 증후군, 복강 질병, 경추증, 만성 허혈, 반흔성 유천포창, 다발성 경화증의 위험이 있는 임상적으로 고립된 증후군 (시스), 결막염, 아동기 발병 정신 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 누낭염, 피부 근육염, 당뇨병성 망막증, 진성당뇨병, 허리 디스크, 추간판 탈출증, 약물 유발 면역 용혈성 빈혈, 심장 내막염, 자궁내막증, 안내염, 상공막염, 다형 홍반, 중증 다형 홍반, 임신 유천포창, 길랑-바레 증후군(GBS), 건초열, 휴즈 증후군, 특발성 파킨슨 병, 특발성 간질성 폐렴, IgE 매개 알러지, 자가 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염, 감염성 안구 염증 질환, 염증성 탈수초성 질환, 염증성 심장 질환, 염증성 신장 질환, 특발성 폐 섬유증/보통 간질성 폐렴, 홍채염, 각막염, 건성 각결막염, 쿠스마울 질환 또는 쿠스마울-마이어 질병, 랜드리 마비, 랑게르한스 세포 조직구증, 대리석 피부, 황반 변성, 현미경적 다발 혈관염, 베크테레프(Bechterew) 질환, 운동 뉴런 질환, 점막 천포창, 다 장기 부전, 중증 근무력증, 척수 이형성증 증후군, 심근염, 신경근 장애, 신경병증, 비-A 비-B형 간염, 시신경염, 골 용해, 난소 암, 소수관절형 JIA, 말초 동맥 폐쇄 질환, 말초 혈관 질환, 말초 동맥 질환 (PAD), 정맥염, 결절성 다발 동맥염, 다발 연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 백모증, 다관절형 소아 특발성 관절염, 여러 내분비 결함, 다발성 근염, 류마티스성 다발성 근육통(PMR), 펌프후 증후군, 원발성 파킨슨병, 전립선암 및 직장암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 전립선염, 순수 적혈구 무형성증, 주 부신 기능 부전, 재발성 시신경 척수염, 재협착, 류마티스 심장 질환, SAPHO(활막염, 여드름, 농포, 뼈과다증 및 골염), 경피증, 속발성 아밀로이드증, 쇼크 폐, 공막염, 좌골신경통, 속발성 부신부전, 실리콘-관련 결합 조직 질환, 스네든-윌킨슨 질환, 강직성 척추염, 스티븐스-존슨 증후군, 전신성 염증 반응 증후군, 두개 동맥염, 톡소플라즈마성 비염, 독성 표피 괴사, 횡단성 척수염, TRAPS (종양 괴사 인자 수용체 관련 주기적 증후군), 알러지 반응 I형, II형 당뇨병, 두드러기, 일반적인 간질성 폐렴, 혈관염, 봄철 결막염, 바이러스성 망막염, 보그-고야나기-하라다 증후군 (VKH 증후군), 습식 황반변성, 상처 치유 및 예르시니아- 또는 살모넬라-관련 관절병증 중에서 선택된다.
인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 약학 조성물은 IL-17A 매개의 질환 또는 질병을 치료하기 위해 치료적 유효량으로 투여될 수 있다.
본 발명은 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 IL-17A 매개의 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 제안한다. 이 치료 방법은 TNF-α 저해제의 추가 투여를 수반할 수 있다.
추가 실시예들은 본 발명을 입증해 보이지만, 본 발명을 이 실시예들 자체에만 한정하려는 것은 아니다.
본 발명의 명세서는 모든 정보 입수원에 대한 언급을 포함한다.
실시예
실시예 1
VHH계 항체를 수득하기 위한 순서도
도 1은 VHH계 항체를 수득 및 최적화하기 위한 순서도를 나타낸 것이다.
실시예 2
현탁 포유동물 세포 배양물에서 재조합 항원 및 항체의 생산
항체 및 항원은 공개된 프로토콜[26; 27]에 따라 중국 햄스터 난소 세포(CHO-K1)로부터 수득한 확립세포주에서 생산했다. EBNA1 단백질(엡스타인 바 바이러스 핵 항원 1)의 유전자를 구성적으로 발현하는 세포를 사용했다. 현탁 배양은 라이프 테크놀로지스 코포레이션의 무혈청 배지를 사용하고 제조업자의 지침에 따라 궤도 진탕기에서 플라스크를 이용하여 수득했다. 일시적 발현을 위해, 2*106/ml 농도의 세포를 선형 폴리에틸렌이민(PEI MAX, Polysciences)을 이용하여 형질감염시켰다. DNA/PEI 비는 1:3 내지 1:10이었다. 형질감염 5 내지 7일 후, 세포 배양물을 2000g 하에 20분 동안 원심분리하고 0.22㎛ 필터를 통해 여과했다. 배양액으로부터 표적 단백질을 affine HPLC로 분리했다.
C-말단 영역에 6개의 His 아미노산을 함유하는 재조합 IL-17A 단백질은 Profinity IMAC Ni-충전 수지(Bio-Rad) 상에서 배양액으로부터 분리 및 정제했다. 정제 절차 전, 배양액에는 NiCl2를 1mM의 농도로 첨가했다. 그 다음, Profinity IMAC Ni-충전 수지 5ml를 배양액에 첨가하고 진탕기에서 실온 하에 1h 동안 혼합했다. 흡수제를 5ml Thermo scientific Polypropylene 컬럼으로 이동시키고, 5 컬럼 부피의 PBS로 세척하여 비-특이적 결합된 성분을 제거했다. 결합된 항원은 0.3M 이미다졸(pH 8)과 150mM NaCl로 용출시켰다. 그 다음, 단백질은 SnakeSkin Dialysis Tubing 기술을 이용하여 PBS(pH 7.4) 내로 투석하고, 여과(0.22㎛)한 뒤, 튜브에 옮겨 담아 -70℃에서 보관했다. 수득한 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 평가했다(도 2).
시험 IgG1 항체 및 대조용 IgG1 항체는 IL-17A-Fc에 대해 전술한 절차에 따라 1ml Hi Trap rProeinA FF 컬럼(GE Healthcare) 상에서 정제했다. 수득한 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 평가했다(도 2).
실시예 3
인간 IL-17A를 이용한 라마 면역화 및 파지-디스플레이된 라마 항체의 Fab 라이브러리의 생산
라마(Lama Glama)는 동량의 완전 프로인트 보강제(1차 주사 시) 또는 불완전 프로인트 보강제(1차 외에 모든 주사 시)와 혼합된 항원 물질을 피하 투여로 사용하여 연속 5회 면역화시켰다. 재조합 단백질의 혼합물(주사 당 각 단백질 0.2mg)(이 중 하나는 인간 IL-17A이다(R&D Systems의 키트))을 항원으로써 사용했다. 2차 주사(면역화 단계)는 1차 주사 3주 후에 수행했고; 2주 간격으로 3회 더 면역화를 수행했다. 3회째부터 각 주사 후에 혈액 샘플(50ml)을 5개 수집했다.
채혈한 혈액을 1mM EDTA를 함유하는 PBS로 2배 희석했다. 그 다음, 희석한 혈액 35ml를 Histopaque®-1077 배지(Sigma, 밀도 1.077 g/ml) 위에 중층시키고 800g에서 20분 동안 원심분리했다. 혈장/Histopaque 배지 계면 구역에서 단핵 세포(림프구 및 단핵구)를 취하여 1mM EDTA를 함유하는 PBS로 세척했다.
단핵성 라마 세포의 총 RNA는 RNeasy Mini Kit를 사용하여 프로토콜(QIAGEN)에 따라 분리했다. RNA 농도 분석은 Nanovue(GE Healthcare)를 사용하여 수행했고; 분리된 RNA의 품질은 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 검사했다.
역전사 반응은 MMLV RT 키트(Evrogen)를 사용하여 MMuLV 역전사효소 및 랜덤 헥사머 프라이머를 이용하는 권장된 프로토콜에 따라 수행했다.
역전사 산물은 2단계 폴리머라제 사슬 반응에서 매트릭스(matrix)로써 사용하여 제한효소 부위가 인접해 있는 가변 도메인들의 유전자를 수득했다; 반응은 올리고뉴클레오타이드 키트 및 프로토콜을 사용하여 수행했다[27; 28; 29]. 또한, 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 유전자는 도 3에 도시된 바와 같은 제한분해, 결찰 및 증폭의 연속 반응을 이용하여 하나의 단편에 조합시켰다. 중쇄 유전자는 각각 카파 및 람다 경쇄 유전자에 부착시켰다. 이 경우, 모든 반응들에서 추정되는 매트릭스 분자의 수는 1011 이상이었다. 수득되는 DNA 산물(VL-CK-VH)은 NheI/Eco91I 제한효소로 처리하고, 오리지널 파지미드 pH5에 결찰시켰다. 파지미드 구조는 도 4에 제시했다. 결찰 산물은 프로토콜[30]에 따라 제조한 SS320 일렉트로컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용했다. 작제된 카파 및 람다 Fab 라이브러리의 목록은 각각 5.1*108 및 3.7*108이었다. 순수 파지-디스플레이 라이브러리의 산물은 앞서 기술된 절차[31]에 따라 제조했다.
실시예 4
파지-디스플레이 항체의 Fab 라이브러리의 선택
특이적 항-IL17A 파지-디스플레이 Fab-항체는 재조합 인간 IL-17A(R&D Systems의 키트)를 사용하여 파지 Fab-디스플레이 라이브러리로부터 선택했고; 일련의 선택 사이클은 전술한 바와 같이 수행했다[27; 31; 32]. 패닝(panning)법으로 선택 공정을 수행하기 위해, 인간 IL-17A는 50mM 탄산염 완충액(pH 9.5)에서 HighSorb 튜브(Nunc) 표면 위에 4℃ 하에 밤새 흡착시켰다. 또한, 튜브는 PBS(pH 7.4)로 세척하고, 그 다음, PBS(pH 7.4) - 탈지유(0.5% w/vol)를 함유하는 용액으로 1시간 동안 차단시켰다. 그 다음, PBS(pH 7.4) - 탈지유(0.5% w/vol) 중의 파지 용액 2 내지 4ml(ml당 1012 파지 입자)를 항원과 함께 튜브로 옮기고, 이 시스템을 교반 하에 1시간 동안 항온처리했다. 미결합된 파지는 PBS(pH 7.4)-Tween 20(0.1% vol/vol)으로 일련의 세척 사이클로 제거했다. 세척 사이클의 횟수는 제1 라운드에서부터 제3 라운드까지 각각 20회, 30회 및 40회로 증가시켰다. 결합된 상태를 유지하는 파지 입자는 교반 하에 15분 동안 100mM Gly-HCl 용액(pH 2.5)으로 용출시키고, 그 다음 1M TRIS-HCl(pH 7.6)로 중화시켰다. 수득한 파지로 E.콜리 TG1 박테리아를 감염시켰고; 이후 파지를 분리하여 다음 사이클에 사용했다.
제2 및 제3 선택 라운드 이후, 다중클론 파지 산물에 대해 수행된 ELISA는 유의적인 농축을 나타냈다. 인간 Fab가 농축된 수집된 클론은 중쇄 CH1 유전자의 C 말단에 His6 태그 및 myc 태그(tag)를 함유하는 발현 플라스미드 LL에 재클로닝했다.
실시예 5
인간 IL-17A와 Fab 특이적 결합 분석
연구된 Fab 단편들과 인간 IL-17A와의 결합을 측정하기 위해 ELISA를 이용했다. 공개된 AIN457 서열(Novatis)을 보유한 Fab는 양성 대조군으로 사용했다. ELISA 평판 웰(Nunc ImmunoMaxisorp)은 50㎕(1X 코팅 탄산염 완충액 중에 0.5㎍/ml) IL-17A-Fc로 코팅하고, 밀봉한 뒤, 4℃에서 밤새 항온처리했다. 이후의 모든 단계들은 GenetixQ-pix2xt(Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200(Tecan)과 같은 고성능 시스템을 가지고 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행했다. 비특이적 결합은 차단 완충액 BB(PBS 중의 0.5% 탈지유 200㎕)를 첨가하여 차단시켰다. 평판은 실온에서 1h 동안 진탕기에서 항온처리했다. PBS-Tween으로 세척한 후, 각 셀은 시험 Fab-함유 세포 상청액과 동량의 BB 혼합물 50㎕로 코팅했다. 평판은 진탕기에서 실온 하에 1시간 동안 항온처리하고; 다시 각 평판 웰을 PBS-Tween 완충액으로 5회 세척했다. 세척 후, 각 웰은 항-인간 Fab HRP-접합된 2차 항체(Pierce-ThermoScientific)가 첨가된 PBS-Tween(1:5000)로 코팅했다(50㎕/웰). 평판을 회전 진탕기로 옮기고(실온에서 50min), 그 다음 전술한 바와 같이 PBS-Tween 완충액으로 5회 세척했다. 포화될 때까지(평균 3 내지 5min) TMB(100㎕/웰)를 첨가하여 비색 시그널을 수득하고; 추가 발색은 정지 용액(100㎕/웰, 10% 황산)을 첨가하여 차단시켰다. 흡광도는 적당한 Tecan-Sunrise 평판 판독기(Tecan)를 사용하여 450nm에서 측정했다. 항체 결합은 생성된 시그널에 비례했다. 색 시그널이 기준 시그널에 비해 5배가 넘는 클론들은 경쟁적 ELISA로 시험하여, IL-17A 리간드와 수용체 사이의 상호작용을 차단하는 길항작용적 Fab를 밝혀냈다.
실시예 6
IL-17A 리간드와 IL-17R 수용체의 상호작용을 차단하는 경쟁적 ELISA
경쟁적 ELISA 기술을 이용하여 인간 IL-17A에 대해 특이적인 상기 선택된 Fab의 길항작용능을 시험했다. 공개된 AIN457 서열(Novartis)을 가진 Fab를 양성 길항물질 대조군으로 사용했다. ELISA 평판(Nunc Immuno Maxisorp) 웰은 50㎕/웰 IL-17RA-Fc 수용체(R&D Systems; 1X 코팅 탄산염 완충액 중에 1㎍/ml 용액)로 커버하고, 4℃에서 밤새 항온처리했다. 이후의 모든 단계들은 GenetixQ-pix2xt(Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200(Tecan)과 같은 고성능 시스템을 가지고 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행했다. 비특이적 결합은 차단 완충액 BB(PBS 중의 0.5% 탈지유 200㎕)를 첨가하여 차단시켰다. 평판은 실온에서 1h 동안 진탕기에서 항온처리했다.
이와 나란히, 비결합성 96웰 평판 중의 시험 Fab-함유 세포 상청액 50㎕를 IL-17A-His6-Flag(PBS-Tween으로 희석된 1% 밀크 중의 0.4㎍/ml) 50㎕와 혼합했다. 평판은 진탕기에서 500rpm 하에 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다.
IL-17RA-Fc 수용체를 함유하는 평판은 BB 용액으로 세척한 후, Fab와 IL-17A-His6-Flag의 반응 혼합물로 웰당 90㎕의 양으로 코팅했다. 평판은 실온에서 45분 동안 진탕 하에 항온처리하고, 각 웰은 PBS-Tween 완충액으로 5회 세척했다. 또한, 1㎍/ml 항-FLAG 뮤린 M2 항체(Sigma) 50㎕/웰을 첨가하고, 평판을 실온에서 45분 동안 항온처리했다. 항온처리 후, 각 평판 웰은 PBS-Tween으로 5회 세척한 뒤, PBS-Tween으로 1:5000으로 희석된 항뮤린-IgG HRP-접합된 2차 항체(Pierce-ThermoScientific) 50㎕/웰로 코팅했다. 평판은 실온에서 45분 동안 회전 진탕기에서 항온처리하고, 전술한 바와 같이 PBS-Tween으로 5회 세척했다. 포화될 때까지(평균 3 내지 5min) TMB(100㎕/웰)를 첨가하여 비색 시그널을 수득하고; 추가 발색은 정지 용액(100㎕/웰, 10% 황산)을 첨가하여 차단시켰다. 흡광도는 적당한 Tecan-Sunrise 평판 판독기(Tecan)를 사용하여 450nm에서 측정했다. 항체 결합은 생성된 시그널에 비례했다.
대조용 Fab 항체 AIN457에 대응하는 수준으로의 차단을 입증해 보이는 클론들은 양성으로 표시하고, 추가 시험에 사용했다. 양성 클론들의 가변 도메인들의 유전자는 Applied Biosystems 3130 유전자 분석기(Applied Biosystems)에서 표준 프로토콜에 따라 서열분석하고, 적당한 분석으로 처리했다. 3VHHFab 가변 도메인을 함유하는 클론은 추가 연구를 위해 선택했다(도 5b). 또한, 3VHHFab 클론은 다양한 서열의 23 경쇄 도메인들과 함께 나타나는 것으로 발견되었고, 이 중 3개는 도 5b에 제시했다. 이는 상대적 구조 내성을 시사하고, 특히 경쇄보다는 VHH 도메인이 IL-17A 결합에 기여한다는 사실을 시사한다.
실시예 7
항-IL-17A VHHFab 후보들의 비교 k off ( k diss )-선별
항-IL-17A Fab 후보들에 대한 비교 koff 선별은 Pall Forte Bio Octet Red 96 시스템을 사용하여 수행했다. 항-FABCH1 바이오센서들은 10mM PBS(pH 7.2 내지 7.4), 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 함유하는 작업 완충액에서 30분 동안 재수화시켰다. E.콜리 상청액의 시험 샘플에 10x 작업 완충액을 첨가하여 1x 최종 농도 이하로 만들었다. 그 다음, 항-FABCH1 바이오센서는 후보 항체들의 Fab 단편들을 함유하는 E.콜리 상청액에 담그고 4℃의 온도에서 12시간 동안 항온처리했다. Fab 단편들로 코팅된 센서들은 작업 완충액이 담긴 웰로 이동시키고, 기준값을 등록했다(60sec). 그 다음, 센서들을 항원-항체 결합을 달성하도록 피분석물 용액(IL-17A, 30㎍/ml)이 담긴 웰로 이동시켰다(300sec). 그 후 센서들은 다시 해리시키기 위해 작업 완충액이 담긴 웰로 복귀시켰다(300sec). 사용된 센서는 각 시험 후에 재생시켰다: 센서들은 재생 완충액(Gly-HCl, pH 1.7)에 3회 방치했고, 그 후 추가 실험용으로 적용가능했다. 수득된 곡선들은 Octet Data Analysis(버전 7.0)을 사용하여 1:1 상호작용 모델과 표준 절차에 따라 분석했다.
항-IL-17A Fab 후보들의 koff-선별에서 수득된 결과는 도 5c 및 표 1에 제시했다. 인간 IL-17A와 모든 고유의 VHHFab의 특이적인 고친화성 결합이 입증되었고, 여기서 3VHHFab는 이 장치의 검출 한계를 벗어나는 매우 빠른 kon 및 매우 느린 kdis(1/s)를 나타냈다.
인간 IL-17A에 대한 VHHFab 친화성
KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
1VHH 2.485E-08 2.498E04 6.206E-04
2VHH 1.352E-08 1.628E05 2.201E-03
3VHHVK4B11 - - <2.272E-06
따라서, 수득한 분석 결과를 기반으로 하여, 3VHHVK4B11 후보를 추가 연구를 위해 선택했다.
실시예 8
VHH 가변 도메인의 FR1 및 FR2에 돌연변이를 가진 VHHIgG1 항체의 생성
3VHHVK4B11 후보의 경쇄 및 중쇄 VHH의 가변 도메인의 유전자는 실시예 3에 기술된 바와 같이 CHO-EBNA 세포에서 합동 일시 발현(joint transient expression)을 위해 pEE-HcnpEE-Lc 플라스미드에 클로닝했다. 또한, 위치 44 및 45(카벳 넘버링 방식)에서의 치환은 프로토콜[Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit(NEB)] 및 문헌[34]에 기술된 절차에 따라 PfuUltraHS 폴리머라제(Stratagene)를 사용하여 올리고뉴클레오타이드-지향성 돌연변이유발을 통해 도입시켰다. 플라스미드 pEE-3VHH는 매트릭스로써 사용했다. PCT 산물은 저융점 아가로스 상에서 분획화하고 적당한 컬럼 상에서 정제했다. 결찰 후, DNA로 이.콜리를 형질전환시켰다. 정확한 서열을 가진 돌연변이 클론을 선택한 즉시, 3VHH에 돌연변이를 가진 플라스미드를 pEE-LcVK4B11와 함께 공동형질감염시켰다(도 6Aa 및 표 2 참조).
3VHHFabVK4B11 돌연변이 클론 샘플
명칭 초기 3VHHFabVK4B11 대비 돌연변이
mut1 E44G, R45L
mut2 S11L, E44G, R45L
mut3 R45L
mut4 S11L, E44G
실시예 9
VHH 가변 도메인의 FR1 및 FR2에 돌연변이를 함유하는 VHHFab 항체의 동역학적 파라미터의 비교 분석
항-IL-17A VHHFab 후보들의 비교 koff 선별은 Pall Forte Bio Octet Red 96 시스템을 사용하여 표준 프로토콜에 따라 수행했다(실시예 8 참조). 천연 3VHHFab에 비해 koff의 유의적인 감소는 mut1, mut2 및 mut4에서 발견되었고, 이보다 덜 유의적인 감소는 mut3에서 발견되었다.
실시예 10
VHH 가변 도메인의 FR1 및 FR2에 돌연변이를 함유하는 전체 크기의 3VHHIgG1VK4B11 항체의 열-응집 특성의 비교 분석
항-IL-17A VHHIgG1 후보들의 응집 특성들의 비교 분석은 다음과 같은 절차를 사용하여 수행했다. PBS 완충액에서 VHHIgG1 항체(10mg/ml) 제조물은 50℃에서 6시간 동안 가열했다. 열 스트레스에 의해 유도된 응집은 크기배제 HPLC로 평가했다. 이 시험은 1100 HPLC 시스템(Agilent) 상에서 Tosoh TSK-Gel G3000SWXL 컬럼, 7.8mm x 30cm, Cat.No.08541 및 Tosoh TSKgel Guard SWXL 예비컬럼, 6.0mm x 4.0cm(7㎛의 입자, Cat.No.08543)를 사용하여 수행했다. 50mM 인산나트륨 완충액 및 0.3M NaCl(pH 7.0)을 함유하는 이동상을 이용하는 등용매 용출은 0.5ml/min 유속으로 수행하고, 검출은 214nm 및 280nm 파장에서 수행했다. 항체 샘플은 PBS(pH 7.5)로 약 1mg/ml 농도로 희석했다. 주사 용량은 10㎕이었다. 겔 여과 표준 혼합물(Bio-Rad, Cat. No. 151-1901)은 시험 전에 컬럼을 조정하는데 사용했다.
도 6c에 제시된 크로마토그램 및 표 3에 정리된 결과는 모든 돌연변이체가 열 스트레스 하에 다양한 정도로 응집한다는 것을 입증해보이며, 천연 변형체에서는 최소 안정성이 관찰되었고, 고전적 VH 구조에 전형적인 E44G+R45L 치환을 함유하는 mut1에서는 최대 안정성이 확인되었다.
또한, 수득된 제조물들의 열안정성 비교 연구는 Thermofluor 절차(열 이동 분석이라고도 지칭됨)를 사용하여 수행하여, 미폴딩된 단백질의 소수성 표면에 결합하는 특이적 염료 SYPROOrange의 형광성 변화를 계측하는 단백질 융점을 측정한다[35]. StepOneReal-TimePCRSystem(Applied Biosystems) 장치 및 권장된 프로토콜을 사용하여 돌연변이 산물을 연구했다. 이 연구 결과는 표 3에 제시했다. 이 결과는 열 스트레스 시험에서 수득된 결과와 다소 상호관련성이 있으며, 이는 야생 3VHHIgG1VK4B11에 비해 mut1 및 mut4의 안정성을 확인시켜준다.
돌연변이체들의 열안정성 연구
산물 열스트레스 전의 단량체 퍼센트(%) 열스트레스 후 단량체 퍼센트(%) 차이 ~△% 융점(Thermofluor), ℃
야생 3VHHIgG1 VK4B11 60 13 47 46±1
mut1 95 95 0 64±1
mut2 65 13 52 42±1
mut3 40 32 8 ND
mut4 89 80 9 53±1
실시예 11
IL-6 생산을 유도하는 IL-17A의 능력을 차단하는 항- IL17A 3VHHIgG1VK4B11 돌연변이체의 세포 시험
인간 HT1080 세포(ATCC:CCL-121)에 의한 IL-6의 생산을 유도하는 IL-17의 능력은 인간 재조합체 IL-17A에 관한 VHHIgG1 후보들 mut1 및 mut4의 중화 활성을 분석하는데 사용했다. 세포는 10% 불활화된 태아 혈청, 젠타마이신 및 글루타민이 첨가된 DMEM 배양 배지에서 증식시켰다. 96웰 배양판에 5x104 세포/웰의 분취량을 접종했다. 세포는 5시간 동안 고착시켰다. 40ng/ml 재조합체 IL-17 및 20ng/ml TNF-α의 혼합물은 VHHIgG1 희석물과 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 그 다음, 세포에 사이토킨/항체 혼합물을 첨가하고 밤새 방치했다. HT1080 세포 배양물에 의한 IL-6의 생산은 IL-17 첨가량에 비례했다. 세포 상청액 샘플에 방출된 IL-6의 양은 DuoSet ELISA Development System Human IL6(RD System, Cat. No. DY206)을 사용하여 ELISA 기술로 평가했다. VHHIgG1 후보들의 길항작용적 성질의 평가로부터 수득된 결과는 AIN457(노바티스의 항-IL-17A 항체)과 비교하여 도 7에 제시했다. mut1의 IC50 값은 천연 변형체의 IC50 값보다 거의 30배 더 높았고, 반면 mut4 변형체는 자신의 저해능을 거의 완전하게 유지했다. mut4 후보의 IC50 값은 30±10pM이었다. 본 연구에서 수득된 결과 및 전반적인 이화학적 및 생물학적 특성을 기반으로 하여, 추가 개발 및 최적화를 위해 상기 후보를 선택했다.
실시예 12
인간 경쇄를 함유하는 mut4VHHFab 항체의 조작
55명의 인간 공여체로부터 수집한 B 림프구의 총 RNA는 적당한 프로토콜(QIAGEN)에 따라 RNeasy Mini Kit를 사용하여 분리했다. RNA 농도는 Nanovue 키트(GE Healthcare)를 사용하여 측정하고, 분리된 RNA의 품질은 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 시험했다.
역전사 반응은 MMuLV 역전사효소 및 랜덤 헥사머 프라이머를 가지고 권장된 프로토콜에 따라 MMLV RT 키트(Evrogen)를 사용하여 수행했다.
역전사 산물은 2단계 폴리머라제 사슬 반응에서 매트릭스로써 사용하여 제한 부위가 인접한 변형체 도메인의 유전자를 수득했고; 반응은 문헌[27]에 기술된 올리고뉴클레오타이드 키트 및 프로토콜을 사용하여 수행했다. IL-17A에 대해 특이적인 키메라성 Fab는 상기 명시된 바와 같은 파지미드 pH 5를 기반으로 하여 WO 93/06213에 기술된 절차에 따라 생산했다. 인간 경쇄의 가변 도메인을 암호화하는 유전자 및 mut4VHH의 가변 도메인을 암호화하는 유전자는 도 8에 제시된 바와 같은 제한분해, 결찰 및 증폭의 연속 반응을 통해 하나의 단편으로 조합시켰다. 이 경우, 모든 반응에서 추산되는 매트릭스 분자의 수는 1012 이상이었다. 수득된 DNA 산물(VL-CK-VH)은 NheI/Eco91I 제한효소로 처리하고, 오리지널 파지미드 pH 5에 결찰시켰다. 결찰 산물을 이용하여 문헌[30]에 기술된 프로토콜에 따라 제조한 SS320 일렉트로컴피턴트 세포를 형질전환시켰다. 혼합 카파 및 람다 인간 사슬을 기반으로 하는 키메라 mut4 VHH Fab-라이브러리의 목록은 2.8x109 형질전환체였다. 키메라 파지-디스플레이된 Fab 라이브러리는 문헌[27]에 기술된 절차에 따라 제조했다.
파지-디스플레이된 키메라 Fab-라이브러리의 선택은 전술한 조건 하에 수행했고(실시예 5 참조), 단 추가로 IL17A-결합된 파지 항체를 20㎍/ml 용해된 IL-17A의 존재 하에 37℃의 온도에서 12시간 동안 항온처리했다.
IL-17A에 대한 2차 선택 라운드 후에, 라이브러리의 유의적인 증량을 관찰했다. 수득되는 증량된 키메라 mut4 VHH Fab 라이브러리의 수집된 클론을 표준 프로토콜(실시예 6 참조)에 따른 IL-17A의 선별에 사용했다. 최종 양성 클론은 서열분석으로 처리했다. 도 8b는 고친화성 mut4 VHHFab 유래의 인간 경쇄 가변 도메인의 4개의 서열, VK1A7, VK3cl8, VK3cl18 및 VK4clE12를 보여준다. 이 서열들은 최소의 체세포 돌연변이 수를 함유하는 다른 카파 인간 생식세포주 VK1, VK3 및 VK4에 속한다. 인간 서열 VK4clE12가 앞서 선택된 라마 경쇄 VK4B1과 높은 상동성은 있지만, 특징적인 차이가 있음은 유념해야 할 점이다.
실시예 13
다양한 경쇄 변형체를 함유하는 전체 크기의 mut4VHHIgG1 항체의 열-응집 특성의 비교 분석
mut4 VHH 후보인 중쇄 VHH의 가변 도메인 유전자는 pEE-Hc 플라스미드에 클로닝하고, 인간 경쇄 가변 도메인 유전자, VK1A7, VK3cl8, VK3cl18, VK3A4 및 VK4E12는 실시예 3에 기술된 바와 같이, CHO-EBNA 세포에서 합동 일시 발현을 위한 pEE-Lc 플라스미드에 클로닝했다. 또한, 수득된 항체는 열 스트레스에 노출시켰고, 이의 응집 프로필은 실시예 9에 제시된 바와 같이 조사했다. 수득된 결과는 표(표 4)에 정리했다.
mut4 VHHIgG1 전체 크기 항체의 열 안정성
샘플 명칭 경쇄의 구조 패밀리 열 스트레스 전의 단량체 % 열 스트레스 후의 단량체 % 차이
~△%		 정제 동안 가시적 응집체 형성 융점
(Thermofluor)
mut4VHHIgG1V K3c8 VK3 96 82 14 + 58C
mut4VHHIgG1V K3c18 VK3 91 81 10 ++ 61C
mut4VHHIgG1V K3A4 VK3 71 69 2 + 61C
mut4VHHIgG1V K1A7 VK1 95 88 7 - 63C
mut4VHHIgG1V K4E12 VK4 90 49 41 ++ 59C
또한, 수득된 산물의 비교 열안정성 연구는 실시예 11에 기술된 것과 유사한 Thermofluor 절차를 사용하여 수행했다. 수득된 데이터를 기반으로 하여, 인간 경쇄를 함유하는 선택된 mut4VHH 쌍은 VVK4B11 라마 경쇄를 함유하는 천연 변형체보다 더욱 안정적이었다는 결론을 내릴 수 있었다. 즉, 비교 연구에서 최상의 응집 안정성 파라미터들은 mut4 VHHIgG1VK1A7 및 mut4 VHHIgG1VK3c18 조합에서 증명되었다.
실시예 14
mut4 VHHIgG1VK3c8 및 mut4 VHHIgG1VK1A7을 이용하여 IL-6 생산을 유도하는 IL-17A 능력의 차단에 대한 세포 시험
인간 HT1080 세포(ATCC:CCL-121)에 의한 IL-6 생산을 유도하는 IL-17의 능력은 인간 재조합체 IL-17에 관한 VHHIgG1 후보들인 mut4 VHHIgG1VK3c8 및 mut4 VHHIgG1VK1A7의 증화 능력을 분석하는데 사용했다(실시예 12 참조). 도 9는 차단 시험에서 수득된 결과를 보여준다. 특히, mut4 VHHIgG1VK1A7 변형체(최대 안정성을 특징으로 함)가 IC50 값의 유의적인 강하를 입증해 보이는 반면, mut4 VHHIgG1VK3c8 변형체(중간 안정성)는 더욱 안정적인 mut4 VHHIgG1VK1A7 변형체에서 관찰된 것보다 수 배 이상의 저해를 입증해 보였다.
실시예 15
VHH 가변 도메인의 FR2에 존재하는 위치 44 및 45에서의 다양한 돌연변이를 함유하는 mut4 VHHIgG1 전체 크기 항체의 조작 및 이의 응집 및 기능적 특징들의 비교 분석
응집 안정성을 더욱 향상시키기 위한 목적으로, 올리고뉴클레오타이드 지향성 돌연변이유발 방법을 사용하여 mut4VHHIgG1VK3c8 후보(이하 m4VHHc8이라 지칭함)의 VHH 중 FR2 영역에 존재하는 위치 44 및 45에 치환을 도입시켰다. 이 연구는 위치 44에 방향족, 지방족 또는 양성 아미노산을 가진 변형체는 포함시키지 않았고, 그 이유는 이 변형체들이 잠재적으로 면역원성이고 구조적으로 허용되지 않기 때문이다. 돌연변이체는 실시예 3에 기술된 바와 같이 일시 발현되었다(도 8). 또한, 여러 돌연변이체들에서 산물의 양은 실험마다 달라졌고, 즉 동일 실험 내의 수율이 모든 치환마다 비교가능한 크기인 점을 유념해야 한다. 수득된 돌연변이 변형체는 열 스트레스에 노출시켰다. 표 5는 여러 돌연변이체들에서 수득된 결과들을 입증해 보인다. m4VHHc8 내에서 초기 44G45R 조합보다 안정성이 낮은 44G45G 및 44G45D가 덜 안정한 돌연변이체인 것을 알 수 있다. 44G45N, 44V45T, 44D45T, 44T45T 및 44D45V와 같은 변형체들은 안정성을 유의적으로 유지했다. 모든 다른 조합들은 m4VHHc8의 응집 안정성을 증가시키는 추가 효과를 입증해 보였고, 가장 안정한 조합은 위치 45에 방향족 또는 지방족 기를 함유하는 변형체였다. 하지만, 두 위치에 작은 친수성 아미노산 및 소수성 아미노산을 함유하는 변형체, 예컨대 44G45V, 44G45T, 44V45V, 44A45V, 44T45V, 44A45T 및 44S45T도 유의적인 안정성을 입증해 보였다.
m4VHHc8의 FR2 영역의 위치 44 및 45에 치환을 함유하는 돌연변이체들의 일시적 발현 및 열스트레스 연구에서 수득된 결과
No. m4VHHc8의 FR2 영역 중 위치 44+45에서의 돌연변이체 단량체 %,
초기* 		단량체 %,
가열된* 		~△% 산물의 생산 수율**
(실험 수)∼, mg/L		 IC50,
세포 IL6 시험에 의해 정의된 피코몰***
1 44G 45R 96 81 15 41(1) 50
2 44G 45F 98 98 0 22(3) 1100
3 44G 45W 97 97 0 57(2) 1200
4 44G 45Y 97 97 0 33(2) 650
5 44G 45P 98 98 0 41(1) 800
6 44G 45I 97 97 0 20(3) 950
7 44G 45L 97 97 0 25(3) 1000
8 44G 45G 96 50 46 21(3) ND
9 44G 45N 90 77 13 26(2) ND
10 44G 45S 93 85 8 45(2) 100
11 44G 45D 90 40 50 23(3) ND
12 44G 45A 93 89 4 27(3) 100
13 44G 45H 93 93 2 25(3) 150
14 44G 45V 93 93 0 35(1) 250
15 44G 45Q 91 84 7 36(1) ND
16 44G 45T 93 93 0 46(1) 100
17 44V 45T 95 84 11 64(4) ND
18 44D 45T 95 83 12 72(4) ND
19 44T 45T 96 86 10 75(4) 150
20 44A 45T 95 93 2 74(4) 150
21 44S 45T 96 94 2 63(4) 150
22 44V 45V 95 95 0 71(4) 150
23 44D 45V 96 88 12 28(4) 150
24 44A 45V 95 95 0 72(4) 100
25 44T 45V 96 95 1 73(4) 150
26 AIN457 95 95 0 0 1100
* 다른 배취들간의 오차는 최대 5%이다.
** 실험에 따라 유의적으로 변동됨; 더욱 정확한 비교는 동일 배취 내의 산물에서 제공됨.
*** 다른 배취들간의 오차는 최대 50%이다.
실시예 12에 기술된 바와 같이 세포 시험에서 중화 활성을 평가하기 위해, 다양한 돌연변이체를 가지고 실험을 수행했다(도 11). 시험 결과는 표 5에 제시했다. VHH FR2 위치 44 및 45에서 작은 아미노산은 높은 길항작용적 활성을 나타내는 반면, 위치 45에 도입된 큰 아미노산(지방족 및 방향족)은 IC50을 10배 감소시키는 것으로 관찰되었다. 도 12는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인의 상호작용을 측정하는 다양한 아미노산 치환을 함유하는 돌연변이체들의 안정성 및 기능적 성질의 다이아그램을 나타낸다.
실시예 16
CDR 항IL17A 3VHH 도메인의 스캐닝 돌연변이유발
후보 CDR의 개별 위치들에 대한 돌연변이는 NNK 무작위 기술[26]을 이용해 Q5® 부위 지향성 돌연변이유발 키트(NEB)를 프로토콜에 따라 사용하여 삽입했다. 플라스미드 pLL-Fab는 매트릭스로써 사용했다. PCR 산물은 저융점 아가로스 상에서 분획화하고 적당한 컬럼에서 정제했다. 결찰 후, DNA를 이용하여 E.콜리 발현 균주 BL21gold(Stratagene)를 형질전환시켰다. 수득된 개별 클론들은 그 다음 전술한 바와 같이 96웰 평판에서 Fab 발현에 의해 수득했다. 돌연변이 Fab 암(arm)을 함유하는 상청액은 전술한 조건 하에 고성능 Genetix Q-pix2xt 및 Tecan Freedom EVO200 시스템을 사용하여 ELISA로 분석했다. 고정된 IL-17A의 농도는 0.2㎍/ml였다. 결합된 Fab 암은 1:5000 희석된 염소 항-인간 IgG(Fab')2(HRP) 접합체(Pierce) 및 TMB+H2O2/H2SO4 염료로 염색하고; 흡수율은 450nm 파장에서 측정했다.
스캐닝 돌연변이유발에 의해 수득된 결과는 표 6에 제시했다. 이 표는 야생형 서열과 비교했을 때 돌연변이 Fab/인간 IL-17A 결합 시그널의 ≤30% 감소에 대응하는 CDR내 치환을 보여준다. 즉, 이러한 개별 돌연변이체 또는 이의 임의의 조합은 본 발명의 범위이다.
스캐닝 돌연변이유발
돌연변이 위치 돌연변이체 내의 양성 아미노산
HCDR3
V94 S,T,A,K,D,G
R95 K
R96 Y,H,W,K,D,G
R97 A,L,M,S,H,V
F98 -
D99 E,G,A,R,V,K,Q
G100 N,S
T100a G,P,V,R,S,N,K
S100b V,M,T,L,T,A,H,G,I,C
Y100c W,S
Y100d R,L,W,K,A,G,Q,I,V
T100e A,L,S
G100f A,L,T,P,N,Q,F,I,D
D107 -
HCDR2
A50 G,L
S52 -
P52a A
S53 -
G54 -
G55 S,R,P,D,I,T,E,K,A,L
D56 -
R57 -
I58 -
HCDR1
S32 N,K,R,E,W,M,Q,D,F,V,L,A
P33 S
M34 I
G35 L,A,I,S,R,V,N,Q,M
즉, 선별은 아미노산 치환에 내성적인 BCD109 항체 CDR 아미노산 위치들에서 수행했다. 당해 아미노산 치환 패널들은 인간 IL-17A에 대한 항체 친화성을 유의적으로 변화시키지 않는 것으로 입증되었다. 이러한 치환 패널은 후보의 다양한 성질을 향상시키는데 사용될 수 있다.
실시예 17
BCD109 후보의 조작 및 다양한 기원의 IL-17A에 대한 친화성 평가
BCD109 항체는 안정성 또는 IC50 (데이터 미제시)를 변화시키지 않는 인간화 돌연변이 Q5V 및 R89V를 VHH에 도입시키고, 항체 약동학을 향상시키도록 의도된 CH2 도메인 FcIgG1 내 3개의 추가 돌연변이, 232Y/234T/236E를 도입시켜 44G45T 치환(실시예 16에 기술)을 함유하는 m4VHHc8 변형체로부터 수득했다. 이 항체는 일시적으로 발현되었다.
인간, 원숭이 및 래트 IL-17A에 대한 BCD109 결합의 친화성은 OctetRed 96 시스템(ForteBio)에서 조사했다. BCD109는 제조사의 매뉴얼에 기술된 표준 프로토콜에 따라 아민 반응성 제2 세대 센서(AR2G)의 표면에 비특이적으로 고정시켰다. 이 시험은 작업 완충액으로써 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA를 보유한 PBS를 사용하여 30℃의 온도에서 수행했다.
인간, 원숭이 및 래트 IL-17A는 증가율이 2인 126nM의 농도에서 2nM 농도의 작업 완충액으로 적정했다.
결합 곡선(참조 시그널을 뺀 후)은 Octet Data Analysis 소프트웨어(버전 7.0)를 표준 절차에 따라 사용하고 1:1 상호작용 모델을 사용하여 분석했다. 결과는 도 13a에 제시했다.
BCD109는 인간 및 원숭이 IL-17A에 피코몰의 친화성으로 결합하는 것을 관찰할 수 있다(도 13b). 또한, 후보는 래트 IL-17A와 상호작용하지 않는다(곡선은 미제시).
실시예 18
열 스트레스 하에 BCD109의 응집 안정성 측정
PBS에서 10mg/ml의 BCD109 제조물은 실시예 9에 기술된 프로토콜에 따라 50℃의 온도에서 6시간 동안 가열했다.
도 14에 나타낸 결과는 BCD109 항체가 열 스트레스 하에 안정하게 남아 있고, 즉 응집체 함량이 5% 미만인 것을 보여준다.
실시예 19
본 발명의 항체를 함유하는 약학 조성물의 수득
50mg/ml 농도의 BCD 109 항체는 주사를 위해 적당량의 물에 용해하고 pH를 구연산으로 5.5로 조정했다. 용액은 여과(여과 살균)하고 앰플에 밀봉했다.
수득된 산물은 침전 없이 6개월 동안 안정했다.
대안적으로, BCD109는 동결보호제로써 만니톨을 함유하는 물에 용해하고, 여과(여과 살균)한 뒤, 동결건조했다. 수득한 분말은 멸균 바이엘에 분배했다. 바이엘은 고무 스토퍼(stopper)로 막고, 알루미늄 캡으로 밀봉했다. 항체 산물은 동결건조물로부터 주사용수를 이용하여 복원할 수 있다.
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 10 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (50)

  1. 가변 도메인이 경쇄의 가변 도메인 VL과 VHH-유도체의 조합으로 표현되는 것으로, 하기를 포함하는 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 인간화된 단일클론 IgG 항체 또는 이의 단편:
    a) 3개의 초가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 함유하는 중쇄 가변 도메인(VHH)의 유도체로, 여기서:
    상기 HCDR1은 아미노산 서열: G-T-F-A-T-S-P-M-G (서열번호 4)를 함유하고,
    상기 HCDR2는 아미노산 서열: A-I-S-P-S-G-G-D-R-I-Y-A-D-S-V-K-G (서열번호 5)를 함유하고,
    상기 HCDR3는 아미노산 서열: C-A-V-R-R-R-F-D-G-T-S-Y-Y-T-G-D-Y-D-S (서열번호 6)를 함유하며,
    b) 아미노산 서열: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSYSPVTFGQGTKVEIKR (서열번호 8)을 함유하는 인간 항체의 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 인간화된 항체의 경쇄 가변 도메인.
  2. 제 1 항에 있어서, 경쇄의 가변 도메인 VL이 인간 항체 유도체인, 항체 또는 이의 단편.
  3. 제 1 항에 있어서, 경쇄의 가변 도메인 VL이 인간화된 항체 단편인, 항체 또는 이의 단편.
  4. 제 1 항에 있어서, 항체가 다음과 같은 이소타입(isotype), 즉 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 어느 하나인 항체 또는 이의 단편.
  5. 제 1 항에 있어서, IgG의 일부로써 비-천연의 변형 Fc를 함유하는 항체 또는 이의 단편.
  6. 제 1 항에 있어서, 10mg/ml 이상의 농도로 사용하고 4℃의 온도에서 6개월 넘게 저장했을 때, 응집체의 함량이 초기 용액 중의 함량에 비해 5% 이하로 증가하는 응집 안정성을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  7. 제 1 항에 있어서, 10mg/ml 이상의 농도로 사용하고 37℃의 온도에서 2주 넘게 저장했을 때, 응집체의 함량이 초기 용액 중의 함량에 비해 5% 이하로 증가하는 응집 안정성을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  8. 제 1 항에 있어서, 10mg/ml 이상의 농도로 사용하고 42℃의 온도에서 48시간 넘게 저장했을 때, 응집체의 함량이 초기 용액 중의 함량에 비해 5% 이하로 증가하는 응집 안정성을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  9. 제 1 항에 있어서, 10mg/ml 이상의 농도로 사용하고 50℃의 온도에서 6시간 넘게 저장했을 때 응집체의 함량이 초기 용액 중의 함량에 비해 5% 이하로 증가하는 응집 안정성을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  10. 제 1 항에 있어서, 해리 상수 KD가 10-9 M 이하인 항체 또는 이의 단편.
  11. 제 1 항에 있어서, 항체-항원 상호작용 동역학적 결합 상수 kon(1/Ms)이 적어도 105 l/Msec 이상인 항체 또는 이의 단편.
  12. 제 1 항에 있어서, 항체-항원 상호작용 동역학적 해리 상수 dis(1/s)가 10-4 l/sec 이하인 항체 또는 이의 단편.
  13. 제 1 항에 있어서, 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고,
    a) 다음과 같은 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 가변 도메인(VHH)의 유도체: QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFATSPMGWLRQAPGKGTEFVAAISPSGGDRIYADSVKGRFTISRDNAGYFIYLQMNSLKPEDTAVYYCAVRRRFDGTSYYTGDYDSWGQGTLVTVSS(서열번호 7);
    b) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSYSPVTFGQGTKVEIKR의 아미노산 서열 (서열번호 8)을 함유하는 인간 항체의 경쇄 가변 도메인(VL)을 함유하는, 항체 또는 이의 단편.
  14. 제 1 항에 있어서, 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하고,
    a) 하기 아미노산 서열을 함유하는 중쇄:
    QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFATSPMGWLRQAPGKGTEFVAAISPSGGDRIYADSVKGRFTISRDNAGYFIYLQMNSLKPEDTAVYYCAVRRRFDGTSYYTGDYDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 9);
    b) 하기 아미노산 서열을 함유하는 인간 항체 경쇄의 가변 도메인(VL):
    EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSYSPVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 10)
    을 함유하는 항체 또는 이의 단편.
  15. 제 1 항에 있어서, 항체가 인간 IL-17A의 활성을 50% 이상으로 저해하는, 항체 또는 이의 단편.
  16. 제 1 항에 기재된 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 작제물.
  17. 제 16 항에 기재된 하나 또는 여러 DNA 작제물을 함유하는 발현 벡터.
  18. 제 17 항에 기재된 발현 벡터 또는 제 16 항에 기재된 DNA 작제물을 함유하는 세포주.
  19. 제 17 항에 기재된 발현 벡터 또는 제 16 항에 기재된 DNA 작제물을 함유하는 세포주를 배양 배지에서 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 단편을 수득하기에 충분한 조건 하에 항온배양하는 단계, 그 다음 수득되는 항체 또는 이의 단편을 분리 및 정제하는 단계를 수반하여, 상기 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법.
  20. 제 17 항에 기재된 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  21. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법으로써, 제 20 항에 기재된 숙주 세포를 배양 배지에서 상기 항체 또는 이의 단편을 수득하기에 충분한 조건 하에 항온배양하는 단계, 그 다음 수득되는 항체 또는 이의 단편을 분리 및 정제하는 단계를 수반하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 이의 단편을 하나 또는 여러 약학적으로 적합한 부형제, 희석제 또는 운반체와 함께 함유하는, IL-17A 매개의 질환 또는 질병 치료용 약학 조성물로서, 상기 IL-17A 매개의 질환 또는 질병이 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응 관절염, 척추관절병증, 혈청음성 관절병증, 건선 관절병증, 궤양대장염 관련 관절병증, 클라미디아 관련 관절병증, 소아 류마티스 관절염, 소아 척수 근위축증, 강직성 척추염, 폐 질환과 관련된 강직성 척추염, 전신홍반루푸스, 크론병, 궤양대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존적 진성당뇨병, 갑상선염, 천식, 알러지 장애, 건선, 피부염, 전신 경화증, 이식편대숙주 질환, 이식 거부, 모든 장기 또는 조직에 대한 이종 이식 거부, 동종이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 아테롬성 동맥경화증, 파종혈관내응고, 가와사키 질환, 그레이브스 질환, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 질환, 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 신장 병발이 있는 현미경적 다발성혈관염, 포도막염, 패혈 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈 증후군, 악액질, 감염, 침습, 후천성 면역결핍증후군, 급성 횡단 척수염, 발작, 원발담즙성간경변, 용혈빈혈, 심부전, 심근경색, 애디슨병, 다분비자가면역증후군 I형 및 II형, 슈미츠 증후군, 급성호흡곤란증후군, 탈모, 원형탈모, 관절병증, 라이터 증후군, 장병성 활막염, 예르시니아 및 살모넬라, 죽종증 질환/만성 경화증, 자가면역 수포 질환, 천포창, 낙엽천포창, 유사천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈빈혈, 쿰즈 양성 용혈빈혈, 후천성 악성빈혈, 소아 악성빈혈, 근통성 뇌척수염/만성피로증후군, 만성 활동 간염증, 뇌 거대 동맥염, 원발 경화성간염, 잠재 자가면역간염, 후천성 면역결핍증후군(AIDS), AIDS 관련 질환, 공통 가변성 면역결핍증(공통가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근병증, 여성 불임, 난소 기능 부전, 조기 난소 부전, 폐 섬유증, 잠재성 섬유화 폐포염, 포스트 염증성 간질성 폐 병변, 간질성 폐렴, 간질성 폐질환과 연관된 결합 조직 질환, 간질성 폐 질환과 연관된 혼합 결합 조직 질환, 간질성 폐질환과 연관된 전신 경피증, 간질성 폐 질환과 연관된 류마티스성 관절염, 폐 질환과 연관된 전신 홍반성 루푸스, 폐질환과 연관된 피부근염/다발근염, 폐질환과 연관된 쇼그렌 질환, 미만성 폐 혈관염, 폐질환과 연관된 혈철소증, 약물에 의한 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 유발 섬유증, 폐쇄 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤이 있는 폐 질환, 후 감염성 간질성 폐 병리, 통풍성 관절염, 자가 면역 간염, 자가면역성 저혈당, 각피증식증(acanthokeratodermia)이 있는 B형 인슐린 내성, 부갑상선 기능 저하증, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구 감소증, NOS-신장 질환, 사구체신염, 현미경적 신장 다발혈관염, 라임 병, 원반 모양 홍반 루푸스, 특발성 NOS-남성 불임, 항정자 면역성, 다발성 경화증 (모든 유형), 교감 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿파스처 증후군, 결절성 다발동맥염의 폐 증상, 급성 류마티스 열, 류마티스 척추염, 스틸씨병, 전신 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야스 질환/관절염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선기능항진증, 자가면역 갑상선기능저하증(하시모토 병), 하시모토갑상선염, 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 1차 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, B형 간염, C형 간염, 알코올성 간염, 만성 활동성 간염, 알코올성 간경변, 알코올에 의한 간 손상, 담즙울체, 특이한 간 질환, 약물에 의한 간염, 비알코올성 지방 간염, 그룹 B 연쇄구균 감염(GBS), 정신 장애, Th1- 및 Th2-매개 질환, 급성 및 만성 통증(다양한 형태), 악성종양, 조혈 악성 종양, 무베타지단백혈증(abetalipoproteinaemia), 말단 청색증, 급성 및 만성 감염 및 만연, 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 선암, 심방 전위(atrial ectopics), AIDS 치매 복합체, 알파-I 항트립신 결핍증, 측면 근위축성 경화증, 빈혈, 협심증, 전각세포 변성, 항-CD3 치료, 항인지질 증후군, 수용체에 대항한 과민 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 관상 동맥 경화증, 동정맥루, 운동 실조, 심방 세동(불변성 또는 발작성), 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 다발갈래차단, 버킷 림프종, 화상, 심장 부정맥, 심근 기절 증후군, 심장 종양, 심근병증, 우회에 대한 염증 반응, 뇌 피질의 변성, 소뇌 장애, 혼란 또는 다초점 심방 빈맥, 화학 요법에 의한 장애, 만성 골수구성 백혈병(CML), 만성 알코올 중독, 만성 염증성 병변, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄성 폐 질환, 만성 살리실산염 중독, 울혈성 심부전, 결막염, 폐 심장, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥 질병, 배양-음성 패혈증, 낭포성 섬유증, 사이토킨 요법에 의한 장애, 권투 선수의 뇌 질환, 탈수초성 질환, 뎅기 출혈열, 피부학적 증상, 습진, 아토피 습진, 당뇨, 제2형 당뇨병, 진성당뇨병, 당뇨병-관련된 동맥경화성 혈관 질환, 울혈 확장형 심근증, 기저핵 질환, 중년의 다운 증후군, CNS 도파민 차단제에 의해 유도된 운동 장애, 약물 감수성, 뇌척수염, 심장 내막염, 내분비병증, 후두개염, 엡스타인 바 바이러스 감염, 피부홍통증, 추체 외로 및 소뇌 증상, 가족성 적혈구 포식성 림프조직구 증식증, 말초 동맥 질환, 진균 패혈증, 가스 봉소염, 위궤양, 사구체 신염, 그램 음성 패혈증, 그램 양성 패혈증, 세포내 유기체에 의한 육아종, 털 세포 백혈병, 할러포르텐-스파츠 병, 건초열, 혈색소 침착증, 혈액 투석, 용혈성 요독증후군 / 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 출혈, 간염 (A), 다발갈래 부정맥, HIV 감염/HIV-신경병증, 호지킨 병, 운동 과다 운동 장애, 과민 반응, 과민 관련 폐렴, 고혈압, 과소운동성 운동 장애, 시상 하부-뇌하수체-부신 축 검사, 특발성 애디슨 병, 특발성 폐 섬유증, 항체 - 매개 세포 독성, 무력증, 유아 근위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 바이러스 A, 이온화 방사선에 노출, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 허혈/재관류에 의한 질환, 허혈성 뇌졸중, 레지오넬라증, 리슈만 편모충증, 나병, 피질척수 손상, 지방성수종, 간 이식 거부, 림프 수종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 뇌막염, 수막구균혈증, 대사/특발성 질환, 편두통, 다발적 미토콘드리아 장애, 혼합 결합-조직 질환, 단일 클론 감마글로불린병증, 다발성 변성(멘셀 데제린 토마스 시-드래거 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 미코박테리움 아비움, 결핵균, 골수이형성 증후군, 심근 경색, 심근 허혈성 질환, 신생아 만성 폐 질환, 신장염, 신장증, 호중구감소성 발열, 비호지킨 림프종, 복부 대동맥 갈래 폐쇄, 동맥 폐쇄성 질환, 고환염/부고환염, 고환염/정관 수술 반전 작업, 장기비대증, 골다공증, 부신생물 질병/종양 관련 고칼슘혈증, 골반 염증성 질환, 연중 비염, 심낭 질환, 말초 아테롬성 동맥 경화증 (atherlosclerotic) 질환, 말초 혈관 질환, 복막염, 악성 빈혈, 주폐포자충 폐렴, POEMS 증후군(다발성 신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 단일클론 혈장-증식성 질환 및 피부 변화), 관류후 증후군, 펌프 헤드 증후군, 심장절개술후 경색후 증후군, 자간전증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압, 레이노 현상, 레이노 병, 레프섬(Refsum) 병, 정기적으로 좁은 QRS 빈맥, 신장 혈관 고혈압, 재관류 손상, 제한 심근병증, 육종, 피부 경화증 질환, 노인성 무도병, 루이 소체 치매, 혈청 음성 관절염, 쇼크, 겸상 적혈구 질환, 피부 변화, 고형 종양, 특정 부정맥, 척추 운동 장애, 척수 소뇌성 저하, 연쇄상 구균 근염, 소뇌의 구조적 손상, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심장혈관 매독, 전신 아나필락시스, 포괄적 전신성 염증 반응 증후군, 전신 발병 소아 류마티스 관절염, T 세포 또는 FAB ALL, 모세 혈관 확장, 혈전 경화증, 혈소판 감소증, 독성, 외상 / 출혈, 과민 반응 유형 III, 과민 반응 유형 IV, 불안정형 협심증, 요독증, 요로 패혈증, 두드러기, 심장 판막 질환, 정맥류, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 곰팡이 감염, 중요한 뇌염 / 무균성 뇌막염, 중요한 적혈구포식성 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군, 윌슨 병, 급성 관상 동맥 증후군, 급성 특발성 다발신경염, 급성 염증 탈수초성 신경근 신경병증, 급성 허혈, 성인 발병 스틸씨 병, 원형 탈모증, 아나필락시스, 항인지질 항체 증후군, 재생 불량성 빈혈, 관상 동맥 경화증, 연쇄상 구균 감염과 관련된 자가면역 장애, 자가 면역 장질환, 자가 면역 청력 손실, 자가 면역 림프 증식성 증후군(ALPS), 자가 면역 심근염, 자가 면역 조기 난소 부전, 안검염, 기관지 확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 치명적인 항인지질 증후군, 복강 질병, 경추증, 만성 허혈, 반흔성 유천포창, 다발성 경화증의 위험이 있는 임상적으로 고립된 증후군 (시스), 결막염, 아동기 발병 정신 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 누낭염, 피부 근육염, 당뇨병성 망막증, 진성당뇨병, 허리 디스크, 추간판 탈출증, 약물 유발 면역 용혈성 빈혈, 심장 내막염, 자궁내막증, 안내염, 상공막염, 다형 홍반, 중증 다형 홍반, 임신 유천포창, 길랑-바레 증후군(GBS), 건초열, 휴즈 증후군, 특발성 간질성 폐렴, IgE 매개 알러지, 자가 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염, 감염성 안구 염증 질환, 염증성 탈수초성 질환, 염증성 심장 질환, 염증성 신장 질환, 특발성 폐 섬유증/보통 간질성 폐렴, 홍채염, 각막염, 건성 각결막염, 쿠스마울 질환 또는 쿠스마울-마이어 질병, 랜드리 마비, 랑게르한스 세포 조직구증, 대리석 피부, 황반 변성, 현미경적 다발 혈관염, 베크테레프(Bechterew) 질환, 운동 뉴런 질환, 점막 천포창, 다 장기 부전, 중증 근무력증, 척수 이형성증 증후군, 심근염, 신경근 장애, 신경병증, 비-A 비-B형 간염, 시신경염, 골 용해, 난소 암, 소수관절형 JIA, 말초 동맥 폐쇄 질환, 말초 혈관 질환, 말초 동맥 질환 (PAD), 정맥염, 결절성 다발 동맥염, 다발 연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 백모증, 다관절형 소아 특발성 관절염, 여러 내분비 결함, 다발성 근염, 류마티스성 다발성 근육통(PMR), 펌프후 증후군, 전립선염, 순수 적혈구 무형성증, 주 부신 기능 부전, 재발성 시신경 척수염, 재협착, 류마티스 심장 질환, SAPHO(활막염, 여드름, 농포, 뼈과다증 및 골염), 경피증, 속발성 아밀로이드증, 쇼크 폐, 공막염, 좌골신경통, 속발성 부신부전, 실리콘-관련 결합 조직 질환, 스네든-윌킨슨 질환, 스티븐스-존슨 증후군, 전신성 염증 반응 증후군, 두개 동맥염, 톡소플라즈마성 비염, 독성 표피 괴사, 횡단성 척수염, TRAPS (종양 괴사 인자 수용체 관련 주기적 증후군), 두드러기, 일반적인 간질성 폐렴, 혈관염, 봄철 결막염, 바이러스성 망막염, 보그-고야나기-하라다 증후군 (VKH 증후군), 습식 황반변성, 상처 치유 및 예르시니아- 또는 살모넬라-관련 관절병증 중에서 선택되는 약학 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 알러지 장애는 아토피 알러지, 알러지성 결막염, 알러지성 접촉 피부염, 알러지성 비염, 알러지 반응 유형 I로부터 선택되고;
    악성종양은 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 직장결장암, 카포시 육종, 비인두암, 악성 흑색종, 췌장암, 다발성 골수종으로부터 선택되고;
    조혈 악성종양은 백혈병 및 림프종으로부터 선택되며;
    건선은 I형 건선, II형 건선으로부터 선택되고;
    피부염은 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 자가면역 피부염으로부터 선택되고;
    자가면역 간염은 자가면역 간염 유형 I(고전적 자가면역 또는 루푸스 간염), 자가면역 간염 유형 II(항-LKM 항체와 연관됨)로부터 선택되고;
    신경퇴행성 장애는 파킨슨병, 원발성 파킨슨증, 특발성 파킨소병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병, 프리드라이히 운동실조, 미만성 루이소체병, 신경성 근위축 I으로부터 선택되고;
    정신 장애는 우울증 및 정신 분열증으로부터 선택되고;
    이식 거부는 골 이식 거부, 골수 이식(BMT) 거부, 피부 동종이식 거부, 췌장 이식 거부, 부갑상선 이식 거부, 태아 흉선 이식 거부, 연골 이식 거부, 신장 이식 거부, 심장 이식 거부, 소장 이식 거부로부터 선택되며;
    장기 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환은 급성 이식 관련 면역 질환, 만성 이식 관련 면역 질환으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 백혈병은 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
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